Профилирование убиквитин и убиквитин-подобных зависимых посттрансляционных модификаций и выявление значительных изменений

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот протокол направлен на создание убиквитин (Ub) и убиквитин-лайков (Ubls) конкретных протеомов для выявления изменений такого рода посттрансляционных изменений (ПТМ), связанных с конкретным условием, таким как лечение или фенотип.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Swayden, M., Dobric, A., Berthois, Y., Villalba, H., Audebert, S., Camoin, L., Iovanna, J., Soubeyran, P. Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations. J. Vis. Exp. (153), e60402, doi:10.3791/60402 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Убиквитин (уб) и убиквитин-подобные (убл) зависимые посттрансляционные изменения белков играют фундаментальную биологическую регулятивную роль в клетке, контролируя стабильность белка, активность, взаимодействия и внутриклеточную локализацию. Они позволяют клетке реагировать на сигналы и адаптироваться к изменениям в ее среде. Изменения в этих механизмах могут привести к тяжелым патологическим ситуациям, таким как нейродегенеративные заболевания и раковые заболевания. Цель описанного здесь метода состоит в том, чтобы установить ub/ubls зависимые профили ПТМ, быстро и точно, от культивированных клеточных линий. Сравнение различных профилей, полученных из различных условий, позволяет выявить конкретные изменения, такие, как, например, те, которые были вызваны лечением. Лентивирная опосредованного клеточной трансдукции выполняется для создания стабильных клеточных линий, выражающих двухметки (6His и Флаг) версия модификатора (убиквитин или ubl, таких как SUMO1 или Nedd8). Эти метки позволяют очищать убиквитин и, следовательно, убиквитина белков из клеток. Это делается через двухэтапный процесс очистки: первый выполняется в условиях денатурации с использованием тега 6His, а второй в родных условиях с помощью тега Флага. Это приводит к высокоспецифической и чистой изоляции модифицированных белков, которые впоследствии идентифицируются и полуколичественно определяются жидкой хроматографией с последующей тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) технологии. Легкий анализ информатики данных MS с использованием программного обеспечения Excel позволяет создавать профили PTM, устраняя фоновые сигналы. Эти профили сравниваются между каждым условием для того, чтобы определить конкретные изменения, которые затем будут изучены более конкретно, начиная с их проверки стандартными методами биохимии.

Introduction

Предложенный здесь метод предназначен для изучения ПТМ при посредничестве членов семьи убиквитин из культивированных клеток млекопитающих, с тем чтобы определить потенциальные изменения, связанные с конкретным условием (лечение, дифференциация и т.д.). ПТМ представляют собой последний этап регуляции функций белков1. Действительно, когда-то производится переводного механизма, большинство, если не все белки проходят различные виды ПТМ, которые модулируют их активность, молекулярные взаимодействия, и внутриклеточного расположения1. Среди множества ПТМ являются те, опосредовано семьи убиквитин белков, убиквитин себя и все убиквитин-любит, имеют потенциал для регулирования всех внутриклеточных или частично цитоплазматических белков2. Потому что они сами белки, они могут быть сопряжены друг с другом, образуя однородные и неоднородные цепи различных топологий, каждый из которых связан с конкретными регулятивными функциями2. Инструменты необходимы, чтобы попытаться расшифровать и понять этот сложный механизм. Многие подходы были разработаны во всем мире, имея свои преимущества и недостатки, и здесь мы предлагаем один с высокой производительностью подходит для культивированных клеток.

Основным преимуществом этого метода является его точность. Действительно, чистота изолированных модифицированных белков значительно улучшилась за счет комбинаторного использования двух тегов (6His и Flag) и двух шагов-процедур, и поэтому он гораздо более избирательным, чем один тег слияния Ub/Ubl3,4. Наличие тега 6His позволяет первый шаг очистки в полностью денатурации состоянии тем самым избегая каких-либо совместной очистки белков, содержащих убиквитин связывания доменов или других белков, связывающихся с вездесущими. Это техническая проблема, с которой сталкиваются несколько других подходов, основанных на сродстве очистки убиквитинаированных протеомсов с использованием либо конкретных антител5 или тандема убиквитин связывающих элементов (TUBEs)6. Важно отметить, что этот метод не является предвзятым в пользу очищения определенного типа вездесущности, как это может быть в случае некоторых других подходов, так как как моно и различные виды полиубичинаций были определены7. Следовательно, как только будет установлено, что изменение убиквитинации должно быть изучено более подробно с помощью стандартных биохимических подходов, с тем чтобы определить точный вид убиквитина.

Наконец, еще одним техническим преимуществом этого протокола является использование лентивирусов, которые легко и быстро создают стабильные экспрессионные клеточные линии с разумным уровнем выражений помеченного модификатора, не мешая нормальному клеточному поведению.

В то время как одна важная роль повсеместновиления заключается в целевой белков для протеасомальной деградации, в настоящее время известно, что он имеет много других регуляторных свойств для потенциально наиболее внутриклеточных или частично внутриклеточных белков1. Количество этих функций еще больше усиливается существованием многих убиквитин, как белки, образуя семейство белков, регулирующих почти каждый клеточный механизм1. Их изменения могут иметь резкое влияние на биологию клеток и может привести или участвовать в патологических ситуациях8, таких как рак9. Таким образом, инструменты необходимы для изучения этого обширного ландшафта и определить изменения, связанные с патологическим состоянием, которое может служить в качестве новых терапевтических целей.

Этот протокол предназначен для клеток в культуре, так как они должны быть трансуктором, чтобы выразить экзогенные помечены Ub / Ubl. После создания эти стабильные клеточные линии могут быть использованы для генерации профилей Ubl из культуры в 2D или 3D или xenografts, тем самым расширяя горизонт различных экспериментальных моделей, которые могут быть применены для изучения профилей PTMs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Поколение стабильных клеточных линий, выражающих 6His-Flag-Ubl

ПРИМЕЧАНИЕ: Со-трансфекция HEK-293T клеток с pCCL-6HF-Ubl, pVSVG и дельта-Хелпер.

  1. День 0: Семена 293T клетки в 6-хорошо пластины для получения 50-70% слияния на следующий день после.
  2. День 1: Со-трансфект 50-70% сопливых клеток с сочетанием 1 мкг pCCL-6HF-Ubl или pCCL-GFP, 1 мкг pVSVG и 1 мкг дельта-Хелпер векторов, используя трансфекционный реагент и протокол для производства лентивируса. После 6 ч трансфекции, изменить среду на свежий, соответствующий клетки, которые будут транс-индуцирования. Семена клетки должны быть трансумции в 6 хорошо пластины для того, чтобы получить 10-20% слияния на следующий день после (день начала трансдукции).
  3. День 2: 24 ч после трансфекции, восстановить среду, содержащую лецивирные частицы и фильтр с помощью 0,45 мкм фильтров. При необходимости добавьте свежую среду в этот момент, чтобы произвести вторую партию лентивирусов. Замените среду клеток, которые должны быть транс-индуцированы (10-20% слияния) на один, содержащий лентивирусы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лентивирная среда может храниться при 4 градусах Цельсия в течение нескольких дней до трансдукции или храниться при -80 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
  4. Инкубировать клетки с лентивирусами от 24 ч до 72 ч в стандартном инкубаторе (37 градусов по Цельсию, 5% CO2),а затем изменить среду для свежего стандартного. Если возможно, проверьте экспрессию GFP с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа для оценки эффективности трансдукции: процент выражающих сярют клеток и относительного уровня экспрессии на одну клетку. Если флуоресценция не обнаружена, подождите еще 2-3 дня, так как экспрессия может занять больше времени в зависимости от типа клеток, которые будут трансдимированы.
  5. Если контроль GFP является положительным, расти все клетки до тех пор, пока достаточно для выполнения контроля экспрессии 6HF-Ubl иммунофлуоресценции и западной подись с использованием анти-флаг антитела.

2. Двойная очистка модифицированных белков

ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4, рН 8.0, 0.5% Тритон X-100.
Буфер 2: 50 мМ2PO4, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Глицерол, рН 8.0.
Буфер 3: 100 мМ NH4HCO3, рН 8.0.

  1. Лиза клетки: После того, как готовы, мыть культуры блюда по крайней мере один раз с фосфат-буфером сольника (PBS) при комнатной температуре (RT) и приступить к лизис клеток или, в качестве альтернативы, флэш заморозить в жидкости N2 и хранить при -80 градусов по Цельсию. Для lysis, добавить 2 мл буфера 1 на 15 см блюдо на RT. Используйте клеточный скребок для восстановления всех лисатов в 50 мл конических центрифуговых труб (окончательный объем около 20 мл).
  2. Снотировать lysates три раза в течение 30 с разделены 1 минуту паузы.
  3. Центрифуга sonicated lysates на 15000 х г в течение 15 минут.
  4. Перенесите супернатант в новую трубку с помощью клеточного ситечко (40 мкм).
  5. Определите концентрацию образцов и при необходимости регулируйте их для получения одинакового количества белков и того же объема. Используйте общее количество белка от 50 до 100 мг (10 блюд диаметром 15 см для клеток MiaPaCa-2).
  6. Добавьтебисер Ni 2'-NTA, используя 2 л бусины на 1 мг белка.
  7. Поверните при 30 об/мин при 2,5 л на RT.
  8. Пеллет и бусы при 500 х г в течение 5 мин.
  9. Вымойте бусины с 1 мл буфера 1, передавая образцы в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки, а затем передать трубки на льду. Выполните все следующие шаги на льду или при 4 градусах Цельсия.
  10. Вымойте два раза с 1 мл ледяного буфера 2, содержащего 10 мМ имидазола.
  11. Чтобы выяснить связанные белки, добавьте 600 qL буфера 2, содержащий 250 мМ имидазола и поверните на 2 ч при 4 градусах Цельсия.
  12. Пеллети бусины центрифугированием при 500 х г в течение 1 мин. Перенесите супернацианты в новые, предварительно охлажденные, 1,5 мл трубок и добавьте 50 л антител против флага M2.
  13. Поверните при 30 об/мин в течение 2,5 ч при 4 градусах Цельсия, затем промойте 2 раза с 500 qL буфера 2, затем 2 раза с 500 qL буфера 3.
  14. Для окончательного elution добавьте 100 qL буфера 3, содержащий пептид Флага на уровне 0,1 мкг/Л и поверните при 4 градусах по Цельсию на 1,5 ч.
  15. Центрифуга при 500 х г в течение 1 мин и перенесите супернацианты на новые предварительно охлажденные трубки.
  16. Возьмите 10% (10 л), чтобы загрузить на SDS-PAGE и выполнить серебряное окрашивание геля для контроля качества очистки. Если очистка выглядит хорошо, проанализируйте 90%, оставленные LC-MS/MS.

3. Обработка данных масс-спектрометрии для генерации профилей ПТМ Ub/Ubls и выявления существенных различий между ними

ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты анализа MS содержат много информации, включая общее количество пептидов, а также значения пиковой зоны (среднее ТОП 3 пептидной области10)для каждого белка, идентифицированного в каждом образце. Эти данные могут быть обработаны либо с использованием пептидных чисел кол или пиковых значений области, или и то, и другое. Для расчета с пиковыми областями, так как эти значения обычно находятся в диапазоне 106,необходимо разделить их на этот порядок, прежде чем применять те же формулы, что и ниже. Результаты, полученные с помощью обеих методологий подсчета, должны показать сильную корреляцию, как это обычно бывает. Для каждого идентифицированного белка используйте следующие формулы, где:
v1 значения пептидов в необработанном образце убиквитин (например, Ub - препарат)
v2 значения пептидов в гемцитабине, обработанном убиквитином (например, препарат Ub)
значения пептидов k1 в необработанной контрольной пробе GFP (например, GFP - препарат)
значения пептидов к2 в Гемцитабине, обработанных контрольной пробы GFP (например, GFP и препарат).

  1. Нормализация: Нормализация значения между лекарственными обработанными клетками и необработанными клетками для убиквитин и GFP с использованием следующих формул. Нормализованная v q V и нормализованная к. К.
    V1'v1. (Зв1) / (2. V2'v2. (Зв1) / (2.
    К1зк1. (к. к. 2) / (2. q1) ; К2-к2. (Кк1) / (2.
  2. Удаление фона: Используя следующие формулы, вычесть значения в контрольной выборке (GFP) из значений в образце убиквитин для получения конкретных значений (V'1 и V'2) для каждого идентифицированного белка в обоих условиях.
    V'1'V1-K1, если V1-K1-0 ; V'1'0, если V1-K1'lt;0
    V'2'V2-K2, если V2-K2-0 ; V'2 No0, если V2-K2'lt;0
  3. Вариация (Вар) вездесущности. Чтобы получить балл (от -100 до 100 евро) за положительные и отрицательные вариации ПТМ, индуцированных препаратом, используйте следующую формулу, в которой разница между конкретными значениями обработанных и необработанных образцов делится на сумму всех значений, включая контроль (для наказания белков также определены в контроле GFP), и умножить на 100.
    Вар -" (V'2-V'1)/(V1-K1-V2-K2); -100-lt;Варо;100 ;
    Вариации ниже -50 (репрессии PTM) или выше 50 (индукция ПТМ), как правило, считаются значительными.
  4. Доверие (Конф). Используйте следующую формулу для получения значения доверия от 0 до 100%,::
    Конф ((V1'V2)2/(1'V1 'V2'K1'K2)2) - 100 - 100/(1'V'V'2) ; No 0, если Злт;0
    Значения выше 50, как правило, считаются уверенными.
  5. Чтобы получить более хорошее распределение индукционных/репрессионных значений и рассмотреть как параметры вариации, так и параметры доверия, умножьте значения Var и Conf, используя следующую формулу, где V Var и C Conf
    «SI(V2'gt;0;0;((V2'C2))/2)/(10'6);-((V2'C2))/2)/(10'6))
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку значения пиковой зоны, как правило, более точны, чем подсчет пептида, можно использовать специальное программное обеспечение, которое посвящено интерпретации такого рода данных, таких как Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), после рекомендации по использованию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Трансдукция культурных клеток млекопитающих для создания GFP и 6HF-Ub экспрессирующих клеток
Для производства лентивирусов, которые будут использоваться позже для преобразить клетки MiaPaCa-2, 70% конфлирующих клеток HEK-293T совместно трансфицируются с равным количеством трех векторов, pCCL-6HF-Ubiquitin или GFP/Delta-Helper/pvSvG. После 24 ч производства среда, содержащая лецивирные частицы, восстанавливается и фильтруется. В этот момент можно контролировать эффективность трансфекции, проверяя зеленую флуоресценцию GFP, выражающую 293T-клетки на перевернутом микроскопе. Она должна быть около 100% клеток. Клетки MiaPaCa-2 инкубируются с помощью лентивирусного супернатанта в течение 1-3 дней. Эффективность трансдукции лентивирных препаратов сначала контролируется, глядя на флуоресценцию GFP трансиндуцированных клеток GFP(рисунок 1Верхняя панель). Уровень экспрессии GFP может варьироваться от одной клетки к другой, но 100% из них должны быть флуоресцентными. Как только этот контроль будет сделан, выражение флага-убиквитин также должны быть проконтролированы. Это делается путем иммунофлуоресцентного окрашивания с помощью анти-флаг антитела (обычно M2 моноклональных) (Рисунок 1Нижняя панель). Это покажет процент трансиндуцированных клеток, который должен быть 100%, чтобы гарантировать стабильное выражение в отношении будущих проходов клеточной культуры. Для того, чтобы контролировать уровень экспрессии экзогенного флага-убиквитин, лисаты из трансиндуцированных клеток анализируются SDS-PAGE следуют западные подья с антифлаг антитела(Рисунок 1B). Обе клеточные линии могут быть заморожены.

Два шага очистки и контроля sDS PAGE и серебра окрашивания
После того, как стабильные линии экспрессивных клеток были проверены, как GFP, так и 6HF-убиквитин клетки усиливаются до тех пор, пока достаточно материала не будет получено для того, чтобы продолжить двухступенчатую очистку. Рекомендуется держать резервную часть этих клеточных линий в качестве замороженного запаса в жидком азоте, чтобы иметь возможность разморозить их, когда это необходимо. 36 ч перед обработкой, половина клеток (половина GFP и половина 6HF-Ubiquitin) обрабатываются с 10 мкм гемцитабина. Когда готовы, вездесущие белки очищаются от 6HF-убиквитин и из клеток управления GFP, используя двухступенчатый протокол очистки (Рисунок 2A). 10% окончательного elution используется для контроля количества и целостности очищенного материала SDS-PAGE и серебра окрашивания геля(Рисунок 2B). Молекулярные диапазоны маркеров веса могут быть использованы для оценки количества очищенных убиквитированных белков. Кроме того, известное количество BSA или любого другого белка может быть загружено в линию геля, чтобы помочь количественно очищенных белков. Как только эта проверка будет сделана, остальные 90% образцов анализируются с помощью жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией, чтобы позволить идентификацию и полуколичественную очистку очищенных белков.

Идентификация убиквитинаированных белков по фоновым (образцам GFP)
Данные анализа lc-MS/MS образцов дают названия и количественные показатели (пиковые области и количество наблюдаемых пептидов) каждого идентифицированного белка в образцах GFP и 6HF-Ub. Белки, имеющие самую высокую количественную оценку в образце убиквитина по сравнению с образцом GFP, скорее всего, будут те, действительно вездесущие и применение формул, описанных в методах выше, позволяет их классификации, давая оценку доверия от 0 до 100% . Белки, идентифицированные с показателем выше 50%, считаются убиквитинаированными(рисунок 3А).

Этот шаг, который в основном удаляет фоновые белки (GFP) из образцов убиквитина привел к выявлению 364 белков значительно увсебийизированных(рисунок 3B)7. Обратите внимание здесь, что белки, идентифицированные с наивысшими баллами, в основном уже известны как основные цели убиквитинации, которая доказывает эффективность этого метода очистки.

Затем можно выполнить анализ обогащения генного набора (GSEA) этих убиквитинаированных белков, чтобы выделить биологические процессы, в которых они участвуют(Рисунок 3C), их молекулярные функции, их клеточный отсек, или любой другой категоризации гена онтологии. Интересно сравнить этот вездесущий протеом с полным протеомом клетки, когда это возможно. Действительно, этот анализ показывает реальный вклад этих убиквитинаированных белков в конкретных процессах, таких как перевод или протеализ, например (Рисунок 3C).

Основная цель такого рода эксперимента заключается в выявлении изменений в вездесущих протеомов, вызванных лечения, например, здесь гемцитабин. Сравнивая убикитиномы (убиквитинат специфического протеома) в обработанных и необработанных клетках с помощью конкретной формулы дает значение от -100 (репрессии повсеместновинации) до 100 фунтов стерлингов (индукция повсеместного убликитирования). Учитывая только значения ниже -50 или выше 50 как значительные, в общей сложности 73 индуцированных вездесущности и 29 репрессированных вездесущности были определены (Рисунок 4A). GSEA анализ этих изменений вездесущности показал специфические обогащения в процессах репарации ДНК или клеточном цикле, а также важные изменения в переводе и РНК метаболических процессов(Рисунок 4B). Этот результат очень логичен, так как гемцитабин является базовым аналогом, который блокирует синтез ДНК и провоцирует повреждения ДНК.

Чтобы пойти дальше, также интересно использовать базы данных взаимодействующих белков для того, чтобы исследовать и проверить потенциальные взаимодействующие сети, образованные гемцитабин индуцированных изменений убиквитина (Рисунок 5). Это привело к выявлению функциональных взаимодействующих сетей сильно зависит от увеличения или уменьшения убиквитивирования участвующих белков.

Наконец, среди измененных вездесущности, некоторые из них могут включать белки, представляющие наибольший интерес, из-за их известных или потенциальных функций в соответствии с литературой. Таким образом, одним из важных шагов является подтверждение того, что то, что наблюдается масс-спектрометрии является реальным и надежным. PCNA был одним из самых чрезмерно-убиквитинатированный белок на гемцитабин лечения обнаружены масс-спектрометрии анализа(Рисунок 4A). Чтобы убедиться, что гемцитабин действительно вызывает увселивание PCNA, MiaPaCa-2 клетки, выражающие 6HF-Ub и GFP выращиваются, обрабатываются или нет, и при условии либо Ni-NTA очистки в условиях денатурации или анти-флаг иммунопреципсии следуют флаг пептид elution в родных условиях, решенна на SDS PAGE следуют западные подясти с соответствующими антителами. Результат, показанный на рисунке 6, подтвердил, что действительно PCNA сильно убликвитирован в ответ на лечение гемцитабином в клетках MiaPaCa-2.

Figure 1
Рисунок 1: Создание стабильных клеточных линий, выражающих 6His-Flag-Ubl. (A) Контроль экспрессии GFP в транс-индуцированных клетках GFP (верхняя панель) и 6His-Flag-Ubiquitin с помощью анти-флага (M2) антитела в качестве первичного и alexa-567 анти-мышь вторичного антитела. DAPI был использован для окрашивания ядер. Шкала бар: 50 мкм. (B) Контроль 6His-Flag-Ubiquitin выражение в клетках lysates западной подьение с помощью анти-флаг антитела (Альтернативно, анти-6his антитела могут быть использованы) слева, и анти-убиквитин антитела, справа, чтобы сравнить выражение 6His-Flag-Ubiquitin (6HF-Ubiq) с эндогенным убиквитином (Эндо. Убик). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Два шага очистки убиквитинаированных белков. (A) Схематическое представление процедуры. (B) 10% окончательного elution было подвергнуто SDS PAGE последовано за серебряным окрашиванием геля для того чтобы оценить количество и чистоту (по сравнению с GFP) изолированных протеинов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Идентификация убиквитинаированных белков (адаптировано из Bonacci и др. 7). (A) Относительное количество специфических (убиквитин образца) и неспецифических (образец GFP) пептидов для каждого идентифицированного белка были построены в функции их уверенных показателей. Как показано на рисунке, доля неспецифических над убиквитинатированными протеинами будет слишком значительно важн под счетом 50. Таким образом, только белки, идентифицированные с баллом выше 50, считаются значительными. (B) Таблица, показывающая 20 лучших убиквитинатированных белков среди 364-всего выявленных. (C) Только считалось, что в биологических процессах были рассмотрены раздельные белки и общие белки клеток MiaPaCa-2 (Значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Гемцитабин индуцированных изменений профилей PTM (адаптировано из Bonacci и др. 7). (A) Перечисление 20 белков с наибольшим увеличением (всего 73) или уменьшенным (всего 29) убиквицией при лечении гемцитамином (Conf: уверенность; Инд: индукция; Республика: репрессии). (B) Передел гемцитабина индуцированного измененного повсеместного распространения в рамках биологических процессов и сопоставления с необработанными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Функциональные interactomes гемцитабина индуцированной измененной вездесущности. Потенциальные взаимодействия между всеми белками с гемцитабининдудным изменением убиквитина определяются с помощью базы данных белково-белковых взаимодействий (STRING: string-db.org). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Биохимические проверки интересных гемцитабин индуцированных изменений убиквитина. Для того, чтобы проверить увеличение убиквитации PCNA после лечения гемцитабином, лисаты клеток, выражающих 6HF-Ubiquitin, обработанные или не с гемцитабином, были подвергнуты выдвиженец никель (Ni-NTA) следуют анти-PCNA Западной пятно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы разработали надежную и надежную методологию для генерации профилей белков, модифицированных основными членами семьи убиквитин. Действительно, мы успешно применили этот протокол для генерации профилей ПТМ по убиквитину, а также SUMO и Nedd8, а также для обнаружения изменений, связанных с лечением7, в ответ на чрезмерное выражение или нокдаун определенного гена (данные не показано) и в клетках, которые приобрели устойчивый фенотип к разнообразным химиотерапевтическим препаратам.

Есть только несколько критических шагов во время процедуры, что манипулятор должен быть осторожным с. При трубачке из бисера (Ni-NTA или анти-Flag в сочетании), важно, чтобы повторно их тщательно, особенно анти-флаг бусы, поскольку приостановлено в вязкой глицерол основе буфера, и сократить немного в конце кончика увеличить раздел. Еще одна мера предосторожности следует соблюдать, чтобы пипетка медленно, чтобы избежать укладки бисера. Дополнительными критическими шагами являются элютация с имидазолом, а затем с пептидом Флага. Чистый шприц Гамильтона должны быть использованы для восстановления супернатанта после elution, чтобы избежать, насколько это возможно pipetting бисера, на котором остаются неспецифические белки.

В зависимости от типа клетки и количества необходимого конечного материала для масс-спектрометрии, исходный материал может быть увеличен или уменьшен соответственно. Затем, только важная корректировка находится в объеме никеля шарики, как это должно быть 2 Зл на 1 мг белков в лисате. Может случиться так, что количество очищенных белков слишком низкое. Уровень экспрессии помеченного Ub/Ubl следует контролировать, и, если он слишком низок, клетки могут быть повторно трансдуцированы с помощью тех же лентивирусов. Кроме того, можно увеличить количество исходного материала. Иногда количество неспецифического очищенного материала в GFP или родительских камерах слишком высоко. Одним из решений для преодоления этой проблемы является увеличение объема и количества стир на ступенях очистки Ni-NTA и флага. Также возможно увеличение концентрации имидазола в стине с буфером гуанидина, до 20 мМ. Наоборот, не стоит увеличивать концентрацию пептида Флага на заключительном этапе элюции, так как он не увеличит элюцию. Гораздо важнее использовать свежий пептид, так как с течением времени, даже если он хранится при -20 градусов по Цельсию, эффективность пептида может снизиться.

Основное ограничение этого протокола заключается в том, что он подходит только для культивированных клеток, потому что они должны быть трансумированы, чтобы выразить желаемое помечены Ubl. Таким образом, любое исследование тканей или образцов опухоли должно быть выполнено с использованием альтернативных подходов, таких как diGly пептиды обогащения после трипсина пищеварения11, иммунопреципиция с антителами, специфическими для Ub / Ubl интереса5, или использование TUBEs6. Все эти альтернативные методы также подходят для их применения в культивированных клетках. Они имеют преимущество использования эндогенных Ub / Ubls машины. Однако существует несколько недостатков. Иммунопрецитификации трудно выполнять с низким фоном и, как tubEs подходы, белки, взаимодействующие с модифицированными белками, и даже модификатор себя, не могут быть устранены, даже если практические улучшения были получены с помощью более жесткие условия. DiGly пептиды обогащения является очень мощным техником, но может соответствовать различным видам ПТМ. Например, diGly обогащение от трипсина переваренный лизат будет определять в основном убиквитированных белков, но и neddylated из них, как Nedd8 оставляет тот же остаток diGly подпись, как убиквитин делает11.

Еще одно ограничение этого протокола заключается в том, что наличие тега 6His-Flag может изменить нормальную функцию Ub/Ubl, а переэкспрессия сама по себе может изменить механизм. Это может, например, препятствовать генерации поликубикитовых цепей и способствовать монобиквитации. Однако, поскольку с помощью этого протокола были идентифицированы как мономного, так и поликубиквиновые цепи, кажется, что это не так7. Наличие тега на N-конечных также предотвращает формирование линейной вездесущности, где убиквитин муати связаны друг с другом через N-терминал метионина убиквитин. Однако, несмотря на то, что 6HF-удиквитин не может быть умиквитинирован на своем первом остатке Met, он все еще имеет возможность положить конец такого рода цепи.

Кроме того, в то время как это существенное преимущество в использовании lentiviruses, что позволяет создание стабильных линий клеток в течение одной или двух недель, вполне возможно, что не все клетки будут выражать желаемую конструкцию. Это не может быть реальной проблемой для процедуры очистки до тех пор, как достаточное количество клеток выразить экзогенные Ub / Ubl, но проблема может прийти с долгосрочной культурой, как в течение нескольких проходов может быть клональной вариации с обогащением в клетках с менее или нет Выражение. Этот недостаток, однако, можно легко обойти с помощью лентивирусов, содержащих либо ген отбора сопротивления или флуоресцентный белок, который может быть использоваться в цитометрии потока, чтобы выбрать только положительные клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана La Ligue Contre ле Рак В. И. и MS, и АРК (ассоциация за ла recherche сюр-ле-рак) для PS, INCa (институт национального рака) и Canceropole PACA в JI. Объект масс-спектрометрии Марсель Протеомика (marseille-proteomique.univ-amu.fr) при поддержке IBISA (Инфраструктура Биология Санте и Агрономия), Plateforme Technologique Aix-Марсель, Канцеропеле PACA, Прованс-Альпы-Кот-д'Азур "Ригион", Институт Паоли-Кальметтс и Центр Рехерче-ан-Кансьологи-де-Марсель.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220-5ML binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody Sigma-Aldrich F3165 to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm Falcon 352350 to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide Sigma-Aldrich F3290 elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich 50933 chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole Sigma-Aldrich I5513 eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000 ThermoFisher L3000015 to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes Sigma-Aldrich Z666491 avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm Millipore HAWP04700F1 to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA Qiagen 30210 purification of the 6His tag

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. (2012).
  2. Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, (7237), 422-429 (2009).
  3. Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin. Proteomics. 5, (8), 2104-2111 (2005).
  4. Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21, (8), 921-926 (2003).
  5. Matsumoto, M., et al. Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome. Proteomics. 5, (16), 4145-4151 (2005).
  6. Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins. Biochemical Society Transactions. 36, (5), 823-827 (2008).
  7. Bonacci, T., et al. Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Journal of Proteome Research. 13, (5), 2478-2494 (2014).
  8. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, (1), 29-46 (2011).
  9. Hoeller, D., Dikic, I. Targeting the ubiquitin system in cancer therapy. Nature. 458, (7237), 438-444 (2009).
  10. Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition. Molecular & Cellular Proteomics. (2006).
  11. Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44, (2), 325-340 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics