देशी Polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण अंतर्जात IRF5 Dimerization

Immunology and Infection

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Summary

अंतर्जात इंटरफेरॉन नियामक कारक 5 CAL-1 प्लाज्मा साइटोइड डेन्ड्रिटिक सेल लाइन में dimerization का विश्लेषण करने के लिए एक देशी पश्चिमी धब्बा विधि का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से अन्य सेल लाइनों के लिए लागू किया जा सकता है.

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Wang, M., Hoo Lim, K., Chow, K. T. Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization. J. Vis. Exp. (152), e60393, doi:10.3791/60393 (2019).

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Abstract

इंटरफेरॉन नियामक कारक 5 (IRF5) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने के लिए एक प्रमुख प्रतिलेखन कारक है. यह टोल की तरह रिसेप्टर माइलॉयड भेदभाव प्राथमिक प्रतिक्रिया जीन 88 (TLR-MyD88) संकेतन मार्ग के बहाव सक्रिय है. IRF5 सक्रियण फॉस्फोरिलेशन शामिल है, dimerization, और बाद में कोशिका द्रव्य से नाभिक में स्थानांतरण, जो बदले में विभिन्न समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के जीन अभिव्यक्ति लाती है. IRF5 सक्रियण के लिए एक का पता लगाने परख IRF5 कार्यों और उसके संबंधित रास्ते का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है. यह लेख CAL-1 मानव प्लाज्मा cytoid डेन्ड्रिटिक सेल (pDC) लाइन में अंतर्जात IRF5 सक्रियण का पता लगाने के लिए एक मजबूत परख का वर्णन करता है. प्रोटोकॉल एक संशोधित nondenaturing electrophoresis परख है कि अपने monomer और dimer रूपों में IRF5 भेद कर सकते हैं के होते हैं, इस प्रकार IRF5 सक्रियण का विश्लेषण करने के लिए एक सस्ती और संवेदनशील दृष्टिकोण प्रदान.

Introduction

इंटरफेरॉन नियामक कारक 5 (IRF5) एक महत्वपूर्ण प्रतिलेखन नियामक है जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, विशेष रूप से समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स और प्रकार मैं इंटरफेरॉन्स (IFNs)1,2 ,3. आईआरएफ 5 का गलत विनियमन कई ऑटोम्यून्यून रोगों में एक योगदान कारक है, जैसा कि आईआरएफ5 टिड्डी में विभिन्न बहुरूपता से स्पष्ट है जो प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस, मल्टीपल स्क्लेरोसिस, रूमेटोइड गठिया आदि के साथ जुड़े हुए हैं। 5,6,7,8,9,10. इसलिए, अंतर्जात IRF5 सक्रियण राज्य के लिए एक मजबूत पता लगाने परख एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेलुलर संदर्भ में नियामक रास्ते और IRF5 के बहाव प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है.

IRF5 एककोशिकाओं, डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी), बी कोशिकाओं, और मैक्रोफेज1,11में व्यक्त किया जाता है। अन्य आईआरएफ परिवार प्रतिलेखन कारकों के साथ के रूप में, IRF5 अपनी गुप्त राज्य में कोशिका द्रव्य में रहता है. सक्रियण पर, IRF5 फॉस्फोरीलेटाइज्ड है और होमोडीमर बनाता है, जो फिर नाभिक में स्थानांतरित हो जाता है और जीन एन्कोडिंग प्रकार I IFNs और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के विशिष्ट विनियामक तत्वों को बांधता है, अंततः इन जीनों की अभिव्यक्ति को प्रेरित करताहै 1 ,2,11,12,13. IRF5 विभिन्न टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLRs), जैसे TLR7, TLR 8, और TLR 9, जो endosomes में स्थानीयकृत कर रहे हैं और संकेत1,11,14के लिए MyD88 का उपयोग की जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करता है. ये टीएलआर मुख्य रूप से विदेशी न्यूक्लिक एसिड प्रजातियों को पहचानते हैं जैसे कि एकल-स्ट्रेंडेड आरएनए (एसआरएनए) और अमेथिलित सीपीजी डीएनए जो संक्रमण का लक्षण15,16,17,18हैं । IRF5 जीवाणु, वायरल, और फंगल संक्रमण के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है19,20,21. प्रतिरक्षा प्रणाली में आईआरएफ5 की प्रभावशाली और विविध भूमिका को ध्यान में रखते हुए, आईआरएफ 5 गतिविधि को बढ़ाने या गीला करने से चिकित्सीय एजेंटों के विकास के लिए एक उपन्यास अवसर के रूप में काम कर सकता है22. इसलिए, यह अंतर्जात IRF5 के सक्रियण की स्थिति की निगरानी करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है रास्ते और विभिन्न सेल प्रकार में IRF5 गतिविधि को विनियमित तंत्र की पूरी तरह से जांच की अनुमति देने के लिए.

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, अंतर्जात IRF5 सक्रियण के लिए कोई जैव रासायनिक या जेल electrophoretic परख इस प्रोटोकॉल के विकास से पहले प्रकाशित किया गया है. Phosphorylation IRF5 सक्रियण का एक महत्वपूर्ण पहला कदम होना दिखाया गया है, और एक phosphospecific IRF5 एंटीबॉडी है कि खोज और IRF5 गतिविधि13के लिए महत्वपूर्ण एक serine अवशेषों की पुष्टि करने के लिए नेतृत्व किया गया था. हालांकि, जबकि एंटीबॉडी स्पष्ट रूप से फॉस्फोरीलेट IRF5 का पता लगाता है जब इम्यूनोप्रिसिटाइज या overexpressed23, यह हमारे हाथों में एक पूरी सेल lysate में IRF5 फॉस्फोरिलेशन का पता लगाने में विफल रहता है (डेटा नहीं दिखाया). Dimerization IRF5 सक्रियण का अगला कदम है, और इस कदम की जांच करने के लिए कई महत्वपूर्ण अध्ययन epitope-टैग IRF5 के overexpression पर भरोसा किया, अक्सर अप्रासंगिक सेल प्रकार है कि आम तौर पर IRF511व्यक्त नहीं करते में,12 ,24,25. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि dimerized IRF5 हमेशा नाभिक में स्थानांतरित नहीं हो सकता है और इसलिए जरूरी नहीं कि पूरी तरह से सक्रिय25,26. इंजिंग आईआरएफ5 परमाणु स्थानीयकरण के लिए एक परख इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री27द्वारा आईआरएफ5 सक्रियण का आकलन करने के लिए विकसित किया गया था . यह परख अध्ययन है कि IRF5 गतिविधि को समझने के लिए महत्वपूर्ण थे में लागू किया गया है, विशेष रूप से प्राथमिक या दुर्लभ सेल प्रकार में28,29 और बहुत क्षेत्र में ज्ञान उन्नत. हालांकि, इस परख शोधकर्ताओं के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है कि एक विशेष साधन पर निर्भर करता है. इसके अलावा, आईआरएफ5 विनियामक मार्गों को विभाजित करते समय सक्रियण के प्रारंभिक चरणों की जांच करना और अपस्ट्रीम विनियामकों और मार्ग घटकों की पहचान करना अक्सर आवश्यक होता है। इस अध्ययन IRF5 के प्रारंभिक सक्रियण घटनाओं है कि आणविक जीव विज्ञान उपकरण ों से लैस प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है के लिए एक मजबूत और विश्वसनीय जैव रासायनिक परख प्रदान करता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल रास्ते और IRF5 कार्यों के तंत्र की जांच में बहुत उपयोगी हो जाएगा, खासकर जब इस तरह के IRF5 परमाणु स्थानीयकरण23के इमेजिंग प्रवाह cytometric विश्लेषण के रूप में orthogonal assays के साथ संयुक्त, 27,28,30.

देशी polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (देशी पेज) प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है31,32. सोडियम dodecylsulfate polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एसडीएस-पेज) के विपरीत, देशी पेज उनके आकार, आकार, और चार्ज के आधार पर प्रोटीन को अलग करता है। यह भी विकृतीकरण के बिना देशी प्रोटीन संरचना को बनाए रखता है31,33,34,35. प्रस्तुत प्रोटोकॉल देशी पृष्ठ की इन सुविधाओं का लाभ लेता है और IRF5 के दोनों monomeric और dimeric रूपों का पता लगाता है. इस विधि जल्दी सक्रियण घटनाओं का पता लगाने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि वहाँ कोई उपयुक्त व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी है कि अंतर्जात फॉस्फोरीलेच्ड IRF5 का पता लगा सकते हैं. पहले, कई प्रकाशित अध्ययन IRF5 dimerization का आकलन करने के लिए देशी पृष्ठ का इस्तेमाल किया. हालांकि, इन अध्ययनों के बहुमत exogenous epitope-tagged IRF5 के overexpression पर निर्भर सक्रियण स्थितिकाविश्लेषण करने के लिए 2 ,13,24,36,37 . यह काम एक मानव प्लाज्मा cytoid डेन्ड्रिटिक सेल (pDC) लाइन में एक संशोधित देशी पेज तकनीक के माध्यम से अंतर्जात IRF5 dimerization का विश्लेषण करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जहां IRF5 गतिविधि अपने समारोह के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है1, 38,39,40. इसी तकनीक को अन्य कोशिका रेखाओं23पर लागू किया गया है।

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Protocol

नोट: यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल CAL-1 pDC सेल लाइन का उपयोग करता है, जिसे resiQuimod (R848), TLR7/8 के लिए एगोनिस्ट के साथ इलाज किया जाता है. इस प्रोटोकॉल रॉ 264.7 (म्यूरिन मैक्रोफेज लाइन), THP-1 (मानव मोनोसाइटिक सेल लाइन), BJAB (मानव बी सेल लाइन), रामोस (मानव बी सेल लाइन), और MUT$-3 (मानव डेन्ड्रिटिक सेल लाइन)23सहित अन्य मानव और murine सेल प्रकार के लिए लागू किया गया है।

1. CAL-1 कोशिकाओं की उत्तेजना

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक T75 फ्लास्क में CAL-1 सेल संस्कृतियों को बनाए रखें और 5% सीओ2 के साथ बाँझ शर्तों के तहत 20 डिग्री 25 आरपीएमआई 1640 मध्यम युक्त 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 25 mM HEPES, और 1x mercaptoethanol (यानी, पूर्ण, पूर्ण RPMI RPMI 1640 मध्यम).
  2. कोशिकाओं को 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
    नोट: CAL-1 कोशिकाओं गैर-अनुकूल हैं. अनुलग्न सेल प्रकारों के लिए, फसल कोशिकाओं के लिए मानक ट्रिप्सिनाइजेशन किया जा सकता है।
  3. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant निकालें और एक सजातीय एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए पूरा RPMI 1640 माध्यम के 8 एमएल में सेल गोली resuspend.
  4. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। प्रत्येक कुएं में 4 एमएल प्रीहीट पूर्ण RPMI 1640 माध्यम के साथ 6 अच्छी प्लेट में 1 x 106 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं को बीज दें। संगम 90% $95% तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 20 डिग्री 24 एच के लिए इनक्यूबेट (लगभग 1.5 x 106 कोशिकाओं के अनुरूप)।
  5. 6 अच्छी प्लेट के प्रति अच्छी तरह से 4 मिलीग्राम/एमएल R848 जोड़कर कोशिकाओं को उत्तेजित करें (अंतिम सांद्रता 1 g/mL)। इसके अलावा R848 उपचार के बिना कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से एक unstimulated नियंत्रण की स्थापना की.
  6. सुनिश्चित करें कि R848 समान रूप से धीरे प्लेट पक्ष की ओर हिल द्वारा फैलाया है. इसके बाद, इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2में 2 डिग्री 16 एच के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

2. सेलुलर प्रोटीन का निष्कर्षण

  1. सेल निलंबन 6 अच्छी तरह से थाली से 5 एमएल अपकेंद्रण ट्यूबों में स्थानांतरण.
  2. RT में 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज. सुपरनेंट निकालें और एक सजातीय एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के 1 एमएल में सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
  3. सेल निलंबन को 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 डिग्री 1 मिनट के लिए 12,000 x g पर संक्षेप में स्पिन करें और ध्यान से सुपरनेंट को हटा दें।
  5. 1 एम ट्रास-एचसीएल पीएच 7.4 (25 एमएम की अंतिम सांद्रता), 7.5 एमएल 5 एम एनसीएल (150 एमएम की अंतिम सांद्रता), 0.5 एमएल 0.5 एम ईटीए (1 एम एम की अंतिम सांद्रता), एनपी 40 के 2.5 एमएल (1% की अंतिम सांद्रता) युक्त lysis बफर तैयार करें। और ग्लिसरोल के 7.5 एमएल (अंतिम एकाग्रता 5%) 250 एमएल में deionized पानी (ddH2हे) के. बस उपयोग से पहले lysis बफर करने के लिए 1x के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 100x प्रोटीज़ अवरोधक एकल उपयोग कॉकटेल जोड़ें। तैयार lysis बर्फ पर बफर रखें.
    नोट: प्रोटीज़ के बिना lysis बफर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. 30 डिग्री सेल्सियस बर्फ-ठंडा lysis बफर में सेल गोली को पुन: निलंबित करें और ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा मिश्रण।
  7. 15 डिग्री 20 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 डिग्री 20 मिनट के लिए 12,000 x g पर centrifuging द्वारा lysate स्पष्ट करें। सुपरनेंट को एक नए प्रीचिल्ड 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। हर समय बर्फ पर अर्क रखें.
    नोट: सेल lysates -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। नमूनों को उबालें नहीं।
  9. ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता को मापने।

3. मूल पृष्ठ द्वारा IRF5 Dimerization का विश्लेषण

  1. ऊपरी (-) और निम्न (+) कक्ष इलेक्ट्रोफोरोसिस बफर तैयार करें। ऊपरी कक्ष बफर के होते हैं 0.3% सोडियम deoxycholate (NaDOC) में 1x देशी पृष्ठ बफर चल रहा है, और निचले कक्ष केवल 1x देशी पृष्ठ बफर चल रहे होते हैं.
    नोट: हर नए रन के लिए एक ताजा ऊपरी कक्ष बफर तैयार करें।
  2. कुओं को विकृत किए बिना पानी के साथ एक 3%$12% देशी पेज जेल को अच्छी तरह से कुल्ला करें। मिनी जेल टैंक में जेल सेट और कंघी हटा दें। जेल को 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में या बर्फ पर 150 वी पर 30 मिनट के लिए प्रीरन करें।
    नोट: पूर्वचलन अत्यधिक अमोनिया और persulfate आयनों कि जेल के चलने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं हटा.
  3. prerun के दौरान, 4x देशी नमूना बफर के साथ बर्फ पर रखा सेलुलर प्रोटीन मिश्रण से लोड करने के लिए नमूने तैयार करते हैं.
  4. प्रीरन के बाद, प्रोटीन का 10 डिग्री 15 डिग्री ग्राम लोड करें, जिसकी अंतिम मात्रा 10 डिग्री 15 एल प्रति नमूना है।
    नोट: प्रोटीन की ओवरलोडिंग स्मियरिंग का कारण बन सकती है।
  5. 30 मिनट के लिए 85 वी पर जेल चलाएँ, तो 2 एच के लिए 150 वी.
    नोट: उपकरण और सेल लाइनों विभिन्न प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल में मतभेद को ध्यान में रखते हुए, प्रोटीन के नमूने की एकाग्रता के लिए मामूली संशोधनों, वोल्टेज और समय चल रहा है इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है. चल रहे समय में वृद्धि करते हुए पूर्व चल रहा है और चल वोल्टेज को कम करने dimer संकल्प और परिणाम स्थिरता में सुधार करने में मदद मिल सकती है.
  6. आरटी में 30 मिनट के लिए एसडीएस चल बफर (25 एमएम ट्रास पीएच 8.3, 250 एमएम ग्लिसिन, 0.1% एसडीएस) में जेल को भिगो दें।
    नोट: किसी आंदोलन की आवश्यकता नहीं है। कभी कभी, बैंड की तीव्रता deoxycholate (DOC) की उपस्थिति में अक्षम हस्तांतरण के कारण भरी हुई प्रोटीन की मात्रा के लिए आनुपातिक नहीं हो सकता है, जो मुख्य रूप से IRF5 के monomeric रूप को प्रभावित करता है. स्थानांतरण से पहले बफर चल रहे एसडीएस में जेल भिगोने से इस समस्या का समाधान हो जाता है। जेल नाजुक है. नीचे से चरम देखभाल के साथ संभाल (यानी, उच्च प्रतिशत) जेल के अंत.

4. IRF5 के इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण

  1. लगभग 5 मिनट के लिए मेथनॉल में भिगोने से polyvinylidene difluoride (PDVF) झिल्ली को सक्रिय करें।
  2. इसके अभिविन्यास को इंगित करने के लिए झिल्ली के एक कोने पर कटौती करें। कोई हवा बुलबुले के भीतर फंस रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त देखभाल के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल में विस्तृत अनुक्रमिक आदेश के अनुसार स्थानांतरण सैंडविच इकट्ठा।
  3. टैंक में स्थानांतरण कैसेट प्लेस और बर्फ पर 1 एच के लिए 20 वी पर स्थानांतरण.
    नोट: एक कमाल शेकर के साथ बाद के चरणों में सभी ऊष्मायन और washes प्रदर्शन करते हैं।
  4. स्थानांतरण पूरा होने के बाद प्लास्टिक के संदंश के साथ कैसेट से झिल्ली निकालें. आरटी में 45 मिनट के लिए बफर (टीबीएस) को अवरुद्ध करने में झिल्ली को ब्लॉक करें।
    नोट: 5% बीएसए के साथ टीबीएस बफर भी एक अवरुद्ध बफर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. मेम्ब्रेन को सारणी 1में सूचीबद्ध प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इन्क्यूबेट करें। 1x TBST धोने बफर (20 एमएम Tris, पीएच 7.0, 150 mM NaCl और 0.1% ट्वीन 20) के साथ झिल्ली धोने 3 मिनट के लिए जबकि कमाल. धोने 2x दोहराएँ.
डिल्यूलशन डिल्यूशन बफर ऊष्मायन टिप्पणियाँ
प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-IRF5) 1/1,000 टीबीएस ब्लॉकिंग बफर आरटी में 4 डिग्री सेल्सियस या 2 एच पर रात भर यदि 0.02% सोडियम अज़ीड की उपस्थिति में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है तो कम एंटीबॉडी का कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
माध्यमिक एंटीबॉडी (एंटी-रैबिट) 1/10,000 टीबीएस ब्लॉकिंग बफर आरटी में 45 मिनट यदि 0.02% सोडियम अज़ीड की उपस्थिति में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है तो कम एंटीबॉडी का कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
नोट: यह निर्माताओं के बीच बदलता है के रूप में Dilution अनुकूलित करने की जरूरत है.

तालिका 1: इम्यूनोब्लोटिंग प्रक्रिया में प्रयुक्त एंटीबॉडी के विनिर्देश।

  1. मेम्ब्रेन को सारणी 1में सूचीबद्ध द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इन्क्यूबेट करें। 1x TBST धोने बफर में 3 मिनट के लिए झिल्ली धो लें. धोने 2x दोहराएँ.
  2. एक उपयुक्त जेल प्रलेखन प्रणाली का उपयोग दाग स्कैन.

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Representative Results

इम्यूनोब्लॉट (आईबी) एक एंटी-आईआरएफ5 एंटीबॉडी के साथ CAL-1 कोशिकाओं पर unstimulated या प्रेरित किया गया था के साथ 1 g/mL R848 के लिए 2 ज (चित्र ासान 1) . सेल lysates तैयार किए गए थे, और देशी पृष्ठ प्रदर्शन किया गया था. unstimulated CAL-1 कोशिकाओं में, IRF5 देशी पृष्ठ पर एक एकल बैंड के रूप में पाया गया था, अपने monomeric रूप के लिए इसी. 2 एच के लिए R848 के साथ CAL-1 कोशिकाओं के उपचार पर, IRF5 मोनोमर का स्तर एक धीरे धीरे पलायन बैंड है कि IRF5 के dimeric रूप से मेल खाती के संचय में एक समवर्ती वृद्धि के साथ कमी आई.

Figure 1
चित्रा 1: अंतर्जात IRF5 CAL-1 कोशिकाओं में dimerized जब TLR7/8 एगोनिस्ट के साथ प्रेरित. CAL-1 कोशिकाओं का इलाज नहीं किया गया या इंगित समय के लिए R848 के साथ इलाज किया गया। प्रोटीन के नमूने देशी पृष्ठ द्वारा हल किया गया और विरोधी IRF5 एंटीबॉडी का उपयोग कर आईबी द्वारा पीछा किया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विरोधी IRF5 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोब्लॉट IRF5 पर प्रदर्शन किया गया था- 293T कोशिकाओं untransfected और विभिन्न निर्माणों के साथ transfected overexpressing. सेल lysates तैयार किए गए थे और देशी पृष्ठ प्रदर्शन किया गया (चित्र 2). कोई IRF5 untransfected 293T कोशिकाओं में पाया गया था, विरोधी IRF5 एंटीबॉडी की विशिष्टता का प्रदर्शन. एक एकल बैंड monomeric IRF5 के लिए इसी केवल 293T कोशिकाओं overexpressing IRF5 में पाया गया था. जब निर्माण IRF5-सक्रिय प्रोटीन, NRIG सहित (संविधान सक्रिय RIG-I), MAVS, और IKK]cotransfected थे, एक धीरे-धीरे पलायन बैंड IRF5 के dimeric रूप के लिए इसी दिखाई दिया. हालांकि, NMDA5 (संक्षिप्त रूप से सक्रिय MDA5), RIG-I के लिए एक संबंधित प्रोटीन, IRF5 dimerization प्रेरित नहीं किया जब cotransfected.

Figure 2
चित्र 2: 293T कोशिकाओं में IRF5-सक्रिय कारकों प्रेरित IRF5 dimerization के सह-परिवर्तन. 293T कोशिकाओं untransfected थे (लेन 1) या IRF5 के साथ transfected (लेन 2) विभिन्न IRF5 नियामकों के साथ (लेन 3 डिग्री 6). प्रोटीन के नमूने देशी पृष्ठ द्वारा हल किया गया और विरोधी IRF5 एंटीबॉडी का उपयोग कर आईबी द्वारा पीछा किया. NRIG - RIG-I के N-टर्मिनल; NMDA5 MDA5 के एन-टर्मिनल. (मूल रूप से इम्यूनोलॉजी के जर्नलमें प्रकाशित | केटी चाउ, सी विलकिंस, एम Narita, आर ग्रीन, एम Knoll, YM लू और एम गैल जूनियर 2018. अंतर और ओवरलैपिंग प्रतिरक्षा कार्यक्रम प्लाज्मा साइटोइड डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं में आईआरएफ3 और आईआरएफ5 द्वारा विनियमित। जे इम्यूनोल. 201 (10) 3036-3050. कॉपीराइट © 2018 प्रतिरक्षा विज्ञानियों के अमेरिकन एसोसिएशन, इंक23). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित एक संशोधित देशी पृष्ठ है कि अंतर्जात IRF5 के दोनों monomeric और dimeric रूपों भेद है. कुछ अध्ययन ों में विशेष इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री तकनीक23,27,28,30का उपयोग करके अंतर्जात आईआरएफ5 सक्रियण का पता लगाने की सूचना दी गई है . इस प्रोटोकॉल सक्रियण की प्रारंभिक घटनाओं के दौरान अंतर्जात IRF5 सक्रियण स्थिति का आकलन करने के लिए एक आम तकनीक और commonplace अभिकर्मकों और उपकरणों का उपयोग करता है. प्रोटोकॉल IRF5 के monomeric और dimeric रूपों के बीच अंतर सक्षम करने के लिए एक मानक देशी पृष्ठ प्रोटोकॉल के लिए सरल संशोधनों पर जोर देता है. यह आसानी से अन्य सेल लाइनों23का उपयोग कर अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस संशोधित देशी पृष्ठ प्रोटोकॉल अंतर्जात IRF5 अपने दो रूपों में स्पष्ट रूप से गैर विशिष्ट प्रोटीन interferences के बिना हल कर सकते हैं (चित्र 2). unstimulated कोशिकाओं से अंतर्जात IRF5 इस जेल प्रणाली में एक स्पष्ट एकल बैंड के रूप में पाया गया था, जबकि R848 के साथ उपचार के लिए 2 एच के लिए एक बैंड की उपस्थिति में हुई IRF5 dimers के लिए इसी (चित्र 1).

IRF3 के लिए एक देशी पृष्ठ dimerization परख, एक ही परिवार में IRF5 के लिए एक समान प्रतिलेखन कारक, विकसित किया गया है और व्यापक रूप से पिछले दो दशकों में इस्तेमाल किया32. व्यापक परीक्षण और समस्या निवारण के बावजूद, हम एक ही प्रोटोकॉल है कि Laemli Tris-glycine प्रणाली को रोजगार के लिए IRF5 मोनोमर और dimer को हल लागू करने में असमर्थ थे. इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल Bis-Tris ग्रेडिएंट जैल का उपयोग करता है, जो Tris-glycine एकल प्रतिशत जैल IRF3 प्रोटोकॉल में इस्तेमाल करने के लिए एक बहुत ही अलग रसायन शास्त्र है. जेल इलेक्ट्रोफोरेटिक सिस्टम के विभिन्न पीएच और रासायनिक संरचना IRF3 और IRF5 के विभिन्न रूपों भेद करने में महत्वपूर्ण हो सकता है. दरअसल, IRF3 और IRF5, जबकि इसी तरह, अलग गुण है (उदा., isoelectric अंक और संशोधन साइटों) की संभावना अलग व्यवहार में जिसके परिणामस्वरूप जबकि अलग जेल सिस्टम पर अलग किया जा रहा है.

एक 1x देशी पेज डॉक्टर युक्त बफर चल जेल चलाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. बफर ताजा तैयार किया जाना चाहिए या एक स्वच्छ और प्रोटीन मुक्त वातावरण में रखा सफेद precipitates की उपस्थिति से बचने के लिए ऊपरी कक्ष में समाधान बादल गैर विशिष्ट प्रोटीन के परिणामस्वरूप. यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि निकाले अंतर्जात IRF5 नमूने के रूप में जल्द से जल्द देशी पृष्ठ के अधीन किया जाना है, अधिमानतः कम से कम फ्रीज-थॉव चक्र के साथ एक सप्ताह के भीतर. अन्यथा, वहाँ महत्वपूर्ण प्रोटीन गिरावट हो सकती है. अवक्रमण -80 डिग्री सेल्सियस और -20 डिग्री सेल्सियस दोनों पर भंडारण के साथ देखा जाता है। इसके अलावा, बफ़र चल रहे एसडीएस और TBST वाशिंग बफ़र का पीएच RT में समायोजित किया जाना चाहिए।

प्रत्येक कुएं में लोड किए गए नमूने का आदर्श अंतिम आयतन 10$15 डिग्री सेल्सियस था, लेकिन विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों के आधार पर मामूली समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। 30 मिनट के लिए 85 वी पर प्रारंभिक चलाने के बाद, यह लगभग 2 से 3 एच के लिए 150 वी पर जेल चलाने के लिए अलग जुदाई और IRF5 मोनोमर और dimer के संकल्प प्राप्त करने के लिए जारी रखने के लिए सिफारिश की है. रन समाप्त होने के बाद, यह अत्यधिक महत्व का है कि घनत्व के अपने अंतर के स्तर के कारण इसके नीचे अंत से जेल को सावधानी से संभाला जाए, शीर्ष पर 3% से लेकर और नीचे 12% की ओर बढ़ रहा है। इस मामले में, यह इस्तेमाल किया चल बफर में डूब द्वारा थाली से जेल को दूर करने के लिए बेहतर है, जो घर्षण को कम करने के लिए एक प्रभाव तकिया के रूप में कार्य करता है और जेल टूटना से बचने के लिए थाली से दूर फ्लोट करने के लिए अनुमति देता है।

इस प्रोटोकॉल के कुछ मामूली कमियां वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए उपलब्ध जैल की सीमित चयन शामिल हैं. घर का बना जैल और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जैल के कुछ अन्य ब्रांडों सफलता के बिना परीक्षण किया गया है. हमारे हाथों में, एक वाणिज्यिक चल बफर और जेल प्रणाली का उपयोग मजबूती और इस प्रोटोकॉल की प्रजनन क्षमता के लिए योगदान दिया, हालांकि घर का बना बफ़र्स के व्यापक परीक्षण नहीं किया गया है. विस्तार करने के लिए ध्यान आवश्यक है, और अनुभव स्पष्ट परिणाम प्राप्त करने में सफलता की कुंजी है. अंत में, IRF5 के संकल्प मोनोमर और dimer के एक आदर्श जुदाई पाने के लिए एक लंबे समय (यानी, 2 "3 ज) की आवश्यकता है। आगे वृद्धि और भविष्य में संशोधनों दक्षता में सुधार और इस प्रोटोकॉल की कमियों को कम कर सकते हैं.

अंत में, इस प्रोटोकॉल अंतर्जात IRF5 मोनोमर और dimer का पता लगाने के लिए एक मजबूत परख है. यह अंतर्जात IRF5 व्यक्त विभिन्न मानव और murine सेल प्रकार में आवेदन के लिए उपयुक्त है. यह IRF5 नियामक रास्ते और विभिन्न सेल प्रकार में संकेत घटकों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण होगा.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

काम Croucher फाउंडेशन और सिटी विश्वविद्यालय स्टार्टअप फंड से धन द्वारा समर्थित किया गया था. हम प्रयोग और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के साथ मदद के लिए चाउ प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Life Technologies, HK 21985023
300 W/250 V power supply 230 V AC Life Technologies, HK PS0301
Anti-IRF5 antibody Bethyl Laboratories, USA A303-385
BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) EcoLife, HK MR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mL Life Technologies 15575020
Glycerol 500 mL Life Technologies 15514011
Glycine Life Technologies, HK 15527013
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 610-145-002-0.5
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 611-145-002-0.5
Halt protease inhibitor cocktail (100x) Thermo Fisher Scientific, HK 78430
HEPES Life Technologies, HK 15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) Gene Company, HK 927-50000
Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories Life Technologies, HK NW2000
NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit Life Technologies, HK BN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20x Life Technologies, HK BN2001
NativePAGE Sample Buffer 4x Life Technologies, HK BN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol Tin Hang/Calbiochem, HK #492016-100ML
PBS 7.4 Life Technologies, HK 10010023
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Bio-gene/Merck Millipore, HK IPFL00010
Protein assay kit II (BSA) Bio-Rad, HK 5000002
R848 Invivogen, HK tlrl-r848
RPMI 1640 Life Technologies, HK 61870127
Sodium Chloride ThermoFisher BP358-1
Sodium deoxycholate ≥97% (titration) Tin Hang/Sigma, HK D6750-100G
Tris Life Technologies, HK 15504020
TWEEN 20 Tin Hang/Sigma, HK #P9416-100ML

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