リファレンスフリートラクションフォース顕微鏡プラットフォームの製造と実装

Bioengineering

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Summary

このプロトコルは、ポリ(エチレングリコール)ベースのヒドロゲルに埋め込まれた蛍光線マーカーの3次元配列を製造するための多光子リソグラフィーを実装するための指示を提供し、参照フリー、トラクション力顕微鏡として使用します。プラットフォーム。これらの指示を使用して、3D材料ひずみの測定および細胞牽引の計算は高スループット牽引力の測定を促進するために簡単にされる。

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Banda, O. A., Slater, J. H. Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform. J. Vis. Exp. (152), e60383, doi:10.3791/60383 (2019).

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Abstract

細胞誘発物質の変形を定量化すると、細胞が微小環境の物理的特性をどのように感知し、それに反応するかに関する有用な情報が提供されます。細胞誘発物質株を測定するための多くのアプローチが存在する一方で、ここでは、参照フリーの方法でサブミクロン分解能で歪みを監視するための方法論を提供します。2光子活性化フォトリソグラフィパターニングプロセスを用いて、蛍光線マーカーの埋め込み配列を含む機械的および生体的に微細に微細に誘導可能な合成基板を生成し、3次元を容易に測定する方法を示します(3D)サーフェストラクションに応答する材料変形プロファイル。これらの基質を使用して、セル張力プロファイルは、対象セルの単一の 3D イメージ スタックを使用してマッピングできます。この方法論の目標は、トラクションフォース顕微鏡検査をよりアクセスしやすく、細胞メカノトランスダクションプロセスを研究する研究者、特にこの分野の新規参入者のためのツールを実装しやすくすることです。

Introduction

牽引力顕微鏡(TFM)は、付着細胞および収縮細胞によって生成された受動マーカーの補間変位場を使用して細胞トラクションを近似するプロセスである。TFMを用いて、増殖、分化、および移行などの重要な細胞プロセスに対する細胞外環境における機械的手がかりの影響を調査することができる1、2、3、4 ,5,6,7,8,9,10,11,12.残念ながら、既存のアプローチの多くは実装が難しいか、高度に専門化された分析ツールや計算ツールに精通している必要があり、経験の浅い研究者が TFM を使用することは困難です。分析の難しさを解消しつつ、ハイスループットのデータ取得を提供するTFMプラットフォームを生成する方法論について述べた。

既存のTFMアプローチのうち、材料株の定量化に最も一般的に使用されるのは、ポリアクリルアミド(PAA)またはポリなどの変形可能なヒドロゲルに小さな蛍光マーカー(通常はナノまたはマイクロメートルサイズの蛍光ビーズ)を取り込むことを含む。(エチレングリコール) ダイアクリレート (PEGDA)13,14,15.これらのビーズベースのアプローチは、変位サンプリングを最大化するために、対象のセルの周りにフィデューシャルマーカーを密集させる機能を提供します。残念ながら、ヒドロゲル全体のビーズの分布を直接制御することはできないため、空間的な組織はランダムです。このランダムな配置は、ビーズが互いに近すぎて正確に解決できないなどの問題を引き起こしたり、基板のパッチが低品質のデータを生み出すように広がったりします。細胞が存在しない場合に、フィデューシャルマーカーがどこに存在するかを予測できないため、収集されたセルトラクションデータのセットごとに、緩和された状態で基になるマーカーの追加参照画像もキャプチャする必要があるという制約が生じます。強調されたイメージとストレスのないイメージの差として、強調されたイメージの変位を近似できるように、参照イメージが必要です。リラックスした状態を達成するために、測定される細胞は化学的にリラックスするか、または完全に除去される。このプロセスは、多くの場合、さらなる実験測定値の獲得を妨げ、長期細胞研究を阻害し、スループットを制限する。参照画像はまた、実験中に発生した可能性のあるドリフトに対応するために画像登録技術を必要とし、多くの場合、画像を参照するストレス状態画像の面倒な手動マッチングにつながります。

参照フリーとみなされる他のTFM法は、高解像度リソグラフィ、マイクロコンタクト印刷、またはマイクロモールディング16、17、18のいずれかによって、フィデューシャルマーカーの分布を何らかの形で制御する、19、20.リファレンスフリーTFMは、製造プロセス中にマーカー位置がどのように規定されたかに基づいて、各フィデューシャルマーカーの緩和状態を予測できるという仮定によって達成される。これらの方法は、フィデュースマーカーの変位が、フィデュースマーカージオメトリから推測できるよりも暗黙的な参照と比較して測定される単一の画像キャプチャ内でセルの張力状態を完全にキャプチャすることを可能にします。マーカー配置の一貫性は通常、これらのプラットフォームを使用して達成されますが、一般的に、1)トラクション解像度の低下を含む広く使用されているビーズベースのアプローチに対する独自の欠点に苦しんでいます。2)平面外変位の精度の低下(場合によっては完全に測定できない)。そして3)プラットフォーム基板および材料のカスタマイズ性の低下(例えば、リガンド提示、機械的特性)。

これらの欠点に対処するために、新しいリファレンスフリー TFM プラットフォームを設計しました。このプラットフォームは、マルチフォトン活性化化学を利用して、材料の歪みを測定するためのフィデューシャルマーカーとして機能するヒドロゲル内の特定の3D位置に蛍光素の少量を架け取ります。このように、我々はビーズベースのアプローチと同様に動作するプラットフォームを設計しましたが、フィデューシャルマーカーがグリッド化された配列に編成され、参照フリーの材料ひずみ追跡を可能にするという大きな利点があります。このリファレンスフリーのプロパティは、多くの利点を提供します。まず第一に、細胞トラクション状態の非侵入的なモニタリングを可能にする(すなわち、細胞をリラックスまたは除去する必要性を回避し、変位した受託マーカーの参照位置を獲得する必要を回避する)。これは、破壊的なエンドポイントTFMアプローチでは困難なTFMと組み合わせて他の下流分析方法を組み込むことを意図したので、このシステムを設計する上で私たちの主な目標でした。次に、グリッド配列に基づく暗黙的な参照を使用すると、変位解析のほぼ完全な自動化が可能になります。配列の規則性は、例外的なケースの発生 (つまり、最適でないマーカー間隔や登録の不一致など、予期しないアーティファクトを含むサンプルセル データ) を最小限に抑えることができる予測可能なワークフローを作成します。第3に、参照画像を取得する必要性を持つ場合は、長期間にわたって単一のサンプル上の多くのセルを自由に監視できます。これは従来のビーズベースのアプローチとは対照的で、顕微鏡の自動ステージの動きの忠実さに応じて、位置決めの誤差が蓄積し、細胞張力に基準画像を適切に登録する難易度を高めることができます。画像。全体的に、このプラットフォームは、細胞張力データを収集する上で高いスループットを容易にします。

このプロトコルを使用して、我々は、種子細胞によって生成された平面外のトラクション成分を測定するために、このリファレンスフリーTFMプラットフォームを生成するために実装した2光子、レーザースキャニングリソグラフィ技術を読者に理解したいと考えています。表面に。このプロトコルではカバーされていないのは、一部の単量体成分の合成である。一般に、これらの反応は、前述の21とほぼ同一の「ワンポット」合成反応スキームを含み、これらの製品に代わるものも購入することができる。また、市販のレーザー走査顕微鏡を3D印刷ツールとして使用し、受託マーカー変位の解析を容易にするために、生成したソフトウェアベースのツールを読者に理解することを目指しています。

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Protocol

1. PEGDA塩基ヒドロゲルを光重合

  1. 試薬の収集
    1. リチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)、3.4 kDaポリ(エチレン)グリコールダイアクリレート(PEGDA)、n-ビニルピロリドン(NVP)、アレクサフルオール488標識PEGDA(PEG-488)、アレクサフルオール633標識PEGDA(PEGDA)を収集PEG-RGDS)をそれぞれの冷凍庫から、それぞれを室温にします。
    2. 別々の琥珀色マイクロ遠心管では、LAPの3mg、PEGDAの10mg、PEG-488の5mg、PEG-633の20mg、およびRGDSペプチドの6mgを測定する。
  2. プレポリマー溶液の調製
    1. LAPをリン酸緩衝生理食生の1mL(PBS、pH 7.4)で溶解します。溶解したLAP溶液の200 μLを使用してPEGDAを溶解します。次に、PEGDA溶液の200 μLを使用してPEG-RGDSを溶解させます。
      注:細胞形状の制御が望ましい場合は、ベースヒドロゲルプレポリマー溶液中のPEG-RGDSを省略し、2光子を介して追加され、後でプロトコルでレーザー走査リソグラフィを行います。
    2. 80 μL の PBS を使用して PEG-488 を溶解します。この溶液の2.5 μLをプレポリマー溶液に加えます。
      注:PEG-488は最終的なヒドロゲルにパターニング中にナビゲートするために使用できる蛍光信号を与え、濃度は信号強度を変えるために変更することができる。
    3. 0.2 μmポリテトラフルオロエチレン(PTFE)フィルターを通して完全なプレポリマー溶液を濾過し、溶液中に存在する可能性のある微粒子を除去します。反応物が適切に合成されている場合、フィルタが詰まってはなりません。
  3. ベースヒドロゲルの光重合
    1. パーフルアルコキシーアルカン(PFA)の薄い平らなシートの上にプレポリマー溶液の3 μLを置きます。平らな150 μm厚のポリジメチルシロキサン(PDMS)ストリップを周囲に配置しますが、接触していないプレポリマー溶液の滴。PDMSにアクリル系シラン化カバースリップ21、22、23、24を配置し、カバースリップの下にプレポリマー液滴を中央に置き、プレポリマー液滴を厚さに平坦化する。PDMS スペーサー。
    2. ヒドロゲルが完全に形成されるまで、サンドイッチされたプレポリマー溶液をUV光にさらすこと(370-400nm光の14 mW/cm2で約1分)。
    3. 慎重にPDMSスペーサーからカバースリップを分離し、高性能、両面アクリル接着剤を使用して、オープンボトムペトリ皿に取り付けます。接着剤接触面に圧力をかけて、カバースリップ、接着剤、ペトリ皿の間に完全なシールを作成し、ガラスを割らないことに注意してください。
    4. 生殖不能のPBSを使用してペトリ皿のヒドロゲルをすすいで、生物学的および微粒子の汚染物質を最小にする。
    5. 必要に応じて手順 1.3.1-1.3.4 を繰り返し、必要な数のヒドロゲルを作成します。
    6. LAP溶液の残りの800 μLに8 μLのNVPを追加し、パターンにする準備ができるまで、この溶液と未溶解PEG-633を維持します。
      注:NVPを使用したLAPソリューションは、光に非常に敏感であり、暗闇の中で保持されていない場合は重合します。アルミ箔でチューブを包むことで、貯蔵寿命の向上に役立ちます。

2. パターニング命令の作成

  1. バイナリ イメージのデザイン
    1. フィデューシャルマーカー配列を規定する仮想マスクを作成するには、画像処理または描画ソフトウェアを使用して、アスペクト比が 100:1 (縦 2000 ピクセル x 幅 20 ピクセル) のイメージを作成します。
    2. 画像の長い軸に沿って中央に黒い背景に 100 の等間隔の白いピクセルの行を作成します。
    3. このイメージを *.tif ファイルタイプとして保存します。
      注:セル形状の制御が望ましい場合は、21、25、26、27、28、追加の仮想マスクを作成します。正方形の画像キャンバスを使用し、黒の背景に正の白いフィーチャを作成します。白色の特徴に適したサイズを近似するために(最終的には細胞接着をサポートします)、画像の総サイズはレーザー走査リソグラフィに使用される顕微鏡の視野の大きさと同等であると仮定します。
  2. バイナリイメージをデジタルマスクに変換する
    1. ソフトウェアリポジトリ29で無料で利用可能なLSM-ROIジェネレータ機能をダウンロードしてください。
    2. Matlab を開き、ダウンロードした関数ファイルのディレクトリを見つけます。ディレクトリに入ったら、run_script.m Matlab スクリプトを開き、スクリプトを実行します。
    3. 変換用のバイナリ *.tif ファイルを選択します。次に、リージョンファイルを保存するフォルダを選択します。
    4. 選択した画像の目的の最終サイズをミクロン単位で入力します。入力イメージは、これらのパラメータに一致するようにスケーリングおよび寸法記入されます。画像全体を顕微鏡の視野に収めるには、画像の総サイズが顕微鏡ビューフィールドのサイズ以下でなければなりません。
    5. 単一ピクセル配列を作成する場合は、ROIジェネレータオプションで、[小さな領域/単一ピクセル]の下にある[削除]チェックボックスをオフにして、[正方形]というチェックボックスをオンにし、[使用]をオフにしてください。水平破断線:次に、[OK]をクリックします。
      注: リージョンファイルを作成して単一のセルパターンを作成する場合は、デフォルトのオプションが適切です。
    6. 前に指定したフォルダ内の結果の *.ovl ファイルを検索します。このファイルは、2光子レーザー走査リソグラフィ中にレーザーシャッターを制御する所望の領域をロードするために顕微鏡に持って来る必要があります。

3. フィデューシャルマーカー配列の製造

  1. ベースヒドロゲルを浸す
    1. 低照時間条件下で、LAP/NVP溶液の200 μLをAF633に追加します(どちらもステップ1で用意)。光から保護しながら、十分に混ぜます。
    2. ステップ1からPEGDAヒドロゲルを含むペトリ皿からすべてのPBS溶液を取り除きます。
    3. 溶解したPEG-633をヒドロゲルに加え、塩基ヒドロゲルを完全に包含する液滴を形成する。
      注:ペトリ皿の穴がヒドロゲルよりもわずかに大きい場合は、パターニング溶液を保持するウェルとして役立ちます。それ以外の場合は、パターニング溶液を追加する前にカバースリップが完全に乾燥していることを確認するか、またはパターニング中にヒドロゲルが脱水する原因となるヒドロゲルを使い果たしてしてもよいことを確認してください。
    4. ペトリ皿を顕微鏡ステージのサンプルホルダーにロードし、ペトリ皿の上に蓋を置きます。パターニング溶液を暗闇の中で少なくとも30分間ヒドロゲルに浸漬させる。
      注:顕微鏡は、この浸漬時間中にオンにし、構成することができます。488nmレーザーを使用して、浸漬中にヒドロゲルを画像化することは問題ありません。
  2. 顕微鏡の構成
    1. AlexaFluor 488の画像に適した488nmレーザーラインとフィルタを使用して、PEG-488信号を使用してヒドロゲルを見つけます。これらはPEG-633からの信号で飽和されるとして検出器からのより長い放出波長のブロックコレクション。
    2. 垂直および水平タイルスキャンを使用してXY平面のヒドロゲルの中心を見つけ、ここでステージ位置をゼロにします。
    3. ラインスキャンとZスタック機能を使用してヒドロゲルの表面を見つけます。ここでフォーカス位置をゼロにします。これらのラインスキャンをXYセンターから離れて繰り返し繰り返してヒドロゲルを平準化し、表面位置を特定し、顕微鏡ステージ用のセットネジを調整します。
    4. 顕微鏡ソフトウェアワークスペース内に、フォトパターニング用の別の実験ファイルを作成します。マルチフォトン電力を1.8%(目的の背面開口部で測定した740nmで15.5mW)、スキャン速度を6(0.1 μm/μs)に設定します。ピクセル単位でイメージ フレームのサイズを調整して、ピクセルあたり 0.1 μm のピクセル サイズとアスペクト比 100:1 を実現します。
    5. ステップ 2.2 で作成したリージョン ファイル (*.ovl) をリージョン タブに読み込みます。
    6. Z スタック関数をオンにし、合計深さ 28 μm と Z スライスの合計数 9 の間隔を 3.5 μm に設定します。
    7. 位置関数を使用して、フィデューシャル マーカー配列がフォトパターン化されるヒドロゲル上の特定の位置を設定します。
      注: これらの位置の Z 位置は、各 Z スタックの中心位置を指定します。位置を配置するときは、各位置がパターン化された容積がすべての表面位置でヒドロゲルと重なることを保証することを確認してください。
    8. タイル関数を使用して、各位置に追加の行と列を指定します。パターン化された領域が重複しないように注意してください。理想的には、パターン化された領域が、位置間の空の位置と使用できない場所を削除するのに十分近いことを確認します。
  3. フィデューシャルマーカー配列のフォトパターン化
    1. 浸漬時間が30分マークに近づくにつれて、5分ごとにヒドロゲルの表面の連続したZスタックラインスキャンを行い、ゼロフォーカス位置に対する表面の位置の変化に基づいて腫れをチェックします。
    2. 5 分間隔でサーフェス位置に変化がない場合は、ステップ 3.2.4 で作成したパターニング設定をロードして実行します。
    3. パターニング実験が終了したら、488 nm レーザーを使用して、パターン化中にヒドロゲルの表面が動かないように確認します。
      注:ヒドロゲルの表面がパターニング前と同じ位置にない場合は、いくつかのシナリオが存在します。ヒドロゲルは、パターニングの前に膨潤平衡に達していなかった、ヒドロゲルはパターニング中に乾燥し始めた、または顕微鏡はZドリフトを経験した。このサーフェス変換のソースは、後続のパターニング実行で識別および修正する必要があります。
    4. 顕微鏡からヒドロゲルを取り出し、PEG-633溶液をペトリ皿から吸引します。
      注:ヒドロゲルはまだ光に非常に敏感です。すべてのすすが完了するまで、ハイドロゲルを暗闇の中に保つことは非常に重要です。
    5. 無菌濾過PBSでヒドロゲルを3回すすいで、連続するすすみの間に完全にすすすり落としを入れなさい。このトリプルリンスを1時間毎に15分繰り返します。
    6. ヒドロゲルを一晩PBSですすいで下ろします。
      注: プロトコルはここで一時停止できます。
    7. ヒドロゲルをPBSで三重にすすいでくすします。その後、200プルーフエタノール溶液でヒドロゲルを素早く三重すすいで、続いてPBSで別のトリプルリンスを行います。ヒドロゲルが長期間200証拠エタノールに座ることを許可しないでください。
      注:パターニング溶液の一部の成分は、溶液からクラッシュし、ヒドロゲルの表面に堆積し、633 nm照明下で蛍光の固体層(約1〜5ミクロン厚)として現れる可能性があります。200証拠エタノールですすは、これらの不要な成分を除去する必要があります。
  4. 連続するフォトパターニングを使用して単一のセル パターンを生成する (オプション)
    注: セルの広がり領域と形状の制御が必要な場合は、複数のラウンドのパターニングを実行できます。ベースゲルは、その初期製剤からPEG-RGDSを省略している必要があります。蛍光線マーカーの漂白を避けるために、フィデューシャルマーカーアレイのパターニングを最後に行うことをお勧めします。
    1. ステップ1で調製したLAP/NVP溶液中にPEG-RGDSの20mgを溶解します。
    2. PEG-633 ソリューションの代わりに PEG-RGDS ソリューションを使用して、手順 3.1 ~ 3.3 を繰り返します。単一のセル パターンを定義する適切な領域ファイルを使用します (手順については、手順 2 を参照してください)。
      注: PEG-RGDS パターンの配列を視覚化するには、いくつかのオプションがあります。PEG-RGDSの蛍光変異体は、21、30、またはPEG-RGDSを蛍光PEGでドープすることができる。推奨:または、488 nmレーザーラインは、ベースヒドロゲル内のPEG-488信号を漂白するマルチフォトンパターニングレーザーと並行して実行することができ、RGDSの組み込みと一致する非蛍光領域を作成します。

4. フィデューシャルマーカー配列の可視化

  1. ファブリケートされた配列の Z スタック イメージの取得
    1. ペトリ皿のPBSを細胞培養に使用する細胞培養物に置き換えます。
      注:フェノール赤フリーメディアは、光毒性を防ぐために画像取得中に使用することをお勧めします。
    2. 1時間を浸した後は、構造化照明モジュールと高倍率水浸漬対物レンズを備えた広視野蛍光顕微鏡を使用して、蛍光線マーカーに適したフィルターセットを使用してヒドロゲルを可視化します。
    3. ヒドロゲルの表面からパターン化された領域のヒドロゲルへの深さの少なくとも20 μmを包含する高解像度のZスタック(Zで0.4 μmの間隔)を収集し、Zスタックの上限が物理的に上に少なくとも1〜2の画像を含むことを確認するパターン化された領域(すなわち、蛍光線マーカーがもはや見えなくなり、ノイズのみが存在する)。
      注: このイメージ スタックの取得は、すべてのパターニング パラメータが正しく、ステップ 5.3 のセル データと共に解析できることを確認するために必要です。

5. フォトパターンヒドロゲルを用いたTFMの実行

  1. シードセル
    注:無菌性を維持するには、すべての標準的な組織培養慣行に従ってください。
    1. 細胞播種の前に、細胞培養および維持のためのそれぞれの細胞株の標準プロトコルに従ってください。
    2. (オプション)ヒドロゲルの無菌性が懸念される場合は、抗生物質を含む培温で24時間ヒドロゲルをインキュベートし、続いて通常の培法ですすすする。
    3. 細胞を種子化するために、まずヒドロゲルペトリ皿で使用される培養の最終体積でトリプシン化細胞を再中断する。
    4. ヒドロゲル皿からすべての溶液を取り出し、セルを含んだ媒体に置き換えます。
    5. ヒドロゲルを10分間、細胞を含んだ媒体に邪魔されずに座るようにします。
    6. ペトリ皿をインキュベーターに注意深く移動します。インキュベーター内の細胞を4時間、または細胞が目に見えるまで維持します。
    7. 細胞を含む培った培った培体をセルフリーの培体に置き換えて、付着のない細胞を取り除きます。
  2. 細胞とフィデューシャルマーカーの画像の取得
    1. 顕微鏡上のインキュベーションチャンバーの温度を37°CとCO2~5%に設定し、チャンバーが設定ポイントに到達できるようにします。
    2. ペトリ皿をサンプルホルダーに置き、パターン化された領域を見つけます。
    3. 対象セル(COI)を見つけ、COIの透過または蛍光画像を取得します。
      注: このイメージは解析中にセル境界をセグメント化するために使用されます。
    4. ステップ 4.1.4 のように、COI の下にあるパターン化された配列の Z スタックを取得します。
    5. 細胞の送信または蛍光画像の第2セットを取得します。
      注: 2 番目の画像セットを最初の画像と比較して、光毒性による細胞損傷が観察されるかどうか、および画像取得設定を調整する必要があるかどうかを判断します。暴露後に収縮する細胞は、結果に影響を与える可能性が高い重大な光毒性作用を受けている可能性があります。
    6. COI ごとに手順 5.2.3 - 5.2.5 を繰り返します。

6. 画像の分析

  1. 解析用画像ファイルの準備
    1. ステップ 5.2 で収集したデータを使用して、スタックの下部イメージ (最初のイメージ) が最初のフレームを表す(1) >80% パターンマーカー列が表示され、(2) 最上部の画像 (最後のイメージ) を表す、COI の周囲の領域のトリミングされたイメージ スタックを準備します。スタックには、もはや目に見える受託マーカー(すなわち、ヒドロゲル表面の上)が含まれず、(3)COIを取り巻く非ストレス性の受託マーカーが少なくとも20 μm存在する。
      注: 画像をトリミングすると、解析中の計算時間が大幅に短縮されます。後の手順の分析コードは、イメージをトリミングせずに実行できますが、これはお勧めしません。
    2. 前の手順でスタックの XY トリミングに一致するように、送信された画像または蛍光イメージのトリミングイメージを作成します。
    3. トリミングされた送信画像または蛍光画像 (セルシェイプの代表的な画像) を使用して、手で画像をセグメント化します (セルの境界線をトレース)、または画像処理ツールを使用します。
    4. このイメージを、セルの内部が黒(強度 = 0)、セルを囲む領域が白(強度 ≥ 0)のバイナリ イメージに変換します。このイメージをバイナリ マスクとして保存します。
    5. COI ごとに、イメージ スタック ファイル、送信イメージ ファイル、およびバイナリ マスク ファイルを 1 つのフォルダーに収集します。
  2. イメージに対する分析スクリプトの実行
    1. ソフトウェアリポジトリ29で無料で利用できるTFM分析機能をクローンまたはダウンロードしてください。サブフォルダにはかなりの数の依存関係があるので、リポジトリ全体をダウンロードする必要があります。
    2. Matlab を開き、コード リポジトリのローカル クローンのすべてのサブフォルダをパスに追加します。
    3. Matlab ワークスペース内のディレクトリを、手順 6.1 で準備されたイメージが格納されているフォルダの場所に設定します。
    4. tracking.mスクリプトを開いて実行します。プロンプトが表示された場合は、指示に従って適切なイメージを読み込み、初期処理手順を実行し、オブジェクト追跡アルゴリズムをエラーチェックします。
    5. スクリプトが完了したら、dispShear.m関数を開いて実行します。このスクリプトは、ユーザーからの入力を必要としません。
    6. dispShear.mスクリプトが完了したら、disp3D.mを開いて実行します。画像を開くメッセージが表示された場合は、指示に従います。
      注: 実行時に、スクリプトはパターン化された配列のイメージに線を引く必要があります。この線は、パターニング中に走査レーザの主運動軸を表し、パターン化されたフィデューシャルマーカーの行と並ぶ必要があります。このプロセスは、どの方向(すなわち、fiducial マーカーの行または列)が最も整列した行を生み出す可能性が高いかをコードに指示します。
    7. dispShear.mコードが完了したら、dispSurface.m コードの後にinterpFinal3D_2.mコードを実行します。これらのスクリプトは、ユーザーからの入力を必要としません。
      注: interpFinal3D_2.mスクリプトは、前述の31で説明した外部で取得されたソフトウェアを使用して、変位データをサーフェス トラクションに変換します。これらの外部関数を適用するために、interpFinal3D_2.mは変位データを均一なグリッドに補間し、変換関数の入力として機能します。別の変換方法を使用している場合、またはトラクションが不要な場合は、この手順をスキップできます。
    8. すべてのスクリプトを実行したら、すべてのデータと出力が初期ディレクトリに見つかることを確認します。
    9. COI ごとに手順 6.2.3 ~ 6.2.8 を繰り返します。
      注: コード リポジトリ内には、ディレクトリのリスト上の各スクリプトの自動バッチ実行を許可するスクリプトを含むフォルダーがあります。自動化スクリプト自体 (コード内のコメント) を参照して、その使用方法について説明します。

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Representative Results

プロトコル全体を通じて、パターニング手順の品質を評価するためのフィードバックを提供するチェックポイントがいくつかあります。各チェックポイントの進捗状況を評価する方法に関する洞察を提供するために、実際の実験の代表的な結果を提供します。結果は、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)のTFM分析のために調製されたフォトパターンヒドロゲルに対して行われたこのプロトコルの適用を強調する。結果には、生の画像データと、各重要なステップでの処理されたデータ出力が含まれます。

最初のチェックポイントはステップ4で起こり、フィデューシャルマーカー配列がヒドロゲル中にフォトパターン化された後に行われる。イメージ スタックを収集する場合、結果として得られるイメージは、イメージ スタック内の Z 位置の関数として強度で振動するパターン化されたフィーチャ (図 1A-C)の定期的な配列を表示する必要があります。パターン化されたサーフェスが完全に水平でない場合、各画像スライスの異なる領域は、これらの振動に関して互いに相外に見えるかもしれません。これは予想され、極端な場合を除いて分析に影響を与えるべきではありません。

残りのチェックポイントは、特定の COI の分析中に実行される各スクリプトからの出力を使用します。tracking.mスクリプトは、前処理品質を評価するために蛍光線マーカーの Z 投影 (図 2A) を含むいくつかの診断画像を提供します。図2B)は、物体検出品質を評価し、z方向の列に連結された検出されたマーカーの高等部を表すトラックのプロット(図2C)を用いて、物体追跡品質を評価する。

基準座標と変位を計算するために必要な正確な 3D 重心検出のために、蛍光線マーカーは、中心から放射状に減少する強度を持つ楕円体形状に似ている必要があります。disp3D.mスクリプトは、特定の画像スタック内の検出されたフィーチャの各列の Z 位置の関数として強度のプロットを提供します (図 3A,B) は、フィデューシャル マーカー強度プロファイルの品質を評価します。disp3D.mdispShear.mの両方が共に、デカルト座標寸法 (図 4A-C)の測定された変位ノイズのヒストグラムと、変位の補間ヒート マップ (図 4)を提供します(図 4)E,F)。最後に、interpFinal3D_2.mは、外部委託コード (図 5)31を使用して計算されたサーフェス トラクションのヒート マップを提供します。

Figure 1
図 1: 一般的なパターニング結果。
(A)ヒドロゲル表面から12.4μmまでのZ次元を通る強度変動を示すフィデューシャルマーカーの蛍光画像。(B)処理された体積レンダリングは、フィデューシャルマーカーの楕円体形状を明らかにする。(C)ボリュームレンダリングのセクション化されたプロファイルビューには、生のマーカー データが表示されます。A,C: スケールバー =5 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:パーティクルトラッキングアルゴリズムからの診断出力。
オブジェクト検出および追跡ソフトウェアは、蛍光線マーカーのZ加重投影(A)および(B)色分けされたZ位置を有するマーカー位置の散布図を含むいくつかの診断画像を出力する。(C)追加の出力では、(A) のように Z加重投影が表示され、各フレームからの 2D 検出が列にリンクされます。(D)(B)を詳しく見ると、Z 位置でコード化された個々の 2D 検出カラーがより明確に表示されます。A: スケール バー =20 μm。C: スケール バー =5 μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 3D 変位アルゴリズムからの診断出力。
(A, B)フレーム位置の関数としてのマーカー強度の線プロットは、垂直方向にグループ化されたマーカー間の振動を表示します。これらの線プロットは、イメージング平面とのグリッドアライメントの定性的評価と、パターン化されたフィデューシャルマーカーの全体的な品質を可能にします。(A)マーカー強度の振動の重なりは、パターン化されたフィデューシャルマーカーアレイとのイメージング平面の許容可能な位置合わせを確認する。Z スタックの上部に空のフレームを含めると、処理ソフトウェアのノイズしきい値を自動で計算できます。(B)振動間の不十分な重なりは、パターン化されたグリッドとイメージング平面の位置合わせが不十分であることを示すことがよくありますが、グリッド自体がずれ、結果が悪い可能性があることを示唆している可能性があります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 2D および 3D 変位アルゴリズムからの診断出力。
(A-C)「非変形」と見なされる領域における測定された変位のヒストグラム(すなわち、変位ノイズ)は、マーカー参照位置を近似するための計算された基準線の精度の定量的評価を提供します。変位フィールドは、(D)平面内(せん断)と(E)面外(標準)測定された変位の両方を視覚的に表現します。D: スケールバー =20 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: トラクション変換アルゴリズムからの診断出力。
(A-C)トラクション応力は、補間された変位フィールドに基づいて計算され、(B)総牽引、(C)せん断牽引、および(D)法線トラクションを決定します。A: スケールバー =20 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルの目的は、TFM データの生成と分析に関連する困難の多くを軽減するワークフローを提供することです。一度調製されると、フォトパターン化されたヒドロゲルは使いやすく、標準的な組織培養慣行と蛍光顕微鏡の知識のみを必要とします。リファレンスフリーのアスペクトにより、セルを含むヒドロゲルの気楽なナビゲーションが可能になり、参照画像と変形画像間の画像登録などの面倒な画像処理手順を排除します。結果として得られる分析はほぼ完全に自動化され、個々のCOIからのデータを最初から最後まで10分以内に分析できます。

このプロトコルの主な課題は、フォトパターン化ヒドロゲルの製造に起因します。プロトコルで使用される試薬のほとんどは社内で合成されるため、合成ヒドロゲル材料を使用した経験の少ないユーザーは、このプロトコルを試みるのをいくらか妨げる可能性があります。とは言うに、このプロトコルで使用されるPEGylatedコンポーネントはすべて、ワンポット反応を使用してほぼ同一のプロトコルから合成され、多くのコンポーネントは商用ベンダーから購入することができます。

このプロトコルはまた、レーザー走査顕微鏡の使用に関するいくつかの習得を必要とします。レーザーの強度、対物レンズ、およびその他の顕微鏡コンポーネントは、同じモデルの顕微鏡間でも変化するため、レーザー走査パラメータは、異なる顕微鏡ごとに最適化する必要があります。フォトパターニングに最適な顕微鏡設定を決定する簡単なアプローチは、さまざまな設定でスキャンのパネルを実行することです。サンプルが受け取るレーザーの総露出に影響を与える設定は、パターンマーカーのサイズと品質に影響します。これには、スキャン速度、ピクセルサイズ、平均数、レーザーパワー/強度/流暢さ、倍率、および数値絞り32、33が含まれます。レーザーパワーとスキャン速度を調整するのが最も簡単な場合が多いため、これらの2つのパラメータから始めるのが推奨されます。また、地域ファイルを生成するために使用されるソフトウェアは、私たちが使用する顕微鏡のブランドのために特別に設計されており、他の顕微鏡の製造やモデルを収容するために拡張する必要がある場合があることに留意すべきです。プロトコルで提供される設定により、XY では 0.84 ± 0.11 μm、Z では 3.73 ± 0.30 μm の全幅半最大寸法の 3D ガウス状強度プロファイルを持つ楕円体マーカーを生成する必要があります。オブジェクト検出アルゴリズムは、中心強度を使用してマーカーの重心を識別し、マーカーが強度の明確な勾配を示す場合に最適に実行されます。

ヒドロゲルを適切にすすいで、光や汚染物質から保護することは、細胞培養にとって非常に重要です。プロトコルで述べたように、いくつかのパターニング成分は、ヒドロゲルの表面に溶液および堆積物からクラッシュする可能性があります。これらの成分が表面から完全にすすいでいない場合、細胞の接着が予測不能に影響を受ける可能性があります。紫外線光にさらされると、少量でも、ヒドロゲルがパターニング溶液に浸漬している間に、パターニング溶液が重合し始め、悪い結果をもたらす。最後に、空気中の微粒子や濾過されていない微粒子は、特に蛍光である場合、分析を複雑にします。これらの汚染物質がプロトコルのすべてのステップでサンプルに入るのを防ぐために特別な注意を払う必要があります。

解析コードは、変形マーカーと同じ行または列内の非変形マーカーから元の配列を予測することによって、変形されたフィデューシャルマーカーの参照位置を予測します。これにより解析が大幅に簡素化されますが、分析できるものや分析できないものにはいくつかの制限が課されます。少なくとも、分析される各変形マーカーには、正確な予測を行うことができるように、変形されていないマーカーの列と行の両方の 2 つ以上のメンバが必要です。行は、顕微鏡上の単一のラインスキャンで印刷されたドットのグループによって定義され、列はZスタック関数を使用して単一の垂直軸上にパターン化されたマーカーによって定義されます。これにより、各パターン領域の長さと深さに基づいて、単一セルまたは小さなセル クラスターに解析が制限されます。これは、2 つのパターン化された領域を互いに完全に隣り合って配置することで改善されないことに注意してください。これは、XY コンポーネントが整列する場合がありますが、サンプルサーフェスが焦点面とステージの両方で完全に水平でない限り、アレイの Z 位置コンポーネントを完全に整列させることは不可能であるためです。この制限を回避する最良の方法は、特に接着リガンドの配置を指示するパターニングの追加ラウンドを採用することです。適切に整列すれば、細胞の接着はパターン上の使用可能な領域に制限することができます。

解析コードは、マーカーがZで約3.5μm、XとYで2.1μm離れた正方形配列に最適化されています。最終的な間隔は、パターニングの忠実度と腫れによって異なりますが、行内の間隔が一貫している場合はパフォーマンスに大きな影響を与えるべきではありません(行間の間隔の可変性はトラッキングに影響しません)。コードは異なる規定の配列で完了するように実行される場合がありますが、配列がここに示すパラメータと一致しない場合、現在の状態では結果が悪い可能性があります。分析コードの現在の目標は、可変間隔と三角形配列のサポートを含めることであり、トラクション再構成の精度を向上させ、平方配列と比較して地域的バイアスを低減する可能性があります。

結論として、我々は、細胞機能を乱すことなく、TFMデータの顔の収集と分析を可能にするTFMへのアプローチを提供する。このアプローチの目標は、TFM データの解像度と品質を損なうことなく、よりアクセスしやすく、非侵入的な TFM アプローチを提供することです。この方法論は、細胞の観察された物理的特性と細胞の実化学的知識の収束を促進することを期待する。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

バンダは、NSF IGERT SBE2フェローシップ(1144726)、デラウェア大学が提供するスタートアップファンド、国立衛生・国立がん研究所IMATプログラム(R21CA214299)からの資金提供を受けました。JHSは、国立衛生研究所/国立がん研究所IMATプログラム(R21CA214299)と国立科学財団キャリア賞プログラム(1751797)からの資金援助を受けています。顕微鏡検査アクセスは、NIH-NIGMS(P20 GM103446)、NSF(IIA-1301765)およびデラウェア州からの助成金によってサポートされました。構造化照明顕微鏡は、デラウェア州連邦研究開発助成プログラム(16A00471)からの資金で取得されました。2光子レーザー走査リソグラフィに使用されるLSM880共焦点顕微鏡は、共有計装交付金(S10 OD016361)で取得されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips in-house in-house Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome Zeiss Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii Coherent Inc. Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil 3M Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880 Zeiss Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB Mathworks R2018a Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter USCutter SC631E Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 Zeiss Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633 in-house in-house Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA in-house in-house Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS in-house in-house RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes CELLTREAT 229638 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL BD 309628 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp UVP Blak-Ray® B-100AP Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.

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References

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