Detecteren van de totstandbrenging van gedeelde bloedtoevoer in parabiotische muizen door Caudal Vein Glucose Injection

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier beschrijven we een nieuwe methode voor het opsporen van een succesvolle vaststelling van gedeelde bloedcirculatie van twee parabionten door middel van een caudale ader injectie van glucose, die minimale schade veroorzaakt en is niet fataal voor de parabionts.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Liu, X., Bai, X., Li, M., Li, H., Zhang, Y., Yang, B. Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection. J. Vis. Exp. (156), e60411, doi:10.3791/60411 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Parabiose is een experimentele methode voor het chirurgisch combineren van twee parallelle dieren langs de lengteas van het lichaam. We presenteren een protocol voor het opsporen van de succesvolle oprichting van bloedchimerisme in parabionts door een caudal aderinjectie van glucose. Parabiotische muizen werden geconstrueerd. Glucose werd geïnjecteerd in de donormuis door de staartader, en de fluctuatie van de bloedsuikerspiegel werd gemeten bij beide muizen met behulp van een bloedglucometer op verschillende tijdspunten. Onze resultaten toonden aan dat na glucose-injectie het bloedglucoseniveau bij donormuizen na 1 min sterk steeg en daarna langzaam daalde. Ondertussen piekte de bloedsuikerspiegel van de ontvangende muizen 15 min na injectie. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met Evans blauw, gebruikt als een positieve controle voor glucose. De synchrone fluctuatie van de bloedsuikerspiegel geeft aan dat de bloedstroom tussen de twee muizen met succes werd vastgesteld.

Introduction

Parabiose is een modelleringsmethode waarbij twee levende organismen chirurgisch worden samengevoegd en zich ontwikkelen als één fysiologisch systeem met een gedeelde bloedsomloop1. Dergelijke modellen zijn op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de fysiologie vanwege het voordeel dat de stoffen die door één enkel individu worden geproduceerd, tegelijkertijd via de gedeelde bloedsomloop op beide dieren kunnen werken. Sinds het midden van de jaren 1800, toen parabiotische experimenten werden gepionierd door Paul Bert2, zijn de methoden voor de bouw van parabiotische modellen gestandaardiseerd geworden. Echter, een eenvoudige en handige methode voor het verifiëren van de succesvolle oprichting van bloedchimerisme is verdwenen. Er is gemeld dat cross-circulation met succes kan worden beoordeeld door intraperitoneally injecteren 0,5% Evans blauwe kleurstof in een van de parabionten, gevolgd door meting van de absorptie van Evans blauw in het bloed van beide parabionts met een microplate lezer3. Een andere methode vereist een specifiek muisras dat CD45.1+- en CD45.2+-gelabelde monocyten in elke parabiont bevat. Celcytometrie wordt vervolgens gebruikt om bloedchimerisme te bepalen door de frequentie van de twee markers in monocyten van milt of bloed te meten4. Deze methoden zijn echter vaak dodelijk of omslachtig voor de dieren, en een veilige en eenvoudige methode voor snelle en betrouwbare verificatie van parabiotische modellen is zeer wenselijk. In deze studie hebben we hiervoor een nieuwe methode vastgesteld, die werd gevalideerd in een muismodel van parabiose. Glucoseconcentratie in bloedmonsters uit een staartader wordt gemeten met behulp van een glucometer, en het patroon van veranderingen van glucoseniveau bij donor- en ontvangende muizen wordt beschouwd als een indicatie van circulatiechimerisme. We noemden deze methode de "glucose fluctuatiemethode". De toepassing van deze validatiemethode is niet beperkt tot muizen, maar kan worden uitgebreid tot diverse pathologische modellen, behalve voor modellen met ernstige dysregulatie van het glucosemetabolisme. De procedure is eenvoudig, tijdbesparend en veilig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dieren en hun zorg werden goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik van de Harbin Medical University.

OPMERKING: De gereedschappen en apparatuur die nodig zijn voor de methode zijn opgenomen in de tabel met materialen.

1. Bereiding van materialen en dieren

  1. Bestel C57BL/6 mannelijke muizen met een gewicht tussen 20 g-25 g bij een standaard leverancier van laboratoriumdieren.
  2. Huis de muizen in een cyclus van 12 uur licht: 12 uur duisternis bij 24−26 °C met ad libitum toegang tot water en voedsel.

2. Parabiose

  1. Verdoven de muizen door intraperitoneale injectie van 20 g/L 2,2,2-tribromoethanol bij een concentratie van 0,1 mL/10 g. Bevestig een goede verdoving zoals aangegeven door spierontspanning, langzame en gestage ademhaling, verlies van huidstimulatiereflex en verdwijning van hoornvliesreflex.
  2. Breng oogheelkundige zalf aan met een Q-tip om droge ogen te voorkomen.
  3. Voer de parabioseprocedure uit zoals eerder beschreven5.
    1. Plaats de muizen in de supine positie. Scheer grondig de linkerkant van de ene muis en de rechterkant van de andere muis vanaf ongeveer 1 cm boven de elleboog tot 1 cm onder de knie met een elektrisch scheerapparaat. Gebruik ontharingscrème om de vacht op de geschoren huid volledig te wissen.
    2. Veeg de geschoren gebieden met iodophor. Plaats de muizen op een verwarmde pad bedekt met een steriele pad.
    3. Maak longitudinale huidinsnijdingen vanaf 0,5 cm boven de elleboog tot 0,5 cm onder het kniegewricht met behulp van een scherpe schaar aan de geschoren kant van elk dier.
    4. Maak de huid voorzichtig los van de onderhuidse fascia na de incisie.
    5. Sluit de olecranon en knie van de parabiont aan met een 3-0 hechting.
    6. Hecht de geschoren huid met een continue 5-0 hechting.
  4. Injecteer 0,5 mL van 0,9% NaCl onderhuids aan elke muis om uitdroging te voorkomen.
  5. Injecteer tramadol (10 mg/25 g/dag) intramusair aan elke muis om pijn te verlichten.

3. Validatie van circulatiechimerisme

  1. Glucosefluctuatiemethode
    OPMERKING: Controleer de succesvolle constructie van circulatiechimerisme tussen parabionts met behulp van de glucosefluctuatiemethode (geen vasten) op de 10e dag na de parabiosechirurgie.
    1. Verdoven de parabionts door intraperitoneale injectie van 20 g/L 2,2,2-tribromoethanol aan elke muis bij een concentratie van 0,1 mL/10 g.
    2. Bevestig de donormuizen in een Venous visuele muisstaartfixator.
    3. Wrijf de staartaders in de flank van een van de staart van de parabiont met een katoenen bal gedrenkt in 70−75% alcohol om de staart schoon te maken en de bloedvaten te verwijden.
    4. Houd een 1,0 mL spuit met glucose in de rechterhand en houd de naald parallel aan de ader (minder dan 15°).
    5. Plaats de naald op een positie ongeveer 2−4 cm van de staartpunt.
    6. Injecteer 100 μL glucose (1,2 g/kg) in de donor binnen 10 s.
      OPMERKING: De term donor verwijst naar de parabiont die de glucose-injectie ontvangt via de staartader. De ontvanger is de andere parabiont, die niet direct glucose ontvangt.
    7. Maak de tenen schoon met iodophor. Snijd de tenen van de donor en de ontvangende muizen af met een schaar en verzamel een druppel bloed op verschillende tijdpunten na de injectie van glucose (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min en 60 min). Verwijder het bloedstolsel op elk verzamelmoment punt om meer schade te voorkomen.
      OPMERKING: Het volume van het verzamelde bloed was 10-25 ul voor een test, en 90-225 ul in totaal.
    8. Druppel het bloed in het midden van glucometer teststrips voor glucoseniveau detectie.
  2. Gebruik Evan's blauwe Counterstain als een positieve controle3.
    1. Injecteer 200 μL van 0,5% Evan's blauwe Counterstain intraperitoneally in de donormuis.
    2. 2 uur later, euthanaseren de parabionten door intraperitoneale injectie van 20 g/L 2,2,2-tribromoethanol aan elke muis bij een concentratie van 0,2 mL/10 g, en verzamel bloed van beide parabionts door cardiale punctie.
    3. Centrifugeer de bloedmonsters op 916 x g gedurende 15 min.
    4. Verzamel serum van de supernatant.
    5. Verdun het serum met 0,9% NaCl om 1:50.
    6. Meet de absorptie van de verdunde serummonsters op 620 nm met een spectrofotometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bij zes donormuizen steeg de bloedsuikerspiegel sterk tot 26,5 μmol/L (173% toename) met een gemiddelde van 1 min na de injectie van 100 μL glucose (1,2 g/kg) door de staartader en daalde vervolgens geleidelijk tot 13,3 mol μ/L bij 60 min. Bij de ontvangende muizen nam de bloedglucose na de injectie langzaam toe en bereikte het eerste piekniveau op 15 min (47% toename, 12,2 μmol/L). Op basis van de bovenstaande resultaten werd de norm voor circulatiechimerisme als volgt vastgesteld: 1) een sterke stijging van het bloedglucoseniveau (een stijging van minimaal 100% of >20 μmol/L) bij donormuizen binnen 1 min na glucose-injectie, en 2) een aanzienlijke stijging van het bloedglucoseniveau bij ontvangende muizen 15 min na injectie (minimaal 37% verhoging) (figuur 1).

De concentratie van Evans blauwe kleurstof in het serum van parabionts wees ook op de succesvolle opbouw van circulatiechimerisme (figuur 2). We euthanaserden de parabionten na bloedglucosemeting met behulp van 5 mL 2,2,2-tribromoethanol (20 g/L). De onderhuidse vasculaire verbindingen tussen de parabionten werden duidelijk waargenomen (figuur 3).

Aanvullende figuur 1 toont aan dat de donormuizen een significante bloedglucosestijging van 1 min hadden na glucose-injectie, terwijl het bloedglucoseniveau van de ontvangende muizen niet verhoogd was, hetgeen aantoonde dat het circulatiechimerisme in parabionts niet met succes 1 dag na de parabioseoperatie werd vastgesteld. Evenzo was het aOD-gehalte in de ontvangende muizen niet zo hoog als dat van donormuizen (Aanvullend figuur 2).

Op basis van de resultaten van de glucosefluctuatiemethode, vonden we dat twee paren parabionten geen bloedchimerisme 15 dagen na de parabiosechirurgie vaststelden. Zoals blijkt uit aanvullende tabel 1,hadden de twee ontvangende muizen geen verhoogde bloedsuikerspiegel binnen 60 min na glucose-injectie in de donormuizen. De bloedconcentratie van Evans blauw in de twee ontvangers was ook niet verhoogd (Aanvullende Tabel 2), waaruit bleek dat de glucose fluctuatie methode was zo gevoelig als de Evans blauwe methode.

Bovendien, om de invloed van geïnjecteerde glucose op het insulinemetabolisme te evalueren, ontdekten we het insulineniveau in het bloed 1 h en 3 uur na injectie van 100 μL glucose (1,2 g/kg) bij muizen (Aanvullend figuur 3). Het bloed insulineniveau was opmerkelijk verminderd 1 uur na glucose-injectie als gevolg van snel verhoogde glucose en hersteld tot normale niveaus op 3 uur. Deze resultaten toonden aan dat de effecten van glucose die we op de insulinestofwisseling injecteerden, restorable waren.

Figure 1
Figuur 1: Veranderingen van de bloedsuikerspiegel in parabionts na injectie van glucose door de staartader. (A) Bloedglucoseniveau van donormuizen. (B) Bloedglucoseniveau van ontvangende muizen (n = 6). De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM. * p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs. 0 min. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: De concentratie Evans blauw in serummonsters van parabionten gemeten door een microplatelezer. De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM. ***p < 0,001 (n = 6). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Generatie van onderhuidse vasoganglions in verbonden huid tussen de parabionten. Links: Representatief beeld van de parabiosemuizen. Rechts: Een representatief beeld van de onderhuidse vasoganglion tussen de parabionten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Supplementary Figure 1
Aanvullende figuur 1: De bloedsuikerspiegel van parabionten werd getest 1 dag na de parabiose operatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Supplementary Figure 2
Aanvullende figuur 2: De concentratie Evans blauw gemeten door microplate lezer in het serum van de parabionts 1 dag na de parabiose operatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Supplementary Figure 3
Aanvullende figuur 3: De concentratie insuline in het serum van de muizen na glucose-injectie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

0 min 5 min 15 min 20 min 40 min 60 min
Donor-1 5.7 26.2 21.2 17.6 16.9 15.4
Ontvanger-1 6.7 5.8 5.9 6.2 5.2 5.4
Donor-2 8.4 25.5 21.1 20.5 17.4 13.8
Ontvanger-2 6.7 5.8 5.9 6.2 5.2 5.4

Aanvullende tabel 1: Bloedglucose (μmol/L) in parabionts 15 dagen na de parabioseoperatie.

Controle-1 Donor-1 Ontvanger-1 Controle-2 Donor-2 Ontvanger-2
OD-waarde 0.059 0.935 0.062 0.068 0.862 0.073

Aanvullende tabel 2: Bloedconcentratie van Evans blauw (OD waarde) in parabionts 15 dagen na parabiose chirurgie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Parabiose verwijst naar de chirurgische techniek om twee levende dieren met elkaar te verbinden om een gemeenschappelijk vasculair systeem op te zetten met experimentele middelen6,7,8. Het voordeel van dit model is dat de stoffen die door één enkel individu worden geproduceerd tegelijkertijd op beide dieren kunnen werken. Zo kan het parabiosemodel worden gebruikt om de rol van een stof of factor in een verwante ziekte te onderzoeken, waardoor veel zinvolle en innovatieve conclusies worden getrokken. Gezien de grote toepassingswaarde heeft het model geleid tot een beter begrip van hart- en vaatziekten8,9,10,11,12,13, aandoeningen van het zenuwstelsel14,15, orgaantransplantatie16, en diabetes17,18.

Verificatie van de succesvolle invoering van circulatiechimerisme is echter de eerste en bepalende stap voor studies met parabiose. Huidige studies hebben gemeld een aantal methoden voor het opsporen van circulatie chimerisme. Loffredo et al.4 meldden dat bloedchimerisme in parabiotische paren werd bevestigd door de gemengde frequentie van monocyten in de milt te meten met verschillende gelabelde markers bij de donor (CD45.1+) en ontvanger (CD45.2+) muizen. Bij deze methode werden specifieke muizen met CD45.1+- of CD45.2+-gelabelde monocyten voor elke parabiont gebruikt voor parabiose. Celcytometrie was nodig om bloedchimerisme te bepalen door de integratie van de gemarkeerde bloedcellen te meten. Bovendien beoordeelden Marta et al.3 de kruiscirculatie door intraperitoneally 200 μL van 0,5% Evans blauwe kleurstof in een van de parabionten te injecteren. Bloed van beide parabionten werd 2 uur later verzameld door een hartpunctie. Bloedchimerisme werd bepaald door een verhoogde Evans blauwe concentratie in de ontvangende muizen, die werd getest door een microplate lezer. Hoewel deze strategieën ons in staat stellen om bloedchimerisme te bepalen, zijn er nog veel beperkingen die niet kunnen worden genegeerd. Ten eerste, voor dodelijke methoden, kan het bloedchimerisme alleen worden bevestigd bij de uitvoering. Echter, in onze methode, de oprichting van bloedchimerisme kan worden getest op elk gewenst moment na parabiose chirurgie. Parabionts met niet-succesvol vastgesteld circulatiechimerisme kunnen worden uitgesloten voor verder onderzoek op voorhand om onnodige werklast te verminderen. Inderdaad, met behulp van onze glucose fluctuatie methode waren we in staat om uit te kiezen van de muizen met mislukte constructie van bloedchimerisme in bepaalde parabionts, die zou kunnen worden te wijten aan onvoldoende tijd van parabiose, instabiele chirurgie manipulatie, vertraagde wondgenezing, of losgekoppeld lichaamsweefsel veroorzaakt door dierlijke worstelen. In dergelijke omstandigheden werd het falen van bloedchimerisme ook bevestigd met behulp van de Evans blauwe methode. Uit deze resultaten blijkt dat de glucosefluctuatiemethode even doeltreffend was als de Evans-blauwe methode (Aanvullende figuur 1 en aanvullend cijfer 2, aanvullende tabel 1 en aanvullende tabel 2). Ten tweede zijn de momenteel gebruikte validatiemethoden te tijdrovend en moeilijk, in tegenstelling tot deze nieuwe methode, die eenvoudig en effectief is.

In deze studie hebben we met succes getest op circulatiechimerisme bij parabiotische muizen volgens de glucosefluctuatiemethode. De muizen werden verdoofd voor de glucose-injectie en bloedglucoseniveau metingen, die hun manipulatie gemakkelijker maakte. We injecteerden 100 μL glucose (1,2 g/kg) door de staartader van de muizen binnen 10 s. Onder deze omstandigheden werd een regelmatige fluctuatie van de bloedsuikerspiegel bij donor- en ontvangende muizen waargenomen. Belangrijk is dat de hoeveelheid glucose die we gebruikten de neiging had om het bloedglucoseniveau binnen een bepaald bereik stabiel te verhogen. Bovendien toonden de resultaten aan dat het insulinegehalte in het bloed zich herstelde tot het normale bereik 3 uur na glucose-injectie(aanvullende figuur 3),wat suggereert dat de hoeveelheid glucose die in de muizen wordt geïnjecteerd minimale effecten had op het insulinemetabolisme. Bovendien was de dosering glucose die we aan de donor gaven lager dan die welke wordt gebruikt voor de glucosetolerantietest van muizen (voor de GTT, 2 g/kg glucose wordt intraperitoneally geïnjecteerd aan de muizen, gelijk aan ongeveer 1,6 g/kg door caudal aderinjectie19,20,21), wat betekent dat de dosering van glucose voor de glucosefluctuatiemethode geen hyperglykemie en andere schadelijke veranderingen zou veroorzaken. Tot slot, de methode die we gebruikten is effectief, onschadelijk en tijdbesparend. Het kan echter beperkt zijn tot diabetische muizen in parabiose, die nog verdere experimenten nodig hebben voor bevestiging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Nature Science Foundation of China (81570399 en 81773735), het National Key Research and Development Program of China - Traditional Chinese Medicine Modernization Research project (2017YFC1702003), en Hei Long Jiang Outstanding Youth Science Fund (JC2017020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
curved forceps JZ surgical Instruments, China J31340
fine scissors JZ surgical Instruments, China WA1030
needle forcep JZ surgical Instruments, China 60017961
2.5 mL syringes Agilent, USA 5182-9642
Tribromoethano Sigma-Aldrich, USA T48402-5G
penicillin Solarbio, China IP0150
tramadol Yijishiye, China YJT712520
glucometer Roche Diabetes Care, Indiana Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain Solarbio, China G1810
depilatory cream Nair, USA LL9161
Warming Blanket (Heating pad) Kent Scientific Corp, USA TP-22G
Electrical shaver Codos, China CP-5000
3-0,5-0
surgical suture
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China SYZ 3-0#, SYZ 5-0#

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346, (6205), 89-93 (2014).
  2. Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372, (6505), 425-432 (1994).
  3. Torres, M., et al. Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia. Journal of Applied Physiology (1985). 118, (1), 42-47 (2015).
  4. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, (4), 828-839 (2013).
  5. Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. Journal of Visualized Experiments. (80), e50556 (2013).
  6. Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity. Aging Cell. 12, (3), 525-530 (2013).
  7. Eggel, A., Wyss-Coray, T. A revival of parabiosis in biomedical research. Swiss Medical Weekly. 144, w13914 (2014).
  8. Brack, A. S. Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors! EMBO Journal. 32, (16), 2189-2190 (2013).
  9. Wu, J. M., et al. Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury. Circulation Research. 116, (4), 633-641 (2015).
  10. Kaiser, J. 'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice. Science. 344, (6184), 570-571 (2014).
  11. Rando, T. A., Finkel, T. Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors? New England Journal of Medicine. 369, (6), 575-576 (2013).
  12. Heidt, T., et al. Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction. Circulation Research. 115, (2), 284-295 (2014).
  13. McPherron, A. C. Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy. Circulation Research. 113, (5), 487-491 (2013).
  14. Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine. 20, (6), 659-663 (2014).
  15. Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344, (6184), 630-634 (2014).
  16. Starzl, T. E., et al. The lost chord: microchimerism and allograft survival. Immunology Today. 17, (12), 577-584 (1996).
  17. Coleman, D. L. A historical perspective on leptin. Nature Medicine. 16, (10), 1097-1099 (2010).
  18. Salpeter, S. J., et al. Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication. Diabetes. 62, (8), 2843-2848 (2013).
  19. Sheldon, R. D., et al. Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis. Journal of Hepatology. 64, (1), 171-178 (2016).
  20. Martineau, M. G., et al. The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth. Diabetes Care. 38, (2), 243-248 (2015).
  21. Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics