Upptäcka etablering av delad blodtillförsel i parabiotiska möss av Caudal Vein Glukos Injektion

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här beskriver vi en ny metod för att upptäcka framgångsrik etablering av delad blodcirkulation av två parabionter genom en caudal ven injektion av glukos, vilket orsakar minimal skada och är inte dödlig för parabionterna.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Liu, X., Bai, X., Li, M., Li, H., Zhang, Y., Yang, B. Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection. J. Vis. Exp. (156), e60411, doi:10.3791/60411 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Parabios är en experimentell metod för att kirurgiskt kombinera två parallella djur längs kroppens längsgående axel. Vi presenterar ett protokoll för att upptäcka det framgångsrika inrättandet av blodchimär i parabionter genom en caudal ven injektion av glukos. Parabiotiska möss konstruerades. Glukos injicerades i givaren musen genom svansvenen, och fluktuationer na i blodsockernivån mättes i båda mössen med hjälp av en blodglukometer vid olika tidpunkter. Våra resultat visade att efter glukosinjektion, blodglukosnivån hos donatormöss ökade kraftigt efter 1 min och minskade långsamt därefter. Samtidigt nådde de mottagande mössens blodsockernivå 15 min efter injektionen. Liknande resultat erhölls med Evans blå, som användes som en positiv kontroll för glukos. Den synkrona fluktuationen av blodsockernivåer indikerar att blodflödet mellan de två mössen har etablerats framgångsrikt.

Introduction

Parabios är en modelleringsmetod där två levande organismer förenas kirurgiskt och utvecklas som ett enda fysiologiskt system med ett gemensamt cirkulationssystem1. Sådana modeller har använts i stor utsträckning för att studera fysiologi på grund av den fördel som de ämnen som produceras av en enda individ kan agera på båda djuren samtidigt via det gemensamma cirkulationssystemet. Sedan mitten av 1800-talet då parabiotiska experiment var pionjärer av Paul Bert2, metoderna för att konstruera parabiotiska modeller har blivit standardiserade. Men en enkel och bekväm metod för att kontrollera det framgångsrika inrättandet av blodchimär har saknats. Det har rapporterats att korscirkulationen framgångsrikt kan bedömas genom intraperitoneally injicera 0,5% Evans blå färgämne i en av de parabionts följt av mätning av absorbans av Evans blå i blodet av båda parabionts med en mikroplatta läsare3. En annan metod kräver en specifik musras som innehåller CD45.1+- och CD45.2+märkta monocyter i varje parabiont. Cellcytometri används sedan för att bestämma blodcmerism genom att mäta frekvensen av de två markörerna i monocyter från mjälte eller blod4. Dessa metoder är dock ofta dödliga eller besvärliga för djuren, och en säker och enkel metod för snabb och tillförlitlig verifiering av parabiotiska modeller är mycket önskvärt. I denna studie etablerade vi en ny metod för detta ändamål, som validerades i en musmodell av parabios. Glukoskoncentrationen i blodprover från en svansven mäts med hjälp av en glukometer, och mönstret för förändringar av glukosnivån hos donatorer och mottagarmöss anses vara en indikation på cirkulationskirmerism. Vi namngav denna metod "glukosfluktuationsmetoden". Tillämpningen av denna valideringsmetod är inte begränsad till möss, men kan utvidgas till olika patologiska modeller utom för dem med allvarlig dysreglering av glukosmetabolism. Proceduren är enkel, tidsbesparande och säker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden som involverar djur och deras vård godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee of Harbin Medical University.

OBS: De verktyg och den utrustning som krävs för metoden anges i materialförteckningen.

1. Beredning av material och djur

  1. Beställ C57BL/6 hanmöss med vikt mellan 20 g-25 g från en vanlig djurleverantör för laboratorier.
  2. Hus mössen i en cykel av 12 h ljus: 12 h mörker vid 24−26 °C med ad libitum tillgång till vatten och mat.

2. Parabiosis

  1. Anesthetize mössen genom intraperitoneal injektion av 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol vid en koncentration av 0,1 mL/10 g. Bekräfta korrekt anestesisom indikeras av muskelavslappning, långsam och stadig andning, förlust av hudstimulering reflex, och försvinnande av hornhinnans reflex.
  2. Applicera oftalmisk salva med en Q-spets för att förhindra torra ögon.
  3. Utför parabiosproceduren som tidigarebeskrivits 5.
    1. Placera mössen i supine-positionen. Raka den vänstra sidan av en mus och den andra musens högra sida med början vid cirka 1 cm ovanför armbågen till 1 cm under knäet med en elektrisk rakapparat. Använd depilatorisk kräm för att helt rensa pälsen på den rakade huden.
    2. Torka de rakade områdena med iodophor. Placera mössen på en uppvärmd pad täckt av en steril pad.
    3. Skapa längsgående hudsnitt från 0,5 cm ovanför armbågen till 0,5 cm under knäleden med en sax på varje djurs rakade sida.
    4. Lossa huden från subkutan fascia försiktigt efter snittet.
    5. Anslut parabiontens olecranon och knä med en 3-0-sutur.
    6. Sutur den rakade huden med en kontinuerlig 5-0 sutur.
  4. Injicera 0,5 ml 0,9% NaCl subkutant till varje mus för att förhindra uttorkning.
  5. Injicera tramadol (10 mg/25 g/dag) intramuskulärt till varje mus för att lindra smärta.

3. Validering av spridningskirmmerism

  1. Glukosfluktuationsmetod
    OBS: Kontrollera den framgångsrika konstruktionen av cirkulationskirmerism mellan parabionter med hjälp av glukosfluktuationsmetoden (ingen fasta) den 10: e dagen efter parabioskirurgi.
    1. Bedövningsmedel genom intraperitoneal injektion av 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol till varje mus vid en koncentration av 0,1 ml/10 g.
    2. Fixa donatormössen i en Venös visuell amussvansfixator.
    3. Gnugga caudalvenerna i flanken av en av parabiontens svans med en bomullstuss indränkt i 70−75% alkohol för att rengöra svansen och vidga blodkärlen.
    4. Håll en 1,0 ml spruta som innehåller glukos i höger hand och håll nålen parallellt med venen (mindre än 15°).
    5. För in nålen på ett läge ca 2−4 cm från svansspetsen.
    6. Injicera 100 μl glukos (1,2 g/kg) i givaren inom 10 s.
      OBS: Termen givaren hänvisar till parabiont som tar emot glukosinjektionen genom svansvenen. Mottagaren är den andra parabionten, som inte får glukos direkt.
    7. Rengör tårna med iodophor. Skär av tårna på givaren och mottagaren möss med en sax och samla en droppe blod vid olika tidpunkter efter injektion av glukos (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min och 60 min). Ta bort blodproppen vid varje insamlingstid för att undvika mer skada.
      OBS: Volymen av insamlat blod var 10-25 ul för ett test, och 90-225 ul totalt.
    8. Droppa blodet i mitten av glukometer testremsor för glukosnivå detektion.
  2. Använd Evans blå motfläck som en positiv kontroll3.
    1. Injicera 200 μL 0,5% Evanblå Counterstain intraperitoneally i givaren musen.
    2. 2 h senare avlivades parabionterna genom intraperitoneal injektion av 20 g/L 2,2-tribromoetanol till varje mus vid en koncentration av 0,2 ml/10 g, och samla blod från båda parabionterna genom hjärtpunktering.
    3. Centrifugera blodproverna vid 916 x g i 15 min.
    4. Samla serum från supernatanten.
    5. Späd serumet med 0,9% NaCl vid 1:50.
    6. Mät absorbansen hos de utspädda serumproverna vid 620 nm med en spektrofotometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hos sex donatormöss ökade blodsockernivåerna kraftigt till 26,5 μmol/L (173% ökning) i genomsnitt 1 min efter injektionen av 100 μL glukos (1,2 g/kg) genom svansvenen och minskade sedan gradvis till 13,3 μmol/L vid 60 min. Hos mottagarmöss ökade blodsockret långsamt efter injektionen och nådde den första toppnivån vid 15 min (47% ökning, 12,2 μmol/L). Baserat på ovanstående resultat fastställdes standarden för cirkulationskirmerism enligt följande: 1) en kraftig ökning av blodsockernivån (en ökning på minst 100 % eller >20 μmol/L) hos donatormöss inom 1 min efter glukosinjektionen och 2) en signifikant ökning av blodsockernivån hos mottagarmöss 15 min efter injektion (minst 37 % ökning) (figur 1).

Koncentrationen av Evans blå färgämne i serum av parabionter indikerade också den framgångsrika byggandet av cirkulationschimär (Figur 2). Vi avlivade parabionterna efter blodsockermätning med 5 ml 2,2,2-tribromoetanol (20 g/L). De subkutana kärlkorsningarna mellan parabionterna observerades tydligt (figur 3).

Kompletterande figur 1 visar att donatormössen hade en betydande blodsockernivå ökning 1 min efter glukosinjektion, medan blodglukosnivån hos mottagarmössen inte upphöjdes, vilket visade att cirkulationen chimäriska i parabionts inte framgångsrikt etablerades 1 dag efter parabioskirurgi. På samma sätt var blodOD-nivån hos mottagarmöss inte lika förhöjd som givarens möss (Kompletterande figur 2).

Baserat på resultaten från glukosfluktuationsmetoden fann vi att två par parabionter inte etablerade blodchimär 15 dagar efter parabioskirurgi. Som visas i Kompletterande tabell 1,de två mottagaren möss hade inte en ökad blodsockernivå inom 60 min efter glukos injektion i givaren möss. Blodkoncentrationen av Evans blå i de två mottagarna var inte heller förhöjd (Kompletterande tabell 2), som visade att glukosfluktuationsmetoden var lika känslig som Evans blå metod.

För att utvärdera påverkan av injicerat glukos på insulinmetabolismen upptäckte vi dessutom blodinsulinnivån 1 h och 3 h efter injektion av 100 μL glukos (1,2 g/kg) hos möss (Kompletterande figur 3). Insulinnivån för blodet minskade anmärkningsvärt 1 h efter glukosinjektion på grund av snabbt ökad glukos och återhämtade sig till normala nivåer vid 3 h. Dessa resultat visade att effekterna av glukos vi injicerade på insulinmetabolismen var reparerbara.

Figure 1
Figur 1: Förändringar av blodsockernivån i parabionter efter injektion av glukos genom caudalvenen. (A)Blodglukoshalt en donatormöss. (B)Blodsockernivån för mottagarmöss (n = 6). Uppgifterna presenteras som medelvärdet ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 mot 0 min. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Koncentrationen av Evans blå i serumprover av parabionter mätt med en mikroplattaläsare. Uppgifterna presenteras som medelvärdet ± SEM. ***p < 0,001 (n = 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Generation av subkutana vasoganglions i ansluten hud mellan parabionterna. Vänster: Representativ bild av parabiosmössen. Höger: En representativ bild av den subkutana vasoganglion mellan parabionterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 1
Kompletterande figur 1: Blodglukosnivån av parabionter testades 1 dag efter parabioskirurgi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 2
Kompletterande figur 2: Koncentrationen av Evans blå mätt med mikroplatta läsare i serum av parabionts 1 dag efter parabios kirurgi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 3
Kompletterande figur 3: Koncentrationen av insulin i mössens serum efter glukosinjektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

0 min 5 min 15 min 20 min 40 min 60 min
Givare-1 5.7 26.2 21.2 17.6 16.9 15.4
Mottagare-1 6.7 5.8 5.9 6.2 5.2 5.4
Givare-2 8.4 25.5 21.1 20.5 17.4 13.8
Mottagare-2 6.7 5.8 5.9 6.2 5.2 5.4

Kompletterande tabell 1: Blodsockernivå (μmol/L) i parabionts 15 dagar efter parabioskirurgi.

Kontroll-1 Givare-1 Mottagare-1 Kontroll-2 Givare-2 Mottagare-2
OD-värde 0.059 0.935 0.062 0.068 0.862 0.073

Kompletterande tabell 2: Blodkoncentration av Evans blå (OD-värde) i parabionts 15 dagar efter parabioskirurgi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Parabios avser den kirurgiska tekniken att ansluta två levande djur för att upprätta ett gemensamt kärlsystem med experimentella medel6,7,8. Fördelen med denna modell är att de ämnen som produceras av en enda individ kan agera på båda djuren samtidigt. Således kan parabiosmodellen användas för att utforska rollen som ett ämne eller faktor i en relaterad sjukdom, vilket ger många meningsfulla och innovativa slutsatser. Med tanke på dess stora tillämpningsvärde har modellen lett till en bättre förståelse av hjärt-kärlsjukdomar8,9,10,11,12,13, nervsystemet störningar14,15, organtransplantation16, och diabetes17,18.

Verifiering av det framgångsrika inrättandet av spridningskirmmerism är dock det första och avgörande steget för studier med parabios. Aktuella studier har rapporterat vissa metoder för att upptäcka cirkulationskirmmerism. Loffredo et al.4 rapporterade att blodcmerism bekräftades i parabiotiska par genom att mäta den blandade frekvensen av monocyter i mjälten med olika märkta markörer i givaren (CD45.1+) och mottagare (CD45.2+) möss. I denna metod användes specifika möss med CD45.1+- eller CD45.2+märkta monocyter för varje parabiont för parabios. Cellcytometri behövdes för att bestämma blodcmerism genom att mäta integrationen av de markerade blodkropparna. Dessutom bedömde Marta et al.3 korscirkulationgenom intraperitoneally injicera 200 μL på 0,5% Evans blå färgämne i en av parabionterna. Blod från båda parabionterna samlades in 2 h senare av hjärtpunktering. Blodchimär en avgjordes av en ökad Evans blå koncentration i mottagarmössen, som testades av en mikroplattaläsare. Även om dessa strategier tillåter oss att bestämma blodcmerism, det finns fortfarande många begränsningar som inte kan ignoreras. För det första, för dödliga metoder, kan blodcmerismen endast bekräftas vid avrättning. Men i vår metod kan upprättandet av blodcmerism testas när som helst efter parabioskirurgi. Parabionts med misslyckade etablerade cirkulationskirmerism kan uteslutas för vidare studier i förväg för att minska onödig arbetsbelastning. Faktum är att använda vår glukos fluktuation metod vi kunde plocka ut möss med misslyckade konstruktion av blod chimär i vissa parabionts, som kan bero på otillräcklig tid av parabios, instabil kirurgi manipulation, fördröjd sårläkning, eller frånkopplad kroppsvävnad orsakad av djur kämpar. Under sådana omständigheter bekräftades också misslyckandet med blodchimär en genom att använda Evans blå metod. Dessa resultat tyder på att glukosfluktuationsmetoden var lika effektiv som Evans blå metod(kompletterande figur 1 och kompletterande figur 2, kompletterande tabell 1 och kompletterande tabell 2). För det andra är de metoder som för närvarande används för validering alltför tidskrävande och svåra, i motsats till denna nya metod, som är enkel och effektiv.

I den aktuella studien testade vi framgångsrikt för cirkulationskirmerism hos parabiotiska möss med glukosfluktuationsmetoden. Mössen var sethetized för glukos injektion och blodsockernivå mätningar, vilket gjorde deras manipulation lättare. Vi injicerade 100 μl glukos (1,2 g/kg) genom mössens svansven inom 10 s. Under dessa förhållanden observerades en regelbunden fluktuation av blodsockernivåerna hos donatorer och mottagarmöss. Viktigt, mängden glukos vi använde tenderade att stabilt höja blodsockernivån inom ett visst intervall. Dessutom visade resultaten att blodinsulinnivån återhämtat sig till det normala intervallet 3 h efter glukosinjektion (Kompletterande figur 3), vilket tyder på att mängden glukos som injiceras i mössen hade minimala effekter på insulinmetabolismen. Dessutom var dosen av glukos vi gav till givaren lägre än den som används för glukostoleranstest av möss (för GTT, 2 g/kg glukos är intraperitoneally injiceras till möss, vilket motsvarar cirka 1,6 g/kg genom caudal ven injektion19,20,21), vilket innebär att dosen av glukos för glukosfluktuationsmetoden inte skulle orsaka hyperglykemi och andra skadliga förändringar. Sammanfattningsvis är den metod vi använde effektiv, ofarlig och tidsbesparande. Det kan dock begränsas till diabetiker möss i parabios, som fortfarande behöver ytterligare experiment för bekräftelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Nature Science Foundation of China (81570399 och 81773735), National Key Research and Development Program of China - Traditionell kinesisk medicin modernisering Forskningsprojekt (2017YFC1702003) och Hei Long Jiang Outstanding Youth Science Fund (JC2017020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
curved forceps JZ surgical Instruments, China J31340
fine scissors JZ surgical Instruments, China WA1030
needle forcep JZ surgical Instruments, China 60017961
2.5 mL syringes Agilent, USA 5182-9642
Tribromoethano Sigma-Aldrich, USA T48402-5G
penicillin Solarbio, China IP0150
tramadol Yijishiye, China YJT712520
glucometer Roche Diabetes Care, Indiana Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain Solarbio, China G1810
depilatory cream Nair, USA LL9161
Warming Blanket (Heating pad) Kent Scientific Corp, USA TP-22G
Electrical shaver Codos, China CP-5000
3-0,5-0
surgical suture
Shanghai Medical Suture Needle Factory, China SYZ 3-0#, SYZ 5-0#

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346, (6205), 89-93 (2014).
  2. Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372, (6505), 425-432 (1994).
  3. Torres, M., et al. Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia. Journal of Applied Physiology (1985). 118, (1), 42-47 (2015).
  4. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, (4), 828-839 (2013).
  5. Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. Journal of Visualized Experiments. (80), e50556 (2013).
  6. Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity. Aging Cell. 12, (3), 525-530 (2013).
  7. Eggel, A., Wyss-Coray, T. A revival of parabiosis in biomedical research. Swiss Medical Weekly. 144, w13914 (2014).
  8. Brack, A. S. Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors! EMBO Journal. 32, (16), 2189-2190 (2013).
  9. Wu, J. M., et al. Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury. Circulation Research. 116, (4), 633-641 (2015).
  10. Kaiser, J. 'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice. Science. 344, (6184), 570-571 (2014).
  11. Rando, T. A., Finkel, T. Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors? New England Journal of Medicine. 369, (6), 575-576 (2013).
  12. Heidt, T., et al. Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction. Circulation Research. 115, (2), 284-295 (2014).
  13. McPherron, A. C. Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy. Circulation Research. 113, (5), 487-491 (2013).
  14. Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine. 20, (6), 659-663 (2014).
  15. Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344, (6184), 630-634 (2014).
  16. Starzl, T. E., et al. The lost chord: microchimerism and allograft survival. Immunology Today. 17, (12), 577-584 (1996).
  17. Coleman, D. L. A historical perspective on leptin. Nature Medicine. 16, (10), 1097-1099 (2010).
  18. Salpeter, S. J., et al. Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication. Diabetes. 62, (8), 2843-2848 (2013).
  19. Sheldon, R. D., et al. Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis. Journal of Hepatology. 64, (1), 171-178 (2016).
  20. Martineau, M. G., et al. The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth. Diabetes Care. 38, (2), 243-248 (2015).
  21. Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics