카달 정맥 포도당 주사에 의한 파라바이오틱 마우스의 공유 혈액 공급 확립 감지

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Biology

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Summary

여기에서 우리는 포도당의 꼬리 정맥 주입을 통해 2개의 parabionts의 공유 혈액 순환의 성공적인 설치를 검출하는 새로운 방법을 기술합니다, 이는 최소한의 손상을 일으키는 원인이 되고 parabionts에 치명적이지 않습니다.

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Liu, X., Bai, X., Li, M., Li, H., Zhang, Y., Yang, B. Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection. J. Vis. Exp. (156), e60411, doi:10.3791/60411 (2020).

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Abstract

파라바이오시스는 신체의 세로 축을 따라 두 마리의 평행 동물을 외과적으로 결합시키는 실험적인 방법입니다. 우리는 포도당의 꼬리 정맥 주입에 의하여 parabionts에 있는 혈액 키메증의 성공적인 설치를 검출하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 파라바이오틱 마우스를 시공하였다. 포도당은 꼬리 정맥을 통해 기증자 마우스에 주입되었고, 혈당 수치의 변동은 서로 다른 시점에서 혈액 글루컴터를 사용하여 두 마우스모두에서 측정되었다. 우리의 결과는 포도당 주입 후에, 기증자 마우스에 있는 혈액 포도당 수준이 1 분 후에 급격하게 증가하고 그 후에 천천히 감소한다는 것을 보여주었습니다. 한편, 수용자 마우스의 혈당 수준은 주사 후 15분 만에 정점을 찍었다. 유사한 결과 에반스 블루와 함께 얻은, 포도 당에 대 한 긍정적인 제어로 사용. 혈액 포도당 수준의 동기 변동은 두 마우스 사이의 혈류가 성공적으로 확립되었다는 것을 나타냅니다.

Introduction

파라바이오시스는 두 개의 살아있는 유기체가 외과적으로 결합되어 공유순환계통1을가진 단일 생리시스템으로 발전하는 모델링 방법이다. 이러한 모델은 한 개인에 의해 생성된 물질이 공유 순환 계통을 통해 동시에 두 동물에 작용할 수 있다는 이점 때문에 생리학을 연구하는 데 널리 사용되어 왔다. 1800년대 중반 폴버트(PaulBert 2)가 파라바이오틱 실험을 개척한 이래, 파라바이오틱 모델을 만드는 방법이 표준화되었다. 그러나 혈액 키메라의 성공적인 확립을 확인하는 간단하고 편리한 방법이 누락되었습니다. 교차 순환은 0.5% 에반스 청색 염료를 파라비오엔트 중 하나에 주입한 후 마이크로플레이트 판독기를 가진 두 파라비오트의 혈액에서 에반스 블루의 흡광도를 측정함으로써 성공적으로 평가될 수 있다고 보고되었다3. 또 다른 방법은 각 파라비올트에 CD45.1+및 CD45.2+-표지된 단핵구를 포함하는 특정 마우스 품종을 필요로 한다. 세포 세포측정은 비장 또는 혈액4에서단핵구에 있는 2개의 마커의 주파수를 측정하여 혈액 키메라증을 결정하기 위하여 그 때 이용됩니다. 그러나, 이러한 방법은 종종 동물에게 치명적이거나 번거롭고, 파라바이오틱 모델의 신속하고 신뢰할 수 있는 검증을 위한 안전하고 간단한 방법이 매우 바람직하다. 이 연구에서는, 우리는 이 목적을 위한 새로운 방법을 설치했습니다, 이는 parabiosis의 마우스 모형에서 검증되었습니다. 꼬리 정맥에서 가져온 혈액 샘플의 포도당 농도는 글루컴터를 사용하여 측정되며, 기증자 및 수용자 마우스의 포도당 수준 변화 패턴은 순환 키메라의 표시로 간주됩니다. 우리는이 방법을 "포도당 변동 방법"이라고 명명했습니다. 이 검증 방법의 적용은 마우스에 한정되지 않지만 포도당 대사의 심각한 dysregulation을 가진 사람들을 제외하고 다양한 병리학 적 모델로 확장 될 수있다. 절차는 간단하고, 시간을 절약하고, 안전합니다.

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Protocol

동물과 그들의 배려를 관련시키는 모든 절차는 하얼빈 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

참고: 이 방법에 필요한 도구와 장비는 재료 표에나열되어 있습니다.

1. 재료 및 동물의 준비

  1. 표준 실험실 동물 공급 업체에서 20 g-25 g 사이의 무게를 가진 C57BL/6 남성 마우스를 주문하십시오.
  2. 12 시간 빛의 주기에 마우스를 집: 물과 음식에 광고 libitum 액세스와 24-26 °C에서 12 시간 어둠.

2. 파라바이오시스

  1. 0.1 mL/10 g의 농도로 20 g/L 2,2,2-tribromoethanol의 복강 내 주사로 마우스를 마취.
  2. 안구 건조를 방지하기 위해 Q-tip으로 안과 연고를 바르십시오.
  3. 앞서 설명한 대로 파라바이오시스 절차를수행5.
    1. 마우스를 척추 위치에 놓습니다. 한 마우스의 왼쪽과 다른 마우스의 오른쪽을 전기 면도기로 무릎 아래 1cm까지 팔꿈치 위 약 1cm에서 시작하십시오. 제모 크림을 사용하여 면도한 피부의 털을 완전히 지웁히 치웁습니다.
    2. 요오드도프로 면도 부위를 닦으소서. 생쥐를 멸균 패드로 덮은 가열된 패드에 놓습니다.
    3. 각 동물의 면도면에 날카로운 가위를 사용하여 팔꿈치 위 0.5cm에서 무릎 관절 아래 0.5cm까지 세로 피부 절개를 만듭니다.
    4. 절개 후 피하 근막으로부터 피부를 부드럽게 분리합니다.
    5. 파라비올라논과 무릎을 3-0 봉합사와 연결합니다.
    6. 연속 5-0 봉합과 면도 피부를 봉합.
  4. 탈수를 방지하기 위해 각 마우스에 0.5 mL의 0.9 % NaCl을 피하로 주입하십시오.
  5. 트라마돌 (10 mg / 25 g / 일)을 각 마우스에 심근으로 주입하여 통증을 완화하십시오.

3. 순환 키메라의 유효성 검사

  1. 포도당 변동 방법
    참고 : 파라 바이오시스 수술 후 10 일째에 포도당 변동 방법 (금식 없음)을 사용하여 파라비오인 사이의 순환 키메라의 성공적인 건설을 확인하십시오.
    1. 0.1 mL/10 g의 농도로 각 마우스에 20 g/L 2,2,2 트리브로모에탄올을 주입하여 파라비오엔트체를 마취시다.
    2. 정맥 시각 마우스 꼬리 고정기에서 기증자 마우스를 수정합니다.
    3. 꼬리를 청소하고 혈관을 팽창하기 위해 70-75 % 알코올에 담근 면봉으로 parabiont의 꼬리 중 하나의 측면에 꼬리 정맥을 문질러.
    4. 오른손에 포도당을 포함하는 1.0 mL 주사기를 잡고 바늘을 정맥 (15° 미만)에 평행하게 유지하십시오.
    5. 꼬리 끝에서 약 2-4cm 떨어진 위치에 바늘을 삽입합니다.
    6. 10s 이내 기증자에 포도당 (1.2 g/kg)의 100 μL를 주입하십시오.
      참고: 용어 기증자는 꼬리 정맥을 통해 포도당 주입을 수신하는 parabiont를 나타납니다. 수령인은 포도당을 직접 수신하지 않는 그밖 parabiont입니다.
    7. 요오드도프로 발가락을 청소합니다. 가위로 기증자 및 수용자 마우스의 발가락을 잘라 내고 포도당 주입 후 다른 시점에서 혈액 한 방울을 수집합니다 (1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 및 60 분). 더 많은 피해를 피하기 위해 각 수집 시점에서 혈전을 제거하십시오.
      참고: 수집된 혈액의 부피는 1회 검사에 대해 10-25 ul, 총 90-225 ul이었다.
    8. 포도당 수준 검출을 위한 글루컴터 시험 스트립의 중앙으로 혈액을 적물.
  2. 에반의 파란색 카운터스테인을 포지티브 컨트롤3으로사용하십시오.
    1. 200 μL의 0.5% 에반의 청색 카운터스테인을 복강내 마우스에 주입합니다.
    2. 2 시간 후, 복강 내 주입에 의해 파라비오엔트 20 g/L 2,2,2-트리브로모에탄올을 각 마우스에 0.2 mL/10 g의 농도로 안락사시키고, 심장 천자에 의해 두 파라비온제로부터 혈액을 수집한다.
    3. 15 분 동안 916 x g에서 혈액 샘플을 원심 분리합니다.
    4. 상급에서 혈청을 수집합니다.
    5. 1:50에 0.9% NaCl로 세럼을 희석합니다.
    6. 분광광도계로 620 nm에서 희석 된 혈청 샘플의 흡광도를 측정합니다.

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Representative Results

6명의 기증자 마우스에서, 혈액 포도당 수준은 꼬리 정맥을 통해포도당 (1.2 g/kg)의 100 μL의 주입 후에 1 분의 평균에서 26.5 μmol/L (173% 증가)로 급격히 증가한 다음 60 분에 13.3 μmol/L로 점차적으로 감소했습니다. 수용자 마우스에서, 혈액 포도 당은 주입 후 천천히 증가하고 15 분 (47 % 증가, 12.2 μmol / L)에서 첫 번째 피크 수준에 도달했습니다. 상기 결과에 기초하여, 순환 키메라에 대한 표준은 다음과 같이 설정하였다: 1) 혈당 수치의 급격한 증가(최소 100% 증가 또는 >20 μmol/L) 포도당 주사 후 1분 이내의 공여자 마우스에서, 2) 주사 후 15분 후에 수용자 마우스에서 혈당 수치가 현저한 증가(최소 37% 증가)(도1).

파라비오엔트의 혈청에 에반스 블루 염료의 농도는 또한 순환 키메라의 성공적인 건설을 나타냈다(그림 2). 우리는 2,2,2-트리브로모에탄올 (20 g/L)의 5 mL를 사용하여 혈당 측정 후 파라비오엔트(parabionts)를 안락사시켰습니다. 파라비올산체 사이의 피하 혈관 접합은 명확하게 관찰되었다(그림3).

보충도 1은 기증자 마우스가 포도당 주사 후 1분 동안 유의한 혈당 수치를 보였으며, 수용자 마우스의 혈당 수준은 상승되지 않았으며, 이는 파라바이오시스 수술 후 1일 동안 파라바이오시스의 순환 키메라증이 성공적으로 확립되지 않았다는 것을 입증하였다. 유사하게, 수용자 마우스에서의 혈액 OD 수준은 공여자 마우스의 그것만큼 상승하지않았다(보충도 2).

포도당 변동 방법의 결과에 근거하여, 우리는 파라비오염의 2쌍이 parabiosis 수술 후에 15 일 혈액 키메증을 설치하지 않았다는 것을 것을을 발견했습니다. 보충표 1에나타낸 바와 같이, 2명의 수용자 마우스는 기증자 마우스내로 포도당 주사 후 60분 이내에 증가된 혈당 수준을 갖지 않았다. 두 수혜자에서 에반스 블루의 혈중 농도도 상승되지않았다(보충표 2),이는 포도당 변동 방법이 에반스 블루 방법만큼 민감하다는 것을 입증하였다.

더욱이, 인슐린 대사에 대한 주입된 포도당의 영향을 평가하기 위해, 마우스에서 100 μL(1.2 g/kg)의 포도당(1.2 g/kg)을 주사한 후 혈액 인슐린 레벨 1 및 3h를검출하였다(보충도 3). 혈액 인슐린 수준은 포도당 주입 후에 현저하게 감소되었습니다 1 h 때문에 급속하게 증가한 포도당 및 3 h에 정상 수준으로 회복했습니다. 이 결과는 우리가 인슐린 물질 대사에 주입한 포도당의 효력이 복구가능했다는 것을 설명했습니다.

Figure 1
그림 1: 꼬리 정맥을 통해 포도당을 주입 한 후 parabionts에서 혈액 포도당 수준의 변화. (A)기증자 마우스의 혈당 수준. (B)수용자 마우스의 혈당 수준 (n = 6). 데이터는 평균 ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 대 0분으로 표시됩니다.

Figure 2
도 2: 마이크로플레이트 판독기에서 측정된 파라바이올트의 혈청 샘플에서 에반스 블루의 농도. 데이터는 평균 ± SEM. ***p&0.001(n=6)으로 제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 파라바이오트 들 사이의 연결된 피부에서 피하 혈관의 생성. 왼쪽: 파라바이오시스 마우스의 대표적인 이미지. 오른쪽: 파라비온성 사이의 피하 혈관의 대표적인 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Supplementary Figure 1
보조 그림 1: 파라바이오티스의 혈당 수치를 파라바이오시스 수술 1일 후 시험했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Supplementary Figure 2
보조 그림 2: 파라바이오시스 수술 후 1일 파라바이오티스의 혈청에서 마이크로플레이트 판독기에서 측정된 에반스 블루의 농도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Supplementary Figure 3
보조 그림 3: 포도당 주입 후 마우스의 혈청에서 인슐린의 농도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

약 0분 약 5분 약 15분 20분 약 40분 약 60분
기증자-1 5.7 26.2 21.2 17.6 16.9 15.4
받는 사람 1 6.7 5.8 5.9 6.2 5.2 5.4
기증자-2 8.4 25.5 21.1 20.5 17.4 13.8
받는 사람 2 6.7 5.8 5.9 6.2 5.2 5.4

보충 표 1: 파라바이오시스 수술 후 15일 간 파라비오엔트에서 혈당 수치(μmol/L)를 채진한다.

제어 1 기증자-1 받는 사람 1 제어-2 기증자-2 받는 사람 2
OD 값 0.059 0.935 0.062 0.068 0.862 0.073

보충 표 2: 파라바이오시스 수술 후 15일 후 파비오엔트에서 에반스 블루(OD 값)의 혈중 농도.

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Discussion

파라바이오시스는 실험수단6,7,8에의해 일반적인 혈관시스템을 확립하기 위해 두 마리의 살아있는 동물을 연결하는 외과적 기법을 말한다. 이 모델의 장점은 한 개인이 생산한 물질이 동시에 두 동물에 작용할 수 있다는 것입니다. 따라서, 파라바이오시스 모델은 관련 질환에서 물질 또는 요인의 역할을 탐구하는데 사용될 수 있으며, 많은 의미 있고 혁신적인 결론을 낳을 수 있다. 그것의 중대한 적용 가치의 관점에서, 모형은 심장 혈관 시스템 질병의 더 나은 이해를 초래했습니다8,9,10,11, 12,13,신경계 무질서14,15,기관 이식16,및 당뇨병17,18.

그러나, 순환 키메라의 성공적인 설립의 확인은 파라 바이오시스와 연구를위한 첫 번째 결정 단계입니다. 현재 연구는 순환 키메라를 검출하기위한 몇 가지 방법을보고했다. Loffredo 등.4는 기증자(CD45.1+)및 수용자(CD45.2+) 마우스에서 상이한 표지된 마커를 가진 비장내 단핵구의 혼합빈도를 측정함으로써 파라바이오틱 쌍에서 혈액 키메라증이 확인되었다고 보고했다. 이 방법에서, 각 파라바이오트에대해 CD45.1+ 또는 CD45.2+ -표지된 단핵구를 가진 특정 마우스를 파라바이오시스에 사용하였다. 세포 세포측정은 표시된 혈액 세포의 통합을 측정하여 혈액 키메라증을 결정하는 데 필요하였다. 또한, 마르타 외3은 파라비오엔트 중 하나에 0.5% 에반스 블루 염료의 200 μL을 주입하여 교차 순환을 평가하였다. 두 파라비온트에서 혈액은 심장 천자에 의해 2 시간 후에 수집되었다. 혈액 키메라리즘은 수용자 마우스에서 증가된 에반스 청색 농도에 의해 결정되었고, 이는 마이크로플레이트 판독기로 시험하였다. 이러한 전략은 우리가 혈액 키메라를 결정할 수 있지만, 무시할 수없는 많은 제한이 여전히 있습니다. 첫째, 치명적인 방법의 경우 혈액 키메라증은 실행 시에만 확인할 수 있습니다. 그러나, 우리의 방법에서, 혈액 키메라의 설립은 parabiosis 수술 후 언제든지 테스트 할 수 있습니다. 실패한 확립된 순환 키메라증을 가진 Parabionts는 불필요한 워크로드를 감소시키기 위하여 사전에 추가 연구를 위해 제외될 수 있습니다. 실제로, 우리의 포도당 변동 방법을 사용하여 우리는 특정 parabionts에 있는 혈액 키메증의 실패한 건축을 가진 마우스를 골라낼 수 있었습니다, 이는 parabiosis의 부족한 시간 때문일지도 모르다, 불안정한 수술 조작, 연기한 상처 치유, 또는 동물 투쟁에 기인한 단절된 바디 조직. 이러한 상황에서, 혈액 키메라의 실패는 또한 에반스 블루 방법을 사용하여 확인되었다. 이러한 결과는 포도당 변동 방법이 에반스 블루방법(보충도 1보충도 2, 보충표 1보충표 2)만큼효과적이었다는 것을 나타낸다. 둘째, 현재 사용되는 유효성 검사 방법은 간단하고 효과적인 이 새로운 방법과 달리 지나치게 시간이 많이 걸리고 어렵습니다.

본 연구에서, 우리는 포도당 변동 방법에 의해 파라바이오틱 마우스의 순환 키메라증을 성공적으로 테스트했습니다. 마우스는 포도당 주입과 혈액 포도당 수준 측정을 위해 마취되었습니다, 그들의 조작을 쉽게 했습니다. 우리는 10 초 안에 마우스의 꼬리 정맥을 통해 포도당 (1.2 g/kg)의 100 μL를 주입했습니다. 이러한 조건 하에서, 기증자 와 받는 사람 마우스에서 혈액 포도 당 수준의 정기적인 변동 관찰 되었다. 중요 한 것은, 우리가 사용 하는 포도 당의 양 안정적으로 특정 범위 내에서 혈액 포도 당 수준을 상승 하는 경향이. 더욱이, 그 결과 혈당 주사 후 혈중 인슐린 수치가 정상 범위3시간으로 회복되는 것으로나타났다(보충도 3),마우스에 주입된 포도당의 양은 인슐린 대사에 최소한의 영향을 미친 것으로 나타났다. 또한, 우리가 기증자에게 준 포도당의 투여량은 마우스의 포도당 내성 시험에 사용되는 것보다 낮았다(GTT의 경우, 2 g/kg의 포도당은 마우스에 인맥상 주사되고, 카달 정맥 주사를 통해 약 1.6 g/kg에 해당,19,20,21),이는 포도당 변동 방법에 대한 포도당 투여량이 혈당 변동을 유발하지 않는다는 것을 의미한다. 결론적으로, 우리가 사용하는 방법은 효과적이고 무해하며 시간 절약입니다. 그러나, 그것은 parabiosis에 당뇨병 마우스로 제한 될 수 있습니다., 여전히 확인에 대 한 추가 실험을 필요.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81570399 및 81773735), 중국의 국가 주요 연구 개발 프로그램 - 중국 전통 의학 현대화 연구 프로젝트 (2017YFC1702003), 헤이 롱 장에 의해 지원되었다 우수 청소년 과학 기금 (JC2017020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
curved forceps JZ surgical Instruments, China J31340
fine scissors JZ surgical Instruments, China WA1030
needle forcep JZ surgical Instruments, China 60017961
2.5 mL syringes Agilent, USA 5182-9642
Tribromoethano Sigma-Aldrich, USA T48402-5G
penicillin Solarbio, China IP0150
tramadol Yijishiye, China YJT712520
glucometer Roche Diabetes Care, Indiana Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain Solarbio, China G1810
depilatory cream Nair, USA LL9161
Warming Blanket (Heating pad) Kent Scientific Corp, USA TP-22G
Electrical shaver Codos, China CP-5000
3-0,5-0
surgical suture
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China SYZ 3-0#, SYZ 5-0#

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References

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