מקורי פוליאקרילאמיד ג'ל לטיפול חיסוני כתמי באנליזה של אנדודוגני IRF5 דימרזציה

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

שיטת כתמי האבן המערבית המקומית לניתוח מקדם אינטרפרון הרגולציה האנדוגניים מהווה 5 דימרזציה בשורת התא הדנדריאיד של CAL-1 מתוארת. ניתן להחיל פרוטוקול זה גם על קווי תאים אחרים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wang, M., Hoo Lim, K., Chow, K. T. Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization. J. Vis. Exp. (152), e60393, doi:10.3791/60393 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אינטרפרון פקטור 5 (IRF5) הוא גורם שעתוק מפתח לוויסות התגובה החיסונית. הוא מופעל במורד במורד הזרם של שיחת כמו מיאלואידית קולטן מיאלואיד התגובה הראשונית גן 88 (TLR-MyD88) איתות מסלול. ההפעלה IRF5 כרוכה זירחון, דימרזציה, והטרנסלוקציה הבאים מן הציטופלסמה לתוך הגרעין, אשר בתורו מעורר את הביטוי הגנטי של ציטוקינים פרו דלקתיים שונים. שיטת זיהוי עבור הפעלת IRF5 חיונית ללימוד פונקציות IRF5 ומסלולים רלוונטיים. מאמר זה מתאר את הערך החזק לזיהוי הפעלה IRF5 אנדודוגני ב-CAL-1 (pDC) של תא הדנדריטי האנושי. הפרוטוקול מורכב מתוך שונה מבחינה אלקטרופורזה בלתי מבוקר שיכול להבחין IRF5 בצורות המונומר שלה דיימר, ובכך לספק גישה במחיר סביר ורגיש לנתח IRF5 הפעלה.

Introduction

אינטרפרון התקינה פקטור 5 (IRF5) הוא מווסת שעתוק חשוב המשחק תפקיד בולט בוויסות התגובה החיסונית, במיוחד לשחרור ציטוקינים פרו דלקתיים וסוג אני הפרעות (ifns)1,2 ,3. Misregulation של IRF5 הוא גורם תורם במחלות אוטואימוניות רבות, כפי שניכר על ידי פולימריות שונות ב IRF5 לוקוס כי הם קשורים עם זאבת מערכתית אריתסוס, טרשת נפוצה, דלקת מפרקים שגרונית, וכו '4, . חמש,שש,שבע,שמונה,9,10 לכן, שיטת גילוי חזקה עבור מצב הפעלה אנדודוגני IRF5 היא חיונית להבנת מסלולים הרגולציה ואת ההשפעה של הזרם של IRF5 בהקשר הסלולר הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית.

IRF5 הוא מבוטא באופן קונסטיטולי ב מונוציטים, תאים דנדריטים (DCs), B תאים, ו מקרופאגים1,11. כמו בשאר משפחת IRF מרכיבי התעתיק, IRF5 שוכנת בציטופלסמה במצבו הנסתר. עם ההפעלה, IRF5 הוא זרחנות וצורות הומודימרס, אשר לאחר מכן העברה לתוך הגרעין ולאגד אלמנטים הרגולציה ספציפיים של גנים קידוד סוג I IFNs והפרו-דלקתיות ציטוקינים, בסופו של דבר גרימת הביטוי של גנים אלה1 ,2,11,12,13. IRF5 מווסת את התגובות החיסוניות המורמות במורד של קולטני שונים כמו שיחות (tlrs), כגון TLR7, tlrs 8, ו-tlrs 9, אשר מותאמים לאנזומים ומשתמשים ב-MyD88 עבור איתות1,11,14. אלה tlrs לזהות בעיקר חומצות גרעין זרות מינים כגון רנ א אחד (ssrna) ו-DNA הסרת מתילated של ה-CpG כי הם סימפטומים של זיהום15,16,17,18. IRF5 הוכח לווסת את התגובות החיסונית נגד חיידקים, נגיפי, ופטריות זיהומים19,20,21. בהתחשב IRF5's תפקיד המשפיע והמגוונים במערכת החיסונית, שיפור או לחות פעילות IRF5 יכול לשמש כשדרה הרומן לפיתוח של סוכנים טיפוליים22. מכאן, זה קריטי לפתח פרוטוקול כדי לפקח על מצב ההפעלה של אנדודוגני IRF5 כדי לאפשר חקירה יסודית של מסלולים ומנגנונים המסדירים פעילות IRF5 סוגי תאים שונים.

למיטב הידע שלנו, לא שיטת ביוכימיה או ג'ל אלקטרופלטית עבור הפעלה אנדודוגני IRF5 פורסמה לפני הפיתוח של פרוטוקול זה. זירחון הוכח להיות צעד ראשון חשוב של הפעלה IRF5, והנוגדן IRF5 מסוים זרחן פותחה כי הוביל גילוי ואישור של סרין שאריות חשוב עבור IRF5 פעילות13. עם זאת, בעוד הנוגדן מזהה בבירור IRF5 זרחתי כאשר immunoprecipitated או overexpressed יטא23, זה לא מצליח לזהות IRF5 זרחון בתאים שלמים בידינו (נתונים לא מוצגים). דימרזציה היא השלב הבא של IRF5 הפעלה, ומחקרים חשובים רבים עד כה בחקירת שלב זה הסתמך על ביטוי יתר של אפירופה-מתויג IRF5, לעתים קרובות בסוגי תאים לא רלוונטיים שאינם מבטאים בדרך כלל IRF511,12 ,24,25. מחקרים קודמים הראו כי dimerized IRF5 לא תמיד לאתר את הגרעין ולכן הוא לא בהכרח הופעל באופן מלא25,26. שיטת התאמה לוקליזציה גרעינית IRF5 פותחה כדי להעריך את IRF5 ההפעלה על ידי זרימת הדמיה cy try27. השיקול הזה הוחל במחקרים שהיו חיוניים להבנת פעילות IRF5, במיוחד בסוגי תאים ראשוניים או נדירים28,29 , ומתקדם מאוד את הידע בתחום. עם זאת, שיטת הפעולה נשענת על כלי מיוחד שאינו זמין באופן נרחב לחוקרים. יתר על כן, לעתים קרובות יש צורך לחקור את הצעדים הראשוניים של ההפעלה תוך מנתח מסלולים IRF5 רגולציה וזיהוי הרגולטורים במעלה ורכיבי מסלול. מחקר זה מספק שיטת ביוכימית איתנה ואמינה לאירועי ההפעלה המוקדמים של IRF5 שניתן לבצע במעבדות המצוידות בכלים ביולוגיים מולקולריים. הפרוטוקול המתואר כאן יהיה שימושי מאוד בחקירת מסלולים ומנגנונים של פעולות IRF5, במיוחד כאשר בשילוב עם אורתוגונאליות מספר כגון הדמיה של זרימת ההדמיה ניתוח ציטוטומטשל IRF5 לוקליזציה גרעינית23, 27,28,30.

פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (עמוד מקורי) היא שיטה נפוצה לניתוח מתחמי חלבונים31,32. בניגוד נתרן dodecylsulfate אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (sds-page), דף יליד מפריד חלבונים על בסיס צורתם, גודל, וטעינה. זה גם שומרמבנה החלבון המקוריללא הדציה31,33,34,35. הפרוטוקול המוצג מנצל תכונות אלה של דף מקורי ומזהה הן monomeric ו dimeric צורות של IRF5. שיטה זו חשובה במיוחד לגילוי אירועים הפעלה מוקדמת, כי אין נוגדן המתאים מסחרית זמין שיכול לזהות זרחני IRF5. בעבר, מספר מחקרים שפורסמו השתמשו בעמוד יליד כדי להעריך IRF5 dimerization. עם זאת, רוב המחקרים תלויים בביטוי יתר של אפידוגני-מתויג IRF5 לנתח מצב הפעלה2,13,24,36,37 . עבודה זו מציגה פרוטוקול צעד אחר צעד לניתוח אנדוגניים IRF5 dimerization באמצעות שינוי בטכניקה מקורית של דף מקורי (pDC) האדם תא דנדריטי, שם הפעילות IRF5 הוכח קריטי עבור תפקידה1, 38,39,40. אותה טכניקה הוחלה על קווי תאים אחרים23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בקו התאים CAL-1 של pDC שטופלו ברסיקימוד (R848), אגוניסט עבור TLR7/8. פרוטוקול זה הוחל על סוגים אחרים של תאים אנושיים ו-murine, כולל RAW 264.7 (מורלין מקרופאג line), THP-1 (קו מונלוציטיק האנושי), BJAB (קו תא אנושי B), ראמוס (קו התא האנושי), ו-MUTZ-3 (קו הדנדריטי האנושי)23.

1. המרצת תאים CAL-1

  1. שמירה על תרביות תאים CAL-1 בבקבוקון T75 ב 37 ° c ו-5% CO2 תחת תנאים סטריליים עם 20 על 25 מ ל של RPMI 1640 בינוני המכיל 5% סרום העוברי (fbs), 25 מ"מ hepes, ו-1x רקפטואתנול (כלומר, להשלים RPMI 1640 בינוני).
  2. העבר את התאים לשפופרת חרוט ב50 mL.
    הערה: תאי CAL-1 אינם מחסיד. לסוגי תאים מחסיד, ניתן לבצע טריסיזציה סטנדרטית לתאי הקציר.
  3. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הסר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה תא ב 8 מ ל להשלים RPMI 1640 בינונית כדי לקבל הבולם האחיד התא יחיד.
  4. לספור את התאים באמצעות הומוציטומטר. זרע את התאים בצפיפות של 1 x 106 תאים לכל טוב בצלחת 6 היטב עם 4 מ ל של RPMI מלאה מחומם להשלים בינוני 1640 בכל טוב. מודטה עבור 20-24 שעות ב 37 ° c ו-5% CO2 כדי לאפשר את השטף להגיע 90% ל 95% (מתאים כ 1.5 x 106 תאים).
  5. לגרות את התאים על ידי הוספת 4 μL של 1 מ"ג/mL R848 לכל טוב של 6 צלחת הבאר (הריכוז הסופי של 1 μg/mL). גם להגדיר שליטה ללא גירוי היטב עם תאים ללא טיפול R848.
  6. ודא R848 מפוזר באופן שווה על ידי נדנוד בעדינות את הצלחת מצד לצד. לאחר מכן, מודאת התאים עבור 2-16 h בחממה ב 37 ° c ו-5% CO2.

2. הפקת חלבונים סלולריים

  1. להעביר את השעיות התא מ 6 צלחת הבאר לתוך 5 שפופרות צנטריפוגה mL.
  2. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות ב RT. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של תמיסת מלח (PBS) כדי לקבל השעיית תא יחיד אחיד.
  3. להעביר את ההשעיה התא לתוך שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL.
  4. הסתובב לזמן קצר בשעה 12,000 x g עבור 0.5-1 דקות ב-4 ° c ובזהירות הסר את הסופרנטאנט.
  5. הכן את מאגר הליזה המכילה 6.25 mL של 1 M Tris-HCl pH 7.4 (ריכוז סופי של 25 מ"מ), 7.5 mL של 5 M הנאל (ריכוז סופי של 150 mM), 0.5 ml של 0.5 M EDTA (הריכוז הסופי של 1 מ"מ), 2.5 mL של NP-40 (הריכוז הסופי של 1%) ו 7.5 מ ל של גליצרול (הריכוז הסופי של 5%) ב 250 מ ל של מים מפוהים (ddH2O). הוסף מעכב פרוטאז 100x יחיד להשתמש בקוקטייל לריכוז הסופי של 1x למאגר הליזה ממש לפני השימוש. שמור את מאגר הליזה המוכן על הקרח.
    הערה: מאגר הליזה ללא פרוטאז יכול להיות מאוחסן ב -4 ° c.
  6. מחדש את הגלולה תא ב 30 μL של מאגר פירוק קרח קר ומערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה.
  7. מיכל הקרח במשך 15-20 דקות
  8. להבהיר את הליפוסט על ידי תפרידו ב 12,000 x g עבור 15-20 דקות ב 4 ° c. העבר את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חדש מקורר 1.5 mL. . שמור את התמציות על הקרח כל הזמן
    הערה: ניתן לאחסן ליסיטים סלולריים ב-20 ° c או-80 ° c. . אל תרתיח את הדגימות
  9. מדידת ריכוז חלבונים. בעזרת מגיב ברדפורד

3. ניתוח IRF5 דימרזציה על-ידי דף מקורי

  1. הכן את מאגרי האלקטרופורזה העליונים (-) והנמוכים (+). מאגר החדר העליון מורכב מ-0.3% נתרן (NaDOC) במאגר מקורי של 1 x, והתא התחתון מכיל רק דף מקורי של 1x הפועל מאגר.
    הערה: הכן מאגר חדש של התא העליון עבור כל הפעלה חדשה.
  2. לשטוף 3%-12% ג'ל מקורי לעמוד ביסודיות עם מים מבלי לעוות את הבארות. הגדר את ג'ל לתוך המיכל מיני ג'ל ולהסיר את המסרק. מזוג את הג בחדר קר בגודל 4 ° c או על הקרח ב-150 V במשך 30 דקות.
    הערה: מראש מסיר אמוניה מוגזמת ויונים פרסולפט העלולים להפריע להפעלת הג.
  3. במהלך ההכנה מוקלטת, הכינו את הדגימות לטעינה על ידי ערבוב החלבונים הסלולריים הנשמרים על הקרח עם מאגר דגם מקורי של 4 x.
  4. לאחר העריכה המוכנה, טען 10 עד 15 μg של חלבון עם נפח סופי של 10 עד 15 μL לכל מדגם.
    הערה: העמסת יתר של חלבון יכולה לגרום לכהיית.
  5. הפעל ג'ל ב 85 V עבור 30 דקות, ואז 150 V עבור 2 h.
    הערה: בהתחשב בהבדלים בציוד ובקווי התאים המשמשים מעבדות שונות, שינויים קלים בריכוז של דגימות חלבונים, מתח וזמן ריצה עשויים להתאים למיטוב פרוטוקול זה. הפחתת הפעלה מראש והפעלת מתח בעת הגדלת זמן הריצה עשויה לסייע בשיפור הרזולוציה של דיימר ועקביות התוצאה.
  6. להשרות את ג'ל ב SDS פועל מאגר (25 mM Tris pH 8.3, 250 מ"מ גליצין, 0.1% SDS) עבור 30 דקות ב RT.
    הערה: . אין צורך בעצבנות לעיתים, עוצמת הלהקה לא תהיה פרופורציונלית לכמות החלבון שנטענה עקב העברה לא יעילה בנוכחות הדאוקסיכוליום (DOC), המשפיעה בעיקר על צורת monomeric של IRF5. הספגת הג ב-SDS המפעיל מאגר לפני ההעברה פותרת בעיה זו. . הג'ל שברירי לטפל בזהירות קיצונית מלמטה (כלומר, אחוז גבוה יותר) בקצה של ג'ל.

4. ניתוח כתמי חיסוני של IRF5

  1. הפעל את ממברנה divinylidene (PDVF) על ידי המתנול במשך כ 5 דקות.
  2. לחתוך בפינה אחת של הקרום כדי לציין את כיוון. להרכיב את הכריך להעביר בהתאם לסדר רציפים מפורט בפרוטוקול של היצרן עם טיפול נוסף כדי להבטיח כי אין בועות אוויר לכודים בתוך.
  3. הצב את קלטת ההעברה לתוך המיכל והעבר ב -20 וולט עבור 1 h על הקרח.
    הערה: לבצע את כל incubations ושוטף בצעדים הבאים עם נדנדה.
  4. להסיר את קרום מתוך הקלטת עם מלקחיים פלסטיק לאחר השלמת ההעברה. לחסום את הממברנה במאגר חסימת (TBS) עבור 45 דקות ב RT.
    הערה: ניתן להשתמש במאגר TBS עם 5% BSA גם כמאגר חסימה.
  5. מודדת את הקרום עם הנוגדן העיקרי המפורטים בטבלה 1. לשטוף את הקרום עם מאגר כביסה 1 x TBST (20 מ"מ טריס, pH 7.0, 150 מ"מ הנאל ו 0.1% רצף 20) עבור 3 דקות בזמן נדנדה. חזור על השטיפה 2 x.
דידליזציה מאגר דיילוטור דגירה ערות
נוגדן ראשוני (Anti-IRF5) 1/1000 מאגר חסימה של TBS לינה בשעה 4 ° צ' או 2 שעות בשעה נוגדנים מדולל ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים אם מאוחסן ב 4 ° c בנוכחות של 0.02% נתרן azide.
נוגדן משני (אנטי ארנבת) 1/10000 מאגר חסימה של TBS 45 דקות ב-RT נוגדנים מדולל ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים אם מאוחסן ב 4 ° c בנוכחות של 0.02% נתרן azide.
הערה: דילול צריך להיות ממוטב כפי שהוא משתנה בין יצרנים.

טבלה 1: מפרטים של הנוגדנים הנמצאים בשימוש בהליך החיסוני.

  1. מודדת את הקרום עם הנוגדן המשני המפורטים בטבלה 1. לשטוף את הקרומים עבור 3 דקות ב-1 x TBST מאגר כביסה. חזור על השטיפה 2 x.
  2. סרוק את האבן החשופה באמצעות מערכת תיעוד מתאימה של ג'ל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

החיסוני (ליברות) עם נוגדן anti-IRF5 בוצעה על התאים CAL-1 בלתי מגורה או מגורה עם 1 μg/mL R848 עבור 2 h (איור 1). ליוטים סלולריים היו מוכנים, והדף המקורי בוצע. בתאי CAL-1 הממריצים, IRF5 זוהתה כלהקה יחידה בעמוד המקור, המתאימה לצורתו של monomeric. עם הטיפול בתאים CAL-1 עם R848 עבור 2 h, רמת IRF5 מונומר ירד עם עלייה במקביל בהצטברות של להקה הגירה לאט שתאמו את הצורה dimeric של IRF5.

Figure 1
איור 1: אנדוסוגני IRF5 dimerized בתאים CAL-1 כאשר מגורה עם TLR7/8 אגוניסט. תאים CAL-1 לא טופלו או טופלו R848 עבור הזמן המצוין. דגימות חלבונים נפתרו על-ידי הדף המקורי ואחריו לאחר השימוש ב-ליברות באמצעות הנוגדן anti-IRF5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הכתם החיסוני עם הנוגדן anti-IRF5 בוצע על IRF5-overexpressing יטוי 293T t מזוהמים ומנוכר עם מבנים שונים. ליקוטים תא היו מוכנים והדף המקורי בוצע (איור 2). No IRF5 זוהה בתאים 293T מזוהמים, הוכחת את הספציפיות של הנוגדן anti-IRF5. להקה אחת המתאימה monomeric IRF5 זוהה רק בתאי t 293T יטוי מופרז IRF5. כאשר בונה קידוד IRF5-הפעלת חלבונים, כולל NRIG (מתקן פעיל מבחינה חוקתית-I), MAVS, ו IKKβ היו מזוהמים, להקה מעביר לאט המתאים לצורה dimeric של IRF5 הופיע. עם זאת, NMDA5 (באופן קונסטיטוקטיבי MDA5), חלבון מקושר ל-I, לא לגרום IRF5 dimerization כאשר מזוהמים.

Figure 2
איור 2: הIRF5 של גורמים מפעילים המושרה IRF5 dimerization בתאי 293T. התאים 293T היו מזוהמים (ליין 1) או מנוכר עם IRF5 (ליין 2) יחד עם הרגולטורים IRF5 שונים (נתיבים 3-6). דגימות חלבונים נפתרו על-ידי הדף המקורי ואחריו לאחר השימוש ב-ליברות באמצעות הנוגדן anti-IRF5. NRIG = N-טרמינל של ציוד-I; NMDA5 = N-טרמינל של MDA5. (פורסם במקור בכתב העת לאימונולוגיה. קאפה-טאו, סי וילקינס, מ נריטה, ר גרין, מ. נול, מ. ו. גייל הצעיר 2018. המערכת החיסונית הדיפרנציאלי החופפים מוסדר על ידי IRF3 ו IRF5 בתאים דנדריטים פלמקטואיד. . בסדר. 201 (10) 3036-3050. זכויות יוצרים © 2018 האגודה האמריקנית לאימונוולוגים, בע מ23). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן הוא דף יליד שונה אשר מבדיל הן monomeric ו dimeric צורות של אנדודוגני IRF5. היו מחקרים מעטים דיווחו על זיהוי של הפעלה אנדודוגני IRF5 באמצעות זרימת הדמיה מיוחדות cy, 27,25,28,30. פרוטוקול זה משתמש בטכניקה נפוצה וריאגנטים שגרתי וכלים כדי להעריך את מצב ההפעלה האנדודוגני IRF5 במהלך האירועים המוקדמים של ההפעלה. הפרוטוקול מהווה שינויים פשוטים בפרוטוקול המקורי של עמוד מקורי כדי לאפשר הבחנה בין הצורות monomeric ו dimeric של IRF5. זה יכול להיות מותאם בקלות למחקרים באמצעות קווי תאים אחרים23. פרוטוקול זה שונה דף מקורי יכול לפתור IRF5 אנדוגני בשתי הצורות שלה בבירור ללא הפרעות חלבון לא ספציפיות (איור 2). אנדודוגני IRF5 מתאים בלתי ממריצים זוהה כלהקה אחת ברורה במערכת זו ג'ל, בעוד הטיפול עם R848 עבור 2 h הביא את המראה של הלהקה המתאימה IRF5 דימרים (איור 1).

מקור הדימיזציה של עמוד מקורי עבור IRF3, גורם שעתוק דומה IRF5 באותה משפחה, פותחה בשימוש נרחב בשני העשורים האחרונים32. למרות בדיקות נרחבות ופתרון בעיות, לא היינו מסוגלים ליישם את אותו פרוטוקול המעסיק את המערכת laemmli טריס-גליצין כדי לפתור IRF5 מונומר ו dimer. הפרוטוקול המתואר במאמר זה משתמש ג ' ל Bis הדרגתי ג'לים, אשר יש כימיה שונה מאוד ל-Tris-גליצין אחוז אחד ג'ל בשימוש בפרוטוקול IRF3. ה-pH השונים ההרכב הכימי של מערכות אלקטרופטיות ג'ל עשוי להיות קריטי בהבחנה צורות שונות של IRF3 ו IRF5. אכן, IRF3 ו IRF5, בעוד דומה, יש תכונות שונות (למשל, נקודות איזואלקטריים ואתרי שינוי) כנראה כתוצאה מכך התנהגות שונה תוך הפרדה על מערכות ג'ל שונות.

עמוד מקורי של 1x המפעיל מאגר המכיל DOC שימש להפעלת ג'ל. המאגר צריך להיות מוכן טרי או מוחזק בסביבה נקייה ונטולת חלבון כדי למנוע את הופעתו של מזרז לבן מדגיש את הפתרון בחדר העליון כתוצאה של החלבונים לא ספציפיים של DOC. מומלץ מאוד כי הדגימות IRF5 אנדוגניים המחולצים להיות חשופים לדף יליד בהקדם האפשרי, רצוי בתוך שבוע עם מחזורים להפשיר הקפאה מינימלית. אחרת, ייתכן שיש השפלה משמעותית בחלבון. ההשפלה מובחנות בשטח האחסון בשניהם-80 ° c ו-20 ° c. בנוסף, יש לכוונן את ה-pH של המאגר המפעיל של SDS ואת מאגר הכביסה של TBST בשעה RT.

הנפח הסופי האידיאלי של מדגם טעון בכל באר היה 10 לל15 μL, אך ייתכן שהתאמות קלות נדרשות בהתאם לסוגי תאים שונים. לאחר ההפעלה הראשונית ב 85 V עבור 30 דקות, מומלץ להמשיך להפעיל את ג'ל ב 150 V עבור כ 2 כדי 3 h כדי להשיג הפרדה ורזולוציה ברורים של IRF5 מונומר ו dimer. לאחר סיום הריצה, הוא בעל חשיבות עליונה להתמודד עם הג בקפדנות מהקצה התחתון שלה בשל הרמות הדיפרנציאליות של צפיפות, החל מ 3% בראש והגדלת לקראת 12% בתחתית. במקרה זה, עדיף להסיר את ג'ל מן הצלחת על ידי האישר אותו מאגר פועל משומשים, אשר משמש כרית השפעה כדי למזער את החיכוך ומאפשר ג'ל לרחף הרחק מהצלחת כדי למנוע שבירה.

כמה חסרונות קטנים של פרוטוקול זה כוללים מבחר מצומצם של ג'לים הזמינים כדי להשיג את התוצאות הרצויות. ג'לים תוצרת בית ועוד כמה מותגים של ג'ל זמין מסחרית נבדקו ללא הצלחה. בידינו, השימוש במאגר מסחרי פועל ומערכת ג'ל תרם לחוסן ולאי של פרוטוקול זה, אם כי בדיקות נרחבות של מאגרים תוצרת בית לא בוצעו. תשומת לב לפרטים חיונית, וניסיון הוא המפתח להצלחה בהשגת תוצאות ברורות. לבסוף, הרזולוציה של IRF5 נדרש זמן רב (כלומר, 2-3 שעות) כדי לקבל הפרדה אידיאלית של המונומר ו dimer. שיפור נוסף ושינויים בעתיד יכולים לשפר את היעילות ולמזער את החסרונות של פרוטוקול זה.

לסיכום, פרוטוקול זה הוא מעשה יציב לזיהוי של אנדודוגני IRF5 מונומר ו dimer. הוא מתאים ליישומים בסוגים שונים של תאים אנושיים ומורקיים המבטא אנדודוגני IRF5. זה יהיה כלי רב ערך כדי ללמוד את מסלולים IRF5 רגולטוריות ו איתות מרכיבים בסוגי תאים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

העבודה נתמכת על ידי מימון של קרן קראוצ'ר וקרנות האתחול של אוניברסיטת סיטי. אנו מודים לכל חברי המעבדה צ'או לקבלת עזרה בניסוי ובקריאה ביקורתית של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Life Technologies, HK 21985023
300 W/250 V power supply 230 V AC Life Technologies, HK PS0301
Anti-IRF5 antibody Bethyl Laboratories, USA A303-385
BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) EcoLife, HK MR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mL Life Technologies 15575020
Glycerol 500 mL Life Technologies 15514011
Glycine Life Technologies, HK 15527013
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 610-145-002-0.5
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 611-145-002-0.5
Halt protease inhibitor cocktail (100x) Thermo Fisher Scientific, HK 78430
HEPES Life Technologies, HK 15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) Gene Company, HK 927-50000
Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories Life Technologies, HK NW2000
NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit Life Technologies, HK BN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20x Life Technologies, HK BN2001
NativePAGE Sample Buffer 4x Life Technologies, HK BN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol Tin Hang/Calbiochem, HK #492016-100ML
PBS 7.4 Life Technologies, HK 10010023
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Bio-gene/Merck Millipore, HK IPFL00010
Protein assay kit II (BSA) Bio-Rad, HK 5000002
R848 Invivogen, HK tlrl-r848
RPMI 1640 Life Technologies, HK 61870127
Sodium Chloride ThermoFisher BP358-1
Sodium deoxycholate ≥97% (titration) Tin Hang/Sigma, HK D6750-100G
Tris Life Technologies, HK 15504020
TWEEN 20 Tin Hang/Sigma, HK #P9416-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434, (7030), 243-249 (2005).
  2. Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17438-17443 (2014).
  3. Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10, (11), (2018).
  4. Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
  5. Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8, (1), 1789 (2018).
  6. Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67, (12), 3146-3157 (2015).
  7. Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42, (6), 1477-1487 (2012).
  8. Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184, (2), 796-806 (2010).
  9. Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63, (3), 738-748 (2011).
  10. Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (35), 11001-11006 (2015).
  11. Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280, (17), 17005-17012 (2005).
  12. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28, (24), 7296-7308 (2008).
  13. Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17432-17437 (2014).
  14. McGettrick, A. F., O'Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22, (1), 20-27 (2010).
  15. Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13, (5), 543-551 (2007).
  16. Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8, (8), 594-606 (2008).
  17. Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34, (5), 637-650 (2011).
  18. Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18, (6), 871-882 (2012).
  19. del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38, (6), 1176-1186 (2013).
  20. Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
  21. Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10, (1), 1349 (2019).
  22. Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286, (9), 1624-1637 (2019).
  23. Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201, (10), 3036-3050 (2018).
  24. Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176, (12), 7462-7470 (2006).
  25. Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7, (3), 33098 (2012).
  26. Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280, (4), 3088-3095 (2005).
  27. Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64, (3), 788-798 (2012).
  28. De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
  29. Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24, (5), 1163-1175 (2018).
  30. Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292, (45), 18689-18698 (2017).
  31. Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
  32. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6, (4), 375-388 (2001).
  33. Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1865, (10), 1267-1273 (2017).
  34. Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66, (3), 1002 (1970).
  35. Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochemistry. 43, (35), 11248-11254 (2004).
  36. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22, (1), 117-127 (2010).
  37. Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283, (21), 14295-14308 (2008).
  38. Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178, (11), 6876-6885 (2007).
  39. Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43, (7), 1896-1906 (2013).
  40. Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7, (5), 1001345 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics