الأصلي بولياكرياميد هلام الكهربائي تحليل المناعية لIRF5 الذاتية الثنائية

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ويوصف أسلوب لطخه الغربية المحلية لتحليل الذاتية مضاده للفيروسات عامل التنظيمية 5 ديميريشن في خط الخلايا الجذعية كال-1 بلازجيري. يمكن تطبيق هذا البروتوكول علي خطوط الخلايا الأخرى أيضا.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wang, M., Hoo Lim, K., Chow, K. T. Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization. J. Vis. Exp. (152), e60393, doi:10.3791/60393 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

العامل التنظيمي المضاد للفيروسات 5 (IRF5) هو عامل نسخ رئيسي لتنظيم الاستجابة المناعية. يتم تنشيطه في المصب من مستقبلات مثل الرقم المرجعي التمايز الأساسي استجابه الجينات 88 (TLR-MyD88) يشير المسار. وينطوي التنشيط IRF5 علي الفوسفات ، والتحوير ، والانتقال اللاحق من السيتوبلاسما إلى النواة ، مما يؤدي بدوره إلى التعبير الجيني لمختلف السايتوكينات الموالية للالتهابات. فحص الكشف عن تنشيط IRF5 ضروري لدراسة وظائف IRF5 ومساراتها ذات الصلة. توضح هذه المقالة فحص قويه للكشف عن التنشيط IRF5 الذاتية في خط الخلية البشرية الخلايا الجذعية (pDC) CAL-1. ويتكون البروتوكول من فحص الكهربي غير التقليدي المعدل الذي يمكن ان يميز IRF5 في اشكاله المومير والديمر ، التالي يوفر نهجا بأسعار معقولة وحساسة لتحليل IRF5 التنشيط.

Introduction

العامل التنظيمي المضاد للفيروسات 5 (IRF5) هو منظم النسخ الهامه التي تلعب دورا بارزا في تنظيم الاستجابة المناعية ، وخاصه في الإفراج عن السايتوكينات الموالية للالتهابات والتداخل من النوع الأول (ifns)1،2 ،3. سوء تنظيم IRF5 هو عامل المساهمة في العديد من امراض المناعة الذاتية, كما يتضح من مختلف اشكال التعدد في الموضع IRF5 التي ترتبط مع الذئبه الحماميه الجهازية, التصلب المتعدد, التهاب المفاصل الروماتويدي, الخ.4, 5،6،7،8،9،10. ولذلك ، فان فحص الكشف القوي لحاله التنشيط IRF5 الذاتية أمر حاسم لفهم المسارات التنظيمية والآثار النهائية لIRF5 في سياق خلوي ذي صله من الناحية الفسيولوجية.

يتم التعبير عن IRF5 بشكل دستوري في الخلايا الاحاديه ، والكريات الجذعية (DCs) ، والخلايا B ، والضامة1،11. كما هو الحال مع غيرها من عوامل النسخ الاسره IRF, IRF5 يقيم في سيتوتوبلاسما في حالتها الكامنة. عند التنشيط ، IRF5 هو الفوسفارلاتيد واشكال الhomodimers ، والتي بعد ذلك translocate في النواة وربط لعناصر تنظيميه محدده من نوع ترميز الجينات I IFNs والموالية للالتهابات السايتوكينات ، وحمل في نهاية المطاف التعبير عن هذه الجينات1 ،2،11،12،13. ينظم IRF5 الاستجابات المناعية الفطرية في المصب من مختلف المستقبلات التي تشبه الحصيلة (tlrs) ، مثل TLR7 ، tlrs 8 ، و tlrs 9 ، والتي هي مترجمه في التنظير الباطني واستخدام MyD88 للاشاره1،11،14. هذه tlrs تعترف في المقام الأول أنواع الأحماض النووية الاجنبيه مثل الجيش النيبالي الوحيد الذي تقطعت به السبل (أسانا) والحمض النووي cpg unmethylated التي هي اعراض للعدوى15,16,17,18. وقد ثبت IRF5 لتنظيم الاستجابات المناعية ضد العدوى البكتيرية والفيروسية والفطرية19،20،21. النظر في IRF5's دور مؤثره ومتنوعة في الجهاز المناعي, تعزيز أو الملطف IRF5 النشاط يمكن ان تكون بمثابه وسيله جديده لتطوير العوامل العلاجية22. ومن ثم ، من الاهميه بمكان وضع بروتوكول لرصد حاله تفعيل الIRF5 الذاتية للسماح باجراء تحقيق شامل في المسارات واليات التي تنظم نشاط IRF5 في مختلف أنواع الخلايا.

إلى أفضل ما لدينا من المعرفة ، وقد نشرت اي البيوكيميائية أو هلام الفحص الكهربي لتنشيط IRF5 الذاتية قبل تطوير هذا البروتوكول. وقد تبين ان الفوسفات خطوه اولي هامه من IRF5 التنشيط ، وتم تطوير الأجسام المضادة IRF5 فوسفوسيبيفيك التي أدت إلى اكتشاف وتاكيد بقايا سيرين المهم لنشاط IRF513. ومع ذلك ، في حين ان الأجسام المضادة بوضوح بالكشف عن IRF5 فوسفولات عندما إيمونوبريسيبيتاتيد أو اوفيريكسبريسيد23، فانه يفشل في الكشف عن IRF5 فوسفولات في خليه كامله محلله في ايدينا (البيانات لم تظهر). ديميريشن هو الخطوة التالية من تفعيل IRF5 ، والعديد من الدراسات الهامه حتى الآن التحقيق في هذه الخطوة تعتمد علي الإفراط في التعبير عن الIRF5 الموسومة ، في كثير من الأحيان في أنواع الخلايا غير ذات الصلة التي لا تعبر عاده IRF511،12 و24و25. وقد أظهرت الدراسات السابقة ان IRF5 dimerized قد لا translocate دائما في النواةالتالي ليس بالضرورة تفعيلهابالبالكامل 25,26. تم تطوير فحص لتوطين النووية IRF5 الذاتية لتقييم IRF5 التنشيط عن طريق التصوير الخلوي التدفق27. وقد تم تطبيق هذا الفحص في الدراسات التي كانت حاسمه لفهم النشاط IRF5 ، وخاصه في أنواع الخلايا الاوليه أو النادرة28،29 ومتقدمة إلى حد كبير المعرفة في الميدان. ومع ذلك ، يعتمد هذا الفحص علي أداه متخصصة ليست متاحه علي نطاق واسع للباحثين. وعلاوة علي ذلك ، غالبا ما يكون من الضروري التحقيق في الخطوات الاوليه للتنشيط اثناء تشريح IRF5 المسارات التنظيمية وتحديد الجهات التنظيمية التمهيدية ومكونات المسار. توفر هذه الدراسة فحصا بيوكيميائيا قويا وموثوقا به لاحداث التنشيط المبكرة لIRF5 التي يمكن أداؤها في المختبرات المجهزة باداات البيولوجيا الجزيئية. البروتوكول الموصوف هنا سيكون مفيدا جدا في التحقيق في مسارات واليات IRF5 الإجراءات ، وخاصه عندما يقترن باختبارات متعامدة مثل تحليل تدفق التصوير الخلوي لIRF5 النووية23، 27و28و30.

الأصلي بولياكرياميد هلام الكهربائي (الصفحة الاصليه) هو أسلوب يستخدم علي نطاق واسع لتحليل مجمعات البروتين31،32. علي عكس الصوديوم دوديسيلكبريتات بولياكرياميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) ، الصفحة الاصليه تفصل البروتينات علي أساس شكلها وحجمها ، وتهمه. كما انه يحتفظ بنيه البروتين الأصلي دون التشبع31,33,34,35. البروتوكول المقدمة يستفيد من هذه الميزات من الصفحة الاصليه ويكتشف كلا من موحودي و ديميريك اشكال IRF5. هذا الأسلوب مهم بشكل خاص للكشف عن احداث التنشيط في وقت مبكر لأنه لا يوجد الأجسام المضادة المتاحة تجاريا المناسبة التي يمكن الكشف عن الذاتية فوسفوريلاتيد IRF5. في السابق ، استخدمت العديد من الدراسات المنشورة الصفحة الاصليه لتقييم IRF5 ديميريشن. ومع ذلك ، فان غالبيه هذه الدراسات تعتمد علي الإفراط في التعبير الخارجي-الموسومة IRF5 لتحليل حاله التنشيط2،13،24،36،37 . يقدم هذا العمل بروتوكول خطوه بخطوه لتحليل IRF5 الذاتية عن طريق أسلوب الصفحة الاصليه المعدلة في الخلية البشرية الجذعية (pDC) خط ، حيث تم إظهار نشاط IRF5 ان تكون حاسمه لوظيفتها1، 38،39،40. وقد تم تطبيق هذه التقنية نفسها علي خطوط الخلايا الأخرى23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظه: البروتوكول الموصوفة هنا يستخدم CAL-1 pDC خط الخلية التعامل مع resiquimod (R848) ، ناهض ل TLR7/8. وقد طبق هذا البروتوكول علي أنواع أخرى من الخلايا البشرية والmurine ، بما في ذلك RAW 264.7 (خط الضامة murine) ، THP-1 (خط الخلية الاحاديه الإنسان) ، BJAB (الإنسان B خط الخلية) ، راموس (الإنسان Bخط الخلية) ، و mutz-3 (خط الخلية البشرية)

1. تحفيز خلايا CAL-1

  1. الحفاظ علي خلايا CAL-1 الثقافات في قارورة T75 في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 تحت ظروف معقمه مع 20 − 25 مل من rpmi 1640 المتوسطة التي تحتوي علي 5 ٪ الجنين البقري المصل (ار) ، 25 مم hepes ، و 1x mercaptoethanol (اي ، كامل rpmi 1640 المتوسطة).
  2. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 mL.
    ملاحظه: خلايا CAL-1 غير ملتصقة. بالنسبة لأنواع الخلايا الملتصقة ، يمكن اجراء التريسينايشن القياسي لخلايا الحصاد.
  3. الطرد المركزي الخلايا في 200 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة (RT). أزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 8 مل من المتوسطة rpmi 1640 كامله للحصول علي تعليق خليه واحده متجانسة.
  4. عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية. بذره الخلايا في كثافة من 1 × 106 خلايا لكل بئر في 6 لوحه جيدا مع 4 مل من المتوسطة الكاملة 1640 rpmi في كل بئر. احتضان لمده 20 − 24 ساعة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 للسماح لكونفلوينسي للوصول إلى 90 ٪ − 95 ٪ (المقابلة لحوالي 1.5 × 106 خلايا).
  5. تحفيز الخلايا عن طريق أضافه 4 μL من 1 مغ/مل R848 لكل بئر من 6 لوحه جيدا (التركيز النهائي من 1 ميكروغرام/مل). أيضا اعداد عنصر تحكم غير محفز بشكل جيد مع الخلايا دون العلاج R848.
  6. تاكد من تفريق R848 بالتساوي عن طريق هزاز بلطف لوحه جنبا إلى جنب. ثم ، احتضان الخلايا لمده 2 − 16 ح في الحاضنة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.

2. استخراج البروتينات الخلوية

  1. نقل تعليق الخلية من 6 لوحه جيدا في أنابيب الطرد المركزي 5 مل.
  2. أجهزه الطرد المركزي في 200 x g لمده 5 دقائق في RT. أزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) للحصول علي تعليق خليه واحده متجانسة.
  3. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL.
  4. تدور لفتره وجيزة في 12,000 x g لمده 0.5 − 1 دقيقه عند 4 درجه مئوية وأزاله سوبرناتانت بعناية.
  5. اعداد تحلل العازلة التي تحتوي علي 6.25 مل من 1 متر تريس-HCl pH 7.4 (التركيز النهائي من 25 ملم) ، 7.5 مل من كلوريد الصوديوم 5 م (التركيز النهائي من 150 mM) ، 0.5 mL من 0.5 M أدتا (التركيز النهائي من 1 ملم) ، 2.5 مل من NP-40 (التركيز النهائي من 1 ٪) و 7.5 مل من الجلسرين (التركيز النهائي من 5 ٪) في 250 مل من الماء منزوع الأيونات (ddH2س). أضف مثبطات الانزيم البروتيني 100x للاستخدام الفردي إلى التركيز النهائي من 1x إلى المخزن المؤقت لتحلل قبل الاستخدام فقط. الحفاظ علي المخزن المؤقت تحلل المعدة علي الجليد.
    ملاحظه: يمكن تخزين المخزن المؤقت تحلل بدون الانزيم البروتيني في 4 درجه مئوية.
  6. أعاده التعليق علي بيليه الخلية في 30 μL من الجليد الباردة تحلل العازلة وتخلط بالأنابيب صعودا وهبوطا.
  7. احتضان علي الجليد لمده 15 − 20 دقيقه.
  8. توضيح محلله بواسطة يطرد في 12,000 x g ل 15 − 20 دقيقه في 4 ° c. نقل ماده طافي إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL المبردة جديده. الحفاظ علي مقتطفات علي الجليد في جميع الأوقات.
    ملاحظه: يمكن تخزين لست] الخلية في-20 درجه مئوية أو-80 درجه مئوية. لا تغلي العينات.
  9. قياس تركيز البروتين باستخدام كاشف برادفورد.

3-تحليل الIRF5 الثنائية حسب الصفحة الاصليه

  1. اعداد العلوي (-) والسفلي (+) غرفه المخازن المؤقتة الكهربائي. الغرفة العلوية العازلة تتكون من 0.3 ٪ وديوكسيتشولاتي الصوديوم (nadoc) في 1x الصفحة الاصليه تشغيل المخزن المؤقت ، والغرفة السفلي يتكون من 1x الصفحة الام فقط تشغيل المخزن المؤقت.
    ملاحظه: اعداد العازلة الغرفة العلوية الطازجة لكل شوط جديد.
  2. شطف 3 ٪ − 12 ٪ هلام الصفحة الاصليه جيدا مع الماء دون تشويه الآبار. تعيين هلام في خزان هلام مصغره وأزاله المشط. التجريبية هلام في غرفه بارده 4 °C أو علي الجليد في 150 V لمده 30 دقيقه.
    ملاحظه: السلف يزيل الأمونيا المفرطة وأيونات الكبريت التي يمكن ان تتداخل مع تشغيل الهلام.
  3. اثناء التجريبي ، واعداد عينات للتحميل عن طريق خلط البروتينات الخلوية الاحتفاظ بها علي الجليد مع 4x المخزن المؤقت عينه الأصلي.
  4. بعد التجريبي ، تحميل 10 − 15 ميكروغرام من البروتين مع الحجم النهائي من 10 − 15 μL لكل عينه.
    ملاحظه: الحمولة الزائدة من البروتين يمكن ان يسبب تلطيخ.
  5. تشغيل هلام في 85 V لمده 30 دقيقه ، ثم 150 V لمده 2 ساعة.
    ملاحظه: النظر في الاختلافات في المعدات والخطوط الخلوية المستخدمة من قبل مختبرات مختلفه ، والتعديلات الطفيفة علي تركيز عينات البروتين ، والجهد ووقت التشغيل قد يكون من المناسب لتحسين هذا البروتوكول. خفض الجهد قبل تشغيل وتشغيل بينما زيادة وقت التشغيل قد يساعد علي تحسين القرار ديمر والاتساق نتيجة.
  6. نقع الهلام في المخزن المؤقت لتشغيل SDS (25 ملم تريس الأس الهيدروجيني 8.3 ، 250 mM الجليسين ، 0.1 ٪ SDS) لمده 30 دقيقه في RT.
    ملاحظه: لا حاجه الانفعالات. في بعض الأحيان ، قد لا تكون كثافة النطاق متناسبة مع كميه البروتين التي تم تحميلها بسبب عدم كفاءه النقل في وجود ديكسيتشولاتي (DOC) ، والتي تؤثر بشكل رئيسي علي النموذج مونوميريك من IRF5. نقع الهلام في المخزن المؤقت لتشغيل SDS قبل النقل يحل هذه المشكلة. الهلام هش. التعامل مع العناية القصوى من أسفل (اي ، نسبه اعلي) نهاية هلام.

4. تحليل المناعة من IRF5

  1. تفعيل غشاء بوليفينوليدين ثنائي فلوريد (PDVF) بنقع في الميثانول لمده 5 دقائق تقريبا.
  2. جعل قطع علي زاوية واحده من الغشاء للاشاره إلى توجهها. تجميع ساندويتش نقل وفقا لترتيب تسلسلي مفصل في بروتوكول الشركة المصنعة مع الرعاية الاضافيه لضمان عدم وجود فقاعات الهواء المحاصرين داخل.
  3. وضع كاسيت نقل في خزان ونقل في 20 فولت لمده 1 ساعة علي الجليد.
    ملاحظه: اجراء جميع الاحتضان ويغسل في الخطوات التالية مع شاكر هزاز.
  4. أزاله الغشاء من الكاسيت مع ملقط البلاستيك بعد اكتمال النقل. كتله الغشاء في حجب العازلة (TBS) لمده 45 دقيقه في RT.
    ملاحظه: يمكن أيضا استخدام المخزن المؤقت TBS مع 5% جيش صرب البوسنيين كمخزن مؤقت حظر.
  5. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الاساسيه المدرجة في الجدول 1. غسل الغشاء مع 1x TBST غسل العازلة (20 مم تريس ، pH 7.0 ، 150 mM NaCl و 0.1 ٪ توين 20) لمده 3 دقائق بينما هزاز. كرر غسل 2x.
الكل المخزن المؤقت dillution الحضانه تعليقات
أجسام مضاده أوليه ([انتي-IRF5) 1/1000 المخزن المؤقت حجب TBS بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية أو 2 ساعة في RT يمكن أعاده استخدام الأجسام المضادة المخففة عده مرات إذا كانت مخزنه في 4 درجه مئوية في وجود 0.02 ٪ من الصوديوم أزيد.
الأجسام المضادة الثانوية (مكافحه الأرانب) 1/10000 المخزن المؤقت حجب TBS 45 دقيقه في RT يمكن أعاده استخدام الأجسام المضادة المخففة عده مرات إذا كانت مخزنه في 4 درجه مئوية في وجود 0.02 ٪ من الصوديوم أزيد.
ملاحظه: التخفيف يحتاج إلى ان يكون الأمثل لأنه يختلف بين الشركات المصنعة.

الجدول 1: مواصفات الأجسام المضادة المستخدمة في الاجراء المناعي.

  1. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية المدرجة في الجدول 1. غسل الاغشيه لمده 3 دقائق في 1x TBST غسل العازلة. كرر غسل 2x.
  2. مسح وصمه عار باستخدام نظام التوثيق هلام المناسبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد أجريت المناعة (IB) مع مضاد لIRF5 علي خلايا CAL-1 غير محفزه أو محفزه مع 1 ميكروغرام/مل R848 لمده 2 ساعة (الشكل 1). تم اعداد لست] الخلية ، وتم تنفيذ الصفحة الاصليه. في خلايا CAL-1 غير المحفزة ، تم الكشف عن IRF5 كنطاق واحد علي الصفحة الاصليه ، المقابلة للنموذج الأحادي الخاص بها. عند العلاج من خلايا CAL-1 مع R848 لمده 2 ح ، انخفض مستوي IRF5 مونومر مع زيادة متزامنة في تراكم الفرقة المهاجرة ببطء التي تناظر الشكل الديميريك من IRF5.

Figure 1
الشكل 1: dimerized IRF5 الذاتية في خلايا كال-1 عند تحفيز مع ناهض TLR7/8. ولم تعالج خلايا CAL-1 أو عولجت بR848 للوقت المشار اليه. تم حل عينات البروتين من قبل الصفحة الاصليه وتلاها IB باستخدام الأجسام المضادة لIRF5. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

تم تنفيذ وصمه المناعي مع الأجسام المضادة لIRF5 علي IRF5-overexpressing عن الخلايا 293T غير المقسمة والمتحولة مع مختلف الثوابت. تم اعداد لست] الخلية وتم تنفيذ الصفحةالاصليه (الشكل 2). لم يتم الكشف عن اي IRF5 في خلايا 293T غير المتحولة ، مما يدل علي خصوصية الأجسام المضادة لIRF5. تم الكشف عن فرقه واحده المقابلة IRF5 موحودي فقط في خلايا 293t تبالغ في التعبير عن IRF5. عندما يبني ترميز IRF5-تنشيط البروتينات ، بما في ذلك NRIG (النشطة دستوريا تلاعب-I) ، مافس ، و IKKβ كانت المقسمة ، والفرقة المهاجرة ببطء المقابلة للشكل ديميريك من IRF5 ظهرت. ومع ذلك ، فان NMDA5 (النشطة دستوريا MDA5) ، وهو البروتين ذات الصلة لجهاز الحفر الأول ، لم يحفز IRF5 التحوير عند النقل المختلط.

Figure 2
الشكل 2: النقل المختلط للعوامل المنشطة IRF5 المستحثة IRF5 التحوير في خلايا 293T. وكانت خلايا 293T غير مقسمه (حاره 1) أو تم تحويلها إلى IRF5 (حاره 2) إلى جانب منظمات IRF5 مختلفه (الممرات 3 − 6). تم حل عينات البروتين من قبل الصفحة الاصليه وتلاها IB باستخدام الأجسام المضادة لIRF5. [نريج] = [ن-ترمينل] من [تلاعب-ا]; NMDA5 = N-الطرفية من MDA5. (نشرت أصلا في مجلة المناعة. KT تشاو ، C ويلكينز ، م ناريتا ، R الأخضر ، M الربوة ، YM Loo و M غيل الابن 2018. التفاضلية وتداخل البرامج المناعية التي ينظمها IRF3 و IRF5 في الخلايا الجذعية Plasmacytoid. J. مناعي. 201 (10) 3036-3050. حقوق التاليف والنشر © 2018 الرابطة الامريكيه لعلماء المناعة ، الشركة23). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول الموصوف هنا هو الصفحة الاصليه المعدلة التي تميز كل من الاشكال الاحاديه والديميريكه لIRF5 الذاتية. كانت هناك دراسات قليله الإبلاغ عن الكشف عن التنشيط IRF5 الذاتية باستخدام تقنيه التصوير تدفق الخلوية المتخصصة23,27,28,30. يستخدم هذا البروتوكول تقنيه شائعه وكاشفات شائعه وأداات لتقييم حاله تنشيط IRF5 الذاتية اثناء احداث التنشيط المبكرة. ويستتبع البروتوكول تعديلات بسيطه علي بروتوكول صفحه أصليه قياسيه لتمكين التمييز بين الاشكال الاحاديه والديميريكه لIRF5. ويمكن تكييفها بسهوله للدراسات باستخدام خطوط الخلايا الأخرى23. يمكن لهذا البروتوكول صفحه الأصلي تعديل حل IRF5 الذاتية في شكلين بوضوح دون تدخلات البروتين غير محدده (الشكل 2). تم الكشف عن IRF5 الذاتية من الخلايا غير المحفزة كفرقه واحده واضحة في هذا النظام هلام ، في حين ان العلاج مع R848 ل 2 ح أسفرت عن ظهور الفرقة المقابلة ل IRF5 dimers (الشكل 1).

وقد تم تطوير مقايسة الصفحة الاصليه لIRF3 ، وهو عامل نسخ مماثل ل IRF5 في نفس العائلة ، ويستخدم علي نطاق واسع في العقدين الماضيين32. علي الرغم من التجارب الواسعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، لم نكن قادرين علي تطبيق نفس البروتوكول الذي يستخدم نظام Laemmli تريس-غليسين لحل IRF5 مونومر وديمير. يستخدم البروتوكول الموصوف في هذه المقالة الهلام المتدرج Bis-تريس ، التي لها كيمياء مختلفه جدا إلى تريس-الجليسين نسبه واحده من المواد الهلامية المستخدمة في بروتوكول IRF3. وقد تكون التركيبة الهيدروجينية والكيميائية المختلفة للانظمه الكهربية للهلام حاسمه في تمييز الاشكال المختلفة لIRF3 و IRF5. في الواقع ، IRF3 و IRF5 ، في حين انها متشابهة ، لديها خصائص مختلفه (علي سبيل المثال ، نقاط isoelectric ومواقع التعديل) من المرجح ان تؤدي إلى سلوك مختلف اثناء فصلها علي أنظمه هلام مختلفه.

تم استخدام المخزن المؤقت لتشغيل الصفحة الاصليه 1x الذي يحتوي علي DOC لتشغيل الجيل. المخزن المؤقت يحتاج إلى اعداد جديده أو الاحتفاظ بها في بيئة نظيفه وخاليه من البروتين لتجنب ظهور الرواسب البيضاء التي تغيم المحلول في الغرفة العليا نتيجة لل DOC التي تعجل البروتينات غير محدده. ويوصي بشده ان يتم إخضاع عينات IRF5 الذاتية المستخرجة إلى الصفحة الاصليه في أقرب وقت ممكن ، ويفضل في غضون أسبوع مع الحد الأدنى من دورات التجميد والذوبان. والا ، قد يكون هناك تدهور كبير في البروتين. لاحظت الانحلال مع تخزين في علي حد سواء-80 [ك] و-20 [ك.]. الاضافه إلى ذلك ، يجب تعديل درجه الحموضة في المخزن المؤقت لتشغيل SDS ومخزن الغسيل TBST في RT.

وكان الحجم النهائي المثالي للعينه المحملة في كل بئر هو 10 − 15 μL ، ولكن قد تكون هناك حاجه إلى تعديلات طفيفه تبعا لأنواع الخلايا المختلفة. بعد التشغيل الاولي في 85 V لمده 30 دقيقه ، فمن المستحسن ان تستمر في تشغيل هلام في 150 V لحوالي 2 إلى 3 ح لتحقيق فصل متميز والقرار من IRF5 مونومر وديمير. بعد الانتهاء من الشوط ، فمن المهم للغاية للتعامل مع هلام بدقه من نهايته السفلي بسبب مستوياته التفاضلية من الكثافة ، تتراوح بين 3 ٪ في الجزء العلوي وزيادة نحو 12 ٪ في الجزء السفلي. في هذه الحالة ، فمن الأفضل لأزاله هلام من لوحه من خلال غمر في المخزن المؤقت المستخدمة ، والذي يعمل كوسادة تاثير للحد من الاحتكاك ويسمح للهلام لتطفو بعيدا عن لوحه لتجنب الكسر.

وتشمل بعض العيوب الطفيفة لهذا البروتوكول اختيار محدود من الهلام المتاحة لتحقيق النتائج المرجوة. وقد تم اختبار الهلام محليه الصنع وعدد قليل من العلامات التجارية الأخرى من الهلام المتاحة تجاريا دون نجاح. في ايدينا ، واستخدام المخزن المؤقت التجارية تشغيل ونظام هلام ساهمت في متانة واستنساخ هذا البروتوكول ، علي الرغم من ان اختبار واسعه من المخازن المؤقتة محليه الصنع لم يتم تنفيذها. والاهتمام بالتفاصيل أمر أساسي ، والتجربة هي مفتاح النجاح في الحصول علي نتائج واضحة. وأخيرا ، فان قرار IRF5 يتطلب وقتا طويلا (اي 2 − 3 ساعة) للحصول علي فصل مثالي بين المونومر وديمير. ومن الممكن ان يؤدي المزيد من التحسين والتعديلات في المستقبل إلى تحسين كفاءه هذا البروتوكول وتقليل أوجه القصور فيه.

وفي الختام ، يعد هذا البروتوكول اختبارا قويا للكشف عن الIRF5 الذاتية الاحاديه والديمير. وهي مناسبه للتطبيقات في مختلف أنواع الخلايا البشرية والmurine التعبير عن IRF5 الذاتية. ستكون أداه قيمه لدراسة المسارات التنظيمية IRF5 ومكونات الإشارات في مختلف أنواع الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم العمل بتمويل من مؤسسه الرابض والصناديق الناشئة في جامعه المدينة. نشكر جميع أعضاء مختبر تشاو للمساعدة في التجربة والقراءة النقدية للمخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Life Technologies, HK 21985023
300 W/250 V power supply 230 V AC Life Technologies, HK PS0301
Anti-IRF5 antibody Bethyl Laboratories, USA A303-385
BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) EcoLife, HK MR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mL Life Technologies 15575020
Glycerol 500 mL Life Technologies 15514011
Glycine Life Technologies, HK 15527013
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 610-145-002-0.5
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 611-145-002-0.5
Halt protease inhibitor cocktail (100x) Thermo Fisher Scientific, HK 78430
HEPES Life Technologies, HK 15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) Gene Company, HK 927-50000
Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories Life Technologies, HK NW2000
NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit Life Technologies, HK BN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20x Life Technologies, HK BN2001
NativePAGE Sample Buffer 4x Life Technologies, HK BN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol Tin Hang/Calbiochem, HK #492016-100ML
PBS 7.4 Life Technologies, HK 10010023
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Bio-gene/Merck Millipore, HK IPFL00010
Protein assay kit II (BSA) Bio-Rad, HK 5000002
R848 Invivogen, HK tlrl-r848
RPMI 1640 Life Technologies, HK 61870127
Sodium Chloride ThermoFisher BP358-1
Sodium deoxycholate ≥97% (titration) Tin Hang/Sigma, HK D6750-100G
Tris Life Technologies, HK 15504020
TWEEN 20 Tin Hang/Sigma, HK #P9416-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434, (7030), 243-249 (2005).
  2. Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17438-17443 (2014).
  3. Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10, (11), (2018).
  4. Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
  5. Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8, (1), 1789 (2018).
  6. Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67, (12), 3146-3157 (2015).
  7. Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42, (6), 1477-1487 (2012).
  8. Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184, (2), 796-806 (2010).
  9. Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63, (3), 738-748 (2011).
  10. Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (35), 11001-11006 (2015).
  11. Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280, (17), 17005-17012 (2005).
  12. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28, (24), 7296-7308 (2008).
  13. Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17432-17437 (2014).
  14. McGettrick, A. F., O'Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22, (1), 20-27 (2010).
  15. Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13, (5), 543-551 (2007).
  16. Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8, (8), 594-606 (2008).
  17. Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34, (5), 637-650 (2011).
  18. Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18, (6), 871-882 (2012).
  19. del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38, (6), 1176-1186 (2013).
  20. Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
  21. Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10, (1), 1349 (2019).
  22. Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286, (9), 1624-1637 (2019).
  23. Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201, (10), 3036-3050 (2018).
  24. Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176, (12), 7462-7470 (2006).
  25. Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7, (3), 33098 (2012).
  26. Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280, (4), 3088-3095 (2005).
  27. Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64, (3), 788-798 (2012).
  28. De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
  29. Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24, (5), 1163-1175 (2018).
  30. Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292, (45), 18689-18698 (2017).
  31. Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
  32. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6, (4), 375-388 (2001).
  33. Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1865, (10), 1267-1273 (2017).
  34. Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66, (3), 1002 (1970).
  35. Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochemistry. 43, (35), 11248-11254 (2004).
  36. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22, (1), 117-127 (2010).
  37. Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283, (21), 14295-14308 (2008).
  38. Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178, (11), 6876-6885 (2007).
  39. Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43, (7), 1896-1906 (2013).
  40. Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7, (5), 1001345 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics