एक संदर्भ मुक्त ट्रैक्शन फोर्स माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्म का निर्माण और कार्यान्वयन

Bioengineering

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Summary

इस प्रोटोकॉल बहुप्रकाशन लिथोग्राफी को लागू करने के लिए निर्देश प्रदान करता है फ्लोरोसेंट fiducial मार्करों के तीन आयामी सरणियों बनाने के लिए पाली में एम्बेडेड (एथिलीन ग्लाइकोल)-आधारित hydrogels संदर्भ मुक्त के रूप में उपयोग के लिए, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों. इन निर्देशों का उपयोग करना, 3 डी सामग्री तनाव और सेलुलर कर्षण की गणना की माप उच्च थ्रूपुट कर्षण बल माप को बढ़ावा देने के लिए सरल है.

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Banda, O. A., Slater, J. H. Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform. J. Vis. Exp. (152), e60383, doi:10.3791/60383 (2019).

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Abstract

मात्राकारी सेल प्रेरित सामग्री विरूपण कैसे कोशिकाओं भावना और उनके microenvironment के भौतिक गुणों के लिए प्रतिक्रिया के विषय में उपयोगी जानकारी प्रदान करता है. जबकि कई दृष्टिकोण सेल प्रेरित सामग्री तनाव को मापने के लिए मौजूद हैं, यहाँ हम एक संदर्भ मुक्त तरीके से उप माइक्रोन संकल्प के साथ तनाव की निगरानी के लिए एक पद्धति प्रदान करते हैं. एक दो-फोटोसक्रिय photolithographic पैटर्न प्रक्रिया का उपयोग करना, हम आसानी से तीन आयामी को मापने के लिए फ्लोरोसेंट fiducial मार्करों के एम्बेडेड सरणियों युक्त यंत्रवत् और जैव सक्रिय टूनाबल सिंथेटिक substrates उत्पन्न करने के लिए कैसे प्रदर्शित करते हैं ( 3 डी) सतह कर्षण के जवाब में सामग्री विरूपण प्रोफाइल. इन substrates का उपयोग करना, सेल तनाव प्रोफाइल ब्याज की एक सेल के एक एकल 3 डी छवि ढेर का उपयोग कर मैप किया जा सकता है. इस पद्धति के साथ हमारा लक्ष्य कर्षण बल माइक्रोस्कोपी को सेलुलर mechanotransduction प्रक्रियाओं, विशेष रूप से क्षेत्र के लिए नए चेहरे का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं के लिए उपकरण को लागू करने के लिए एक और अधिक सुलभ और आसान बनाने के लिए है।

Introduction

ट्रैक्शन बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) एक अनुशीलक और संकुचनशील सेल द्वारा उत्पन्न परिद्युद्योगिक मार्करों के अंतर्विष्ट विस्थापन क्षेत्रों का उपयोग करके लगभग सेलुलर कर्षणों की प्रक्रिया है। TFM का उपयोग करना, इस तरह के प्रसार के रूप में महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं पर extracellular वातावरण में यांत्रिक संकेतों के प्रभाव, भेदभाव, और प्रवास की जांच की जा सकती1,2,3,4 5,6,7,8,9,10,11,12. दुर्भाग्य से, कई मौजूदा दृष्टिकोण को लागू करने के लिए मुश्किल हो सकता है या अत्यधिक विशेष विश्लेषणात्मक और कम्प्यूटेशनल उपकरण TFM का उपयोग करने के लिए मुश्किल बनाने के साथ परिचित की आवश्यकता होती है. हम एक TFM मंच है कि विश्लेषण में कठिनाई के कुछ समाप्त जबकि भी उच्च throughput डेटा अधिग्रहण प्रदान उत्पन्न करने के लिए एक पद्धति का वर्णन.

मौजूदा टीएफएम दृष्टिकोणों में, सामग्री तनाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला सबसे अधिक छोटे फ्लोरोसेंट मार्कर (आमतौर पर नैनो- या माइक्रोमीटर-आकार के फ्लोरोसेंट मोती) को एक विरूपक हाइड्रोजेल में शामिल करना शामिल है, जैसे पॉलीऐक्रिलमाइड (पीएए) या पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) डायक्रिलेट (PEGDA)13,14,15. इन मनका आधारित दृष्टिकोण विस्थापन नमूना को अधिकतम करने के लिए ब्याज की एक सेल के आसपास घने क्लस्टर fiducial मार्करों करने की क्षमता प्रदान करते हैं. दुर्भाग्य से, hydrogel भर में मोती के वितरण सीधे नियंत्रित नहीं किया जा सकता है तो स्थानिक संगठन यादृच्छिक है. इस यादृच्छिक प्लेसमेंट ऐसे मोती जो भी सही ढंग से हल करने के लिए एक दूसरे के करीब हैं, या तो सब्सट्रेट उपज कम गुणवत्ता डेटा के पैच फैल के रूप में समस्याओं की ओर जाता है. भविष्यवाणी करने में असमर्थता जहां fiducial मार्करों कोशिकाओं की अनुपस्थिति में झूठ भी एक बाधा है कि, सेल कर्षण डेटा के हर एकत्र सेट के लिए, एक आराम राज्य में अंतर्निहित मार्करों के एक अतिरिक्त संदर्भ छवि भी कब्जा कर लिया जाना चाहिए बनाता है. संदर्भ प्रतिबिंब की आवश्यकता है ताकि तनावग्रस्त प्रतिबिंब में विस्थापन का अनुमान बल दिया गया और तनावग्रस्त छवियों के बीच के अंतर के रूप में अनुमानित किया जा सके। एक आराम राज्य को प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को मापा जा रहा है या तो रासायनिक आराम कर रहे हैं या पूरी तरह से हटा दिया. इस प्रक्रिया को अक्सर आगे प्रयोगात्मक माप के अधिग्रहण से बचाता है, लंबी अवधि के सेल अध्ययन रोकता है, और सीमा प्रवाह. एक संदर्भ छवि भी छवि पंजीकरण तकनीक बहाव जो प्रयोग के दौरान हुई हो सकता है के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है, अक्सर संदर्भ छवियों के लिए तनाव राज्य छवियों के बोझिल मैनुअल मिलान करने के लिए अग्रणी.

अन्य TFM तरीकों संदर्भ मुक्त समझा, fiducial मार्करों के वितरण पर नियंत्रण के कुछ फार्म को लागू, या तो उच्च संकल्प लिथोग्राफी, microcontact मुद्रण, या micromolding16,17,18 द्वारा ,19,20. संदर्भ मुक्त TFM धारणा है कि प्रत्येक fiducial मार्कर के लिए आराम राज्य कैसे मार्कर पदों निर्माण प्रक्रिया के दौरान निर्धारित किया गया था के आधार पर भविष्यवाणी की जा सकती है के माध्यम से प्राप्त की है. इन तरीकों में एक एकल छवि पर कब्जा है जिसमें fiducial मार्कर विस्थापन एक निहित संदर्भ की तुलना में से fiducial मार्कर ज्यामिति से अनुमान लगाया जा सकता है की तुलना में मापा जाता है के भीतर एक सेल के तनाव राज्य का पूरा कब्जा करने के लिए अनुमति देते हैं. मार्कर प्लेसमेंट में स्थिरता आम तौर पर इन प्लेटफार्मों का उपयोग कर हासिल की है, वे आम तौर पर सहित व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मनका आधारित दृष्टिकोण के सापेक्ष अपनी कमियों से पीड़ित हैं: 1) कर्षण संकल्प में कमी आई; 2) बाहर के विमान विस्थापन की सटीकता में कमी आई (कुछ मामलों में मापने के लिए एक पूरी असमर्थता); और 3) मंच substrates और सामग्री (उदा., लिगंड प्रस्तुति, यांत्रिक गुण) की customizability में कमी आई।

इन कमियों को दूर करने के लिए, हमने एक नया संदर्भ-मुक्त टीएफएम मंच तैयार किया है। मंच hydrogel के भीतर विशिष्ट 3 डी स्थानों में एक फ्लोरोफोर की एक छोटी सी मात्रा crosslink करने के लिए multiphoton सक्रिय रसायन विज्ञान का इस्तेमाल करता है कि भौतिक तनाव को मापने के लिए fiducial मार्करों के रूप में सेवा. इस तरह, हम एक मंच है कि इसी तरह संचालित करने के लिए मनका आधारित दृष्टिकोण है, लेकिन महत्वपूर्ण लाभ है कि fiducial मार्करों संदर्भ मुक्त सामग्री तनाव ट्रैकिंग के लिए अनुमति grided सरणियों में आयोजित कर रहे हैं के साथ डिजाइन किया है. यह संदर्भ मुक्त संपत्ति कई फायदे वहन करती है। और सबसे पहले, यह सेलुलर कर्षण राज्यों के गैर दखल देने वाली निगरानी के लिए अनुमति देता है (यानी, आराम करने के लिए या कोशिकाओं को हटाने के लिए विस्थापित fiducial मार्करों के संदर्भ पदों प्राप्त करने की आवश्यकता को दरकिनार). यह इस प्रणाली को डिजाइन करने में हमारा प्राथमिक लक्ष्य था, जैसा कि हम TFM, जो विनाशकारी अंत बिंदु TFM दृष्टिकोण के साथ मुश्किल हो सकता है के साथ मिलकर अन्य बहाव विश्लेषणात्मक तरीकों को शामिल करने का इरादा. दूसरा, gridded सरणियों पर आधारित एक निहित संदर्भ का उपयोग विस्थापन विश्लेषण के लगभग पूरा स्वचालन के लिए अनुमति देता है. सरणियों की नियमितता एक उम्मीद के मुताबिक कार्यप्रवाह बनाता है जहां असाधारण मामलों की घटना (यानी, नमूना सेल डेटा जिसमें अप्रत्याशित कलाकृतियों जैसे suboptimal मार्कर रिक्ति या पंजीकरण बेमेल) को कम से कम बनाए रखा जा सकता है। तीसरा, एक संदर्भ छवि प्राप्त करने की आवश्यकता के लिए जा रहा समय की विस्तारित अवधि में एक ही नमूने पर कई कोशिकाओं की निगरानी करने की स्वतंत्रता प्रदान करता है. पारंपरिक मनका आधारित दृष्टिकोण है, जहां, माइक्रोस्कोप के स्वचालित मंच आंदोलनों की निष्ठा पर निर्भर करता है के साथ यह विरोधाभास, स्थिति में त्रुटियों जमा और सेल तनाव के लिए ठीक से संदर्भ छवियों के पंजीकरण की कठिनाई में वृद्धि कर सकते हैं छवियां. कुल मिलाकर, इस मंच सेलुलर तनाव डेटा इकट्ठा करने में उच्च थ्रूपुट की सुविधा.

इस प्रोटोकॉल के साथ, हम दो फोटो, लेजर स्कैनिंग लिथोग्राफी तकनीक है कि हम इस संदर्भ मुक्त TFM मंच को मापने के लिए लागू के साथ पाठकों को परिचित करने की उम्मीद है विमान और बाहर के विमान कर्षण घटकों कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न बीज सतह पर. इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं एकामंडलिक घटकों में से कुछ का संश्लेषण है. सामान्य में, इन प्रतिक्रियाओं में शामिल हैं लगभग समान "एक पॉट" संश्लेषण प्रतिक्रिया योजनाओं पहले वर्णित21, और इन उत्पादों के लिए विकल्प भी खरीदा जा सकता है. हम भी सॉफ्टवेयर आधारित उपकरण हम 3 डी मुद्रण उपकरण के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के उपयोग को बढ़ावा देने के लिए और fiducial मार्कर विस्थापन के विश्लेषण की सुविधा के लिए उत्पन्न के साथ पाठकों को परिचित करना है.

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Protocol

1. फोटोबहुलकीकरण एक PEGDA आधार हाइड्रोजेल

  1. रीएजेंट्स एकत्रित करना
    1. लीथियम फ़ेनिल-2,4,6-ट्राइमेथिलबेन्जोइलफॉस्फिनेट (लैप), 3.4 केडीए पॉली (एथिलीन) ग्लाइकोल डायक्रिलेट (PEGDA), n-vinyl पाइरोलिडोन (NVP), एलेक्साफ्लुओर 488 लेबल पेगडा (PEGDA), एलेक्साफ्लुओर 633 लेबल पेगाडा (PEGD), और PEGD (PEGD) खूंटी-RGDS) उनके संबंधित फ्रीजर से और कमरे के तापमान के लिए प्रत्येक लाने के लिए।
    2. अलग एम्बर microcentrifuge ट्यूबों में, उपाय 3 एलएपी के मिलीग्राम, 10 PEGDA के मिलीग्राम, 5 खूंटी-488 के मिलीग्राम, 20 खूंटी-633 की मिलीग्राम, और 6 RGDS पेप्टाइड के मिलीग्राम.
  2. प्री-पॉलीमर समाधान की तैयारी
    1. 1 एमएल फॉस्फेट बफरेड लवण (पीबीएस, पीएच 7-4) में एलएपी को भंग करें। PEGDA भंग करने के लिए भंग LAP समाधान के 200 डिग्री एल का प्रयोग करें। फिर, PEG-RGDS भंग करने के लिए PEGDA समाधान के 200 $L का उपयोग करें।
      नोट: यदि सेल आकार का नियंत्रण वांछित है, तो यह प्रोटोकॉल में बाद में दो-फोटोन, लेजर स्कैनिंग लिथोग्राफी के माध्यम से जोड़ दिया जाएगा के रूप में, आधार hydrogel पूर्व बहुलक समाधान में खूंटी-RGDS भंग छोड़ दें।
    2. खूंटी-488 को भंग करने के लिए पीबीएस के 80 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें। इस विलयन का 2.5 डिग्री सेल्सियस बहुलक पूर्व विलयन में जोड़ें।
      नोट: खूंटी-488 अंतिम hydrogel एक फ्लोरोसेंट संकेत जो पैटर्न के दौरान नेविगेट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एकाग्रता संकेत तीव्रता को बदलने के लिए संशोधित किया जा सकता दे देंगे.
    3. समाधान में मौजूद हो सकता है कि किसी भी कण को दूर करने के लिए एक 0.2 m polytetrafluoroethylene (PTFE) फिल्टर के माध्यम से पूरा पूर्व बहुलक समाधान फ़िल्टर करें। reactants ठीक से संश्लेषित कर रहे हैं, तो फ़िल्टर भरा हुआ नहीं होना चाहिए।
  3. फोटोबहुलक आधार हाइड्रोजेल
    1. परफ्लोरिक अल्केन्स (पीएफए) की एक पतली सपाट शीट पर पूर्व-बहुलक समाधान के 3 डिग्री एल रखें। चारों ओर फ्लैट 150 डिग्री मीटर मोटी polydimethylsiloxane (PDMS) स्ट्रिप्स रखें, लेकिन के साथ संपर्क में नहीं, पूर्व बहुलक समाधान की बूंद. एक ऐक्रिलेट-सिलानाइज्ड कवरस्लिप21,22,23,24 को PDMS पर रखें-पूर्व-बहुलक बूंद के साथ जो कवरस्लिप के नीचे केंद्रित है- पूर्व-बहुलक बूंद को मोटाई के लिए समतल करें पीडीएमएस स्पेसर्स।
    2. यूवी प्रकाश के लिए sandwiched पूर्व बहुलक समाधान को उजागर जब तक एक hydrogel पूरी तरह से गठन किया है (लगभग 1 मिनट पर 14 mW/cm2 370-400nm प्रकाश के).
    3. ध्यान से PDMS spacers से कवरस्लिप अलग और उच्च प्रदर्शन, डबल पक्षीय एक्रिलिक चिपकने वाला का उपयोग कर एक खुले नीचे पेट्री डिश के लिए देते हैं। कवरस्लिप, चिपकने वाला, चिपकने वाला, और पेट्री डिश के बीच एक पूर्ण सील बनाने के लिए चिपकने वाला संपर्क सतह पर दबाव लागू करें- कांच को दरार न करने की देखभाल के साथ।
    4. जैविक और कणीय संदूषकों को कम करने के लिए बाँझ-फिल्टर्ड पीबीएस का उपयोग करके पेट्री डिश में हाइड्रोजेल को कुल्ला करें।
    5. 1.3.1-1.3.4 के चरणों को दोहराएँ के रूप में hydrogels की वांछित संख्या बनाने की जरूरत है.
    6. एलएपी समाधान के शेष 800 डिग्री सेल्सियस में NVP के 8 डिग्री एल जोड़ें और पैटर्न के लिए तैयार होने तक इस समाधान के साथ-साथ undissolved PEG-633 रखें।
      नोट: NVP के साथ LAP समाधान प्रकाश के लिए बहुत संवेदनशील है और अंधेरे में नहीं रखा तो बहुलक होगा। एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब लपेटकर मदद कर सकते हैं अपने शेल्फ जीवन में सुधार.

2. पैटर्न निर्देश बनाना

  1. बाइनरी छवि डिज़ाइन करना
    1. fiducial मार्कर सरणियों निर्धारित करने के लिए एक आभासी मुखौटा बनाने के लिए, 100:1 (उदाहरण के लिए, 2000 पिक्सेल लंबे x 20 पिक्सेल चौड़ा) के एक पहलू अनुपात के साथ एक छवि बनाने के लिए छवि प्रसंस्करण या ड्राइंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    2. छवि के लंबे अक्ष के साथ केंद्रित एक काली पृष्ठभूमि पर 100 समान रूप से स्थान सफेद पिक्सेल की एक पंक्ति बनाएँ.
    3. इस छवि को *.tif फ़ाइल प्रकार के रूप में सहेजें.
      नोट: यदि सेल आकार का नियंत्रण वांछित है21,25,26,27,28, एक अतिरिक्त आभासी मुखौटा बनाएँ. एक वर्ग के आकार का छवि कैनवास का प्रयोग करें और एक काली पृष्ठभूमि पर सकारात्मक सफेद सुविधाओं बनाएँ. सफेद सुविधाओं के लिए एक उपयुक्त आकार लगभग के लिए (जो अंततः सेल आसंजन का समर्थन करेंगे) मान लें कि छवि का कुल आकार लेजर स्कैनिंग लिथोग्राफी के लिए इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के व्यूफील्ड के आकार के बराबर है।
  2. बाइनरी छवि को डिजिटल मास्क में कनवर्ट करना
    1. डाउनलोड LSM-ROI-जेनरेटर कार्य सॉफ्टवेयर भंडार29पर मुफ्त उपलब्ध है .
    2. Matlab खोलें और डाउनलोड समारोह फ़ाइलों की निर्देशिका पाते हैं। एक बार निर्देशिका में, run-script.m Matlab स्क्रिप्ट खोलें और स्क्रिप्ट चलाएँ।
    3. कनवर्ज़न के लिए बाइनरी *.tif फ़ाइल का चयन करें। उसके बाद, क्षेत्र फ़ाइलों को सहेजने के लिए किसी फ़ोल्डर का चयन करें।
    4. चयनित छवि के माइक्रोन में वांछित अंतिम आकार इनपुट करें। इनपुट छवि को इन पैरामीटर से मेल करने के लिए स्केल और आयाम दिया जाएगा. पूरी छवि के लिए माइक्रोस्कोप के व्यूफील्ड में फिट करने के लिए, छवि का कुल आकार माइक्रोस्कोप व्यूफील्ड के आकार से कम या बराबर होना चाहिए।
    5. यदि कोई एकल पिक्सेल सरणी बनाते हैं, तो ROI-जेनरेटर विकल्प में, छोटे क्षेत्र/एकल पिक्सेलके अंतर्गत चेकबॉक्स निकालें चेक करना, चेक बॉक्स लेबल वाले वर्गकी जाँच करने के लिए, और नीचे उपयोग अनचेक करना सुनिश्चित करें क्षैतिज तोड़ लाइन्स| उसके बाद, ठीकक्लिक करें.
      नोट: यदि एकल कक्ष प्रतिमान बनाने के लिए कोई क्षेत्र फ़ाइल बनाते हैं, तो डिफ़ॉल्ट विकल्प उपयुक्त होते हैं.
    6. पहले निर्दिष्ट फ़ोल्डर में परिणामी *.ovl फ़ाइल ढूँढें। इस फ़ाइल को माइक्रोस्कोप के लिए लाया जाना चाहिए वांछित क्षेत्रों है कि दो-photon लेजर स्कैनिंग लिथोग्राफी के दौरान लेजर शटर नियंत्रण लोड करने के लिए.

3. fiducial मार्कर सरणियों का निर्माण

  1. बेस हाइड्रोजेल को भिगोने
    1. कम प्रकाश की स्थिति के तहत, AF633 (दोनों चरण 1 में तैयार) के लिए LAP/NVP समाधान के 200 $L जोड़ें। प्रकाश से रक्षा करते समय अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. चरण 1 से एक PEGDA hydrogel युक्त पेट्री डिश से सभी PBS समाधान निकालें.
    3. भंग खूंटी-633 hydrogel करने के लिए एक बूंद है कि पूरी तरह से आधार hydrogel शामिल बनाने के लिए जोड़ें.
      नोट: पेट्री डिश में छेद केवल hydrogel से थोड़ा बड़ा है, यह पैटर्न समाधान पकड़ करने के लिए एक अच्छी तरह के रूप में सेवा कर सकते हैं. अन्यथा, सुनिश्चित करें कि coverslip पैटर्निंग समाधान जोड़ने से पहले पूरी तरह से सूखा है या यह hydrogel बंद चला सकते हैं पैटर्न के दौरान निर्जलित करने के लिए hydrogel के कारण.
    4. माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना धारक पर पेट्री डिश लोड और पेट्री डिश पर ढक्कन जगह है। अंधेरे में कम से कम 30 मिनट के लिए hydrogel में भिगोने के लिए पैटर्न समाधान की अनुमति दें।
      नोट: माइक्रोस्कोप चालू और इस सोख समय के दौरान विन्यस्त किया जा सकता है. 488 एनएम लेजर का उपयोग करने के लिए भिगोने के दौरान hydrogel छवि ठीक है.
  2. माइक्रोस्कोप का विन्यास
    1. एक 488 एनएम लेजर लाइन का उपयोग करना और छवि AlexaFluor 488 के लिए उपयुक्त फिल्टर, खूंटी-488 संकेत का उपयोग hydrogel का पता लगाने. डिटेक्टर से लंबे समय तक उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के ब्लॉक संग्रह के रूप में इन खूंटी-633 से संकेत के साथ संतृप्त किया जाएगा.
    2. खड़ी और क्षैतिज टाइल स्कैन का उपयोग कर XY विमान में hydrogel के केंद्र का पता लगाएं और यहाँ मंच की स्थिति शून्य।
    3. लाइन स्कैन और z-स्टैक समारोह का उपयोग hydrogel की सतह का पता लगाएं। यहाँ ध्यान की स्थिति शून्य. सतह की स्थिति की पहचान करने और माइक्रोस्कोप चरण के लिए सेट शिकंजा का समायोजन करने के लिए XY केंद्र से दूर इन लाइन स्कैन दोहराद्वारा hydrogel स्तर।
    4. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर कार्यस्थान के भीतर, photopaterning के लिए एक अलग प्रयोग फ़ाइल बनाएँ. बहुफोटोन शक्ति को 1.8% (15.5 उ.मा.) 740 दउ पर सेट करें, जैसा कि उद्देश्य के पीछे एपर्चर पर मापा जाता है, और स्कैनिंग गति 6 (0.1 डिग्री उम/ पिक्सेल में छवि फ़्रेम का आकार समायोजित करें 0.1 $m प्रति पिक्सेल का पिक्सेल आकार और 100:1 का एक पक्ष अनुपात प्राप्त करने के लिए.
    5. चरण 2.2 में बनाई गई क्षेत्र फ़ाइल (*.ovl) को क्षेत्र टैब में लोड करें. सभी क्षेत्रों को प्राप्ति पर सेट करने के लिए मैक्रो का उपयोग करें.
    6. z-स्टैक फ़ंक्शन चालू करें और रिक्ति को 28 डिग्री उ की कुल गहराई और 9 की z-slices की कुल संख्या के लिए 3.5 $m पर सेट करें.
    7. पदों समारोह का उपयोग hydrogel पर विशिष्ट स्थानों को स्थापित करने के लिए जहां fiducial मार्कर सरणियां photopatterned किया जाएगा.
      नोट: इन पदों के z-स्थान प्रत्येक z-स्टैक के केंद्र की स्थिति तय करेगा; जब पदों रखने, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक स्थिति की गारंटी होगी कि पैटर्न मात्रा सभी सतह स्थानों पर hydrogel के साथ ओवरलैप होगा.
    8. प्रत्येक स्थिति में अतिरिक्त पंक्तियाँ और स्तंभ निर्दिष्ट करने के लिए टाइल फ़ंक्शन का उपयोग करें. ओवरलैपिंग पैटर्न वाले क्षेत्रों से बचने के लिए सावधान रहें। आदर्श रूप से, सुनिश्चित करें कि प्रतिमान वाले क्षेत्र स्थितियों के बीच रिक्त और अनुपयोगी स्थानों को निकालने के लिए पर्याप्त बंद हैं.
  3. प्रकाशपैटर्न दतिद्युति मार्कर सरणियाँ
    1. सोख समय 30 मिनट के निशान दृष्टिकोण के रूप में, hydrogel की सतह के लगातार z-स्टैक लाइन स्कैन हर 5 मिनट लेने के लिए शून्य फोकस स्थिति के सापेक्ष सतह के स्थान में परिवर्तन के आधार पर सूजन के लिए जाँच करने के लिए.
    2. सतह की स्थिति में कोई परिवर्तन एक 5 मिनट अंतराल पर होता है, तो लोड और चरण 3.2.4 में बनाई गई पैटर्न सेटिंग्स चलाएँ
    3. एक बार पैटर्न प्रयोग चल रहा समाप्त हो गया है, का उपयोग करें 488 एनएम लेजर सत्यापित करने के लिए कि hydrogel की सतह पैटर्न के दौरान कदम नहीं था.
      नोट: यदि यह hydrogel की सतह के रूप में यह पैटर्न से पहले था एक ही स्थिति में नहीं है, कई परिदृश्य मौजूद हैं. hydrogel सूजन संतुलन पैटर्न से पहले नहीं पहुँच गया था, hydrogel पैटर्न के दौरान बाहर सूख शुरू कर दिया, या माइक्रोस्कोप अनुभवz-ड्रिफ्ट. इस सतह अनुवाद के स्रोत की पहचान की जानी चाहिए और बाद पैटर्न रन में सही.
    4. माइक्रोस्कोप से हाइड्रोजेल निकालें और पेट्री डिश से खूंटी-633 समाधान aspirate.
      नोट: hydrogel अभी भी प्रकाश के लिए बेहद संवेदनशील है. अंधेरे में hydrogel रखते हुए बहुत महत्वपूर्ण है जब तक सभी rinsing पूरा हो गया है.
    5. बाँझ फ़िल्टर PBS के साथ hydrogel 3 बार कुल्ला, पूरी तरह से प्रत्येक लगातार कुल्ला के बीच rinsate को दूर करने के लिए सुनिश्चित कर रही है. इस ट्रिपल कुल्ला 1 ज के लिए हर 15 मिनट.
    6. हाइड्रोजेल को पीबीएस में रात भर कुल्ला करने की अनुमति दें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
    7. ट्रिपल पीबीएस के साथ hydrogel कुल्ला. फिर जल्दी से ट्रिपल एक 200 प्रूफ इथेनॉल समाधान के साथ hydrogel कुल्ला, PBS के साथ एक और ट्रिपल कुल्ला द्वारा पीछा किया. hydrogel समय की विस्तारित अवधि के लिए 200 सबूत इथेनॉल में बैठने के लिए अनुमति न दें।
      नोट: पैटर्न समाधान के कुछ घटकों के समाधान से बाहर दुर्घटना और hydrogel की सतह पर जमा कर सकते हैं और 633 एनएम रोशनी के तहत फ्लोरोसेंट ($1-5 microns मोटी) की एक ठोस परत के रूप में दिखाई देते हैं. 200 सबूत इथेनॉल के साथ rinsing इन अवांछित घटकों को दूर करना चाहिए.
  4. एकल सेल पैटर्न उत्पन्न करने के लिए क्रमिक photopatterning का उपयोग करना (वैकल्पिक)
    नोट: यदि सेल प्रसार क्षेत्र और आकार पर नियंत्रण वांछित है, पैटर्न के कई दौर किया जा सकता है. आधार जेल खूंटी-RGDS अपनी प्रारंभिक तैयार करने से छोड़ा जाना चाहिए. यह अनुशंसा की जाती है कि फिड्यूशियल मार्कर सरणियों के पैटर्न फ्लोरोसेंट fiducial मार्करों के विरंजन से बचने के लिए पिछले प्रदर्शन किया.
    1. चरण 1 में तैयार LAP/NVP समाधान में 20 मिलीग्राम खूंटी-आरजीडीएस को भंग करें।
    2. PEG-633 समाधान के बजाय PEG-RGDS समाधान का उपयोग कर चरण 3.1 - 3.3 दोहराएँ। एकल कक्ष प्रतिमानों को परिभाषित करने वाली उपयुक्त क्षेत्र फ़ाइल का उपयोग करें (निर्देशों के लिए चरण 2 देखें).
      नोट: PEG-RGDS प्रतिमानों की सरणियों कल्पना करने के लिए, वहाँ कई विकल्प हैं. खूंटी-आरजीडीएस के फ्लोरोसेंट संस्करण का उपयोग21,30 या पीईजी-आरजीडीएस फ्लोरोसेंट खूंटी के साथ किया जा सकता है। अनुशंसित: वैकल्पिक रूप से, 488 एनएम लेजर लाइन आधार hydrogel में खूंटी-488 संकेत ब्लीच करने के लिए multiphoton पैटर्न लेजर के साथ मिलकर चलाया जा सकता है, गैर-फ्लोरोसेंट क्षेत्रों है कि RGDS निगमन के साथ मेल बनाने का निर्माण.

4. दृश्यात्मक चिह्नक सरणियों

  1. गढ़े सरणी की एक z-स्टैक छवि प्राप्त करना
    1. पेट्री डिश में पीबीएस को सेल कल्चर के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले सेल मीडिया से बदलें।
      नोट: Phenol लाल मुक्त मीडिया phototoxicity को रोकने के लिए छवि अधिग्रहण के दौरान उपयोग के लिए सिफारिश की है.
    2. सोख समय के 1 एच के बाद, एक व्यापक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप एक संरचित रोशनी मॉड्यूल और एक उच्च आवर्धन पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस के साथ सुसज्जित का उपयोग करने के लिए एक फिल्टर फ्लोरोसेंट fiducial मार्करों के लिए उपयुक्त सेट का उपयोग hydrogels कल्पना.
    3. छवियों की एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन z-स्टैक लीजिए (स्थान 0.4 $m में $) जिसमें हाइड्रोजेल की सतह से कम से कम 20 डिग्री मी गहराई को पैटर्न वाले क्षेत्र में हाइड्रोजेल में शामिल किया गया है, यह सुनिश्चित करते हुए कि z-स्टैक की ऊपरी सीमा में कम से कम 1-2 छवियां शामिल हैं पैटर्न क्षेत्र (यानी, जहां फ्लोरोसेंट fiducial मार्करों अब दिखाई दे रहे हैं और केवल शोर मौजूद है).
      नोट: इस छवि स्टैक का प्राप्ति सत्यापित करें कि सभी प्रतिमान पैरामीटर सही हैं और चरण 5.3 में कक्ष डेटा के साथ विश्लेषित किया जा सकता करने के लिए आवश्यक है।

5. फोटोपैटर्न hydrogels का उपयोग कर TFM प्रदर्शन

  1. सीडिंग सेल
    नोट: बाँझपन बनाए रखने के लिए, सभी मानक ऊतक संस्कृति प्रथाओं का पालन करें.
    1. सेल बोने से पहले, सेल संस्कृति और रखरखाव के लिए संबंधित सेल लाइन के लिए मानक प्रोटोकॉल का पालन करें।
    2. (वैकल्पिक) यदि हाइड्रोजेल की बाँझपन एक चिंता का विषय है, तो सामान्य मीडिया के साथ rinsing द्वारा पीछा करने के बाद एंटीबायोटिक दवाओं युक्त मीडिया में 24 एच के लिए hydrogel इनक्यूबेट करें।
    3. कोशिकाओं को बीज के लिए, पहले मीडिया के अंतिम खंड में trypsinized कोशिकाओं को फिर से निलंबित hydrogel पेट्री डिश में इस्तेमाल किया जाएगा.
    4. hydrogel पकवान से सभी समाधान निकालें और सेल से लदी मीडिया के साथ बदलें.
    5. हाइड्रोजेल को सेल से लदे मीडिया में 10 मिनट तक बिना किसी बाधा के बैठने की अनुमति दें।
    6. ध्यान से एक इनक्यूबेटर के लिए पेट्री पकवान ले जाएँ। 4 ज के लिए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बनाए रखें या जब तक कोशिकाओं का प्रत्यक्ष रूप से पालन नहीं किया जाता है।
    7. अनपराधित कक्षों को निकालने के लिए सेल-ललित मीडिया को सेल-मुक्त मीडिया से बदलें.
  2. कोशिकाओं और fiducial मार्करों की छवियों को प्राप्त
    1. सूक्ष्मदर्शी पर ऊष्मायन कक्ष के लिए तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस और ब्व्2 से 5% तक सेट करें और कक्ष को सेट बिंदुओं तक पहुंचने की अनुमति दें।
    2. नमूना धारक पर पेट्री पकवान प्लेस और पैटर्न क्षेत्रों का पता लगाने.
    3. ब्याज की एक कोशिका का पता लगाएँ (सीओआई) और सीओआई के एक संचारित या फ्लोरोसेंट छवि प्राप्त.
      नोट: इस छवि को विश्लेषण के दौरान सेल सीमा खंड के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, तो छवि स्पष्ट रूप से सेल boarders कल्पना करनी चाहिए.
    4. चरण 4.1.4 में के रूप में सीओआई के नीचे पैटर्न सरणी के एक z-स्टैक प्राप्त करें।
    5. सेल के संचारित या फ्लोरोसेंट छवियों का एक दूसरा सेट प्राप्त करें।
      नोट: यदि phototoxicity के कारण सेल क्षति मनाया जाता है और छवि अधिग्रहण सेटिंग्स समायोजित करने की आवश्यकता है, यह निर्धारित करने के लिए पहले करने के लिए सेट दूसरी छवि की तुलना करें। कोशिकाओं जो जोखिम के बाद हटना की संभावना महत्वपूर्ण phototoxic प्रभाव का सामना करना पड़ा है, जो परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं.
    6. प्रत्येक सीओआई के लिए चरण 5.2.3-5.2.5 दोहराएँ.

6. छवियों का विश्लेषण

  1. विश्लेषण के लिए छवि फ़ाइलों की तैयारी
    1. चरण 5.2 में एकत्रित डेटा का उपयोग करके, सीओआई के आस-पास के क्षेत्र की एक फसली छवि स्टैक तैयार करें ताकि स्टैक की निचली छवि (पहली छवि) पहले फ़्रेम का प्रतिनिधित्व करे, जहाँ :(1) और प्रतिरूपित मार्कर स्तंभों का 80% दृश्यमान है, (2) सबसे ऊपर की छवि (अंतिम छवि) ढेर में अब किसी भी दृश्य fiducial मार्करों शामिल हैं (यानी, hydrogel सतह के ऊपर), और (3) वहाँ कम से कम है 20 $m गैर तनावग्रस्त fiducial मार्करों सीओआई के आसपास के.
      नोट: छवियों फसल बहुत विश्लेषण के दौरान कम्प्यूटेशनल समय कम कर देता है. विश्लेषण कोड बाद के चरणों में छवियों फसल के बिना चलाया जा सकता है, लेकिन यह अनुशंसित नहीं है.
    2. पिछले चरण में स्टैक की XY फसल से मेल करने के लिए संचारित और/या फ्लोरोसेंट छवि की एक फसली छवि बनाएँ।
    3. या तो फसली संचारित या फ्लोरोसेंट छवि का उपयोग करें-जो भी सेल आकार का अधिक प्रतिनिधि है- छवि को हाथ से विभाजित करने के लिए (सेल बॉर्डर का पता लगाना) या छवि संसाधन उपकरणों के माध्यम से.
    4. इस छवि को द्विआधारी प्रतिबिंब में कनवर्ट करें जहाँ सेल का आंतरिक भाग काला (अर्थात ् तीव्रता र् 0) तथा सेल के आस-पास का क्षेत्र ासाकीय है (अर्थात ्तीव्रता र् म् ०)। इस छवि को बाइनरी Mask.tifके रूप में सहेजें.
    5. प्रत्येक COI के लिए, छवि स्टैक फ़ाइल, प्रसारित छवि फ़ाइल, और बाइनरी मास्क फ़ाइल किसी एकल फ़ोल्डर में एकत्रित करें।
  2. छवियों पर विश्लेषण स्क्रिप्ट चलाना
    1. क्लोन या डाउनलोड TFM विश्लेषण कार्य सॉफ्टवेयर भंडार29पर मुफ्त उपलब्ध है. पूरे भंडार डाउनलोड किया जाना चाहिए के रूप में वहाँ सबफ़ोल्डर्स में निर्भरता की एक महत्वपूर्ण संख्या हैं।
    2. Matlab खोलें और पथ के लिए कोड भंडार के स्थानीय क्लोन के निर्देशिका और सभी सबफ़ोल्डर जोड़ें।
    3. जहाँ चरण 6.1 में तैयार छवियों संग्रहीत किए गए फ़ोल्डर स्थान के लिए Matlab कार्यस्थान के भीतर निर्देशिका सेट करें।
    4. ट्रैकिंग.m स्क्रिप्ट खोलें और चलाएँ. जब संकेत मिले, तो उपयुक्त छवियाँ लोड करने के लिए निर्देशों का पालन करें, प्रारंभिक पूर्व-संसाधन चरण निष्पादित करें, और ऑब्जेक्ट ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म त्रुटि जाँच करें।
    5. एक बार स्क्रिप्ट पूरा हो गया है, खोलने के लिए और dispShear.m समारोह चलाते हैं। यह स्क्रिप्ट उपयोगकर्ता से इनपुट की आवश्यकता नहीं होनी चाहिए।
    6. एक बार dispShear.m स्क्रिप्ट पूरा हो गया है, खुला और disp3D.mचलाते हैं. किसी भी चित्र को खोलने के लिए कहा जाता है, तो निर्देशों का पालन करें।
      नोट: रनटाइम के दौरान, स्क्रिप्ट पैटर्नेड सरणी की एक छवि पर एक पंक्ति आरेखित करने के लिए उपयोगकर्ता से पूछ सकते हैं। इस लाइन पैटर्न के दौरान स्कैनिंग लेजर के प्राथमिक गति अक्ष का प्रतिनिधित्व करना चाहिए और पैटर्न fiducial मार्करों की एक पंक्ति के साथ लाइन अप करना चाहिए. यह प्रक्रिया कोड को निर्देश देती है कि कौन सी दिशा (यानी, पंक्तियाँ या fiducial markers के स्तंभ) संभावित रूप से fiducial markers की सबसे संरेखित पंक्तियाँ प्राप्त करती हैं.
    7. एक बार dispSsheer.m कोड पूरा हो गया है, dispSurface.m कोड interpFinal3D$2.m कोड द्वारा पीछा चलाएँ। इन स्क्रिप्ट उपयोगकर्ता से इनपुट की आवश्यकता नहीं होनी चाहिए।
      नोट: interpFinal3D$2.m स्क्रिप्ट बाह्य रूप से प्राप्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विस्थापन डेटा को सतह कर्षणमें परिवर्तित करता है, जिसे पहले31वर्णित किया गया है। इन बाहरी फ़ंक्शंस को लागू करने के लिए, रूपांतरण फ़ंक्शंस के लिए इनपुट के रूप में कार्य करने के लिए interpFinal3D$2.m विस्थापन डेटा को एक समान ग्रिड में interpoles करता है। यदि किसी भिन्न रूपांतरण विधि का उपयोग कर, या कर्षण की आवश्यकता नहीं है, तो यह चरण छोड़ दिया जा सकता है।
    8. एक बार सभी स्क्रिप्ट चला गया है, सभी डेटा और outputs प्रारंभिक निर्देशिका में पाया जा सकता है सुनिश्चित करें.
    9. दोहराएँ चरण 6.2.3 - 6.2.8 प्रत्येक सीओआई के लिए.
      नोट: कोड संग्रह के भीतर, वहाँ स्क्रिप्ट है कि स्वचालित बैच निर्देशिका ओंकारियों की एक सूची पर स्क्रिप्ट में से प्रत्येक के चल रहे अनुमति देने वाले एक फ़ोल्डर है. स्वचालन स्क्रिप्ट स्वयं को देखें (यानी, कोड के भीतर टिप्पणियाँ) उन्हें कैसे उपयोग करने पर निर्देशों के लिए.

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Representative Results

प्रोटोकॉल के दौरान, पैटर्निंग प्रक्रिया की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए प्रतिक्रिया प्रदान करने वाली कई जांच चौकी हैं। इन चौकियों में से प्रत्येक पर प्रगति का आकलन करने के तरीके से संबंधित कुछ अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए, हम एक वास्तविक प्रयोग के प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं. परिणाम मानव नाभि नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) के TFM विश्लेषण के लिए तैयार एक photopatterned hydrogel पर प्रदर्शन इस प्रोटोकॉल के आवेदन पर प्रकाश डाला. परिणाम कच्चे छवि डेटा के साथ ही संसाधित डेटा आउटपुट प्रत्येक महत्वपूर्ण चरण पर शामिल हैं।

पहली जांच की चौकी 4 चरण में होती है, एक बार fiducial मार्कर सरणी hydrogel में photopatterned किया गया है. एक छवि स्टैक एकत्रित करते समय, परिणामी छवियों पैटर्न सुविधाओं की एक नियमित सरणी प्रदर्शित करना चाहिए (चित्र 1ए -सी) कि छवि ढेर के भीतर z स्थिति के एक समारोह के रूप में तीव्रता में दोलन. पैटर्न सतह पूरी तरह से स्तर नहीं था, तो प्रत्येक छवि टुकड़ा के विभिन्न क्षेत्रों इन दोलनों के संबंध में एक दूसरे के साथ चरण से बाहर लग सकता है; यह उम्मीद है और चरम मामलों को छोड़कर विश्लेषण को प्रभावित नहीं करना चाहिए.

शेष चौकियों एक दिए गए सीओआई के विश्लेषण के दौरान चलने स्क्रिप्ट में से प्रत्येक से outputs का उपयोग करें। tracking.m स्क्रिप्ट पूर्व प्रसंस्करण की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए फ्लोरोसेंट fiducial मार्करों के एक z-प्रक्षेप सहित कई नैदानिक छवियों प्रदान करता है (चित्र 2A)का पता लगाया centroids रंग की एक साजिश z-स्थिति के एक समारोह के रूप में कोडित ( चित्र 2ख) ऑब्जेक्ट डिटेक्शन गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, और ऑब्जेक्ट ट्रैकिंग गुणवत्ता का आकलन करने के लिए ज़-दिशा (चित्र 2C) में स्तंभों में लिंक किए गए चिह्नक centroids का प्रतिनिधित्व करने वाले ट्रैक्स का एक प्लॉट.

संदर्भ निर्देशांक और विस्थापन की गणना करने के लिए आवश्यक सटीक 3 डी centroid का पता लगाने के लिए, फ्लोरोसेंट fiducial मार्करों केंद्र से रेडियल कम तीव्रता के साथ दीर्घवृत्तीय आकृतियों के समान होना चाहिए। disp3D.m स्क्रिप्ट किसी दिए गए छवि स्टैक में पता की गई सुविधाओं के प्रत्येक स्तंभ के लिए z-स्थिति के एक समारोह के रूप में तीव्रता का एक आलेख प्रदान करता है (चित्र 3ए, बी) परिदय मार्कर तीव्रता प्रोफाइल की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए। दोनों disp3D.m और dispShear.m एक साथ कार्तीय निर्देशांक आयाम में मापा विस्थापन शोर के हिस्टोग्राम प्रदान करते हैं (चित्र 4-सी) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विस्थापन के interpolated गर्मी नक्शे (चित्र 4 4 ई, एफ). अंत में, interpFinal3D $2.m आउटसोर्स कोड का उपयोग करके परिकलित सतह कर्षणों की गर्मी के नक्शे प्रदान करता है (चित्र 5)31.

Figure 1
चित्र 1: विशिष्ट पैटर्निंग परिणाम.
(क)हाइड्रोजेल सतह से हाइड्रोजेल सतह से 12ण्4 उ तक तीव्रता में उतार-चढ़ाव को प्रदर्शित करने वाले विश्वीय मार्करों के फ्लोरेसेंट चित्र। (ख)एक प्रसंस्कृत आयतनीय प्रतिपादन, दीर्घवृत्तीय मार्करों के दीर्घवृत् तॉइडी आकृति का पता चलता है। (C)volumetric प्रतिपादन प्रदर्शन कच्चे मार्कर डेटा के अनुभागित प्रोफ़ाइल दृश्य. ए,सी: स्केल बार $5 $m. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: नैदानिक कण ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म से outputs।
ऑब्जेक्ट डिटेक्शन और ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर कई नैदानिक छवियों का आउटपुट करता है, जिनमें(A) फ्लोरोसेंट फिड्यूशियल मार्कर का एक जेड-भारित प्रक्षेपण और (बी) रंग कोडित स्थिति के साथ मार्कर पदों का एक स्कैटर प्लॉट होता है। (C) एक अतिरिक्त आउटपुट एक z-भारित प्रक्षेपण प्रदर्शित करता है, जैसा कि(A) , स्तंभों में लिंक किए गए प्रत्येक फ़्रेम से 2D का पता लगाने के साथ. () () को और अधिक निकट देखो से अधिक स्पष्ट रूप से पता चलता है व्यक्तिगत 2 डी का पता लगाने रंग z-स्थिति द्वारा कोडित. A: स्केल बार $20 $m. C: स्केल बार [5 ]m. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: निदान आउटपुट 3D विस्थापन एल्गोरिथ्म से।
(, बी) ऊर्ध्वाधर दिशा में समूहित मार्करों के बीच फ्रेम स्थिति दोलनों के एक समारोह के रूप में मार्कर तीव्रता के रेखा भूखंडों। इन लाइन भूखंडों इमेजिंग विमान के साथ ग्रिड संरेखण के गुणात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं, साथ ही पैटर्न fiducial मार्करों के समग्र गुणवत्ता. (क)मार्कर तीव्रता में अतिव्यापन दोलनों से यह पुष्टि होती है कि इमेजिंग प्लेन के स्वीकार्य संरेखण में प्रतिरूपित विश्वीय मार्कर सरणियों के साथ है। एक $-स्टैक के शीर्ष पर खाली फ्रेम सहित प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में एक शोर सीमा की स्वचालित गणना के लिए अनुमति देता है। (ख) दोलनों के बीच खराब ओवरलैप अक्सर इमेजिंग प्लेन के साथ पैटर्न किए गए ग्रिड के खराब संरेखण का संकेत देता है लेकिन यह भी सुझाव दे सकता है कि ग्रिड स्वयं misaligned हैं और खराब परिणाम प्राप्त कर सकते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: 2D और 3D विस्थापन एल्गोरिदम से नैदानिक आउटपुट।
(-सी) 'गैर विकृत' (यानी विस्थापन शोर) माने जाने वाले क्षेत्रों में मापित विस्थापनों के हिस्टोग्राम मार्कर संदर्भ स्थितियों के लगभग के लिए परिकलित संदर्भ रेखाओं की सटीकता का मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान करते हैं। विस्थापन क्षेत्र दोनों(घ) इन-प्लेन (शीयर) और(ई) आउट-ऑफ-प्लेन (सामान्य) मापे गए विस्थापनों का दृश्य निरूपण प्रदान करते हैं। D: स्केल बार [20 ]m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: ट्रैक्शन कनवर्ज़न एल्गोरिथ्म से नैदानिक आउटपुट।
(ए-सी) ट्रैक्शन तनावों की गणना अंतर्विष्ट विस्थापन क्षेत्रों के आधार पर की जा सकती है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि(बी) कुल कर्षण , (ब्) कतरनी कर्षण, और () सामान्य कर्षण है। A: स्केल बार [20 ]m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक कार्यप्रवाह है कि पीढ़ी और TFM डेटा के विश्लेषण के साथ जुड़े कठिनाई के बहुत कम प्रदान करना है. एक बार तैयार, photopatterned hydrogels का उपयोग करने के लिए सरल कर रहे हैं, मानक ऊतक संस्कृति प्रथाओं और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के केवल ज्ञान की आवश्यकता होती है. संदर्भ मुक्त पहलू सेल से लदी hydrogels पर लापरवाह नेविगेशन सक्षम बनाता है और इस तरह के संदर्भ और विकृत छवियों के बीच छवि पंजीकरण के रूप में बोझिल छवि प्रसंस्करण कदम समाप्त. परिणामस्वरूप विश्लेषण लगभग पूरी तरह से स्वचालित है और अलग-अलग COIs से डेटा शुरू से कम 10 मिनट में खत्म करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में प्राथमिक चुनौतियों photopatterned hydrogel के निर्माण से स्टेम. क्योंकि प्रोटोकॉल में इस्तेमाल अभिकर्मकों के अधिकांश घर में संश्लेषित कर रहे हैं, हम सिंथेटिक hydrogel सामग्री का उपयोग कर कम अनुभव के साथ उपयोगकर्ताओं को कुछ हद तक इस प्रोटोकॉल का प्रयास करने से detered हो सकता है कि उम्मीद है. उस ने कहा, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया PEGylated घटकों के सभी एक पॉट प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर लगभग समान प्रोटोकॉल से संश्लेषित कर रहे हैं और घटकों के कई वाणिज्यिक विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल भी लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के उपयोग पर कुछ महारत की आवश्यकता है. लेजर स्कैनिंग मानकों को हर अलग माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, लेजर तीव्रता, उद्देश्य लेंस, और अन्य माइक्रोस्कोप घटकों के रूप में भी एक ही मॉडल के माइक्रोस्कोप के बीच अलग अलग होंगे. फोटो-पैटर्निंग के लिए सबसे अच्छा माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का निर्धारण करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण विभिन्न सेटिंग्स के साथ स्कैन के एक पैनल प्रदर्शन करने के लिए है। किसी भी सेटिंग है कि कुल लेजर नमूने द्वारा प्राप्त जोखिम को प्रभावित करता है आकार और पैटर्न मार्करों की गुणवत्ता को प्रभावित करेगा. इसमें शामिल हैं: स्कैन गति, पिक्सेल आकार, औसत संख्या, लेजर शक्ति / तीव्रता/ यह अक्सर लेजर शक्ति और स्कैन गति को समायोजित करने के लिए आसान है और इसलिए यह उन दो मापदंडों के साथ शुरू करने के लिए सिफारिश की है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि क्षेत्रों फ़ाइलों को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर विशेष रूप से माइक्रोस्कोप हम उपयोग के ब्रांड के लिए डिजाइन किया गया था और अन्य माइक्रोस्कोप बनाता है और मॉडल को समायोजित करने के लिए संवर्धित करने की आवश्यकता हो सकती है. प्रोटोकॉल में प्रदान की गई सेटिंग्स के साथ, उपयोगकर्ता के लिए पूर्ण चौड़ाई आधा अधिकतम आयाम की 3 डी गाऊसी की तरह तीव्रता प्रोफाइल के साथ दीर्घवृत्ताभ मार्कर उत्पन्न करने की उम्मीद करनी चाहिए 0.84 की अधिकतम अधिकतम आयामों - 0.11 $m XY में और 3.73 में 0.30 $m $ में. वस्तु का पता लगाने एल्गोरिथ्म मार्कर centroids की पहचान करने के लिए तीव्रता के एक केंद्र के बड़े पैमाने पर उपयोग करता है और सबसे अच्छा प्रदर्शन करेंगे जब मार्कर तीव्रता का एक निश्चित ढाल मौजूद है.

ठीक से hydrogel rinsing और यह प्रकाश से और contaminants से रक्षा सेल संस्कृति के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है. प्रोटोकॉल में उल्लेख के रूप में, पैटर्न घटकों में से कुछ समाधान से बाहर दुर्घटना और hydrogel की सतह पर जमा हो सकता है. यदि इन घटकों को पूरी तरह से सतह से कुल्ला नहीं कर रहे हैं, सेल आसंजन unpredictably प्रभावित हो सकता है. यूवी स्पेक्ट्रम प्रकाश के संपर्क में हैं, यहां तक कि छोटी खुराक में, जबकि hydrogel पैटर्न समाधान में भिगोने है, पैटर्न समाधान बहुलक बनाने के लिए शुरू हो जाएगा और गरीब परिणाम उपज होगी. अंत में, हवाई कण या अनफिल्टर्ड कण विश्लेषण को जटिल बना देंगे, खासकर यदि वे फ्लोरोसेंट हैं। प्रोटोकॉल में सभी चरणों में नमूने में प्रवेश करने से इन contaminants को रोकने के लिए विशेष ध्यान रखा जाना चाहिए.

विश्लेषण कोड विकृत मार्कर के रूप में एक ही पंक्ति या स्तंभ में गैर-deformed मार्करों से मूल सरणी की भविष्यवाणी करके विकृत fiducial markers के संदर्भ स्थानों की भविष्यवाणी करता है। हालांकि यह बहुत विश्लेषण सरल, यह भी क्या कर सकते हैं या विश्लेषण नहीं किया जा सकता है पर कुछ प्रतिबंध लगाता है. कम से कम, प्रत्येक विकृत मार्कर विश्लेषण किया जा रहा है दोनों अपने स्तंभ और मार्करों की पंक्ति है जो विकृत नहीं कर रहे हैं ताकि एक सटीक भविष्यवाणी की जा सकती है के 2 या अधिक सदस्य होना चाहिए. एक पंक्ति माइक्रोस्कोप पर एक एकल पंक्ति स्कैन में मुद्रित डॉट्स के समूह द्वारा परिभाषित किया गया है, और एक स्तंभ एक z-स्टैक फ़ंक्शन का उपयोग कर एक एकल ऊर्ध्वाधर अक्ष पर पैटर्न मार्करों द्वारा परिभाषित किया गया है। यह विश्लेषण को प्रत्येक प्रतिमानित क्षेत्र की लंबाई और गहराई के आधार पर एकल कक्षों या छोटे कक्ष समूहों तक सीमित करता है. यह ध्यान दें कि यह पूरी तरह से एक दूसरे के बगल में दो पैटर्न क्षेत्रों रखकर उपाय नहीं है महत्वपूर्ण है. इसका कारण यह है कि यद्यपि XY घटक लाइन अप कर सकते हैं, यह पूरी तरह से सरणियों के $ स्थितिपरक घटकों को लाइन अप करने के लिए संभव नहीं है, जब तक कि नमूना सतह फोकल विमान और चरण दोनों के साथ पूरी तरह से स्तर है। इस सीमा से बचने के लिए सबसे अच्छा तरीका है पैटर्न है कि विशेष रूप से आसंजन ligand नियुक्ति हुक्म के अतिरिक्त दौर को रोजगार है. यदि ठीक से गठबंधन, सेल आसंजन पैटर्न पर उपयोगकरनेी क्षेत्रों के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है.

विश्लेषण कोड वर्ग सरणियों के लिए अनुकूलित किया गया है, जहां मार्करों लगभग 3.5 डिग्री के अलावा में स्थान रहे हैं $ और 2.1 $m में एक्स और वाई. अंतिम रिक्ति प्रतिमान निष्ठा और सूजन के आधार पर भिन्न होगी, लेकिन इन-पंक्ति रिक्ति संगत है, तो यह प्रदर्शन को बहुत प्रभावित नहीं करना चाहिए (इंटर-पंक्ति रिक्ति परिवर्तनशीलता ट्रैकिंग को प्रभावित नहीं करेगा)। कोड भिन्न निर्धारित सरणियों पर पूरा करने के लिए चला सकते हैं, जबकि सरणी यहाँ सूचीबद्ध पैरामीटर से मेल नहीं खाता, तो इसकी वर्तमान स्थिति खराब परिणाम प्राप्त कर सकते हैं। विश्लेषण कोड के लिए हमारे वर्तमान लक्ष्यचर रिक्ति के साथ-साथ त्रिकोणीय सरणियों के लिए समर्थन शामिल करना है, जो कर्षण पुनर्निर्माण सटीकता में सुधार कर सकते हैं और वर्ग सरणियों की तुलना में क्षेत्रीय पूर्वाग्रह को कम कर सकते हैं।

समाप्त करने के लिए, हम TFM के लिए एक दृष्टिकोण है कि सहज संग्रह और परेशान सेलुलर समारोह के बिना TFM डेटा के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है प्रदान करते हैं. इस दृष्टिकोण के साथ हमारा लक्ष्य के लिए एक और अधिक सुलभ और गैर दखल TFM दृष्टिकोण प्रदान करना है, संकल्प और TFM डेटा की गुणवत्ता समझौता किए बिना. हम उम्मीद करते हैं कि यह पद्धति कोशिकाओं के प्रेक्षित भौतिक गुणों के साथ सेलुलर फीनोटाइप्स के जैव रासायनिक ज्ञान के अभिसरण को बढ़ावा देगी।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

ओ. बांदा को एनएसएफ आईजीईआरटी एसबीई2 फेलोशिप (1144726), डेलावेयर विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किए गए स्टार्टअप फंड और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान/राष्ट्रीय कैंसर संस्थान आईएमएटी कार्यक्रम (आर21सीए214299) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था। JHS स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से वित्त पोषण द्वारा समर्थित है / राष्ट्रीय कैंसर संस्थान IMAT कार्यक्रम (R21CA214299) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर पुरस्कार कार्यक्रम (1751797). माइक्रोस्कोपी का उपयोग NIH-NIGMS (P20 GM103446), एनएसएफ (IIA-1301765) और डेलावेयर के राज्य से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. संरचित रोशनी माइक्रोस्कोप डेलावेयर संघीय अनुसंधान और विकास अनुदान कार्यक्रम (16A00471) के राज्य से धन के साथ अधिग्रहण किया गया था. दो-फोटोन लेजर स्कैनिंग लिथोग्राफी के लिए इस्तेमाल किया LSM880 confocal माइक्रोस्कोप एक साझा इंस्ट्रूमेंटेशन अनुदान (S10 OD016361) के साथ अधिग्रहण किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips in-house in-house Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome Zeiss Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii Coherent Inc. Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil 3M Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880 Zeiss Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB Mathworks R2018a Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter USCutter SC631E Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 Zeiss Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633 in-house in-house Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA in-house in-house Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS in-house in-house RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes CELLTREAT 229638 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL BD 309628 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp UVP Blak-Ray® B-100AP Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.

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References

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