Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

Bioengineering

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Summary

Wir präsentieren ein motorbetriebenes zentrifugales mikrofluidisches Gerät, das Zellsphäride kultivieren kann. Mit diesem Gerät können Sphäroide von einzelnen oder mehreren Zelltypen leicht unter hohen Schwerkraftbedingungen kokultiviert werden.

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Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee, J. C., Park, J. Y. Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids. J. Vis. Exp. (153), e60399, doi:10.3791/60399 (2019).

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Abstract

Eine dreidimensionale sphäroide Zellkultur kann in Zellexperimenten nützlichere Ergebnisse erzielen, da sie Zellmikroumgebungen des lebenden Körpers besser simulieren kann als zweidimensionale Zellkulturen. In dieser Studie haben wir eine elektrische motorgesteuerte Lab-on-a-CD-Plattform (Compact Disc) hergestellt, ein so genanntes zentrifugales mikrofluidisches Sphäroid-basiertesphärisches Sphäroid (CMS)-Kultursystem, um dreidimensionale (3D) Zellsphäride zu erstellen, die eine hohe Zentrifugalkraft implementieren. Dieses Gerät kann die Drehzahlen variieren, um Schwerkraftbedingungen von 1 x g bis 521 x gzu erzeugen. Das CMS-System hat einen Durchmesser von 6 cm, hat hundert 400 m Mikroschäbe und wird durch Formen mit Polydimethylsiloxan in einer Polycarbonatform hergestellt, die von einer numerischen Computersteuerungsmaschine vorgefertigt wurde. Eine Barrierewand am Kanaleingang des CMS-Systems nutzt Fliehkraft, um Zellen gleichmäßig im Chip zu verteilen. Am Ende des Kanals befindet sich ein Diabereich, der es den Zellen ermöglicht, in die Mikrobrunnen einzudringen. Als Demonstration wurden Sphäroide durch Monokultur und Kokultur menschlicher, aus Fettgewonnener Stammzellen und menschlicher Lungenfibroblasten unter Hochgravitationsbedingungen mit Hilfe des Systems erzeugt. Das CMS-System verwendete ein einfaches Betriebsschema, um Cokultur-Sphäroide verschiedener Strukturen von Konzentrisch, Janus und Sandwich zu produzieren. Das CMS-System wird in Zellbiologie- und Gewebe-Engineering-Studien nützlich sein, die Sphäroide und organoide Kultur von einzelnen oder mehreren Zelltypen erfordern.

Introduction

Es ist einfacher, biologische In-vivo-Mikroumgebungen mit dreidimensionaler (3D) Sphäroid-Zellkultur zu simulieren als mit zweidimensionaler (2D) Zellkultur (z. B. konventionelle Petrischalenzellkultur), um physiologisch realistischere experimentelle Ergebnisse1. Derzeit verfügbare Sphäroid-Bildungsmethoden umfassen die Hängetropfentechnik2, Flüssigkeits-Overlay-Technik3, Carboxymethyl-Zellulose-Technik4, magnetische kraftbasierte mikrofluidische Technik5, und die Verwendung von Bioreaktoren6. Obwohl jede Methode ihre eigenen Vorteile hat, ist eine weitere Verbesserung der Reproduzierbarkeit, Produktivität und Erzeugung von Cokultursphäroiden erforderlich. Während beispielsweise die magnetkraftbasierte mikrofluidische Technik5 relativ kostengünstig ist, müssen die Auswirkungen starker Magnetfelder auf lebende Zellen sorgfältig geprüft werden. Die Vorteile der Sphäroidkultur, insbesondere bei der Untersuchung der mesenchymalen Stammzelldifferenzierung und -proliferation, wurden in mehreren Studien7,8,9berichtet.

Das zentrifugale mikrofluidische System, auch Lab-on-a-CD (Compact Disc) genannt, ist nützlich, um die Flüssigkeit im Inneren leicht zu steuern und die Rotation des Substrats zu nutzen und wurde daher in biomedizinischen Anwendungen wie Immunoassays10eingesetzt. kolorimetrische Assays zum Nachweis biochemischer Marker11, Nukleinsäure-Amplifikation (PCR) Assays, automatisierte Blutanalysesysteme12und All-in-One-Zentrifugal-Mikrofluidika13. Die treibende Kraft, die die Flüssigkeit steuert, ist die Zentripetalkraft, die durch Rotation entsteht. Darüber hinaus können mehrere Funktionen des Mischens, Valvings und Sample-Splittings einfach in dieser einzigen CD-Plattform durchgeführt werden. Im Vergleich zu den oben genannten biochemischen Analysemethoden gab es jedoch weniger Versuche, CD-Plattformen auf Kulturzellen anzuwenden, insbesondere Sphäroide14.

In dieser Studie zeigen wir die Leistungsfähigkeit des zentrifugalen mikrofluidischen Sphäroid-basierten Sphäroid-Systems (CMS) durch Monokultur oder Kokultur von humanen Adipose-abgeleiteten Stammzellen (hASC) und menschlichen Lungenfibroblasten (MRC-5). In diesem Beitrag wird die Forschungsmethodik unserer Gruppe ausführlich beschrieben15. So kann die Sphäroid-Kultur-Lab-on-a-CD-Plattform einfach reproduziert werden. Ein CMS-Erzeugungssystem bestehend aus einem CMS-Kulturchip, einem Chiphalter, einem Gleichstrommotor, einer Motorhalterung und einer rotierenden Plattform wird vorgestellt. Die Motorhalterung ist 3D mit Acrylnitril Butadien-Styrol (ABS) bedruckt. Der Chiphalter und die rotierende Plattform sind CNC (Computer numerische Steuerung) mit dem PC (Polycarbonat) bearbeitet. Die Drehzahl des Motors wird von 200 bis 4.500 Umdrehungen pro Minute durch Kodierung eines PID-Algorithmus (proportional-integral-derivative) auf Basis der Pulsweitenmodulation gesteuert. Seine Abmessungen sind 100 mm x 100 mm x 150 mm und wiegt 860 g, so dass es einfach zu handhaben. Mit dem CMS-System können Sphäroide unter verschiedenen Schwerkraftbedingungen von 1 x g bis 521 x gerzeugt werden, so dass die Untersuchung der Zelldifferenzierungsförderung unter hoher Schwerkraft von den 2D-Zellen16,17 bis 3D erweitert werden kann. Sphäroid. Kokultur verschiedener Zelltypen ist auch eine Schlüsseltechnologie, um die in vivo-Umgebung effektiv nachzuahmen18. Das CMS-System kann problemlos Monokultur-Sphäroide sowie Cokultur-Sphäroide verschiedener Strukturtypen (z. B. konzentrisch, Janus und Sandwich) erzeugen. Das CMS-System kann nicht nur in einfachen Sphäroidstudien, sondern auch in 3D-Organoidstudien genutzt werden, um menschliche Organstrukturen zu berücksichtigen.

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Protocol

1. Zentrifugal mikrofluidische Basis Sphäroid (CMS) Kultur Chip Herstellung

  1. Machen Sie PC-Formen für die oberen und unteren Schichten des CMS-Kulturchips durch CNC-Bearbeitung. Detaillierte Abmessungen des Chips sind in Abbildung 1angegeben.
  2. Mischen Sie PDMS-Basis und PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 10:1 (w/w) für 5 min und legen Sie sie in einen Trockengrund für 1 h, um Luftblasen zu entfernen.
  3. Nachdem Sie das PDMS-Gemisch in die Formen des CMS-Kulturchips gegossen haben, entfernen Sie Luftblasen für 1 h mehr und härten Sie in einer Wärmekammer bei 80 °C für 2 h aus.
  4. Legen Sie sie in den gesaugten Plasmareiniger mit den zu verklebenden Oberflächen nach oben und setzen Sie sie mit einer Leistung von 18 W für 30 s luftunterstütztem Plasma aus.
  5. Die beiden Schichten des CMS-Kulturchips verkleben und 30 min bei 80 °C in die Wärmekammer legen, um die Haftfestigkeit zu erhöhen.
  6. Sterilisieren Sie den CMS-Kulturchip in einem Autoklavensterilisator bei 121 °C und 15 psi.

2. Zellvorbereitung

  1. Die 1 ml der Durchstechflasche mit 5 x 105x 1 x 106 hASCs oder MRC-5s-Zellen in einem Wasserbad bei 36,5 °C für 2 min auftauen.
  2. Fügen Sie 1 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) in eine Durchstechflasche und mischen Sie sie vorsichtig mit einer 1.000 L Pipette.
  3. 15 ml des DMEM auf 36,5 °C in eine Petrischale mit 150 mm Durchmesser mit einer Pipette geben und die Zellen aus der Durchstechflasche hinzufügen.
  4. Nach 1 Tag die DMEM ansaugen und durch 15 ml frischeDMEM ersetzen. Wechseln Sie anschließend alle 2 oder 3 Tage die Medien.
  5. Um die Zellen von der Petrischale zu lösen, fügen Sie 4 ml Trypsin in die Petrischalen ein und legen Sie sie in einen Inkubator bei 36,5 °C und 5%CO2 für 4 min.

3. Monokultur Sphäroidbildung

  1. Legen Sie 2,5 ml 4% (w/v) pluronische F-127-Lösung in das Einlassloch des CMS-Kulturchips (Abbildung 2A) und drehen Sie den Chip bei 500–1.000 U/min und drehen Sie den Chip dann mit 3 min mit dem CMS-System um 4.000 U/min (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Die pluronische Beschichtung verhindert die Zellbefestigung am Einlassanschluss, während sich der Chip dreht. Stellen Sie sicher, dass die Luft nicht in den Mikrobrunnen eingeschlossen ist.
  2. Inkubieren Sie den cmS-Kulturchip, der über Nacht bei 36,5 °C in 5%CO2mit pluronischer Lösung gefüllt ist.
  3. Entfernen Sie die pluronische Lösung, waschen Sie die verbleibende pluronische Lösung mit DMEM aus und trocknen Sie den Chip für 12 h auf einer sauberen Bank.
  4. Fügen Sie dem CMS-Kulturchip 2,5 ml DMEM hinzu und drehen Sie den Chip um 3 min für 3 min, um die Innenseite des Chips vorzuvernetzen.
  5. Stoppen Sie die Drehung und ziehen Sie 100 l DMEM heraus, um Platz für die Injektion der Zellsuspension zu schaffen.
  6. Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die entweder 5 x 105 hASCs oder 8 x 105 MRC-5s enthalten, indem Sie die Zellen gleichmäßig verteilen, indem sie 3–5x zur Resuspension pipetieren.
  7. Drehen Sie den Chip bei 3.000 U/min für 3 min, um Zellen in jedem Mikrobrunnen durch Zentrifugalkraft einzufangen.
    HINWEIS: Übermäßige Rotationsgeschwindigkeit kann zu Zellaustritt enden durch Lösungsauswurflöcher.
  8. Kultur die Zellen für 3 Tage im Inkubator bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2,rotieren d.h. bei 1.000–2.000 U/min. Ändern Sie Kulturmedium jeden Tag.

4. Coculture Sphäroidbildung

  1. Konzentrische Sphäroide Bildung
    1. Fügen Sie die ersten Zellen, 2,5 x 105 hASCs, und drehen Sie den Chip bei 3.000 U/min. Nach 3 min fügen Sie die zweiten Zellen, 4 x 105 MRC-5s, hinzu und drehen Sie den Chip bei 3.000 U/min für 3 min. Injizieren Sie insgesamt 100 l Zellsuspensionen durch Pipetten. Wenn die Zellen injiziert werden, verschieben Sie die Rotationsgeschwindigkeit auf 500-1.000 Rpm.
    2. Kultur die Zellen im Inkubator bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit% und 5%CO2 durch Drehen bei 1.000–2.000 U/min. Die konzentrischen Sphäroide werden innerhalb von 24 h erstellt. Für eine langfristige Kultur, ändern Sie das Kulturmedium jeden Tag.
  2. Janus Sphäroid-Formation
    1. Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die die ersten Zellen enthalten, 2,5 x 105 hASCs, indem Sie Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.
    2. Inkubieren Sie den Chip bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2, indem Sie bei 1.000–2.000 U/min für 3 h rotieren.
    3. Fügen Sie 100 l der Zellsuspensionen hinzu, die den zweiten Satz von Zellen, 4 x 105 MRC-5s, enthalten, indem Sie Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.
    4. Kultur die Zellen im Inkubator bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2 durch Drehen bei 1.000–2.000 U/min. Die Janus Sphäroide werden innerhalb von 24 h erstellt. Für eine langfristige Kultur, ändern Sie das Kulturmedium jeden Tag.
  3. Sandwich-Sphäroid-Formation
    1. Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die die ersten Zellen enthalten, 1,5 x 105 hASCs, indem Sie Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.
    2. Inkubieren Sie den Chip bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2, indem Sie bei 1.000–2.000 U/min für 3 h rotieren.
    3. Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die die zweiten Zellen enthalten, 3 x 105 MRC-5s, durch Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.
    4. Inkubieren Sie den Chip bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit% und 5%CO2, indem Sie bei 1.000–2.000 U/min für 3 h rotieren.
    5. Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die die dritten Zellen enthalten, 1,5 x 105 hASCs, indem Sie Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.
    6. Kultur die Zellen im Inkubator bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit% und 5%CO2 durch Drehen bei 1.000–2.000 U/min. Die Sandwich-Sphäroide werden innerhalb von 12 h erstellt. Für eine langfristige Kultur, ändern Sie das Kulturmedium jeden Tag.

5. Zellfärbung

  1. Erwärmen Sie den Zellfluoreszenzfarbstoff auf Raumtemperatur (20 °C).
  2. Fügen Sie 20 l wasserfreies Dimethylsulfoxid (DMSO) pro Durchstechflasche hinzu, um eine 1 mM-Lösung herzustellen.
  3. Verdünnen Sie die Fluoreszenz mit DMEM auf eine Endarbeitskonzentration von 1 m.
  4. Fügen Sie die Fluoreszenz in die Zellsuspension und setzen Sie sie vorsichtig mit einer Pipette wieder auf.
  5. 20 min bei 36,5 °C inkubieren, Luftfeuchtigkeit von >95% und 5%CO2.

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Representative Results

Der CMS-Kulturchip mit einem Durchmesser von 6 cm (Abbildung 2) wurde erfolgreich nach dem obigen Protokoll hergestellt. Zunächst wurde der Chip getrennt von einer oberen und einer unteren Schicht hergestellt und dann durch Plasmabindung miteinander verbunden. Die resultierenden Sphäroide können leicht durch Lösen des Chips gesammelt werden. Der Kanal des CMS-Kulturchips besteht aus einem Einlassanschluss und zentralen, gleitenden und Microwell-Regionen (Abbildung 3). Die Zell-, Mittel- und Pluronischen Lösungen werden durch ein Einlassloch mit einem Durchmesser von 5 mm injiziert. Die injizierten Zellen werden gleichmäßig durch Resuspension 3-5x im Einlassportbereich verteilt. Die Zellen werden im zentralen Bereich zentrifugaler Kraft ausgesetzt und nach außen verteilt. Da die zentrale Region höher als der Mikrobrunnen ist, kann sie mehr Medien enthalten, so dass die Sphäroide länger überleben können. Die Höhe des Mikrobrunnens beträgt 0,4 mm und die Höhe des zentralen Bereichs 1,5 mm. Sauglöcher sind in der Mitte des zentralen Bereichs vorhanden, um die internen Lösungen leicht zu entfernen. Die Rutschregion ist ein schräger Bereich, der die zentrale Region mit der Mikrobrunnenregion verbindet. Die Zellen bewegen sich entlang einer 45°-Neigung und setzen sich im Mikrobrunnenbereich nieder, wo sich die Zellen niederlassen, wachsen und verheddern, um Sphäroide zu bilden. Mikrobrunnen, die sich 14 mm von der Mitte des Chips entfernt befinden, sind halbzylindrisch mit einer Höhe von 400 m und einem Durchmesser von 400 m. Insgesamt können 100 Sphäroide gleichzeitig in 100 Mikrobrunnen erzeugt werden.

Mit dem vorbereiteten CMS-Chip können Sphäroide in der im Protokoll angegebenen Reihenfolge erzeugt werden (Abbildung 4). Monokultur und Cokultur sphäroide wurden mit hASC- und MRC-5-Zellen erzeugt. Um ein Monokultur-Sphäroid jeder Zellart zu erzeugen, wurden 5 x 105 hASCs oder 8 x 105 MRC-5s injiziert. Die Anzahl der injizierten Zellen war unabhängig von der Zellengröße. Zeitrafferbilder beider Zelltypen wurden bis zum 3. Tag der Zellkultur bei 2.000 Umdrehungen pro Minute aufgenommen (Abbildung 5). Coculture Spheroide von hASCs und MRC-5s wurden auch mit konzentrischen, Janus- und Sandwichstrukturen erzeugt. Zur Herstellung konzentrischer Sphäroide wurden die ersten Zellen (2,5 x 105 hASCs) injiziert und die zweiten Zellen (4 x 105 MRC-5s) 3 min später injiziert (Abbildung 6A). Als die ersten Zellen injiziert wurden, wurden sie aufgrund der hohen Schwerkraft U-förmig, und wenn die zweiten Zellen injiziert wurden, bewegten sie sich in die Mitte der U-Form. Im Laufe der Zeit umschlossen die ersten U-förmigen Zellen die zweiten Zellen und schlossen die konzentrischen Sphäroide ab. Um Janus-Sphäroide herzustellen, wurden die ersten Zellen (2,5 x 105 hASCs) injiziert, und die zweiten Zellen (4 x 105 MRC-5s) wurden 3 h später injiziert (Abbildung 6B). Wenn das Injektionsintervall zwischen den beiden Zellen lang war, änderte sich die Form der ersten Zellen durch Zellaggregation von einer U-Form in eine elliptische Form. Sobald die zweiten Zellen der elliptischen Form der ersten Zellen hinzugefügt wurden, wurden die Janus-Sphäroide erzeugt. Bei den Sandwich-Sphäroiden wurden die ersten Zellen (1,5 x 105 hASCs) injiziert, die zweiten Zellen (3 x 105 MRC-5s) 3 h später injiziert und die dritten Zellen (1,5 x 105 hASCs) nach weiteren 3 h injiziert wurden(Abbildung 6C ). Ähnlich wie das Janus-Sphäroid aggregierte sich jede Zelle zu einer elliptischen Form und die drei Schichten stapelten sich, um Sandwich-Sphäroide zu erzeugen. Um schließlich die langfristige Kulturfähigkeit des CMS zu demonstrieren, wurden hASCs kultiviert, 7 Tage lang hoher Schwerkraft ausgesetzt, gefolgt von einem Live/Dead-Assay, der zeigte, dass die meisten Zellen überlebten (Abbildung 7). Auch wurden Fotos von allen Mikrobrunnen des CMS nach 3 Tagen MRC-5s Anbau gemacht, um eine ausgezeichnete Homogenität und Sphäicity von Sphäroiden zu zeigen (Abbildung 8).

Figure 1
Abbildung 1: Abmessungen der oberen und unteren Schichten eines CMS-Kulturchips. Die PC-Form wurde mit einer CNC-Maschine hergestellt und mit PDMS repliziert, um einen CMS-Kulturchip auf der Grundlage der Zeichnung zu erstellen, die von einem 3D-CAD-Programm (computer-aided design) erstellt wurde. Die vier Kreise an den Rändern der oberen und unteren Ebenen sind zum Ausrichten der beiden Ebenen. Die Abmessungen sind in Millimetern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Fotos des CMS-Systems. (A) Fotos des fertigen CMS-Kulturchips. Der Durchmesser des Chips beträgt 6 cm und der Durchmesser des Mikrobrunnens 400 m. Die Zahlen über den Mikrobrunnen stellen die einzelnen Zahlen der Mikrobrunnen von 1 bis 100 dar. Diese Zahlen wurden in die Form eingraviert. Skalenbalken = 400 m. (B) Foto des gesamten CMS-Systems. Das CMS-System besteht aus CMS-Kulturchip, Chiphalter, Gleichstrommotor und rotierender Plattform. CMS-Geräte können Schwerkraftbedingungen bis zu 521 x g durch Rotationskraft erzeugen. Der Chiphalter verhindert die Trennung des CMS-Kulturchips durch hohe Schwerkraft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Kanalkomponenten des CMS. (A) Schematische Bilder und (B) Fotografien eines Querschnitts des CMS-Kulturchips. Der CMS-Kulturchip besteht aus einem Einlassanschluss und zentralen, Slide- und Microwell-Regionen. Da die injizierten Zellen die Barriere nicht mit einer Drehzahl von weniger als 1.000 Umdrehungen pro Minute passieren, hilft die Barriere bei der Resuspension der Zelle und sogar bei der Verteilung auf den Mikrobrunnen. Maßstabsleiste = 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Prozess des Ladens von Zellen in den CMS-Kulturchip. (A) Um zu verhindern, dass Zellen an der Unterseite des Chips kleben, schichte mit 2,5 ml der pluronischen F-127-Lösung bei 4.000 U/min. Warten Sie einen Tag, bis die Beschichtung aufgetragen wird. (B) Entfernen Sie die pluronische Lösung und füllen Sie den Kanal mit 2,5 ml des DMEM-Mediums vor. (C) Entfernen Sie 100 l des DMEM und fügen Sie 100 l Zellsuspension hinzu. Zu diesem Zeitpunkt, 3-5x wieder aussetzen, so dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind. (D) Bewegen Sie die Zellen in den Mikrobrunnen, indem Sie den Chip drehen, und kultiieren Sie die Zellen dann für 3 Tage bei 1.000 bis 2.000 Rpm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Zeitrafferfoto von Monokultursphäroiden von hASC- und MRC-5-Zellen. Die Zellen wurden für 24 h bei 2.000 Umdrehungen pro Minute angebaut. Das Sphäroid wurde innerhalb von 24 h erzeugt. Scale bar = 400 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Fluoreszenzbilder von Cokultursphäriden. (A) Konzentrische Sphäroid-Shapes, in denen hASC-Zellen (grün) MRC-5-Zellen umgeben (rot). (B) Janus Sphäroid-Form, in der zwei Zellen symmetrisch sind. (C) Sandwich-Sphäroid-Form, in der hASC-Schichten zwischen zwei MRC-5-Schichten gestapelt werden. Skalenbalken = 400 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Live/Dead Assay von hASC am 7. Tag. Die grüne fluoreszierende Farbe stellt lebende Zellen und die rote fluoreszierende Farbe abgestorbene Zellen dar. Skalenbalken = 400 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: MRC-5 Sphäroide an Tag 3. Eine relativ konstante Anzahl von Zellen gelangen in jeden Mikrobrunnen und bilden Sphäroide mit relativ konstanter Sphärizität im CMS-System. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: Ernte sphäroide. Kultivierte Sphäroide können geerntet werden, indem die beiden Schichten des CMS-Kulturchips geteilt werden. Die beiden plasmagebundenen Schichten lassen sich leicht von Hand trennen. Dann werden die Sphäroide aus den Mikrobrunnen in der unteren Schicht einfach durch Pipettieren gesammelt. Skalenbalken = 400 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das CMS ist ein geschlossenes System, bei dem alle injizierten Zellen ohne Abfall in den Mikrobrunnen gelangen, was es effizienter und wirtschaftlicher macht als herkömmliche mikrowellbasierte Sphäroid-Erzeugungsmethoden. Im CMS-System wird das Medium alle 12–24 h durch ein Saugloch ersetzt, das entwickelt wurde, um die Medien im Chip zu entfernen (Abbildung 3A). Während des Mediensaugvorgangs entweicht kaum ein Medium aus dem Inneren des Mikrobrunnens aufgrund der Oberflächenspannung zwischen den Medien und der Wand des Mikrobrunnens. Ein Benutzer kann die eingeschlossenen Medien leicht entfernen, indem er mit einem Finger in die Nähe des Mikrowellbereichs des Chips drückt, da der Chip aus PDMS elastisch und flexibel ist. Zellen im Mikrobrunnen bleiben stabil, ohne zu entkommen, selbst bei mehreren Medienwechseln. Um die gleiche Qualität des Sphäroids in allen 100 Mikrobrunnen zu erreichen, sollte die Drehung des Geräts nicht exzentrisch sein, und der Chip sollte axisymmetrisch sein. Andernfalls kann eine variable Anzahl von Zellen in jeden Brunnen eintreten und die Größe und Form des Sphäroids können unterschiedlich sein. Im herkömmlichen Mikrowell-System, da die Luft oft im Mikrobrunnen gefangen ist, ist es notwendig, die Luftblasen zu entfernen. Das CMS-System erfordert jedoch keinen Blasenentfernungsprozess, da die hohe Zentrifugalkraft, die durch die Rotation erzeugt wird, dazu führt, dass die Medien die Blasen schieben und aus den Mikrobrunnen herausdrücken.

Das CMS-System hat auch seine Grenzen im Vergleich zu herkömmlichen Methoden. Das CMS-System benötigt einen größeren Kulturraum (z. B. großer Inkubatorraum), da es einen Motor, eine rotierende Plattform und einen Controller umfasst und seine Gesamtgröße etwa 100 mm x 100 mm x 150 mm beträgt(Abbildung 2B). Darüber hinaus verursacht es eine leichte, aber anhaltende Vibration. Wir erwarten, dass die Miniaturisierung des Systems (hoffentlich ähnlich der Größe von 6 Brunnenplatten) diese Probleme lösen wird.

Es sei darauf hingewiesen, dass die kultivierten Sphäroide durch Trennen der beiden plasmagebundenen Schichten des CMS-Systems gesammelt werden können (Abbildung 9). Die Verklebung der beiden Schichten ist stark genug, um zu verhindern, dass die Medien während des Systembetriebs auslaufen. Aufgrund der kleinen Verklebungsfläche ist sie jedoch von Hand trennbar. Die Sphäroide können einfach aus der unteren Schicht durch Pipettieren gesammelt werden.

Das CMS-System hat eine bessere Reproduzierbarkeit und Produktivität als herkömmliche Methoden der Sphäroiderzeugung. Die herkömmlichen Methoden, wie normale Mikrowell- oder Hängenlet-Methoden, sind arbeitsintensiv. Im CMS-System ist es jedoch viel einfacher, die Anzahl der Sphäroide zu erhöhen, indem die Chipgröße einfach erhöht wird. Mit diesem Gerät ist es auch möglich, Organoide zu erzeugen, die eine Kultur von Multicell-Typen erfordern, was bei herkömmlichen Kulturmethoden nicht einfach ist. Zusätzlich zu den Zellen in dieser Studie (hASC und MRC-5) könnte CMS für die Sphäroidproduktion mit verschiedenen anderen Zelltypen verwendet werden, die Sphäroide bilden können.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch das Basic Science Research Program (2016R1D1A1B03934418) und das Bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) des NRF und finanziert von der koreanischen Regierung MSIT unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Cubicon 3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) ATCC PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA Thermo Fisher Scientific C2925 10 mM
CellTracker Red CMTPX Thermo Fisher Scientific C34552 10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver Roland DGA EGX-350
DC motor Nurielectricity Inc. MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020 Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5) ATCC CCL-171
Inventor 2019 Autodesk 3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm JetBiofill CAD010150 Surface Treated
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Pluronic F-127 Sigma Aldrich 11/6/9003 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC) Acrylmall AC15PC 200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Trypsin Gibco 12604021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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