Tillverkning och implementering av en referens fri dragkrafts mikroskopi plattform

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta protokoll innehåller instruktioner för att genomföra multiphoton litografi att tillverka tredimensionella matriser av fluorescerande relaterat markörer inbäddade i poly (etylenglykol)-baserade hydrogeler för användning som referens-fri, dragkraft mikroskopi Plattformar. Med hjälp av dessa instruktioner, är mätning av 3D-materialstam och beräkning av cellulära Tractions förenklad för att främja hög genomströmning dragkraft mätningar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Banda, O. A., Slater, J. H. Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform. J. Vis. Exp. (152), e60383, doi:10.3791/60383 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kvantifiering av cellinducerad material deformation ger användbar information om hur celler känner och reagerar på de fysikaliska egenskaperna hos deras mikromiljö. Medan många metoder finns för att mäta cell-inducerad material stam, här erbjuder vi en metod för övervakning stam med sub-micron upplösning på ett referensfritt sätt. Med hjälp av en två-Photon aktiverat photolithographic mönstra process, visar vi hur man genererar mekaniskt och biologiskt aktivt avstämbara syntetiska substrat som innehåller inbäddade arrayer av fluorescerande relaterat markörer för att enkelt mäta tredimensionell ( 3D) material deformationsprofiler som svar på yttractions. Med hjälp av dessa substrat kan cell spännings profiler mappas med en enda 3D-bildstapel i en cell av intresse. Vårt mål med denna metod är att göra dragkraft mikroskopi en mer tillgänglig och lättare att implementera verktyg för forskare som studerar cellulära mechanotransduction processer, särskilt nykomlingar på området.

Introduction

Traction Force mikroskopi (TFM) är processen att approximera cellulära Tractions med interpolerade förskjutnings fält av relaterat markörer som genereras av en anhängare och kontraktila cell. Med hjälp av TFM, påverkan av mekaniska signaler i den extracellulära miljön på viktiga cellulära processer såsom spridning, differentiering, och migration kan undersökas1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Tyvärr, många befintliga metoder kan vara svårt att genomföra eller kräva förtrogenhet med mycket specialiserade analytiska och Computational verktyg gör TFM svårt för oerfarna forskare att använda. Vi beskriver en metod för att skapa en TFM-plattform som eliminerar några av svårigheterna i analysen samtidigt som datainsamling med högt dataflöde.

Av de befintliga TFM-metoderna innebär den mest använda för kvantifiering av materialets belastning att små fluorescerande markörer (typiskt nano-eller mikrometerfluorescerande pärlor) införlivas i en deformerbar hydrogel, såsom polyakrylamid (PAA) eller Poly (etylenglykol) diakrylat (pegda)13,14,15. Dessa pärla-baserade metoder ger möjlighet att tätt kluster relaterat markörer runt en cell av intresse för att maximera förskjutning provtagning. Tyvärr kan fördelningen av pärlorna i hela hydrogel inte direkt kontrolleras så att den rumsliga organisationen är slumpmässig. Denna slumpmässiga placering leder till problem som pärlor som är för nära varandra för att korrekt lösa, eller så sprids att fläckar av substratet ger låg kvalitet data. Oförmågan att förutsäga var relaterat markörer ligger i avsaknad av celler skapar också en begränsning som, för varje insamlade uppsättning av cell Traction data, en ytterligare referensbild av de underliggande markörer i ett avslappnat tillstånd måste också fångas. Referensbilden krävs så att förskjutningen i den stressade bilden kan approximeras som skillnaden mellan de stressade och ostressade bilderna. För att uppnå ett avslappnat tillstånd är de celler som mäts antingen kemiskt avslappnade eller helt borttagna. Denna process förhindrar ofta förvärv av ytterligare experimentella mätningar, hämmar långsiktiga cellstudier, och begränsar genomströmningen. En referensbild kräver också bild registrering tekniker för att rymma för drift som kan ha inträffat under experimenterande, ofta leder till besvärlig manuell matchning av stresstillstånd bilder till referensbilder.

Andra TFM metoder som anses vara referens fria, genomföra någon form av kontroll över fördelningen av relaterat markörer, antingen genom högupplöst litografi, microcontact utskrift, eller micromolding16,17,18 ,19,20. Referens fria TFM uppnås genom antagandet att den avslappnade tillstånd för varje relaterat markör kan förutses baserat på hur markör positioner ordinerades under tillverkningsprocessen. Dessa metoder möjliggör fullständig avskiljning av en cells spänningstillstånd inom en enda bildfångst där relaterat markör förskjutningar mäts i jämförelse med en antydd referens än vad som kan härledas från den relaterat markör geometri. Medan konsistens i markör placering vanligtvis uppnås med hjälp av dessa plattformar, de i allmänhet lider av sina egna brister i förhållande till de allmänt använda pärla-baserade metoder inklusive: 1) minskad dragkraft upplösning; 2) minskad noggrannhet av out-of-Plane förskjutningar (i vissa fall en fullständig oförmåga att mäta); och 3) minskad anpassningsbarhet av plattforms substrat och material (t. ex. ligand-presentation, mekaniska egenskaper).

För att åtgärda dessa brister har vi utformat en ny referens fri TFM-plattform. Plattformen använder multiphoton aktiverad kemi för att korslänka en liten volym av en fluorophore till specifika 3D-platser inom hydrogel som fungerar som relaterat markörer för att mäta material stam. På detta sätt har vi utformat en plattform som fungerar på liknande sätt som pärlbaserade metoder men med den betydande fördelen att relaterat markörer är organiserade i inrutade matriser möjliggör referens-fri material stam spårning. Denna referens fria egenskap ger många fördelar. Först och främst gör det möjligt för icke-störande övervakning av cellulära Traction stater (dvs kringgår behovet av att slappna av eller ta bort celler för att förvärva referens positioner förskjutna relaterat markörer). Detta var vårt främsta mål i utformningen av detta system, som vi avsåg att införliva andra nedströms analytiska metoder i tandem med TFM, vilket kan vara svårt med destruktiva slutpunkt TFM metoder. För det andra, med hjälp av en implicit referens baserad på inrutade matriser möjliggör nästan komplett automatisering av förskjutnings analys. Regelbundenhet av matriser skapar ett förutsägbart arbetsflöde där förekomsten av exceptionella fall (dvs. exempel celldata som innehåller oförutsedda artefakter som suboptimala markör avstånd eller registrering missmatchningar) kan upprätthållas på ett minimum. För det tredje, att avstå från behovet av att förvärva en referensbild ger frihet att övervaka många celler på ett enda prov under längre tidsperioder. Detta kontrasterar mot traditionella pärlbaserade metoder, där, beroende på trohet av mikroskopet automatiserade steg rörelser, kan fel i positionering ackumuleras och öka svårigheten att korrekt registrera referensbilder till cellspänningar Bilder. Sammantaget underlättar denna plattform högre genomströmning för att samla in cellulära spännings data.

Med detta protokoll, vi hoppas att bekanta läsarna med två-Photon, laserskanning litografi teknik som vi genomfört för att generera denna referens-fri TFM plattform för att mäta in-plane och out-of-Plane dragkraft komponenter som genereras av celler seedade på ytan. Inte omfattas av detta protokoll är syntesen av några av de monomeriska komponenterna. I allmänhet, dessa reaktioner inkluderar nästan identiska "One-Pot" syntes reaktionsscheman beskrivs tidigare21, och alternativ till dessa produkter kan också köpas. Vi strävar också efter att bekanta läsarna med mjukvarubaserade verktyg vi genererade för att främja användningen av kommersiellt tillgängliga laser-scanning Mikroskop som 3D-utskriftsverktyg och för att underlätta analys av relaterat markör förskjutningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. photopolymerizing en PEGDA bas hydrogel

  1. Samla reagenser
    1. Samla in litiumfenyl-2, 4, 6-trimetylbensoylfoshinat (varv), 3,4 kDa poly (etylen) glykoldiakrylat (PEGDA), n-vinyl pyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 märkt PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 märkta PEGDA (PEG-633) och pegylerat RGDS peptid ( PEG-RGDS) från sina respektive frysar och ta varje till rumstemperatur.
    2. I separata Amber microcentrifug rör, åtgärd 3 mg varv, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 mg PEG-633, och 6 mg RGDS peptid.
  2. Beredning av Prepolymerlösningen
    1. Lös upp varvet i 1 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4). Använd 200 μL av den upplösta varv lösningen för att lösa upp PEGDA. Använd sedan 200 μL av PEGDA-lösningen för att lösa upp PEG-RGDS.
      Anmärkning: om kontroll av cellform önskas, utelämna upplösning PEG-RGDS i basen hydrogel pre-polymer lösning, eftersom det kommer att läggas till via två-Photon, laserscanning litografi senare i protokollet.
    2. Använd 80 μL PBS för att lösa upp PEG-488. Tillsätt 2,5 μL av denna lösning till prepolymerlösningen.
      Anmärkning: PEG-488 kommer att ge den slutliga hydrogel en fluorescerande signal som kan användas för att navigera under mönkning och koncentrationen kan ändras för att ändra signalintensiteten.
    3. Filtrera den kompletta prepolymerlösningen genom ett PTFE-filter (0,2 μm polytetrafluoreten) för att avlägsna partiklar som kan förekomma i lösningen. Om reaktanter är korrekt syntetiserade, filtret bör inte bli igensatta.
  3. Photopolymerizing basen hydrogel
    1. Placera 3 μL av prepolymerlösningen på ett tunt Plant ark perfluoroalkoxy alkaner (PFA). Placera platta 150 μm tjocka Polydimetylsiloxan (PDMS) remsor som omger, men inte i kontakt med, den droppe av pre-polymer lösning. Placera en akrylat-silaniserad täckslip21,22,23,24 på PDMS-med pre-polymer dropp centrerad under täckslip-att platta till pre-polymer dropp till tjockleken på PDMS distaner.
    2. Exponera den inklämta pre-polymerlösningen till UV-ljus tills en hydrogel är fullt formad (ca 1 min vid 14 mW/cm2 av 370-400nm ljus).
    3. Noggrant separera täckglas från PDMS distansar och bifoga till en öppen botten petriskål med hög prestanda, dubbelsidig akryl lim. Applicera tryck på den adhesiva kontaktytan för att skapa en komplett tätning mellan täckglas, lim och petriskål-med försiktighet att inte knäcka glaset.
    4. Skölj hydrogel i petriskål med steril-filtrerad PBS för att minimera biologiska och partiklar föroreningar.
    5. Upprepa steg 1.3.1-1.3.4 som behövs för att skapa önskat antal hydrogels.
    6. Tillsätt 8 μL NVP till den återstående 800 μL av varv lösningen och Behåll denna lösning samt oupplösta PEG-633 tills de är redo att mönstra.
      Obs: varv lösningen med NVP är mycket känslig för ljus och kommer att polymerisera om den inte hålls i mörker. Inslagning röret i aluminiumfolie kan bidra till att förbättra hållbarhetstiden.

2. skapa mönster instruktioner

  1. Designa en binär bild
    1. För att skapa en virtuell mask för förskrivning av relaterat markör matriser, Använd bildbehandlings-eller ritprogram för att skapa en bild med proportionerna 100:1 (t. ex. 2000 pixlar långa x 20 pixlar breda).
    2. Skapa en rad med 100 jämnt fördelade vita pixlar på en svart bakgrund centrerad längs den långa axeln av bilden.
    3. Spara den här bilden som en *. tif-filtyp.
      Anmärkningar: om kontroll av cell form önskas21,25,26,27,28, skapa en ytterligare virtuell mask. Använd en kvadratisk formad bild arbetsyta och skapa positiva vita funktioner på en svart bakgrund. För approximera en lämplig storlek för de vita funktionerna (som så småningom kommer att stödja celladhesion) anta att den totala storleken på bilden motsvarar storleken på mikroskopet Viewfield används för laserskanning litografi.
  2. Konvertera en binär bild till en digital mask
    1. Ladda ner LSM-ROI-Generator funktioner som finns tillgängliga gratis på programvaru lagret29.
    2. Öppna MATLAB och hitta katalogen på de nedladdade funktionsfilerna. En gång i katalogen, öppna run_script. m MATLAB skriptet och kör skriptet.
    3. Välj den binära *. TIF-filen för konvertering. Välj sedan en mapp för att spara regionfiler.
    4. Mata in önskad slutlig storlek, i mikrometer, av den valda bilden. Ingångs bilden kommer att skalas och dimensioneras för att matcha dessa parametrar. För att hela bilden ska få plats i mikroskopet i Mikroskop, den totala storleken på bilden måste vara mindre än eller lika med storleken på mikroskopet Viewfield.
    5. Om du skapar en enda pixel array, i Roi-Generator alternativ, se till att avmarkera ta bort kryssrutan under små regioner/enstaka pixlar, för att kontrollera kryssrutan märkta rutor, och avmarkera Använd under Vågräta brytlinjer. Klicka sedan på OK.
      ANMÄRKNINGAR: om du skapar en regions-fil för att skapa enstaka cell mönster är standardalternativen lämpliga.
    6. Hitta den resulterande *. OVL-filen i den tidigare angivna mappen. Denna fil måste föras till Mikroskop för att ladda önskade regioner som styr laser slutare under två-Photon laserskanning litografi.

3. fabricera relaterat markör arrayer

  1. Blötläggning basen hydrogel
    1. Vid svagt ljus, tillsätt 200 μL av LAP/NVP-lösningen till AF633 (båda beredda i steg 1). Blanda noga medan du skyddar mot ljus.
    2. Ta bort all PBS-lösning från petriskål som innehåller en PEGDA-hydrogel från steg 1.
    3. Tillsätt den upplösta PEG-633 till Hydrogelen för att bilda en droppe som helt omfattar bashydrogel.
      Obs: om hålet i petriskål är bara något större än hydrogel, kan det fungera som en brunn för att hålla mönster lösning. Annars, se till att täckglås är helt torr innan du lägger mönster lösning eller det kan köra bort hydrogel orsakar hydrogel att torka under mönstrande.
    4. Ladda petriskål på provhållaren på mikroskopet scenen och placera locket på petriskål. Låt mönjande lösningen suga in Hydrogelen i minst 30 min i mörkret.
      Obs: mikroskopet kan slås på och konfigureras under denna blöt tid. Använda 488 nm Laser till bild hydrogel under blötläggning är bra.
  2. Konfigurera mikroskopet
    1. Med hjälp av en 488 nm laserlinje och filter som är lämpliga för bild AlexaFluor 488, lokalisera hydrogel med PEG-488 signal. Block insamling av längre utsläpp våglängder från detektorn eftersom dessa kommer att vara mättad med signal från PEG-633.
    2. Hitta hydrogelens centrum i XY-planet med hjälp av vertikala och horisontella kakel skanningar och noll scenen position här.
    3. Hitta ytan på hydrogel med hjälp av linje skanning och z-stacken funktion. Noll fokuspositionen här. Jämna hydrogel genom att upprepa dessa linje skanningar bort från XY centrum för att identifiera ytan position och justera de inställda skruvarna för mikroskopet skede.
    4. Skapa en separat experiment fil för photopatterning i arbetsytan Mikroskop programvara. Ställ in multiphoton Power till 1,8% (15,5 mW vid 740 nm mätt vid den bakre bländaren av målet), och skanningshastigheten till 6 (0,1 μm/μs). Justera bildramens storlek i pixlar för att uppnå en pixelstorlek på 0,1 μm per pixel och ett bildförhållande på 100:1.
    5. Läs in den regions-fil (*. ovl) som skapades i steg 2,2 på fliken regioner. Använd ett makro för att ange alla regioner till anskaffning.
    6. Slå på z-stack-funktionen och Ställ in avståndet till 3,5 μm för ett totalt djup på 28 μm och totalt antal z-skivor med 9.
    7. Använd positionsfunktionen för att ställa in specifika platser på Hydrogelen där de fiduella markör matriserna kommer att vara fotomönstrade.
      Obs: z-placeringen av dessa positioner kommer att diktera mittpositionen för varje z-stack; När du placerar positioner, se till att varje position kommer att garantera att den mönstrade volymen kommer att överlappa hydrogel på alla ytan platser.
    8. Använd funktionen tile för att ange ytterligare rader och kolumner på varje position. Var noga med att undvika överlappande mönstrade områden. Helst, se till att mönstrade områden är tillräckligt nära för att ta bort tomma och oanvändbara platser mellan positioner.
  3. Photopatterning den relaterat markör arrayer
    1. Som blöt tid närmar sig 30 min mark, ta successiva z-stack linje skanningar av ytan av hydrogel var 5 min för att kontrollera om svullnad baserat på förändringar i placeringen av ytan i förhållande till den nollställning fokus position.
    2. Om ingen förändring i ytan position inträffar under en 5 min intervall, ladda och kör de mönster inställningar som skapats i steg 3.2.4
    3. När mönster försöket har körts färdigt, Använd 488 nm-lasern för att kontrollera att ytan på Hydrogelen inte rör sig under möntring.
      Anmärkning: om hydrogelens yta inte är i samma position som före mönningen finns det flera scenarier. Hydrogel hade inte nått svullnad jämvikt före mönkning, började hydrogel att torka ut under mönkning, eller mikroskopet upplevde z-drift. Källan till denna yta översättning bör identifieras och korrigeras i efterföljande mönster körningar.
    4. Ta bort hydrogel från mikroskopet och aspirera PEG-633 lösning från petriskål.
      Observera: Hydrogelen är fortfarande extremt känslig för ljus. Att hålla Hydrogelen i mörkret är mycket viktigt tills all sköljning är klar.
    5. Skölj hydrogel 3 gånger med steril-filtrerad PBS, att se till att helt ta bort sköljningen mellan varje efterföljande sköljning. Upprepa denna tredubbla sköljning var 15 min för 1 h.
    6. Låt hydrogel att skölja i PBS över natten.
      Obs: protokollet kan pausas här.
    7. Trippelskölj hydrogel med PBS. Sedan snabbt Triple skölj hydrogel med en 200-proof etanollösning, följt av en annan trippel skölj med PBS. Låt inte Hydrogelen sitta i 200-proof etanol under längre tidsperioder.
      Anmärkning: vissa komponenter i mönster lösningen kan krascha ut ur lösningen och sätta in på hydrogelens yta och framstå som ett solitt skikt av fluorescens (~ 1-5 mikrometer tjock) under 633 nm belysning. Sköljning med 200 proof etanol bör ta bort dessa oönskade komponenter.
  4. Använda successiva photopatterning att generera enstaka cell mönster (tillval)
    Anmärkning: om kontroll över cell spridning område och form önskas, kan flera omgångar av mönkning utföras. Bas gelen måste ha PEG-RGDS som utelämnas från dess initiala formulering. Det rekommenderas att mönkning av den relaterat markör arrayer utföras senast för att undvika blekning av fluorescerande relaterat markörer.
    1. Lös 20 mg PEG-RGDS i den LAP/NVP-lösning som förberetts i steg 1.
    2. Upprepa steg 3,1 – 3,3 med PEG-RGDS-lösningen istället för PEG-633-lösningen. Använd lämplig regions-fil som definierar enstaka cell mönster (se steg 2 för instruktioner).
      Anmärkning: för att visualisera arrayer av PEG-RGDS mönster, det finns flera alternativ. En fluorescerande variant av PEG-Rgds kan användas21,30 eller PEG-Rgds kan dopade med fluorescerande pinne. Rekommenderas: Alternativt, den 488 nm laserlinje kan köras i tandem med multiphoton mönster laser för att bleka PEG-488 signal i basen hydrogel, skapa icke-fluorescerande regioner som sammanfaller med RGDS inkorporering.

4. visualisera relaterat markör arrayer

  1. Förvärva en z-stack bild av den fabricerade array
    1. Ersätt PBS i petriskål med cellmedia som används för cellkultur.
      Obs: Phenol Red Free Media rekommenderas för användning under bild förvärv för att förhindra fototoxicitet.
    2. Efter 1 h i blöt tid, Använd en widefield fluorescens Mikroskop utrustad med en strukturerad belysning modul och en hög förstoring vatten fördjupning objektiv för att visualisera hydrogeler med en filteruppsättning lämplig för fluorescerande relaterat markörer.
    3. Samla en högupplöst z-stack av bilder (fördelade 0,4 μm i Z) som omfattar minst 20 μm djup från ytan av hydrogel i hydrogel i det mönstrade området, se till den övre gränsen för z-stacken innehåller minst 1-2 bilder fysiskt över mönstrad yta (dvs. där fluorescerande relaterat markörer inte längre är synliga och endast brus förekommer).
      Obs: förvärvet av denna bildstapel är nödvändig för att kontrollera att alla mönster parametrar är korrekta och kan analyseras tillsammans med celldata i steg 5,3.

5. utföra TFM med fotomönstrade hydrogeler

  1. Seedning celler
    Obs: för att bibehålla sterilitet, följ alla standardmetoder för vävnadsodling.
    1. Före cell sådd, följ standardprotokoll för respektive cellinjer för cellodling och underhåll.
    2. Valfritt Om hydrogelens sterilitet är ett problem, inkubera Hydrogelen i 24 timmar i medier som innehåller antibiotika följt av sköljning med normal media.
    3. Till frö celler, först Återsuspendera trypsinized celler i den slutliga volymen av media som skall användas i hydrogel petriskål.
    4. Ta bort alla lösning från hydrogel skålen och ersätta med cell-lastat media.
    5. Låt Hydrogelen sitta ostört i cellen-lastat median för 10 min.
    6. Flytta försiktigt petriskål till en inkubator. Underhålla cellerna i inkubatorn för 4 h eller tills cellerna är synligt följs.
    7. Ersätt den cell-lastat median med cell-fri median till flytta unanslöt cellerna.
  2. Att förvärva bilder av celler och de relaterat markörer
    1. Ställ in temperaturen för inkubationskammaren på mikroskopet till 37 ° c och CO2 till 5% och låt kammaren nå de fastställda punkterna.
    2. Placera petriskål på provhållaren och lokalisera de mönstrade ytorna.
    3. Lokalisera en cell av intresse (COI) och förvärva en överförd eller fluorescerande bild av COI.
      ANMÄRKNINGAR: denna bild kommer att användas för att segmentera cellgränsen under analysen, så bilden bör tydligt visualisera cell snowboardåkare.
    4. Förvärva en z-stack av den mönstrade matrisen under COI som i steg 4.1.4.
    5. Hämta en andra uppsättning överförda eller fluorescerande bilder av cellen.
      Notera: jämför den andra bilden som är inställd på den första för att avgöra om cellskador på grund av fototoxicitet observeras och om bild anskaffnings inställningarna måste justeras. Celler som krymper efter exponering har sannolikt lidit betydande fototoxiska effekter, vilket kan påverka resultaten.
    6. Upprepa steg 5.2.3-5.2.5 för varje COI.

6. analysera bilderna

  1. Förberedelse av avbildningsfiler för analys
    1. Med hjälp av data som samlats in i steg 5,2, Förbered en beskuren bildstapel i området runt en COI så att den nedre bilden (första bilden) av stacken representerar den första bildrutan där: (1) > 80% av de mönstrade markör kolumnerna är synliga, (2) den översta bilden (sista bilden) i stacken inte längre innehåller några synliga relaterat markörer (dvs, ovanför hydrogel ytan), och (3) det finns minst 20 μm av icke-stressade relaterat markörer som omger COI.
      Om du beskär bilderna minskas beräkningstiden avsevärt under analysen. Analys koden i senare steg kan köras utan att beskära bilderna, men detta rekommenderas inte.
    2. Skapa en beskuren bild av den överförda och/eller fluorescerande bilden så att den matchar XY-beskärningen av stacken i föregående steg.
    3. Använd antingen den beskurna överförda eller fluorescerande bilden – beroende på vilket som är mer representativt för cell formen – för att segmentera bilden för hand (spåra cellkanten) eller via bildbehandlingsverktyg.
    4. Konvertera denna bild till en binär bild där insidan av cellen är svart (dvs. intensitet = 0) och området runt cellen är vit (dvs intensitet ≠ 0). Spara den här bilden som binär mask. tif.
    5. För varje COI, samla in bilden stack filen, överförda bildfil och binär mask fil i en enda mapp.
  2. Köra analys skript på bilderna
    1. Klon eller data överför den TFM analysfunktionerna tillgänglig fri på mjukvaran repository29. Hela databasen ska hämtas eftersom det finns ett stort antal beroenden i undermapparna.
    2. Öppna MATLAB och Lägg till katalogen och alla undermappar i den lokala klon av kod databasen till sökvägen.
    3. Ange katalogen i MATLAB-arbetsytan till den mapp där de förberedda bilderna i steg 6,1 lagrades.
    4. Öppna och kör skriptet tracking. m . När du uppmanas till det följer du anvisningarna för att läsa in lämpliga bilder, utföra inledande för bearbetningssteg och fel-kontrollera objektspårningsalgoritmen.
    5. När skriptet har slutförts, öppna och kör funktionen Dispshear. m . Det här skriptet bör inte kräva indata från användaren.
    6. När Dispshear. m -skriptet har slutförts, öppna och kör disp3D. m. Följ instruktionerna om du uppmanas att öppna några bilder.
      Under körningen kan skriptet be användaren att rita en linje på en bild av den mönstrade matrisen. Denna linje bör representera den primära rörelse axeln av skanning lasern under mönstringen och bör line-up med en rad av mönstrade relaterat markörer. Den här processen instruerar koden om vilken riktning (dvs rader eller kolumner med relaterat markörer) sannolikt ger de mest justerade raderna av relaterat markörer.
    7. När Dispshear. m -koden har slutförts kör du koden dispsurface. m följt av interpFinal3D_2. m -koden. Dessa skript bör inte kräva indata från användaren.
      Anmärkning: interpFinal3D_2. m skriptet omvandlar förskjutnings data till ytan Tractions med hjälp av programvara som erhållits externt, som har beskrivits tidigare31. Om du vill använda dessa externa funktioner interpolerar interpFinal3D_2. m förskjutnings data till enhetliga rutnät för att fungera som indata för konverteringsfunktionerna. Om du använder en annan konverteringsmetod, eller om Tractions inte behövs, kan det här steget hoppas över.
    8. När alla skript har körts, se till att alla data och utdata kan hittas i den ursprungliga katalogen.
    9. Upprepa steg 6.2.3 – 6.2.8 för varje COI.
      Anmärkning: inom kod databasen finns en mapp som innehåller skript som tillåter automatisk batchkörning av varje skript på en lista över kataloger. Se själva automations skripten (d.v.s. kommentarer inom koden) för instruktioner om hur du använder dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under hela protokollet finns det ett antal kontrollpunkter som ger återkoppling för att bedöma kvaliteten på mönster förfarandet. För att ge viss insikt om hur man bedömer framstegen vid var och en av dessa kontrollpunkter, ger vi representativa resultat av ett faktiskt experiment. Resultaten belyser tillämpningen av detta protokoll som utförs på en fotomönstrad hydrogel beredd för TFM analys av mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs). Resultaten inkluderar RAW-bilddata samt bearbetade data utdata vid varje kritiskt steg.

Den första kontrollpunkten inträffar vid steg 4, när den relaterat markör matrisen har fotomönstrat i hydrogel. När du samlar in en bildstapel, bör de resulterande bilderna Visa en regelbunden matris med mönstrade funktioner (figur 1a-C) som oscillerar i intensitet som en funktion av z-position i bildstapeln. Om den mönstrade ytan inte var helt jämn, kan olika regioner i varje bild skiva tyckas ur fas med varandra med avseende på dessa svängningar; Detta förväntas och bör inte påverka analysen utom i extrema fall.

De återstående kontrollpunkterna utnyttjar utdata från varje skript som körs under analys av en given COI. Den tracking. m skriptet innehåller flera diagnostiska bilder inklusive en z-projektion av fluorescerande relaterat markörer (figur 2A) för att bedöma förbehandling kvalitet, en tomt av upptäckta centroids färgkodade som en funktion av z-position ( Figur 2B) för att bedöma objekt detekterings kvalitet, och en tomt med spår som representerar upptäckta markörer centroids som har kopplats till kolumner i z-riktning (figur 2C) för att bedöma objekt spårnings kvalitet.

För exakt 3D axelcentroid upptäckt krävs för att beräkna referenskoordinater och förskjutningar, fluorescerande relaterat markörer bör likna elliptiskt former med intensitet minskar radiellt från centrum. Disp3D. m -skriptet ger en sammansvärjning som en funktion av z-position för varje kolumn med identifierade funktioner i en given bildstapel (figur 3a, B) för att bedöma kvaliteten på de fiduella markör intensitetsprofilerna. Både disp3D. m och dispshear. m tillsammans ger histogram uppmätt förskjutnings brus i var och en av de kartesiska koordinatdimensionerna (figur 4A-C) samt interpolerade värmekartor över förskjutningar (figur 4 E, F). Slutligen ger interpFinal3D_2. m värmekartor över yttractions beräknat med hjälp av outsourcad kod (figur 5)31.

Figure 1
Figur 1: typiska mönster resultat.
Afluorescerande bilder av fiduella markörer som uppvisar intensitetsvariationer genom Z-dimensionen från hydrogelytan till 12,4 μm i Hydrogelen. (B) en bearbetad volymetrisk rendering avslöjar den ellipsoidala formen hos de fiduella markörerna. (C) sektionerade profil vyer av volymetrisk rendering visar rå markör data. A, C: Skalstapel = 5 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: Diagnostikutdata från algoritmen för partikel spårning.
Objekt detekterings-och spårningsprogram varan matar ut flera diagnostiska bilder, inklusive (a) en Z-vägd projektion av fluorescerande relaterat markörer och (B) ett spridningsdiagram med markör positioner med färgkodad Z-position. (C) en ytterligare utgång visar en z-vägd projektion, som i (a), med 2D-identifieringar från varje bildruta som är länkad till kolumner. (D) en närmare titt på (B) tydligare visar individuella 2D-identifieringar färgkodade med z-position. A: Skalstapel = 20 μm. C: skal stång = 5 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Diagnostikutgångar från 3D-deplacement algoritmen.
(a, B) Linjediagram med markörintensitet som funktion av bild Rute position Visa oscillationer mellan markörer grupperade i vertikal riktning. Dessa linjediagram möjliggör kvalitativ bedömning av rutnäts justering med bildplanet, samt övergripande kvalitet på de mönstrade relaterat markörer. (A) överlappande svängningar i markörens intensitet bekräfta godtagbar anpassning av bildplanet med de mönstrade fiduella markör matriserna. Inklusive tomma ramar överst i en Z-stack möjliggör automatisk beräkning av en brus tröskel i bearbetningsprogram varan. (B) dålig överlappning mellan svängningar är ofta tyder på dålig anpassning av mönstrade galler med bildplanet men kan också tyda på att rutnätet själva är feljusterade och kan ge dåliga resultat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Bild 4: diagnostiska utgångar från 2D-och 3D-deplacement algoritmer.
(a-C) Histogram av uppmätta förskjutningar i regioner som betraktas som "icke deformerade" (dvs. förskjutnings buller) ger en kvantitativ bedömning av noggrannheten hos beräknade referenslinjer för tillnärmning av markör referens positioner. Förskjutnings fält ger en visuell representation av både (D) in-plane (skjuvning) och (E) out-of-Plane (normal) uppmätta förskjutningar. D: Scale bar = 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Diagnostikutgångar från algoritmen för Traktionskonvertering.
(a-C) Dragkrafts spänningar kan beräknas baserat på interpolerade förskjutnings fält för att bestämma (B) total dragning, (C) Skjuvdrag och (D) normal dragkraft. A: Scale bar = 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med detta protokoll är att tillhandahålla ett arbetsflöde som lindrar en stor del av svårigheten i samband med generering och analys av TFM-data. När beredd, de fotomönstrade hydrogeler är enkla att använda, kräver endast kunskap om standard vävnad kultur praxis och fluorescens mikroskopi. Den referens fria aspekten möjliggör bekymmersfri navigering på celllastade hydrogeler och eliminerar besvärliga bild bearbetningssteg som bild registrering mellan referens och deformerade bilder. Den resulterande analysen är nästan helt automatiserad och data från enskilda COIs kan analyseras från början till på mindre än 10 min.

De främsta utmaningarna i detta protokoll härrör från tillverkningen av den fotomönstrade Hydrogelen. Eftersom de flesta av de reagens som används i protokollet syntetiseras in-House, förväntar vi oss att användare med liten erfarenhet av syntetiska hydrogel material kan vara något avskräckas från att försöka detta protokoll. Som sagt, alla pegylerade komponenter som används i detta protokoll syntetiseras från nästan identiska protokoll med hjälp av en-Pot reaktioner och många av komponenterna kan köpas från kommersiella leverantörer.

Detta protokoll kräver också en del behärskning över användningen av laserskanning Mikroskop. Laser skannings parametrarna måste optimeras för varje Mikroskop, eftersom laser intensiteter, objektivlinser och andra Mikroskop komponenter kommer att variera, även mellan Mikroskop av samma modell. En enkel metod för att fastställa de bästa Mikroskop inställningarna för foto-mönster är att utföra en panel av skanningar med varierande inställningar. Alla inställningar som påverkar den totala laser exponeringen som tas emot av provet kommer att påverka storleken och kvaliteten på de mönstrade markörerna. Detta inkluderar: skanningshastighet, pixelstorlek, medelvärdes antal, lasereffekt/intensitet/Fluence, förstoring och numerisk bländare32,33. Det är ofta lättast att justera lasereffekt och skanningshastighet och så det rekommenderas att börja med dessa två parametrar. Det bör också noteras att den programvara som används för att generera regioner filer utformades speciellt för varumärket av Mikroskop vi använder och kan behöva förstärkas för att rymma andra Mikroskop gör och modeller. Med de inställningar som anges i protokollet, bör användaren räkna med att generera elliptiskt markörer med 3D Gaussian-liknande intensitet profiler av full bredd halv-Max dimensioner av 0,84 ± 0,11 μm i XY och 3,73 ± 0,30 μm i Z. Objektet detekterings algoritm använder en Center-of-Mass intensitet för att identifiera markörer centroids och kommer att prestera bäst när markörer presentera en bestämd gradient intensitet.

Det är av avgörande betydelse för cellkulturen att Hydrogelen sköljs ordentligt och att den skyddas från ljus och föroreningar. Som nämnts i protokollet, några av de mönster komponenter kan krascha ur lösning och deponering på ytan av hydrogel. Om dessa komponenter inte är helt sköljda från ytan, kan celladhesion vara oförutsägbart påverkas. Om utsätts för UV-spektrum ljus, även i små doser, medan hydrogel är blötläggning i mönster lösning, kommer mönsterlösningen att börja polymerisera och ger dåliga resultat. Slutligen kommer luftburna partiklar eller ofiltrerade partiklar att komplicera analysen, särskilt om de är fluorescerande. Särskild försiktighet bör iakttas för att förhindra att dessa föroreningar kommer in i provet i alla steg i protokollet.

Analys koden förutsäger referens platser för deformerade relaterat markörer genom att förutsäga den ursprungliga matrisen från icke-deformerade markörer i samma rad eller kolumn som den deformerade markören. Även om detta förenklar analysen, det medför också vissa restriktioner för vad som kan eller inte kan analyseras. Minst, varje deformerad markör som analyseras bör ha 2 eller flera medlemmar av både dess kolumn och rad av markörer som inte är deformerade så att en korrekt förutsägelse kan göras. En rad definieras av den grupp av prickar som skrivs ut i en enda rad skanning på mikroskopet, och en kolumn definieras av markörer mönstrade på en enda vertikal axel med hjälp av en z-stack funktion. Detta begränsar analysen till enstaka celler eller små cell kluster baserat på längden och djupet på varje mönstrat område. Det är viktigt att notera att detta inte åtgärdas genom att placera två mönstrade områden perfekt bredvid varandra. Detta beror på att även om XY-komponenterna kan rada upp, är det inte möjligt att perfekt rada upp Z positionella komponenter i arrayer, om inte provet ytan är perfekt nivå med både fokalplanet och scenen. Det bästa sättet att undvika denna begränsning är att anställa ytterligare rundor av mönkning som specifikt diktera adhesion ligand placering. Om den är korrekt justerad kan cellernas vidhäftning begränsas till användbara områden på mönstren.

Analys koden har optimerats för fyrkantiga arrayer där markörer är fördelade ca 3,5 μm isär i Z och 2,1 μm i X och Y. Det slutgiltiga avståndet varierar beroende på mönster exakthet och svällning, men detta bör inte påverka prestanda avsevärt om radavståndet är konsekvent (variationer mellan radens mellanrum påverkar inte spårningen). Medan koden kan köras till på olika ordinerade matriser, kan dess nuvarande tillstånd ge dåliga resultat om arrayer inte matchar parametrarna som anges här. Våra nuvarande mål för analys koden är att inkludera stöd för varierande avstånd samt triangulära matriser, vilket kan förbättra dragkrafts rekonstruktion noggrannhet och minska regionala bias jämfört med fyrkantiga arrayer.

Sammanfattningsvis ger vi en strategi för TFM som möjliggör facile insamling och analys av TFM data utan att störande cellulära funktion. Vårt mål med detta tillvägagångssätt är att ge en mer tillgänglig och icke-störande TFM-strategi, utan att kompromissa med upplösningen och kvaliteten på TFM-data. Vi förväntar oss att denna metod kommer att främja konvergens av biokemiska kunskaper i cellulära fenotyper med de observerade fysikaliska egenskaperna hos celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

O. A. Banda stöddes av finansiering från en NSF IGERT SBE2 Fellowship (1144726), start fonder som tillhandahålls av University of Delaware, och National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT program (R21CA214299). JHS stöds av finansiering från National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT program (R21CA214299) och National Science Foundation CAREER Award program (1751797). Mikroskopi tillgång stöddes av bidrag från NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) och delstaten Delaware. Det strukturerade belysnings mikroskopet förvärvades med medel från delstaten Delaware Federal Research and Development Grant program (16A00471). Den LSM880 konfokalmikroskopi Mikroskop som används för två-Photon laserscanning litografi förvärvades med en delad instrumentering Grant (S10 OD016361).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips in-house in-house Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome Zeiss Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii Coherent Inc. Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil 3M Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880 Zeiss Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB Mathworks R2018a Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter USCutter SC631E Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 Zeiss Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633 in-house in-house Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA in-house in-house Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS in-house in-house RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes CELLTREAT 229638 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL BD 309628 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp UVP Blak-Ray® B-100AP Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158, (1), 143-156 (2014).
  2. Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension. Molecular Biology of the Cell. 9, (11), 3179-3193 (1998).
  3. Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration. Cell. 151, (7), 1513-1527 (2012).
  4. Álvarez-González, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del Álamo, J. C. Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration. Biophysical Journal. 108, (4), 821-832 (2015).
  5. Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124, (8), 1195-1205 (2011).
  6. Reilly, G. C., Engler, A. J. Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation. Journal of Biomechanics. 43, (1), 55-62 (2010).
  7. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nature Materials. 13, (10), 979-987 (2014).
  8. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  9. Steward, A. J., Kelly, D. J. Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Anatomy. 227, (6), 717-731 (2015).
  10. Lv, H., et al. Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness. Stem Cell Research & Therapy. 6, (1), 103 (2015).
  11. Tijore, A., et al. Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell. Advanced Healthcare Materials. 4, (9), 1399-1407 (2015).
  12. Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement. Journal of Cell Science. 120, (9), 1624-1634 (2007).
  13. Legant, W. R., et al. Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, (3), 881-886 (2013).
  14. Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94, (1), 207-220 (2008).
  15. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts. Biophysical Journal. 80, (4), 1744-1757 (2001).
  16. Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2, (2), 124-137 (2018).
  17. Bergert, M., et al. Confocal reference free traction force microscopy. Nature Communications. 7, (2016).
  18. Schwarz, U. S., et al. Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates. Materials Science and Engineering: C. 23, (3), 387-394 (2003).
  19. Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, (4), 1484-1489 (2003).
  20. Desai, R. a, Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. Journal of Visualized Experiments. (0), 1-5 (2007).
  21. Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, (20), 18233-18241 (2019).
  22. Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow. Analytical Methods. 11, (1), 8-16 (2019).
  23. Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).
  24. Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5, (17), 2153-2160 (2016).
  25. Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography. Advanced Functional Materials. 21, (15), 2876-2888 (2011).
  26. Slater, J. H., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9, (6), 6128-6138 (2015).
  27. Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8, (34), 21883-21892 (2016).
  28. Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. Biomimetic Surfaces for Cell Engineering. Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. 543-569 (2016).
  29. Banda, O. A., Slater, J. H. Slater Lab Code Repositories. Available from: https://github.com/SlaterLab (2019).
  30. Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization. Advanced Materials. 24, (17), 2344-2348 (2012).
  31. Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., López-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. High resolution, large deformation 3D traction force microscopy. PLoS ONE. 9, (4), 1-12 (2014).
  32. Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 6, (24), 1-28 (2017).
  33. Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels. Multiphoton Lithography. 183-220 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics