Native polyakrylamid gel elektrofores immunoblot analys av endogena IRF5 Dimerization

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En Native Western blot metod för att analysera endogena interferon reglerande faktor 5 Dimerization i Cal-1 dess dendritiska cellinjer beskrivs. Detta protokoll kan även tillämpas på andra cellinjer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wang, M., Hoo Lim, K., Chow, K. T. Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization. J. Vis. Exp. (152), e60393, doi:10.3791/60393 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Interferon regulatorisfaktor 5 (IRF5) är en viktig transkriptionsfaktor för att reglera immunsvaret. Det aktiveras nedströms den Toll-liknande receptor myeloisk differentiering primär respons gen 88 (TLR-MyD88) signalering väg. IRF5 aktiveringen involverar fosforylering, dimerisering, och efterföljande flyttning från cytoplasman i kärnan, vilket i sin tur inducerar genuttrycket av olika pro-inflammatoriska cytokiner. En detektions analys för IRF5 aktivering är avgörande för att studera IRF5 funktioner och dess relevanta vägar. Denna artikel beskriver en robust analys för att upptäcka endogena IRF5 aktivering i Cal-1 Human dess dendritiska cell (pDC) linje. Protokollet består av en modifierad nondenaturing elektrofores assay som kan skilja IRF5 i sin monomer och dimer former, vilket ger en prisvärd och känslig metod för att analysera IRF5 aktivering.

Introduction

Interferon reglerande faktor 5 (IRF5) är en viktig transkription regulator som spelar en framträdande roll i regleringen av immunförsvaret, särskilt i frisättning av pro-inflammatoriska cytokiner och typ I interferoner (ifns)1,2 ,3. Misregulation av IRF5 är en bidragande faktor i många autoimmuna sjukdomar, som framgår av olika polymorfismer i IRF5 Locus som är förknippade med systemisk lupus erythematosus, multipel skleros, reumatoid artrit, etc.4, 5,6,7,8,9,10. Därför är en robust detektions analys för endogena IRF5 aktiveringstillstånd avgörande för att förstå de reglerings vägar och nedströms effekter av IRF5 i en fysiologiskt relevant cellulära sammanhang.

IRF5 är konstitutivt uttrycks i monocyter, dendritiska celler (DCs), B-celler, och makrofager1,11. Som med andra IRF familj transkription faktorer, IRF5 bosatt i cytoplasman i dess latent tillstånd. Vid aktivering, IRF5 är fosforyleras och bildar homodimers, som sedan translocate i kärnan och binda till specifika reglerande element av gener kodning typ I IFNs och pro-inflammatoriska cytokiner, så småningom inducera uttrycket av dessa gener1 ,2,11,12,13. IRF5 reglerar de medfödda immunsvaren nedströms olika Toll-liknande receptorer (TLRs), såsom TLR7, TLR 8, och TLR 9, som är lokaliserade i hos och använda MyD88 för signalering1,11,14. Dessa TLRs erkänna främst utländska nukleinsyra arter såsom enkelsträngad RNA (ssRNA) och unmethylated CPG DNA som är symptomatiskt för en infektion15,16,17,18. IRF5 har visat sig reglera immunsvaret mot bakteriella, virala och svampinfektioner19,20,21. Med tanke på IRF5's inflytelserika och varierande roll i immunförsvaret, förbättra eller dämpa IRF5 aktivitet skulle kunna fungera som en roman Avenue för utveckling av terapeutiska agenter22. Därför är det viktigt att utveckla ett protokoll för att övervaka aktiveringsstatusen för endogena IRF5 för att möjliggöra en grundlig utredning av de vägar och mekanismer som reglerar IRF5 aktivitet i olika celltyper.

Enligt vår vetskap har ingen biokemisk eller gel-elektroforetisk analys för endogen IRF5 aktivering publicerats före utvecklingen av detta protokoll. Fosforylering har visat sig vara ett viktigt första steg i IRF5 aktiveringen och en fosfospecifik IRF5 antikropp utvecklades som ledde till upptäckten och bekräftelsen av en serinrester viktig för IRF5 aktivitet13. Men medan antikroppen tydligt upptäcker fosforylerade IRF5 när immunoprecipitated eller överuttryckt23, det misslyckas med att upptäcka IRF5 fosforylering i en hel cell lysate i våra händer (data visas inte). Dimerization är nästa steg i IRF5 aktiveringen, och många viktiga studier hittills undersökt detta steg förlitade sig på överuttryck av Epitope-märkta IRF5, ofta i irrelevanta celltyper som normalt inte uttrycker IRF511,12 ,24,25. Tidigare studier har visat att dimerized IRF5 kanske inte alltid translocate in i kärnan och därmed är inte nödvändigtvis fullt aktiverad25,26. Ett test för endogen IRF5 nukleär lokalisering utvecklades för att bedöma IRF5 aktivering av Imaging Flow flödescytometrianalys27. Denna analys har tillämpats i studier som var avgörande för att förstå IRF5 aktivitet, särskilt i primära eller sällsynta celltyper28,29 och kraftigt avancerade kunskaper inom området. Emellertid, denna analys förlitar sig på ett specialiserat instrument som inte är allmänt tillgänglig för forskare. Vidare är det ofta nödvändigt att undersöka de första stegen för aktivering samtidigt dissekera IRF5 reglerings vägar och identifiera uppströms tillsynsmyndigheter och komponenter väg. Denna studie ger en robust och tillförlitlig biokemisk analys för tidiga aktiverings händelser av IRF5 som kan utföras i laboratorier utrustade med molekylärbiologi verktyg. Det protokoll som beskrivs här kommer att vara mycket användbart för att undersöka vägar och mekanismer för IRF5 åtgärder, särskilt i kombination med ortogonala analyser såsom Imaging Flow kors analys av IRF5 nukleär lokalisering23, 27,28,30.

Native polyakrylamid gel elektrofores (infödda sida) är en allmänt använd metod för att analysera proteinkomplex31,32. Till skillnad från natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), separerar den infödda sidan proteiner på grundval av deras form, storlek och laddning. Det behåller också inhemska proteinstruktur utan denaturering31,33,34,35. Det protokoll som presenteras utnyttjar dessa funktioner i infödda sida och upptäcker både monomeriska och dimeriska former av IRF5. Denna metod är särskilt viktig för att upptäcka tidiga aktiverings händelser eftersom det inte finns någon lämplig kommersiellt tillgänglig antikropp som kan detektera endogena fosforylerade IRF5. Tidigare, flera publicerade studier används infödda sida för att bedöma IRF5 Dimerization. Majoriteten av dessa studier berodde dock på överuttryck av exogena Epitope-märkta IRF5 att analysera aktiveringsstatus2,13,24,36,37 . Detta arbete presenterar ett steg-för-steg-protokoll för att analysera endogena IRF5 Dimerization via en modifierad infödd sida teknik i en human dess dendritiska cell (pDC) linje, där IRF5 aktivitet har visat sig vara avgörande för dess funktion1, 38,39,40. Samma teknik har tillämpats på andra cellinjer23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Anmärkning: Protokollet som beskrivs här använder CAL-1 pDC-celllinje som behandlats med resiquimod (R848), en agonist för TLR7/8. Detta protokoll har tillämpats på andra människor och murina celltyper, inklusive rå 264,7 (murina makrofag linje), THP-1 (Human monocytisk cellinjer), bjab (Human b cellinjer), Ramos (Human b cell Line), och mutz-3 (Human dendritiska cellinjer)23.

1. stimulering av CAL-1 celler

  1. Bibehålla CAL-1 cellkulturer i en T75 kolv vid 37 ° c och 5% CO2 under sterila förhållanden med 20 − 25 ml rpmi 1640 medium som innehåller 5% foster bovint serum (FBS), 25 mm Hepes, och 1x merkaptoetanol (dvs komplett rpmi 1640 medium).
  2. Överför cellerna till ett 50 mL koniskt rör.
    Anmärkning: CAL-1-celler är icke-anhängare. För anhängare av celltyper kan standard trypsinization utföras för att skörda celler.
  3. Centrifugera cellerna vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Avlägsna supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 8 mL av det kompletta RPMI 1640-mediet för att få en homogen encellig suspension.
  4. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Utsäde cellerna vid en densitet av 1 x 106 celler per brunn i en 6 väl tallrik med 4 ml förvärmd komplett rpmi 1640 medium i varje brunn. Inkubera i 20 − 24 timmar vid 37 ° c och 5% CO2 för att möjliggöra sammanlänkning för att nå 90% − 95% (motsvarande cirka 1,5 x 106 celler).
  5. Stimulera cellerna genom att tillsätta 4 μL av 1 mg/mL R848 per brunn av den 6 väl plattan (slutkoncentration av 1 μg/mL). Också ställa in en ostimulerad kontroll väl med celler utan R848 behandling.
  6. Se till att R848 är jämnt fördelad genom att försiktigt gunga plattan sida till sida. Inkubera sedan cellerna i 2 − 16 timmar i inkubatorn vid 37 ° c och 5% CO2.

2. extraktion av cellulära proteiner

  1. Överför cell upphängningarna från 6-välsplattan till 5 mL centrifugrör.
  2. Centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid RT. ta bort supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att få en homogen encellig suspension.
  3. Överför cellsuspensionen till ett 1,5 mL centrifugeringsrör.
  4. Snurra kort på 12 000 x g för 0.5 − 1 min vid 4 ° c och ta försiktigt bort supernatanten.
  5. Bered lyseringsbufferten med 6,25 mL 1 M Tris-HCl pH 7,4 (slutkoncentration 25 mM), 7,5 mL 5 M NaCl (slutlig koncentration på 150 mM), 0,5 mL 0,5 M EDTA (slutlig koncentration av 1 mM), 2,5 mL NP-40 (slutlig koncentration av 1%) och 7,5 mL glycerol (slutlig koncentration av 5%) i 250 mL avjoniserat vatten (ddH2O). Tillsätt 100x proteashämmare engångs-cocktail till en slutlig koncentration av 1x till lyseringsbufferten strax före användning. Förvara den förberedda lyseringsbufferten på is.
    Anmärkning: Lyseringsbufferten utan proteasen kan förvaras vid 4 ° c.
  6. Omsuspendera cellpelleten i 30 μL iskall lyseringsbuffert och blanda genom att Pipettera upp och ner.
  7. Inkubera på is i 15 − 20 min.
  8. Förtydliga lysatet genom centrifugering vid 12 000 x g i 15 − 20 min vid 4 ° c. Överför supernatanten till ett nytt prekyld 1,5 mL centrifugeringsrör. Håll extrakten på isen hela tiden.
    Anmärkning: Cell lysaterna kan förvaras vid-20 ° c eller-80 ° c. Koka inte proverna.
  9. Mät protein koncentrationen med hjälp av Bradford reagens.

3. analys av IRF5 Dimerization av infödd sida

  1. Förbered den övre (-) och nedre (+) kammaren elektrofores buffertar. Den övre kammaren buffert består av 0,3% natrium deoxicholat (nadoc) i 1x infödd sida rinnande buffert, och den nedre kammaren består av endast 1x infödda sida springbuffert.
    Anmärkning: Förbered en fräsch övre kammare buffert för varje ny körning.
  2. Skölj en 3% − 12% inbyggd sida gel noggrant med vatten utan att förvränga brunnarna. Ställ in gelen i mini gel tanken och ta bort kammen. Prerun gelen i en 4 ° c kallt rum eller på is vid 150 V i 30 min.
    Anmärkning: Prerunning avlägsnar överdriven ammoniak och persulfat joner som kan störa rinnande av gelen.
  3. Under prerun, Förbered proverna för lastning genom att blanda cellulära proteiner som hålls på is med 4x infödda prov buffert.
  4. Efter prerun, Ladda 10 − 15 μg protein med en slutlig volym av 10 − 15 μL per prov.
    Anmärkning: Överlastning av protein kan orsaka smetas.
  5. Kör gel på 85 V i 30 min, sedan 150 V för 2 h.
    Anmärkning: Med tanke på skillnader i utrustning och cellinjer som används i olika laboratorier kan mindre ändringar av koncentrationen av proteinprover, spänning och drifttid vara lämpliga för att optimera detta protokoll. Sänka pre-löpning och löpande spänningen fördriva tiden ökande löpande tid maj hjälp till förbättra dimer beslutsamhet och resultera konsistensen.
  6. Blötlägg gelen i SDS löpbuffert (25 mM Tris pH 8,3, 250 mM glycin, 0,1% SDS) i 30 minuter vid RT.
    Anmärkning: Ingen omrörning krävs. Ibland kan intensiteten av bandet inte vara proportionell mot mängden protein som lastas på grund av ineffektiv överföring i närvaro av deoxicholat (doc), som främst påverkar monomeren form av IRF5. Blötläggning gelen i SDS löpbuffert före överföringen löser detta problem. Gelen är bräcklig. Hantera med extrem omsorg från botten (dvs. högre procent) änden av gelen.

4. immunoblot analys av IRF5

  1. Aktivera av polyvinylidenklorid vinylidendifluorid (PDVF) membran genom blötläggning den i metanol för cirka 5 min.
  2. Gör ett snitt på ett hörn av membranet för att indikera dess orientering. Montera transfer Sandwich enligt den ordningsföljd som beskrivs i tillverkarens protokoll med extra omsorg för att säkerställa att inga luftbubblor fastnar inom.
  3. Placera överförings kassetten i tanken och överför vid 20 V för 1 h på is.
    Anmärkning: Utför alla inkuberingar och tvättar i efterföljande steg med en gungshaker.
  4. Ta bort membranet från kassetten med plasttång efter överföringen är klar. Blockera membranet i blockeringsbuffert (TBS) för 45 min vid RT.
    Anmärkning: TBS-buffert med 5% BSA kan också användas som blockeringsbuffert.
  5. Inkubera membranet med den primära antikroppen som listas i tabell 1. Tvätta membranet med 1x TBST tvättbuffert (20 mM Tris, pH 7,0, 150 mM NaCl och 0,1% Tween 20) för 3 min medan gunga. Upprepa tvätten 2x.
Utspädnings Dillueringbuffert Inkubation Kommentarer
Primär antikropp (anti-IRF5) 1/1000 TBS blockerande buffert Över natten vid 4 ° c eller 2 timmar vid RT Utspädda antikroppar kan återanvändas flera gånger om de förvaras vid 4 ° c i närvaro av 0,02% natriumazid.
Sekundär antikropp (anti-kanin) 1/10000 TBS blockerande buffert 45 min vid RT Utspädda antikroppar kan återanvändas flera gånger om de förvaras vid 4 ° c i närvaro av 0,02% natriumazid.
Anmärkning: Utspädning måste optimeras eftersom det varierar mellan tillverkarna.

Tabell 1: specifikationer för de antikroppar som används vid Immunoblotting.

  1. Inkubera membranet med den sekundära antikroppen som anges i tabell 1. Tvätta membranen i 3 min i 1x TBST tvättbuffert. Upprepa tvätten 2x.
  2. Skanna blot med ett lämpligt gel dokumentationssystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunoblot (IB) med en anti-IRF5-antikropp utfördes på CAL-1-celler ostimulerad eller stimulerad med 1 μg/mL R848 för 2 h (figur 1). Cell celllysat har förberetts och den ursprungliga sidan utfördes. I ostimulerade CAL-1-celler upptäcktes IRF5 som ett enda band på den ursprungliga sidan, motsvarande dess monomerform. Vid behandling av CAL-1 celler med R848 för 2 h, nivån på IRF5 monomer minskade med en samtidig ökning av ansamling av ett långsamt flytt band som motsvarade den dimeriska formen av IRF5.

Figure 1
Figur 1: endogena IRF5 dimerized i Cal-1 celler när stimuleras med TLR7/8-agonist. CAL-1 celler obehandlade eller behandlades med R848 för den angivna tiden. Proteinprover löstes genom en infödd sida och följdes av IB med anti-IRF5-antikroppen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Immunoblot med anti-IRF5 antikropp utfördes på IRF5-överuttrycker 293t celler untransfected och transfekterade med olika konstruktioner. Cell celllysat utarbetades och infödda sida utfördes (figur 2). Ingen IRF5 upptäcktes i untransfected 293T-celler, vilket visar anti-IRF5-antikroppens specificitet. Ett enda band som motsvarar monomeriska IRF5 upptäcktes endast i 293T-cellerna som överuttrycker IRF5. När konstruerar kodning IRF5-aktiverande proteiner, inklusive NRIG (konstitutivt aktiva RIG-I), MAVS och IKKβ var cotransfected, ett långsamt flytt band som motsvarar den dimeriska formen av IRF5 dök upp. Emellertid, NMDA5 (konstitutivt aktiv MDA5), ett relaterat protein till RIG-jag, inducerade inte IRF5 Dimerization när cotransfected.

Figure 2
Figur 2: Cotransfektion av IRF5-aktiverande faktorer inducerade IRF5 Dimerization i 293T celler. 293t-cellerna var otransfected (Lane 1) eller transfekterade med IRF5 (Lane 2) tillsammans med olika IRF5 regulatorer (körfält 3 − 6). Proteinprover löstes genom en infödd sida och följdes av IB med anti-IRF5-antikroppen. NRIG = N-Terminal av RIG-I; NMDA5 = N-terminalen på MDA5. (Publicerades ursprungligen i Journal of Immunology. KT Chow, C Wilkins, M Narita, R Green, M Knoll, YM Loo och M Gale Jr 2018. Differential och överlappande immun program regleras av IRF3 och IRF5 i Plasmacytoid dendritiska celler. J. Immunol. 201 (10) 3036-3050. Copyright © 2018 American Association of Immunologer, Inc.23). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet som beskrivs här är en modifierad infödd sida som skiljer både monomeriska och dimeriska former av endogena IRF5. Det har varit få studier som rapporterar upptäckten av endogena IRF5 aktivering med hjälp av specialiserade Imaging Flow flödescytometrianalys teknik23,27,28,30. Detta protokoll använder en gemensam teknik och vanliga reagenser och verktyg för att bedöma det endogena IRF5 aktiveringstillståndet under de tidiga händelserna av aktivering. Protokollet innebär enkla ändringar av ett standardiserat inbyggt sid protokoll för att göra det möjligt att skilja mellan de monomeriska och dimeriska formerna av IRF5. Det kan lätt anpassas till studier med andra cellinjer23. Detta modifierade infödda sida protokoll kan lösa endogena IRF5 i dess två former klart utan icke-specifika proteininterferenser (figur 2). Endogena IRF5 från ostimulerade celler upptäcktes som ett tydligt singelband i detta gel system, medan behandling med R848 för 2 h resulterade i ett band som motsvarade IRF5 dimerer (figur 1).

En infödd sida Dimerization assay för IRF3, en liknande transkriptionsfaktor till IRF5 i samma familj, har utvecklats och används flitigt under de senaste två decennierna32. Trots omfattande tester och felsökning kunde vi inte tillämpa samma protokoll som använder Laemmli Tris-Glycine-systemet för att lösa IRF5 monomer och dimer. Det protokoll som beskrivs i denna artikel använder BIS-Tris gradient Gels, som har en mycket annorlunda kemi till Tris-Glycine enda procentuella geler som används i IRF3 protokollet. Den olika pH och kemiska sammansättningen av gel elektroforetiska system kan vara avgörande för att skilja de olika formerna av IRF3 och IRF5. Faktum är att IRF3 och IRF5, medan liknande, har olika egenskaper (t. ex. isoelektriska punkter och modifieringsplatser) sannolikt resulterar i olika beteenden samtidigt som separeras på olika gel-system.

En 1x infödd sida som kör buffert som innehåller DOC användes för gel körningen. Bufferten måste förberedas färsk eller förvaras i en ren och protein fri miljö för att undvika uppkomsten av vita utfällning grumling lösningen i övre kammaren som en följd av DOC utfällt icke-specifika proteiner. Det rekommenderas starkt att de extraherade endogena IRF5 proverna utsätts för den infödda sidan så snart som möjligt, helst inom en vecka med minimal frys-Tina cykler. Annars kan det finnas betydande proteinnedbrytning. Nedbrytningen observeras med förvaring vid både-80 ° c och-20 ° c. Dessutom bör pH i SDS-löpbufferten och TBST-tvättbufferten justeras vid RT.

Den idealiska slutvolymen av prov som laddats i varje brunn var 10 − 15 μL, men smärre justeringar kan krävas beroende på olika celltyper. Efter den första körningen på 85 V för 30 min, det rekommenderas att fortsätta köra gelen vid 150 V för ca 2 till 3 h för att uppnå distinkt separation och upplösning av IRF5 monomer och dimer. Efter körningen är klar, är det av yttersta vikt att hantera gelen minutiöst från dess nedre änden på grund av dess differentiella nivåer av densitet, som sträcker sig från 3% på toppen och ökar mot 12% i botten. I detta fall är det bättre att ta bort gelen från plattan genom att doppa den i den använda löpbufferten, som fungerar som en effekt kudde för att minimera friktion och gör att gelen att flyta bort från plattan för att undvika brott.

Några smärre nackdelar med detta protokoll inkluderar det begränsade urvalet av geler som är tillgängliga för att uppnå önskat resultat. Hemlagad geler och några andra märken av kommersiellt tillgängliga geler har testats utan framgång. I våra händer bidrog användningen av en kommersiell löpbuffert och ett gel system till robustheten och reproducerbarheten i detta protokoll, även om omfattande tester av hemmagjorda buffertar inte har utförts. Uppmärksamhet på detaljer är viktigt, och erfarenhet är nyckeln till framgång i att få tydliga resultat. Avslutnings, krävde upplösningen av IRF5 en lång tid (dvs., 2 − 3 h) för att få en ideal avskiljande av monomeren och dimeren. Ytterligare förbättringar och ändringar i framtiden kan förbättra effektiviteten och minimera nackdelarna med detta protokoll.

Sammanfattningsvis är detta protokoll en robust analys för detektion av endogena IRF5 monomer och dimer. Den är lämplig för tillämpningar i olika mänskliga och murina celltyper som uttrycker endogena IRF5. Det kommer att vara ett värdefullt verktyg för att studera IRF5 reglerings vägar och signalering komponenter i olika celltyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Arbetet stöddes av finansiering från Croucher Foundation och City University Startup Funds. Vi tackar alla medlemmar i Chow Laboratory för hjälp med experimentet och kritisk läsning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Life Technologies, HK 21985023
300 W/250 V power supply 230 V AC Life Technologies, HK PS0301
Anti-IRF5 antibody Bethyl Laboratories, USA A303-385
BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) EcoLife, HK MR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mL Life Technologies 15575020
Glycerol 500 mL Life Technologies 15514011
Glycine Life Technologies, HK 15527013
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 610-145-002-0.5
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 611-145-002-0.5
Halt protease inhibitor cocktail (100x) Thermo Fisher Scientific, HK 78430
HEPES Life Technologies, HK 15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) Gene Company, HK 927-50000
Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories Life Technologies, HK NW2000
NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit Life Technologies, HK BN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20x Life Technologies, HK BN2001
NativePAGE Sample Buffer 4x Life Technologies, HK BN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol Tin Hang/Calbiochem, HK #492016-100ML
PBS 7.4 Life Technologies, HK 10010023
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Bio-gene/Merck Millipore, HK IPFL00010
Protein assay kit II (BSA) Bio-Rad, HK 5000002
R848 Invivogen, HK tlrl-r848
RPMI 1640 Life Technologies, HK 61870127
Sodium Chloride ThermoFisher BP358-1
Sodium deoxycholate ≥97% (titration) Tin Hang/Sigma, HK D6750-100G
Tris Life Technologies, HK 15504020
TWEEN 20 Tin Hang/Sigma, HK #P9416-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434, (7030), 243-249 (2005).
  2. Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17438-17443 (2014).
  3. Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10, (11), (2018).
  4. Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
  5. Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8, (1), 1789 (2018).
  6. Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67, (12), 3146-3157 (2015).
  7. Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42, (6), 1477-1487 (2012).
  8. Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184, (2), 796-806 (2010).
  9. Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63, (3), 738-748 (2011).
  10. Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (35), 11001-11006 (2015).
  11. Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280, (17), 17005-17012 (2005).
  12. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28, (24), 7296-7308 (2008).
  13. Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17432-17437 (2014).
  14. McGettrick, A. F., O'Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22, (1), 20-27 (2010).
  15. Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13, (5), 543-551 (2007).
  16. Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8, (8), 594-606 (2008).
  17. Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34, (5), 637-650 (2011).
  18. Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18, (6), 871-882 (2012).
  19. del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38, (6), 1176-1186 (2013).
  20. Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
  21. Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10, (1), 1349 (2019).
  22. Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286, (9), 1624-1637 (2019).
  23. Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201, (10), 3036-3050 (2018).
  24. Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176, (12), 7462-7470 (2006).
  25. Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7, (3), 33098 (2012).
  26. Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280, (4), 3088-3095 (2005).
  27. Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64, (3), 788-798 (2012).
  28. De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
  29. Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24, (5), 1163-1175 (2018).
  30. Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292, (45), 18689-18698 (2017).
  31. Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
  32. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6, (4), 375-388 (2001).
  33. Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1865, (10), 1267-1273 (2017).
  34. Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66, (3), 1002 (1970).
  35. Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochemistry. 43, (35), 11248-11254 (2004).
  36. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22, (1), 117-127 (2010).
  37. Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283, (21), 14295-14308 (2008).
  38. Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178, (11), 6876-6885 (2007).
  39. Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43, (7), 1896-1906 (2013).
  40. Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7, (5), 1001345 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics