多細胞三次元回転楕円体を生成するためのラボオンCDプラットフォーム

Bioengineering

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Summary

細胞回転楕円体を培養できるモータ駆動遠心マイクロ流体装置を紹介する。この装置を使用して、単一または複数の細胞タイプの回転楕円体は、高い重力条件下で容易に共培養することができる。

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Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee, J. C., Park, J. Y. Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids. J. Vis. Exp. (153), e60399, doi:10.3791/60399 (2019).

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Abstract

三次元回転楕円体細胞培養は、2次元細胞培養よりも生体の細胞微小環境をより良くシミュレートできるため、細胞実験でより有用な結果を得ることができる。本研究では、遠心マイクロ流体ベースの回転楕円体(CMS)培養システムと呼ばれる電気モータ駆動ラボオンCD(コンパクトディスク)プラットフォームを作製し、高遠心力を実装する三次元(3D)細胞回転楕円体を作製した。この装置は1 x gから521 x gに重力条件を生成するために回転速度を変えることができる。CMSシステムは直径6cmで、100400μmのマイクロウェルを有し、コンピュータ数値制御機によって予め作られたポリカーボネート型でポリジメチルシロキサンで成形することによって作られています。CMSシステムのチャネル入り口のバリアウォールは、遠心力を使用してチップ内に均等に細胞を広げます。チャネルの終わりに、細胞がマイクロウェルに入ることを可能にするスライド領域があります。デモンストレーションとして、スフェロイドは、システムを用いた高重力条件下でヒト脂肪由来幹細胞およびヒト肺線維芽細胞の単一培養および共培養によって生成された。CMSシステムは、単純な操作スキームを使用して、同心円、ヤヌス、およびサンドイッチの様々な構造の共培養回転楕円体を生成しました。CMSシステムは、単一または複数の細胞型のスフェロイドおよびオルガノイド培養を必要とする細胞生物学および組織工学研究に有用であろう。

Introduction

2次元(2D)細胞培養(例えば、従来のペトリ皿細胞培養)よりも3次元(3D)スフェロイド細胞培養で生体内の微小環境で生物学的なシミュレーションを行い、より生理学的に現実的な実験を行う方が簡単です。結果1.現在入手可能な回転楕円体形成方法には、吊り下げ滴法2、液体オーバーレイ技術3、カルボキシメチルセルロース技術4、磁力系マイクロ流体技術5、及びバイオリアクター6.それぞれの方法には独自の利点がありますが、再現性、生産性、および共培養スフェロイドの生成のさらなる改善が必要です。例えば、磁力系マイクロ流体技術5は比較的安価であるが、強磁場が生細胞に及ぼす影響は慎重に検討しなければならない。回転楕円体培養の利点は、特に間葉系幹細胞分化および増殖の研究において、いくつかの研究において報告されている7、8、9である。

集光マイクロ流体システムは、ラボオンCD(コンパクトディスク)とも呼ばれ、内部の流体を容易に制御し、基板の回転を利用するのに有用であり、従って免疫測定法10などの生物医学的用途に利用されてきた。生化学的マーカー11を検出するための比色アッセイ、核酸増幅(PCR)アッセイ、自動血液分析システム12、およびオールインワン遠心マイクロ流体デバイス13。流体を制御する駆動力は、回転によって作成される引力です。さらに、混合、評価、およびサンプル分割の複数の機能は、この単一の CD プラットフォームで簡単に行うことができます。しかしながら、上記の生化学的分析方法と比較して、培養細胞、特にスフェロイド14にCDプラットフォームを適用する試験は少なくなっている。

本研究では、ヒト脂肪由来幹細胞(hASC)及びヒト肺線維芽細胞(MRC-5)の単一培養又は共培養による遠心微流体系回転楕円体(CMS)系の性能を示す。本論文では、当社グループの研究方法論15について詳しく述べている。これにより、スフェロイド培養ラボオンCDプラットフォームを容易に再現することができる。CMSカルチャーチップ、チップホルダー、DCモータ、モータマウント、回転プラットフォームを備えたCMS生成システムを提示します。モーターマウントは、アクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS)で3Dプリントされています。チップホルダーと回転プラットフォームは、PC(ポリカーボネート)で加工されたCNC(コンピュータ数値制御)です。モータの回転数は、パルス幅変調に基づいてPID(比例積分微分)アルゴリズムを符号化することにより、200~4,500rpmを制御します。寸法は100mm×100mm×150mmで、重さは860gで取り扱いが容易です。CMSシステムを使用すると、スフェロイドは1 x gから521 x gまでの様々な重力条件下で生成できるため、高重力下での細胞分化促進の研究を2D細胞16、17から3Dに拡張することができます。回転 楕円 体。種々の種類の細胞の共培養も、生体内環境18を効果的に模倣するための重要な技術である。CMSシステムは、様々な構造タイプ(同心円、ヤヌス、サンドイッチなど)の共培養スフェロイドだけでなく、単一培養スフェロイドを簡単に生成することができます。CMSシステムは、単純な回転楕円体研究だけでなく、3Dオルガノイド研究にも利用することができ、ヒト臓器構造を考慮する。

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Protocol

1. 遠心マイクロ流体ベースの回転楕円体(CMS)培養チップ製造

  1. CNC加工により、CMSカルチャーチップの上下層用のPC金型を作ります。チップの詳細な寸法を図1に示します。
  2. PDMSベースとPDMS硬化剤を5分間10:1(w/w)の比率で混合し、デシケータに1時間置いて気泡を除去します。
  3. CMS培養チップの金型にPDMS混合物を注いだ後、気泡を1時間以上取り除き、80°Cのヒートチャンバーで2時間硬化させます。
  4. 表面を上に接合する真空プラズマクリーナーに入れ、30sで18 Wのパワーでエアアシストプラズマにさらします。
  5. CMSカルチャーチップの2層を接着し、80°Cのヒートチャンバーに30分間入れ、接着強度を高めます。
  6. CMS培養チップを121°Cおよび15 psiのオートクレーブ滅菌器で殺菌します。

2. 細胞調製

  1. 5×105-1×106hASCまたはMRC-5s細胞を含むバイアルの1mLを36.5°Cの水浴中で2分間解凍します。
  2. ダルベッコのオグニドイーグルミディアム(DMEM)をバイアルに1mL加え、1,000μLピペットと軽く混ぜます。
  3. 36.5°Cに前温したDMEMの15mLをピペットを使用して直径150mmのペトリ皿に入れ、バイアルから細胞を加えます。
  4. 1日後、DMEMを吸引し、新鮮なDMEMの15 mLに交換してください。その後、2~3日ごとにメディアを変更します。
  5. ペトリ皿から細胞を切り離すために、ペトリ皿に4mLのトリプシンを加え、36.5°Cでインキュベーターに入れ、4分間5%CO2に入れます。

3. 単一培養回転楕円体形成

  1. 2.5 mL の 4% (w/v) プロウロン F-127 溶液を CMS カルチャー チップの入口穴 (図 2A)に入れ、チップを 500 ~ 1,000 rpm で回転させ、CMS システムを使用して 4,000 rpm で 3 分間チップを回転させます (図 2B)。
    メモ:プルーニックコーティングは、チップの回転中に入口ポートへのセルアタッチを防止します。空気がマイクロウェルに閉じ込めされていないことを確認します。
  2. 5%CO2で36.5 °Cで一晩プロロニック溶液で満たされたCMS培養チップをインキュベートします。
  3. プレロニック溶液を取り出し、残りのプルロニック溶液をDMEMで洗い流し、チップを12時間乾燥させます。
  4. CmSカルチャーチップに2.5 mLのDMEMを追加し、チップ内部を前もって3分間約4,000rpmで回転させます。
  5. 回転を停止し、DMEMの100°Lを引き出して、セルサスペンションを注入するスペースを作ります。
  6. 5 × 105 hASC または 8× 105 MRC-5s を含むセル懸濁液を 100 μL 加え、ピペットで 3 ~ 5x のリサスペンション用にセルを均一に分散します。
  7. チップを3,000 rpmで3分間回転させ、各マイクロウェルのセルを遠心力でトラップします。
    メモ:回転速度が過度すぎると、溶液の放出穴を通してセルエスケープが発生する可能性があります。
  8. 36.5°C、>95%湿度、5%CO2でインキュベーターで3日間細胞を培養し、1,000~2,000rpmで回転させる。毎日文化培地を変える。

4. コカルチャースフェロイド形成

  1. 同心円球状形成
    1. 最初のセル、2.5 × 105 hASC を追加し、チップを 3,000 rpm で回転させます。3分後、2番目の細胞、4×105 MRC-5sを加え、3,000rpmで3分間チップを回転させます。細胞が注入されたら、回転速度を500-1,000 rpmにシフトします。
    2. インキュベーター内の細胞を36.5°C、>95%湿度%、5%CO2で培養し、1,000~2,000rpmで回転させた。同心円回転楕円体は 24 時間以内に作成されます。長期的な文化のために、毎日文化培地を変更します。
  2. ヤヌス・スフェロイド形成
    1. チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、最初のセルを含む100μLのセル懸濁液を2.5× 10 5 hASCに加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。
    2. チップを36.5°C、湿度95%、CO25%で3時間1,000~2,000 rpmで回転させてインキュベートします。
    3. チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、2番目のセルセットを含むセル懸濁液を100μL、4×105 MRC-5sに加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。
    4. インキュベーター内の細胞を36.5°C、>95%湿度、5%CO2で培養し、1,000~2,000rpmで回転させた。ヤヌス・スフェロイドは24時間以内に作成されます。長期的な文化のために、毎日文化培地を変更します。
  3. サンドイッチ回転楕円体形成
    1. チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、最初のセルを含む100μLのセル懸濁液(1.5×105 hASC)を加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。
    2. チップを36.5°C、湿度95%、CO25%で3時間1,000~2,000 rpmで回転させてインキュベートします。
    3. チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、2番目のセルを含む100μLのセル懸濁液を3×105 MRC-5sに加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。
    4. チップを36.5°C、>95%湿度%、5%CO2で3時間1,000~2,000 rpmで回転させてインキュベートします。
    5. チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、3番目のセルを含む100μLのセル懸濁液(1.5×105 hASC)を加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。
    6. インキュベーター内の細胞を36.5°C、>95%湿度%、5%CO2で培養し、1,000~2,000rpmで回転させた。サンドイッチ回転楕円体は12時間以内に作成されます。長期的な文化のために、毎日文化培地を変更します。

5. 細胞染色

  1. 細胞蛍光色素を室温(20°C)まで温める。
  2. バイアルあたり20μLの無水ジメチルスルホキシド(DMSO)を加えるため、1mM溶液を作ります。
  3. DMEMを使用して蛍光を1μMの最終作業濃度に希釈します。
  4. 蛍光を細胞懸濁液に加え、ピペットを使用して穏やかに再サスペンドします。
  5. 36.5 °Cで 20 分、湿度 >95%、および 5% CO2をインキュベートします。

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Representative Results

直径6cmCMCMS培養チップ(図2)は、上記のプロトコルに従って正常に作られました。まず、チップを最上層と底層とは別に作り、プラズマ結合により結合した。得られた回転楕円体は、チップを取り外すことによって容易に集めることができる。CMSカルチャーチップのチャネルは、入口ポートと中央、スライド、およびマイクロウェル領域で構成されます(図3)。細胞、中、およびプレロン溶液は、直径5mmの入口穴を通して注入される。注入された細胞は、入口ポート領域の再懸濁液3~5倍によって均等に分布する。細胞は中央領域で遠心力を受け、外側に広がる。中央領域はマイクロウェルよりも高いため、より多くのメディアを含むことができ、回転楕円体がより長く生き残ることができます。マイクロウェルの高さは0.4mm、中央領域の高さは1.5mmであり、吸引孔は中央領域の中心に存在し、内部溶液を容易に取り除く。スライド領域は、中央領域とマイクロウェル領域を結ぶ傾斜領域である。細胞は45°の斜面に沿って移動し、細胞が定着し、成長し、回転楕円体を形成するためにもつれがあるマイクロウェル領域に沈殿する。チップの中心から14mmに位置するマイクロウェルは、高さ400μm、直径400μmの半円筒状です。合計100個のスフェロイドを100マイクロウェルで同時に生成できます。

準備された CMS チップを使用すると、プロトコルに示す順序で回転楕円体を生成できます (図 4)。hASCおよびMRC-5細胞を用いて単培養および共培養スフェロイドを生成した。各種類の細胞の単培養回転楕円体を生成するために、5×105hASCまたは8×105MRC-5sを注入した。 注入された細胞の数は、細胞サイズとは無関係であった。両方の種類の細胞のタイムラプス画像を、細胞培養3日目まで2,000rpmで撮影した(図5)。hASCおよびMRC-5の共培養回転楕円体も同心円、ヤヌス、およびサンドイッチ構造で生成された。同心円球状を作製するために、第1細胞(2.5×105hASC)を注入し、2番目の細胞(4×105MRC-5s)を3分後に注入した(図6A)。 最初の細胞を注入すると、重力が高いためU字型になり、2番目の細胞を注入するとU字型の真ん中に移動しました。時間が経つにつれて、最初のU字型の細胞は2番目の細胞を囲み、同心円球状を完成させた。ヤヌス・スフェロイドを作製するために、第1細胞(2.5×105hASC)を注入し、2番目の細胞(4×105MRC-5s)を3時間後に注入した(図6B)。 2 つのセル間の射出間隔が長い場合、最初のセルの形状が U 字型から楕円形状に変化します。第2の細胞を第1の細胞の楕円形状に加え、ヤヌス・スフェロイドを生成した。サンドイッチ回転楕円体の場合、第1細胞(1.5×105hASC)を注入し、2番目の細胞(3×105MRC-5s)を3時間後に注入し、3番目の細胞(1.5×105hASC)を次の3時間後に注入した(図6C)。).ヤヌス・スフェロイドと同様に、各細胞は楕円形状に凝集し、3つの層を積み重ねてサンドイッチ回転楕円体を生成した。最後に、CMSの長期培養能力を実証するために、hASCを培養し、7日間高重力にさらし、続いて生死球を行い、ほとんどの細胞が生き残ったことを示した(図7)。また、CMSのすべてのマイクロウェルの写真は、MRC-5s栽培の3日後に撮影され、スフェロイドの優れた均一性と球状性を示した(図8)。

Figure 1
図 1: CMS カルチャー チップの上部と下部の層の寸法PC金型はCNCマシンを使用して作られ、PDMSで複製され、3D CAD(コンピュータ支援設計)プログラムによって作成された図面に基づいてCMSカルチャーチップを作りました。上層と下層のエッジにある 4 つの円は、2 つのレイヤーを整列するための円です。寸法はミリメートルです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:CMSシステムの写真(A) 完成したCMSカルチャーチップの写真。チップの直径は6cm、マイクロウェルの直径は400μmです。マイクロウェルの上の数値は、1から100までのマイクロウェルの個々の数を表します。これらの数字は金型に刻まれた。スケール バー = 400 μm(B) CMSシステム全体の写真。CMSシステムはCMS培養チップ、チップホルダー、DCモータ、回転プラットフォームで構成されています。CMS デバイスは、回転力を通じて最大 521 x gの重力条件を生成できます。チップホルダーは、重力の高さによるCMSカルチャーチップの分離を防ぎます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: CMS のチャネル コンポーネント(A)CMS培養チップの断面の模式画像および(B)写真。CMSカルチャーチップは、入口ポートと中央、スライド、マイクロウェル領域で構成されています。注入された細胞は1,000rpm未満の回転速度でバリアを通過しないため、バリアは細胞のサスペンション、さらにはマイクロウェルへの分布に役立ちます。スケール バー = 2 mm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。

Figure 4
図4:CMS培養チップに細胞をロードするプロセス。(A) 細胞がチップの底部に付着するのを防ぐために、4,000 rpmで2.5 mLのプルーニックF-127溶液を塗布します。コーティングが適用されるまで1日待ちます。(B) プルーロン溶液を取り外し、DMEM培地の2.5 mLでチャンネルを事前に埋めます。(C) DMEMを100μL取り外し、100μLのセル懸濁液を加えます。このとき、セルが均等に分布するように 3 ~ 5x を再中断します。(D) チップを回転させて細胞をマイクロウェルに移動し、1,000~2,000rpmで3日間培養する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:hASCおよびMRC-5細胞の単培養スフェロイドのタイムラプス写真。細胞を2,000rpmで24時間増殖させた。回転楕円体は24時間以内に生成されたスケールバー= 400μmである。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:共培養スフェロイドの蛍光画像(A)hASC細胞(緑色)がMRC-5細胞(赤色)を囲む同心円球状。(B)2つの細胞が対称であるヤヌス・スフェロイド形状。(C)hASC層が2つのMRC-5層の間に積層されたサンドイッチ回転楕円体形状。スケール バー = 400 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: 7 日目の hASC のライブ/デッド アッセイ緑色の蛍光色は生きている細胞を表し、赤色蛍光色は死んだ細胞を表します。スケール バー = 400 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:3日目のMRC-5回転楕円体。比較的一定の数の細胞が各マイクロウェルに入り、CMSシステムにおいて比較的一定の球状度を有する回転楕円体を形成する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 9
図9:回転楕円体の収穫培養スフェロイドは、CMS培養チップの2層を分割して採取することができる。2つのプラズマ結合層は手で容易に分離することができる。その後、回転楕円体は、単にピペットによって底層のマイクロウェルから収集されます。スケール バー = 400 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

CMSは、注入されたすべての細胞が無駄なくマイクロウェルに入り、従来のマイクロウェルベースの回転楕円体生成方法よりも効率的で経済的なシステムです。CMSシステムでは、チップ内のメディアを取り外すために設計された吸引穴を通して、メディアは12~24時間ごとに交換されます(図3A)。メディア吸引プロセスの間、メディアとマイクロウェルの壁との間の表面張力のために、マイクロウェルの内部からほとんどすべてのメディアが脱出します。PDMS製のチップは弾力性があり柔軟であるため、チップのマイクロウェル領域付近を指で押すことで、閉じ込められたメディアを簡単に取り外すことができます。マイクロウェル内の細胞は、複数のメディアの変更があっても、エスケープすることなく安定したままです。すべての100マイクロウェルで回転楕円体の同じ品質を達成するために、デバイスの回転は偏心してはず、チップは軸対称でなければなりません。そうしないと、可変個のセルが各ウェルに入り、回転楕円体のサイズと形状が異なる場合があります。従来のマイクロウェルシステムでは、空気がマイクロウェルに閉じ込められることが多いため、気泡を除去する必要がある。しかし、CMSシステムは、回転によって発生する遠心力が高いと、メディアが気泡を押し出し、マイクロウェルから絞り出すので、気泡除去プロセスを必要としません。

CMSシステムには、従来の方法と比較して制限もあります。CMSシステムは、モータ、回転プラットフォーム、コントローラを備えるため、より大きな培養スペース(例えば、大きなインキュベータースペース)を必要とし、その合計サイズは約100mm x 100 mm x 150 mmです(図2B)。さらに、それはわずかなが持続的な振動を引き起こす。システムの小型化(うまくいけば6ウェルプレートの大きさに似ています)がこれらの問題を解決することを期待しています。

なお、培養スフェロイドはCMS系の2つの血漿結合層を分離することによって回収することができる(図9)。2つの層の接合は、システム動作中にメディアが漏れるのを防ぐのに十分な強さです。しかし、小さな接合面積のために、それは手で分離可能である。回転楕円体は、ピペットによって下層から単純に収集することができます。

CMSシステムは回転楕円体の生成の従来の方法よりよい再現性および生産性を有する。通常のマイクロウェルや吊り下げ液滴法などの従来の方法は、手間を要する。しかし、CMSシステムでは、チップサイズを増やすだけでスフェロイドの数を増やす方がはるかに簡単です。この装置を用いると、従来の培養方法では容易ではないマルチセル型の培養を必要とするオルガノイドを生成することもできる。本研究の細胞(hASCおよびMRC-5)に加えて、CMSは、スフェロイドを形成することができる様々な他のタイプの細胞を使用して回転楕円体産生に使用することができる。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

この研究は、NRFの基礎科学研究プログラム(2016R1D1A1B0393934418)と生物医療技術開発プログラム(2018M3A9H1023141)によって支援され、韓国政府MSITが資金を提供しました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Cubicon 3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) ATCC PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA Thermo Fisher Scientific C2925 10 mM
CellTracker Red CMTPX Thermo Fisher Scientific C34552 10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver Roland DGA EGX-350
DC motor Nurielectricity Inc. MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020 Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5) ATCC CCL-171
Inventor 2019 Autodesk 3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm JetBiofill CAD010150 Surface Treated
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Pluronic F-127 Sigma Aldrich 11/6/9003 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC) Acrylmall AC15PC 200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Trypsin Gibco 12604021

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References

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