Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Biochemistry

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Summary

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

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Swayden, M., Dobric, A., Berthois, Y., Villalba, H., Audebert, S., Camoin, L., Iovanna, J., Soubeyran, P. Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations. J. Vis. Exp. (153), e60402, doi:10.3791/60402 (2019).

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Abstract

Ubiquitin (ub) und ubiquitin-like (ubl) abhängige posttranslationale Modifikationen von Proteinen spielen grundlegende biologische regulatorische Rollen innerhalb der Zelle, indem sie Proteinstabilität, Aktivität, Wechselwirkungen und intrazelluläre Lokalisation kontrollieren. Sie ermöglichen es der Zelle, auf Signale zu reagieren und sich an Veränderungen in ihrer Umgebung anzupassen. Veränderungen innerhalb dieser Mechanismen können zu schweren pathologischen Situationen wie neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs führen. Ziel der hier beschriebenen Technik ist es, ub/ubls abhängige PTMs-Profile schnell und genau aus kultivierten Zelllinien zu erstellen. Der Vergleich verschiedener Profile, die unter verschiedenen Bedingungen gewonnen werden, ermöglicht die Identifizierung spezifischer Veränderungen, wie sie z. B. durch eine Behandlung induziert werden. Lentivirale, vermittelte Zelltransduktion wird durchgeführt, um stabile Zelllinien zu erzeugen, die eine Zwei-Tags-Version (6His und Flag) des Modifikators (Ubiquitin oder ein Ubl wie SUMO1 oder Nedd8) exdrücken. Diese Tags ermöglichen die Reinigung von Ubiquitin und damit von ubiquitinierten Proteinen aus den Zellen. Dies geschieht durch einen zweistufigen Reinigungsprozess: Der erste wird unter Denaturierung von Bedingungen mit dem 6His-Tag und der zweite unter systemeigenen Bedingungen mit dem Flag-Tag durchgeführt. Dies führt zu einer hochspezifischen und reinen Isolierung modifizierter Proteine, die anschließend durch Flüssigchromatographie identifiziert und halbquantifiziert werden, gefolgt von der Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Technologie. Die einfache informatierte Analyse von MS-Daten mit Excel-Software ermöglicht die Erstellung von PTM-Profilen durch eliminierung von Hintergrundsignalen. Diese Profile werden zwischen den einzelnen Bedingungen verglichen, um spezifische Veränderungen zu identifizieren, die dann genauer untersucht werden, beginnend mit ihrer Validierung durch Standard-Biochemie-Techniken.

Introduction

Die hier vorgeschlagene Methode ist der Untersuchung von PTMs gewidmet, die von Ubiquitin-Familienmitgliedern aus kultivierten Säugetierzellen vermittelt werden, um potenzielle Veränderungen im Zusammenhang mit einer bestimmten Erkrankung (Behandlung, Differenzierung usw.) zu identifizieren. PTM stellen den letzten Schritt der Regulierung der Proteinfunktionendar 1. In der Tat, einmal von der translationalen Maschinerie produziert, die meisten, wenn nicht alle Proteine unterziehen verschiedene Arten von PTMs, die ihre Aktivität, molekulare Wechselwirkungen und intrazelluläre Lagemodulieren 1. Zu den vielen PTMs gehören die, die von der Ubiquitin-Familie von Proteinen vermittelt werden, Ubiquitin selbst und alle Ubiquitin-Likes, haben das Potenzial, alle intrazellulären oder teilweise zytoplasmatischen Proteine zu regulieren2. Da sie selbst Proteine sind, können sie miteinander konjugiert werden und homogene und heterogene Ketten unterschiedlicher Topologien bilden, die jeweils mit spezifischen regulatorischen Funktionen verbunden sind2. Werkzeuge werden benötigt, um zu versuchen, diese komplexe Maschinerie zu entschlüsseln und zu verstehen. Viele Ansätze wurden weltweit entwickelt, mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen, und hier schlagen wir einen mit hoher Leistung für kultivierte Zellen vor.

Der Hauptvorteil dieser Methode ist ihre Genauigkeit. Tatsächlich wird die Reinheit isolierter modifizierter Proteine durch die kombinatorische Verwendung der beiden Tags (6His und Flag) und das Zwei-Stufen-Verfahren erheblich verbessert und ist daher viel selektiver als eine Single-Tag-Fusion Ub/Ubl3,4. Das Vorhandensein des 6His-Tags ermöglicht einen ersten Schritt der Reinigung in einem vollständig denaturierenden Zustand, wodurch jede Ko-Reinigung von Proteinen, die Ubiquitin-bindende Domänen oder andere Proteine enthalten, die an die ubiquitinierten binden, vermieden wird. Dies ist ein technisches Problem, auf das mehrere andere Ansätze stoßen, die auf der Affinitätsreinigung ubiquitinierter Proteome basieren, die entweder spezifische Antikörper5 oder Tandem-Ubiquitin-Bindungselemente (TUBEs)6verwenden. Wichtig ist, dass diese Technik nicht zugunsten der Reinigung einer bestimmten Art von Ubiquitination voreingenommen ist, da es bei einigen anderen Ansätzen der Fall sein könnte, da sowohl Mono- als auch verschiedene Arten von Polyubiquitinationen identifiziert wurden7. Folglich muss, sobald eine Veränderung der Ubiquitination gefunden wurde, durch biochemische Standardansätze genauer untersucht werden, um die genaue Art der Ubiquitination zu ermitteln.

Ein weiterer technischer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von Lentiviren, die leicht und schnell stabile zelllösende Zelllinien mit einem angemessenen Ausdrucksgrad des markierten Modifizierers erzeugen, ohne das normale Zellverhalten zu stören.

Während eine wichtige Rolle der Ubiquitination darin besteht, Proteine auf den proteasomalen Abbau auszurichten, ist es inzwischen bekannt, dass sie viele andere regulatorische Eigenschaften für potenziell die meisten intrazellulären oder teilweise intrazellulären Proteine hat1. Die Anzahl dieser Funktionen wird durch die Existenz vieler Ubiquitin-ähnlicher Proteine noch verstärkt, wodurch eine Familie von Proteinen gebildet wird, die fast jeden Zellmechanismus regulieren1. Ihre Veränderungen können drastische Auswirkungen auf die Zellbiologie haben und können zu pathologischen Situationen führen oder daran teilnehmen8, wie Krebs9. Daher sind Werkzeuge erforderlich, um diese weite Landschaft zu erforschen und die Veränderungen zu identifizieren, die mit einem pathologischen Zustand verbunden sind, der als neuartige therapeutische Ziele dienen könnte.

Dieses Protokoll ist Zellen in der Kultur gewidmet, da sie transduziert werden müssen, um exogene markierte Ub/Ubl auszudrücken. Nach der Erstellung können diese stabilen Zelllinien verwendet werden, um Ubl-Profile aus Kultur in 2D- oder 3D- oder Xenografts zu generieren und so den Horizont der verschiedenen experimentellen Modelle zu erweitern, die zum Studium von PTMs-Profilen angewendet werden können.

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Protocol

1. Erzeugung stabiler Zelllinien, die 6His-Flag-Ubl exdrücken

HINWEIS: Ko-Transfektion von HEK-293T-Zellen mit pCCL-6HF-Ubl, pVSVG und Delta-Helper.

  1. Tag 0: Samen 293T Zellen in einer 6-Well-Platte, um 50-70% Zusammenfluss am Tag danach zu erhalten.
  2. Tag 1: Ko-Transfekte 50-70% konfluente Zellen mit einer Mischung aus 1 g pCCL-6HF-Ubl oder pCCL-GFP, 1 g pVSVG und 1 g Delta-Helper-Vektoren unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes und eines Protokolls für die Lentivirus-Produktion. Nach 6 h Transfektion das Medium in ein frisches zu verändern, das den zu transduzierenden Zellen entspricht. Säen Sie die Zellen, die in einer 6-Well-Platte transduziert werden sollen, um einen 10-20% Zusammenfluss am Tag danach zu erhalten (der Tag des Beginns der Transduktion).
  3. Tag 2: 24 h nach der Transfektion, das Medium mit lentiviralen Partikeln und Filter mit 0,45 m Filtern wiederherstellen. Fügen Sie bei Bedarf an dieser Stelle frisches Medium hinzu, um eine zweite Charge von Lentiviren herzustellen. Ersetzen Sie das Medium der zu transduzierenden Zellen (10-20% Zusammenfluss) durch das Medium, das Lentiviren enthält.
    HINWEIS: Das Lentivirale Medium kann mehrere Tage vor der Transduktion bei +4 °C aufbewahrt oder monatelang bei -80 °C gelagert werden.
  4. Inkubieren Sie die Zellen mit Lentiviren zwischen 24 h und 72 h in einem Standard-Inkubator (37 °C, 5%CO2), und wechseln Sie dann das Medium für frische Standard-Inkubator. Wenn möglich, überprüfen Sie die GFP-Expression mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, um die Effizienz der Transduktion zu bewerten: Prozentsatz der exlomitierenden Zellen und relativer Expressionsgrad pro Zelle. Wenn keine Fluoreszenz erkannt wird, warten Sie auf weitere 2-3 Tage, da die Expression je nach Zelltyp länger dauern kann.
  5. Wenn die GFP-Kontrolle positiv ist, wachsen alle Zellen, bis sie genug haben, um eine Expressionskontrolle von 6HF-Ubl durch Immunfluoreszenz und Western Blot mit Anti-Flag-Antikörper durchzuführen.

2. Doppelte Reinigung modifizierter Proteine

HINWEIS: Puffer 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0,1 M Na2HPO4/NaH2PO4, pH 8,0, 0,5% Triton X-100.
Puffer 2: 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Glycerin, pH 8.0.
Puffer 3: 100 mM NH4HCO3, pH 8.0.

  1. Zelllyse: Nach der Bereitenise Kulturgeschirr mindestens einmal mit phosphatgepufferter Saline (PBS) bei Raumtemperatur (RT) waschen und zur Zelllyse oder alternativ zum Blitzeinfrieren in Flüssigkeit N2 führen und bei -80 °C lagern. Für die Lyse 2 ml Puffer 1 pro 15 cm Schale bei RT hinzufügen. Verwenden Sie einen Zellschaber, um alle Lysate in 50 ml konischen Zentrifugenrohren (Endvolumen ca. 20 ml) zurückzugewinnen.
  2. Beschallen Sie die Lysate dreimal für 30 s durch eine 1 min Pause getrennt.
  3. Zentrifugieren Sie die beschallten Lysate bei 15.000 x g für 15 min.
  4. Übertragen Sie den Überstand mit einem Zellsieb (40 m) in ein neues Rohr.
  5. Bestimmen Sie die Konzentration der Proben und passen Sie bei Bedarf die gleiche Menge an Proteinen und das gleiche Volumen an. Verwenden Sie eine Gesamtmenge an Protein zwischen 50 und 100 mg (10 Gerichte mit 15 cm Durchmesser für MiaPaCa-2 Zellen).
  6. Fügen Sie Ni2+-NTA Perlen, mit 2 l Perlen pro 1 mg Protein.
  7. Drehen Sie bei 30 Rpm während 2,5 h bei RT.
  8. Pellet die Perlen bei 500 x g für 5 min.
  9. Waschen Sie die Perlen mit 1 ml Puffer 1, übertragen Sie die Proben in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, und übertragen Sie dann die Rohre auf Eis. Führen Sie alle nächsten Schritte auf Eis oder bei 4 °C aus.
  10. Zweimal mit 1 ml eiskaltem Puffer 2 mit 10 mM Imidazol waschen.
  11. Um gebundene Proteine zu elute gebunden, fügen Sie 600 l Puffer 2 mit 250 mM Imidazol hinzu und drehen Sie 2 h bei 4 °C.
  12. Pellet die Perlen durch Zentrifugation bei 500 x g für 1 min. Übertragen Sie die Unterranten auf neue, vorgekühlte, 1,5 ml Rohre und fügen Sie 50 l Anti-Flag M2 Antikörper konjugierte Perlen hinzu.
  13. Drehen Sie bei 30 Rprossen für 2,5 h bei 4 °C, dann waschen Sie 2 mal mit 500 l Puffer 2, dann 2 mal mit 500 l Puffer 3.
  14. Für die endende Elution 100 l Puffer 3 hinzufügen, der ein Flag-Peptid bei 0,1 g/l enthält, und bei 4 °C für 1,5 h drehen.
  15. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 1 min und übertragen Sie die Unterräuer in neue vorgekühlte Rohre.
  16. Nehmen Sie 10% (10 l), um Auf SDS-PAGE zu laden und führen Sie eine Silberfärbung des Gels durch, um die Reinigungsqualität zu kontrollieren. Wenn die Reinigung gut aussieht, analysieren Sie die 90 %, die von LC-MS/MS übrig bleiben.

3. Verarbeitung von Massenspektrometriedaten zur Generierung von Profilen von Ub/Ubls PTMs und zur Ermittlung signifikanter Unterschiede zwischen ihnen

HINWEIS: Die Ergebnisse der MS-Analyse enthalten viele Informationen, einschließlich der Gesamtzahl der Peptide sowie der Spitzenflächenwerte (Mittelwert der TOP 3-Peptidfläche10) für jedes in jeder Probe identifizierte Protein. Diese Daten können entweder mit den Peptidanzahlnummern oder den Spitzenflächenwerten oder beidem verarbeitet werden. Für die Berechnung mit Spitzenflächen, da diese Werte in der Regel im Bereich von 106liegen, ist es notwendig, sie durch diese Reihenfolge zu dividieren, bevor die gleichen Formeln wie unten angewendet werden. Die Ergebnisse, die mit beiden Methoden der Zählung erzielt wurden, sollten eine starke Korrelation aufweisen, wie es normalerweise der Fall ist. Verwenden Sie für jedes identifizierte Protein die folgenden Formeln:
v1 Peptide Werte in nicht behandelter Ubiquitin-Probe (z. B. Ub-Medikament)
v2-Peptide-Werte in Gemcitabin behandelter Ubiquitin-Probe (z. B. Ub + Medikament)
k1 Peptide Werte in nicht behandelter GFP-Probe (z.B. GFP - Medikament)
k2-Peptide-Werte in der von Gemcitabin behandelten GFP-Probe (z. B. GFP + Medikament).

  1. Normalisierung: Normalisieren Sie die Werte zwischen medikamentös behandelten Zellen und unbehandelten Zellen für Ubiquitin und GFP mit den folgenden Formeln. Normalisiert v = V und normalisiert k = K.
    V1=v1. (-v1+ -v2) / (2. V1) ; V2=v2. (-v1+ -v2) / (2. V2)
    K1=k1. (-k1+ k2) / (2. K1) ; K2=k2. k1+ k2/ (2. k2)
  2. Entfernung des Hintergrunds: Subtrahieren Sie anhand der folgenden Formeln Werte in der Kontrollprobe (GFP) von den Werten in der Ubiquitin-Probe, um spezifische Werte (V'1 und V'2) für jedes identifizierte Protein unter beiden Bedingungen zu erhalten.
    V'1=V1-K1, wenn V1-K1-0 ; V'1=0, wenn V1-K1<0
    V'2=V2-K2, wenn V2-K2-0 ; V'2 =0 wenn V2-K2<0
  3. Variation (Var) der Ubiquitination. Um einen Wert (zwischen -100 und +100) für positive und negative Schwankungen von PTM zu erhalten, die durch ein Medikament induziert werden, verwenden Sie die folgende Formel, in der die Differenz zwischen bestimmten Werten der behandelten und der unbehandelten Proben durch die Summe aller Werte, einschließlich der (um Proteine zu bestrafen, die auch in kontrollierbarer GFP identifiziert wurden), und multiplizieren Sie mit 100.
    Var = (V'2-V'1)/(V1+K1+V2+K2)*100 ; -100Abweichungen unter -50 (Repression von PTM) oder über 50 (Induktion von PTM) werden in der Regel als signifikant angesehen.
  4. Vertrauen (Conf). Verwenden Sie die folgende Formel, um einen Konfidenzwert zwischen 0 und 100 % zu erhalten:
    Conf = ((V1+V2)2/(1+V1+V2+K1+K2)2)*100 - 100/(1+V'1+V'2) ; =0, wenn <0
    Werte über 50 gelten in der Regel als zuversichtlich.
  5. Um eine schönere Verteilung der Induktions-/Repressionswerte zu erhalten und sowohl Variations- als auch Konfidenzparameter zu berücksichtigen, multiplizieren Sie Var- und Conf-Werte mit der folgenden Formel, wobei V Var und C
    =SI(V2>0;((V2*C2)-2)/(10-6);-(V2*C2)-2)/(10-6))
    HINWEIS: Da Spitzenflächenwerte in der Regel genauer sind als Peptidzählung, ist es möglich, spezifische Software zu verwenden, die der Interpretation dieser Art von Daten wie Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus) gewidmet ist, Nutzungsempfehlungen.

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Representative Results

Transduktion von Kultur-Säugetierzellen zur Erzeugung von GFP- und 6HF-Ub-exemitten Zellen
Zur Herstellung von Lentiviren, die später zur Transduce von MiaPaCa-2-Zellen verwendet werden, werden 70% konfluente HEK-293T-Zellen mit einer gleichen Menge der drei Vektoren, pCCL-6HF-Ubiquitin oder GFP/Delta-Helper/pvSvG, kotransfiziert. Nach 24 h Produktion wird das Medium, das lentivirale Partikel enthält, zurückgewonnen und gefiltert. An dieser Stelle ist es möglich, die Effizienz der Transfektion zu kontrollieren, indem die grüne Fluoreszenz von GFP, die 293T-Zellen auf einem invertierten Mikroskop exzessiiert, überprüft wird. Es sollte in der Nähe von 100% der Zellen sein. MiaPaCa-2-Zellen werden 1 bis 3 Tage lang mit Lentiviral-Überstand inkubiert. Die Wirksamkeit der lentiviralen Transduktion wird zunächst durch die Betrachtung der GFP-Fluoreszenz von GFP-transduzierten Zellen kontrolliert(Abbildung 1A Oberteil). Die GFP-Expressionsstufe kann von Zelle zu Zelle variieren, aber 100% von ihnen sollten fluoreszierend sein. Sobald diese Kontrolle abgeschlossen ist, muss auch der Ausdruck von Flag-Ubiquitin kontrolliert werden. Dies geschieht durch Immunfluoreszenzfärbung mit einem Anti-Flag-Antikörper (in der Regel M2 monoklonal)(Abbildung 1Eine untere Platte). Dies wird den Prozentsatz der transduzierten Zellen zeigen, der 100% betragen sollte, um einen stabilen Ausdruck über zukünftige Passagen der Zellkultur zu gewährleisten. Um den Expressionsgrad von exogenem Flag-Ubiquitin zu kontrollieren, werden Lysate aus transduzierten Zellen von SDS-PAGE gefolgt von Western Blot mit Anti-Flag-Antikörper analysiert (Abbildung 1B). Beide Zelllinien können eingefroren werden.

Zwei Schritte Reinigung und Steuerung durch SDS PAGE und Silberfärbung
Sobald die stabilen exspiriven Zelllinien validiert sind, werden sowohl GFP- als auch 6HF-Ubiquitinzellen verstärkt, bis genügend Material gewonnen ist, um mit der zweistufigen Reinigung fortzufahren. Es wird empfohlen, eine Sicherung dieser Zelllinien als gefrorenen Vorrat an flüssigem Stickstoff aufzubewahren, um sie bei Bedarf auftauen zu können. 36 h vor der Verarbeitung wird die Hälfte der Zellen (halb GFP und halb 6HF-Ubiquitin) mit 10 M Gemcitabin behandelt. Wenn sie bereit sind, werden ubiquitinierte Proteine aus 6HF-Ubiquitin und aus GFP-Kontrollzellen mit dem zweistufigen Reinigungsprotokoll gereinigt (Abbildung 2A). 10% der Endelution wird verwendet, um die Menge und Integrität des gereinigten Materials durch SDS-PAGE und Silberfärbung des Gels zu kontrollieren (Abbildung 2B). Molekulargewichtsmarkerbänder können verwendet werden, um die Menge an gereinigten ubiquitinierten Proteinen zu schätzen. Alternativ kann eine bekannte Menge an BSA oder einem anderen Protein in eine Linie des Gels geladen werden, um die gereinigten Proteine zu quantifizieren. Sobald diese Überprüfung abgeschlossen ist, werden die restlichen 90% der Proben durch Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie analysiert, um die Identifizierung und Halbquantifizierung von gereinigten Proteinen zu ermöglichen.

Identifizierung von ubiquitinierten Proteinen durch Hintergrundsubtraktion (GFP-Proben)
Die Daten aus der LC-MS/MS-Analyse der Proben geben die Namen und Quantifizierungen (Spitzenbereiche und Anzahl der beobachteten Peptide) jedes identifizierten Proteins in GFP- und 6HF-Ub-Proben an. Die Proteine mit der höchsten Quantifizierung in der Ubiquitin-Probe im Vergleich zur GFP-Probe sind am ehesten die wirklich allgegenwärtigen und die Anwendung der in den oben beschriebenen Methoden beschriebenen Formeln ermöglicht ihre Klassifizierung, indem sie einen Konfidenzwert von 0 bis 100 % . Proteine, die mit einem Wert von über 50 % identifiziert werden, gelten als ubiquitinierte Proteine (Abbildung 3A).

Dieser Schritt, der im Wesentlichen Hintergrundproteine (GFP) aus Ubiquitin-Proben entfernt, führte zur Identifizierung von 364 signifikant ubiquitinierten Proteinen (Abbildung 3B)7. Beachten Sie hier, dass die Proteine, die mit den höchsten Punktzahlen identifiziert werden, meist bereits als Hauptziele der Ubiquitination bekannt sind, was die Wirksamkeit dieser Reinigungsmethode beweist.

Dann ist es möglich, eine Genset-Anreicherungsanalyse (GSEA) dieser ubiquitinierten Proteine durchzuführen, um die biologischen Prozesse, an denen sie beteiligt sind, hervorzuheben (Abbildung 3C), ihre molekularen Funktionen, ihr zelluläres Kompartimt, oder jede andere genontologische Kategorisierung. Es ist interessant, dieses ubiquitinierte Proteom mit dem vollständigen Proteom der Zelle zu vergleichen, wenn möglich. Diese Analyse zeigt den tatsächlichen Beitrag dieser ubiquitinierten Proteine in spezifischen Prozessen wie der Translation oder Proteolyse zum Beispiel (Abbildung 3C).

Der Hauptzweck dieser Art von Experiment ist es, Veränderungen innerhalb des ubiquitinierten Proteoms zu identifizieren, das durch eine Behandlung induziert wird, zum Beispiel hier Gemcitabin. Durch den Vergleich des Ubiquitinoms (das ubiquitinierte spezifische Proteom) in behandelten und unbehandelten Zellen mit der spezifischen Formel ergibt sich ein Wert von -100 (Unterdrückung der Ubiquitination) bis +100 (Induktion der Ubiquitination). Berücksichtigt man nur die Werte unter -50 oder mehr als signifikant, so wurden insgesamt 73 induzierte Ubiquitinationen und 29 unterdrückte Ubiquitinationen identifiziert (Abbildung 4A). Die GSEA-Analyse dieser Veränderungen der Ubiquitination ergab spezifische Anreicherungen in DNA-Reparaturprozessen oder Zellzyklus sowie wichtige Variationen in Translations- und RNA-Stoffwechselprozessen (Abbildung 4B). Dieses Ergebnis ist sehr logisch, da Gemcitabin ein Basisanalogist ist, das die DNA-Synthese blockiert und DNA-Schäden provoziert.

Um weiter zu gehen, ist es auch interessant, Datenbanken von interagierenden Proteinen zu verwenden, um potenzielle interagierende Netzwerke zu erforschen und zu validieren, die durch Gemcitabin induzierte Veränderungen der Ubiquitination gebildet werden (Abbildung 5). Dies führte zur Identifizierung von funktionellen interagierenden Netzwerken, die stark von einer erhöhten oder verminderten Ubiquitination der beteiligten Proteine betroffen sind.

Schließlich, unter der veränderten Ubiquitination, einige können Proteine von höchstem Interesse sein, aufgrund ihrer bekannten oder potenziellen Funktionen nach Literatur. Daher ist ein wichtiger Schritt zu bestätigen, dass das, was durch Massenspektrometrie beobachtet wird, real und vertrauenswürdig ist. PCNA war eines der am häufigsten überubiquitinierten Proteine nach Gemcitabin-Behandlung, das durch Massenspektrometrie-Analyse nachgewiesen wurde (Abbildung 4A). Um zu überprüfen, ob Gemcitabin tatsächlich die Ubiquitination von PCNA induziert, werden MiaPaCa-2-Zellen, die 6HF-Ub und GFP exdrücken, angebaut, behandelt oder nicht, und unterliegen entweder der Ni-NTA-Reinigung unter den Denaturierungsbedingungen oder der Anti-Flag-Immunpräzipitation gefolgt von Flag Peptid-Elution unter nativen Bedingungen, gelöst auf SDS PAGE, gefolgt von Western Blot mit dem entsprechenden Antikörper. Das in Abbildung 6 gezeigte Ergebnis bestätigte, dass PCNA tatsächlich stark als Reaktion auf die Gemcitabin-Behandlung in MiaPaCa-2-Zellen ubiquitiniert ist.

Figure 1
Abbildung 1: Einrichtung stabiler Zelllinien, die 6His-Flag-Ubl exdrücken. (A) Kontrolle der GFP-Expression in GFP-transduzierten Zellen (Oberpanel) und von 6His-Flag-Ubiquitin durch Immunfluoreszenz mit Anti-Flag (M2) Antikörper als primärem und alexa-567 Anti-Maus-Sekundärantikörper. DAPI wurde verwendet, um Kerne zu färben. Scale bar: 50 m. (B) Kontrolle der 6His-Flag-Ubiquitin-Expression in Zelllysaten durch Western Blot mit Anti-Flag-Antikörper (Alternativ kann ein Anti-6his-Antikörper verwendet werden) auf der linken Seite und Anti-Ubiquitin-Antikörper, auf der rechten Seite, um die Expression zu vergleichen von 6His-Flag-Ubiquitin (6HF-Ubiq) mit endogenem Ubiquitin (Endo. Ubiq). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Zweistufige Reinigung von ubiquitinierten Proteinen. (A) Schematische Darstellung des Verfahrens. (B) 10 % der Endelution wurden SDS PAGE gefolgt von einer Silberfärbung des Gels unterzogen, um die Menge und Reinheit (im Vergleich zu GFP) isolierter Proteine zu schätzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Identifizierung von ubiquitinierten Proteinen (angepasst von Bonacci et al. 7). (A) Relative Mengen spezifischer (Ubiquitin-Probe) und unspezifischer (GFP-Probe) Peptide für jedes identifizierte Protein wurden in Abhängigkeit von ihren zuversichtlichen Werten dargestellt. Wie gezeigt, wird der Anteil der unspezifischen über ubiquitinierten Proteine unter der Punktzahl von 50 zu wichtig. Daher werden nur Proteine, die mit einer Punktzahl von mehr als 50 identifiziert werden, als signifikant angesehen. (B) Tabelle mit den 20 besten ubiquitinierten Proteinen unter den insgesamt 364 identifizierten Proteinen. (C) Neuaufteilung von ubiquitinierten Proteinen und Gesamtproteinen von MiaPaCa-2-Zellen innerhalb biologischer Prozesse (Werte > 1,5 % wurden nur berücksichtigt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Gemcitabin induzierte Veränderungen von PTM-Profilen (angepasst von Bonacci et al. 7). (A) Auflistung der 20 Proteine mit der höchsten erhöhten (insgesamt 73) oder verringerten (insgesamt 29) Ubiquitination bei Gemcitabin-Behandlung (Conf: Vertrauen; Ind: Induktion; Rep: Repression). (B) Die Neuaufteilung von Gemcitabin induzierte veränderte Ubiquitination innerhalb biologischer Prozesse und Vergleich mit nicht behandelten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Funktionelle Interome von Gemcitabin induzierte veränderte Ubiquitination. Mögliche Wechselwirkungen zwischen allen Proteinen mit Gemcitabin induzierte Veränderung der Ubiquitination werden anhand einer Protein-Protein-Interaktionsdatenbank (STRING: string-db.org) identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Biochemische Validierungen interessanter Gemcitabin-induzierte Veränderungen der Ubiquitination. Um die erhöhte Ubiquitination von PCNA nach der Gemcitabin-Behandlung zu validieren, wurden Lysate von Zellen, die 6HF-Ubiquitin exemitten, behandelt oder nicht mit Gemcitabin behandelt, Nickel-Pull-down (Ni-NTA) gefolgt von Anti-PCNA Western Blot unterzogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Wir haben eine robuste und zuverlässige Methodik entwickelt, um Profile von Proteinen zu generieren, die von den wichtigsten Ubiquitin-Familienmitgliedern modifiziert wurden. In der Tat haben wir dieses Protokoll erfolgreich angewendet, um Profile von PTMs durch Ubiquitin, aber auch durch SUMO und Nedd8 zu generieren und Veränderungen im Zusammenhang mit einer Behandlung zu erkennen7, als Reaktion auf die Überexpression oder den Knockdown eines bestimmten Gens (Daten nicht und in Zellen, die einen resistenten Phänotyp gegen verschiedene Chemotherapeutika erworben haben.

Es gibt nur wenige kritische Schritte während des Verfahrens, mit denen der Manipulator vorsichtig sein sollte. Beim Pipetieren von Perlen (Ni-NTA oder Anti-Flag gekoppelt), ist es wichtig, sie gründlich zu suspendieren, vor allem die Anti-Flag-Perlen, da in einem viskosen Glycerin-basierten Puffer aufgehängt sind, und ein wenig das Ende der Spitze zu schneiden, um den Abschnitt zu erhöhen. Eine weitere Vorsichtsmaßnahme sollte befolgt werden, um Pipette langsam zu pipette, um das Stapeln von Perlen zu vermeiden. Weitere kritische Schritte sind die Elution mit Imidazol und dann mit Flag Peptid. Eine saubere Hamilton-Spritze muss verwendet werden, um den Überstand nach der Elution zu erholen, um zu vermeiden, so viel wie möglich Pipettierung der Perlen, auf denen unspezifische Proteine bleiben.

Je nach Zelltyp und der Menge des benötigten Endmaterials für die Massenspektrometrie kann das Ausgangsmaterial entsprechend erhöht oder verringert werden. Dann liegt die einzige wichtige Anpassung im Volumen der Nickelperlen, da es von 2 l pro 1 mg Proteinin Lysat sein sollte. Es kann vorkommen, dass die Menge an gereinigten Proteinen zu gering ist. Die Expressionsstufe von mit Tags Ub/Ubl versehenen Werten sollte kontrolliert werden, und wenn sie zu niedrig ist, können Zellen mit den gleichen Lentiviren erneut transduziert werden. Alternativ ist es möglich, die Menge des Ausgangsmaterials zu erhöhen. Manchmal ist die Menge an unspezifischem gereinigtem Material in GFP- oder Elternzellen zu hoch. Eine Lösung, um dieses Problem zu überwinden, ist die Erhöhung des Volumens und der Anzahl der Wärtungen sowohl bei Ni-NTA als auch bei Flag-Reinigungsschritten. Es ist auch möglich, die Konzentration von Imidazol in Waschungen mit Guanidinpuffer, bis zu 20 mM zu erhöhen. Umgekehrt ist es nicht notwendig, die Konzentration von Flag-Peptid im letzten Elutionsschritt zu erhöhen, da es die Elution nicht erhöht. Es ist wichtiger, frisches Peptid als im Laufe der Zeit zu verwenden, auch wenn bei -20 °C gespeichert, die Wirksamkeit des Peptids kann abnehmen.

Die Hauptbeschränkung dieses Protokolls ist, dass es nur für kultivierte Zellen geeignet ist, da sie transduziert werden müssen, um den gewünschten markierten Ubl auszudrücken. Daher muss jede Studie an Geweben oder Tumorproben mit alternativen Ansätzen wie diGly Peptiden Anreicherungen nach Trypsin-Verdauung11,Immunpräzipitation mit Antikörpern spezifisch für die Ub/Ubl von Interesse5, oder die Verwendung von TUBEs6. Alle diese alternativen Methoden eignen sich auch für ihre Anwendung in kultivierten Zellen. Sie haben den Vorteil, dass sie die endogenen Ub/Ubls-Maschinen verwenden. Es bestehen jedoch mehrere Nachteile. Immunpräzipitationen sind mit niedrigem Hintergrund schwer durchzuführen, und wie TUBEs-Ansätze können Proteine, die mit modifizierten Proteinen interagieren, und sogar der Modifikator selbst nicht eliminiert werden, obwohl praktische Verbesserungen mit Hilfe von strengere Nein-Bedingungen. DiGly Peptide Anreicherung ist eine sehr leistungsfähige Technik, kann aber mit verschiedenen Arten von PTMs entsprechen. Zum Beispiel wird die diGly-Anreicherung aus einem Trypsin-verdautem Lysat hauptsächlich ubiquitinierte Proteine, aber auch nedylierte Proteine identifizieren, da Nedd8 die gleiche Rest-diGly-Signatur hinterlässt wie Ubiquitin11.

Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist, dass das Vorhandensein des 6His-Flag-Tags die normale Funktion von Ub/Ubl verändern kann und der Überausdruck selbst die Maschinerie verändern könnte. Dies könnte beispielsweise die Erzeugung von Polyubiquitinketten behindern und die Monoubiquitination begünstigen. Da jedoch sowohl Mono-Multi- als auch Polyubiquitin-Ketten mit diesem Protokoll identifiziert wurden, scheint es nicht der Fall zu sein7. Das Vorhandensein des Tags am N-Terminus verhindert auch die Bildung einer linearen Ubiquitination, bei der Ubiquitin-Moieties über das N-Terminal-Methionin von Ubiquitin miteinander verbunden sind. Obwohl 6HF-udiquitin auf seinem ersten Met-Rückstand nicht allgegenwärtig ist, hat es immer noch die Fähigkeit, diese Art von Kette zu beenden.

Auch wenn es ein wesentlicher Vorteil ist, Lentiviren zu verwenden, die die Bildung stabiler Zelllinien in ein oder zwei Wochen ermöglichen, ist es möglich, dass nicht alle Zellen das gewünschte Konstrukt ausdrücken würden. Dies kann kein wirkliches Problem für das Reinigungsverfahren sein, solange genügend Zellen das exogene Ub/ubl ausdrücken, aber das Problem kann mit einer langfristigen Kultur kommen, da es über mehrere Passagen eine klonale Variation mit Anreicherung in Zellen mit weniger oder gar keiner Ausdruck. Dieser Nachteil kann jedoch leicht umgangen werden, indem Lentiviren verwendet werden, die entweder ein Resistenzselektionsgen oder ein fluoreszierendes Protein enthalten, das in der Durchflusszytometrie verwendet werden kann, um nur positive Zellen auszuwählen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von La Ligue Contre le Cancer to HV und MS und der ARC (Association pour la recherche sur le cancer) an PS, INCa (institute national du cancer) und Canceropole PACA to JI unterstützt. Die Massenspektrometrieanlage von Marseille Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) unterstützt von IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, der Cancéropéle PACA, der Provence-Alpes-Céte d'Azur Région, das Institut Paoli-Calmettes und das Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220-5ML binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody Sigma-Aldrich F3165 to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm Falcon 352350 to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide Sigma-Aldrich F3290 elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich 50933 chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole Sigma-Aldrich I5513 eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000 ThermoFisher L3000015 to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes Sigma-Aldrich Z666491 avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm Millipore HAWP04700F1 to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA Qiagen 30210 purification of the 6His tag

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References

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