Анализ группы IV Вирусные SSHHPS Использование в пробирке и в Силико методы

Immunology and Infection
 

Summary

Мы представляем общий протокол для выявления коротких участков гомологичных хост-патогенных белковых последовательностей (SSHHPS), встроенных в вирусный полипротеин. SSHHPS распознаются вирусными протеазами и направляют целенаправленное уничтожение конкретных белков-хозяев несколькими вирусами группы IV.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hu, X., Compton, J. R., Legler, P. M. Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods. J. Vis. Exp. (154), e60421, doi:10.3791/60421 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Альфавирусные ферменты синтезируются в одном полипептиде. Неструктурный полипротеин (nsP) обрабатывается его протеазой цистеина nsP2 для производства активных ферментов, необходимых для репликации вируса. Вирусные протеазы очень специфичны и распознают сохраненные последовательности мотивов участка расщепления (аминокислоты No6-8). В нескольких группах IV вирусов, nsP протеазы (ы) расщепления сайте мотив последовательности можно найти в конкретных белков хозяина, участвующих в генерации врожденных иммунных реакций и, в некоторых случаях, целевые белки, как представляется, связаны с вирусом индуцированного фенотипа. Эти вирусы используют короткие участки гомологичных хост-патогенных белковых последовательностей (SSHHPS) для целенаправленного уничтожения белков-хозяев. Для выявления SSHHPS вирусный протеаза декольте сайте мотив последовательности могут быть введены в BLAST и геном хозяина (ы) можно искать. Расщепление первоначально может быть проверено с помощью очищенной nsP вирусной протеазы и флуоресценции резонансной передачи энергии (FRET) субстратов, сделанных в кишечной палочке. Фрет субстраты содержат цианский и желтый флуоресцентный белок и последовательность участка расщепления (CFP-sequence-YFP). Этот протеаза асссе можно использовать непрерывно в считывателе плиты или discontinuously в гелях SDS-PAGE. Модели связанных пептидных субстратов могут быть созданы в силико для руководства по отбору субстратов и исследованиям мутагенеза. Субстраты CFP/YFP также использовались для выявления ингибиторов протеазы. Эти in vitro и в методах silico можно использовать в комбинации с клеточными анализами для того чтобы обусловить если пристрелнный протеин хозяина влияет на вирусную репликацию.

Introduction

Доказательства горизонтальной передачи генов от вируса к хозяину, или принимающей вируса, можно найти в различных геномах1,2,3,4. Примерами вирусной эндогенизации являются последовательности прокладки CRISPR, найденные в геномах бактериальных хозяев4. Недавно мы нашли доказательства последовательности протеинов-хозяев, встроенных в неструктурные полипротеины вирусов ГРУППы IV. Эти последовательности в регионах кодирования вирусного генома могут распространяться по коленным поколениям. Короткие участки гомологичных хост-патогенных белковых последовательностей (SSHHPS) находятся в вирусе и хост5,6. SSHHPS являются сохранены декольте сайте мотив последовательности признаны вирусных протеаз, которые имеют гомологии для конкретных белков хозяина. Эти последовательности направляют уничтожение конкретных белков хозяина.

В нашей предыдущей публикации6, мы составили список всех белков хозяина, которые были направлены на вирусные протеазы и обнаружили, что список целей был неслучайным (Таблица 1). Были очевидны две тенденции. Во-первых, большинство вирусных протеаз, которые разрезали белки-хозяева, принадлежали к вирусам группы IV (24 из 25 случаев, связанных с вирусными протеазами группы IV), а одно протеас принадлежало ретровирусам ГРУППы VI (ВИЧ, вирус иммунодефицита человека)7. Во-вторых, цели протеина хозяина будучи отрезанными вирусными proteases вообще включились в производить врожденные иммунные реакции предлагая что расщепления были предназначены для того чтобы антагонизировать реакции хозяина иммунные. Половина белков хозяина, на которые нацелены вирусные протеазы, были известными компонентами сигнальных каскадов, генерирующих интерферон (IFN) и провоспалительные цитокины(таблица 1). Другие были вовлечены в транскрипцию клеток хоста8,9,10 или перевода11. Интересно, что Шмаков и др.4 показали, что многие последовательности протосказеров CRISPR соответствуют генам, участвующим в плазмидном спряжении или репликации4.

Группа IV включает в себя, среди прочего, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae, и Togaviridae. Несколько новых и возникающих патогенных микроорганизмов относятся к группе IV, таким как вирус Зика (ЗИКВ), Западный Нил (WNV), Chikungunya (CHIKV), тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС) и вирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС). Геном (к) ssRNA, по сути, является частью мРНК. Для производства ферментов, необходимых для репликации генома, сначала необходимо перевести геном ssRNA. У альфавирусов и других вирусов группы IV ферменты, необходимые для репликации, вырабатываются в одном полипротеине (т.е. nsP1234 для VEEV). Неструктурный полипротеин (nsP) протеолитически обрабатывается (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) протеазой nsP2 для производства активных ферментов12 (рисунок 1). Расщепление полипротеина протеазой nsP2 имеет важное значение для репликации вируса; Это было продемонстрировано удалением и сайт-направленный мутагенез активного сайта цистеин протеаза nsP213,14. Примечательно, что перевод вирусных белков предшествует событиям репликации генома. Например, nsP4 содержит РНК-зависимую РНК-полимеразу, необходимую для репликации генома (к)SsRNA. Репликация генома может производить промежуточные dsRNA; эти промежуточные могут вызвать врожденные иммунные реакции хозяина. Таким образом, эти вирусы могут расщеплять врожденные белки иммунного ответа на ранних стадиях инфекции, чтобы подавить их действие15,16,17.

Замалчивание может происходить на уровне ДНК, РНК и белка. Что является общим для каждого из механизмов замалчивания показано на рисунке 1 является то, что короткие чужеродные ДНК, РНК, или белковые последовательности используются для руководства уничтожения конкретных целей антагонизировать их функции. Механизмы замалчивания аналогичны программам «поиск и удаление», которые были написаны на трех разных языках. Короткая последовательность сайта расщепления аналогична "ключевому слову". Каждая программа имеет фермент, который распознает соответствие между короткой последовательности ("ключевое слово") и слово в "файл", который должен быть удален. После того, как совпадение найдено, фермент вырезает ("удаляет") большую целевую последовательность. Три механизма, показанные на рисунке 1, используются для защиты хозяина от вирусов или для защиты вируса от иммунной системы хозяина.

Вирусные протеазы распознают короткие последовательности мотивов участка расщепления между аминокислотами No2-11; в нуклеотидах это соответствовало бы 6-33 базам. Для сравнения, последовательности процмеров CRISPR составляют 26-72 нуклеотидов, а РНК - 20-22 нуклеотидов18,19. Хотя эти последовательности являются относительно короткими, они могут быть признаны конкретно. Учитывая более высокое разнообразие аминокислот, вероятность случайного расщепления события является относительно низким для вирусной протеазы признания белковых последовательностей 6-8 аминокислот или дольше. Прогноз SSHHPS в белках хозяина будет во многом зависеть от специфики вирусной протеазы рассматривается. Если протеаза имеет строгие требования к специфичности последовательности последовательности последовательности секвеи, то шанс найти последовательность участка расщепления составляет 1/206 и 1 в 64 миллионаили или 1/208 и 1 в 25.6 миллиарда; однако, большинство протеаз имеют переменные допуски подсайта (например, R или K могут быть допущены на сайте S1). Следовательно, нет необходимости в последовательности идентификации между последовательностями, найденными в хоста против вируса. Для вирусных протеаз, которые имеют более слабые требования последовательности (например, принадлежащие К Picornaviridae) вероятность нахождения расщепления в протеине хозяина может быть выше. Многие из записей в таблице 1 из семьи Picornaviridae.

Schechter и Berger обозначение20 обычно используется для описания остатков в протеак субстрата и подсайтов, к которым они связывают, мы используем эту нотацию во всем. Остатки в субстрате, которые n-терминал ажиотажных облигаций обозначаются как P3-P2-P1, в то время как те, которые C-терминалобывают, обозначаются как P1'-P2'-P3'. Соответствующие подзаисы в протеазе, которые связывают эти аминокислотные остатки, являются S3-S2-S1 и S1'-S2'-S3', соответственно.

Чтобы определить, какие белки-хозяева являются мишенью, мы можем определить SSHHPS в вирусных полипротеиновых расщепления сайтов и поиск принимающих белков, которые содержат их. В этом, мы наметили процедуры для выявления SSHHPS с использованием известных вирусных протеаза расщепления сайта последовательностей. Биоинформатические методы, протеазные анализы и описанные методы силико предназначены для использования в сочетании с клеточными анализами.

Последовательность выравниваний белков-хозяев, на которые нацелены вирусные протеазы, выявила специфические различия в этих коротких последовательностях участка расщепления. Например, венесуэльский вирус конского энцефалита (VEEV) nsP2 протеазы было установлено, сократить человека TRIM14, трехсторонний мотив (TRIM) белок6. Некоторые белки TRIM являются факторами вирусного ограничения (например, TRIM5'21),большинство из которых считаются убиквитином E3 лигазах. TRIM14 не хватает RING (действительно интересный новый ген) домена и не считается E3 лигаза22. TRIM14 было предложено быть адаптером в митохондриальной противовирусной сигналосомы (MAVS)22, но может иметь другие противовирусные функции23. Выравнивание последовательностей TRIM14 от различных видов показывает, что лошади не хватает расщепления сайта и гавани усеченной версии TRIM14, что отсутствует C-терминал PRY / SPRY домена. Этот домен содержит сайт поливиквитивиции(рисунок 2). В лошади, эти вирусы являются весьма смертоносными (20-80% смертности), в то время как у людей только 1% умирают от инфекций VEEV24. Расщепление домена PRY/SPRY может временно замыкаться сигнальным каскадом MAVS. Этот каскад может быть вызван dsRNA и приводит к выработке интерферона и провоспалительных цитокинов. Таким образом, присутствие SSHHPS может быть полезно для прогнозирования того, какие виды имеют защитные системы против конкретных вирусов группы IV.

В группе IV вирусов, IFN антагонизм механизмы, как полагают, умножить избыточные25. Расщепление белка хозяина может быть преходящим во время инфекции и концентрации могут восстановиться с течением времени. Мы обнаружили в клетках, что ПРОДУКТы расщепления TRIM14 могут быть обнаружены очень рано после трансфекции (6 ч) с плазмид кодированием протеазы (цитомегаловирусный промоутер). Однако в более длительные периоды продукты расщепления не были обнаружены. В вирусных клетках, кинетика были разными и декольте продукты могут быть обнаружены между 6-48 ч6. Другие сообщили о появлении продуктов расщепления белка хозяина уже в 3-6 ч после инфекции9,11.

Протеолитическая активность в клетках часто трудно поймать; продукты расщепления могут варьироваться в их растворимости, концентрации, стабильности и продолжительности жизни. В анализах на основе клеток, нельзя предположить, что продукты расщепления будут накапливаться в клетке или что интенсивность полосы разреза и неподрезавшего белка покажет компенсационное увеличение и уменьшение, так как вырезанный белок может быть деградирован очень быстро и не может быть обнаружен в западном подувке при ожидаемом молекулярном весе (МВт) (например, область, содержащая эпитоп, может быть смочена другими умелыми протеинтами). Если субстрат вирусной протеазы является врожденным белком иммунного ответа, его концентрация может варьироваться во время инфекции. Например, некоторые врожденные белки иммунного ответа присутствуют до вирусной инфекции и индуцируются далее интерфероном26. Таким образом, концентрация целевого белка может колебаться во время инфекции, и сравнение неинфицированных и инфицированных клеточных лисатов может быть трудно интерпретировать. Кроме того, все клетки не могут быть равномерно трансинфицированы или инфицированы. In vitro protease анализы с использованием очищенных белков из кишечной палочки, с другой стороны, имеют меньше переменных, для которых для контроля и такие assays может быть сделано с помощью SDS-PAGE, а не иммуноблотов. Загрязнение протеазы могут быть ингибированы в ранних этапах очистки белка субстрата CFP/YFP, и мутифицированные вирусные протеазы могут быть очищены и протестированы в качестве контроля, чтобы определить, если расщепление связано с вирусной протеазой или загрязняющих бактериальных protease.

Одним из ограничений in vitro protease является то, что им не хватает сложности клетки млекопитающих. Для фермента, чтобы сократить его субстрат, два должны быть совместно локализованы. Вирусные протеазы группы IV различаются по структуре и локализации. Например, протеаза ЗИКВ встроена в эндоплазмическую мембрану ретикулума (ER) и сталкивается с цитозолом, в то время как протеаза VEEV nsP2 является растворимым белком в цитоплазме и ядре27. Некоторые из последовательностей участка расщепления, найденные в анализе IKV SSHHPS, были в сигнальных пептидах, предполагая, что расщепление может происходить совместно для некоторых целей. Таким образом, в этих анализах также необходимо учитывать расположение протеазы и субстрата в клетке.

Клеточные анализы могут быть полезны для установления роли для идентифицированного белка хозяина (ы) в инфекции. Методы, которые направлены на прекращение вирусного расщепления протеаза белков-хозяев, таких как добавление ингибитора протеазы6 или мутации в цели хозяина16 могут быть использованы для изучения их воздействия на вирусную репликацию. Переэкспрессия целевого белка также может повлиять на репликацию вируса28. Доска анализы или другие методы могут быть использованы для количественной оценки репликации вируса.

Protocol

1. Биоинформатика: Идентификация SSHHPS в геноме хозяина с использованием BLAST

ПРИМЕЧАНИЕ: Белок BLAST можно найти в blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

  1. Ввод 20 аминокислот, окружающих ножницую связь в вирусном полипротеине. Выберите неизлишние белковые последовательности и введите геном хозяина для поиска (например, Homo sapiens).
    1. При необходимости выберите PHI-BLAST. Введите последовательность шаблонов (например, для 25 остатков V12, показанных ниже, введите шаблон "AG" без котировок).



      ПРИМЕЧАНИЕ: В PHI-BLAST квадратные скобки «XY» указывают на то, что аминокислота X или Y может находиться в положении подсайта (например, АГЗЗЗЗГА).
    2. Осмотрите результаты BLAST и определить хиты, которые имеют высокую идентичность последовательности остатков, которые сохраняются в полипротеиновых расщепления сайтов (например, трехсторонний мотив белка 14) (Рисунок 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для серин протеазы выше сохранение остатков P1, как ожидается, в то время как для цистеина протеазы выше сохранение остатков P2, как ожидается.
    3. Цвет остатков, которые идентичны последовательной последовательной последовательной последовательной последовательной (без пробелов). Цвет остатков допускается на подсайте, но присутствует в другой сайт расщепления во втором цвете.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки, которые представляют собой консервативные замены (например, Leu против Val), которые не присутствуют в вирусной декольте сайт также могут быть найдены и могут или не могут быть признаны вирусной протеазы.
    4. Ранг порядка BLAST хитов на основе числа последовательных идентичных или терпимо остатков, которые соответствуют последовательности сайта расщепления. Из списка выберите белки, содержащие 6 одинаковых или аналогичных остатков для анализа в протеазных анализах.
    5. Повторите процедуру для других участков расщепления (nsP2/3, nsP3/4 и т.д.) и постепенно укрепите прогноз, добавляя более сильно сохраненные остатки в шаблон PHI-BLAST.

2. В vitro Анализы: Проектирование и подготовка Протеаза Субстраты

  1. Построить плазмид кодирования синофлуоресцентного белка (CFP), 25 аминокислот последовательности участка расщепления, а затем желтый флуоресцентный белок (YFP, также известный как Венера29).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида может быть построена с помощью последовательности и перевязки независимого клонирования (SLIC)30 или коммерческого синтеза генов. Плазмида pet15b, содержащая последовательность, показанную на рисунке 4, была синтезирована на коммерческой токе и использовалась здесь.
    1. Для оптимизации длины субстрата постройте дополнительные субстраты FRET переменной длины, содержащие 12-25 аминокислот естественного вирусного полипротеина, секвойонированных последовательностей с использованием 2-фрагментной реакции SLIC. Проанализируйте расщепление с помощью анализа на основе геля SDS-PAGE или путем измерения устойчивых кинетических параметров состояния с помощью приведенных ниже методов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях, расщепление сайты могут быть определены по гомологии известных сайтов расщепления31. Если расщепление субстратов, содержащих последовательности полипротеиновых соединений, не соблюдается, может возникнуть потребность в дополнительных остатках или структурном мотиве (например, альфа-суглюк32). Кроме того, очищенная вирусная протеаза может быть неактивной. Подтвердите расщепление вирусных последовательностей полипротеина, прежде чем проводить анализ SSHHPS. Количество остатков в субстрате было оптимизировано для протеазы VEEV с использованием субстратов переменной длины (от 12 до 25 аминокислот), после чего следует анализ Vmax и Km32,33. Зика вирусных ns2B/nsB протеазы расщепления сайтов, используемых в примерах были опубликованы34,35.
  2. Подготовьте субстраты CFP/YFP, недавно преобразовав 8-20 зл BL-21 (DE3)E. coliкомпетентные ячейки с плазмидом CFP-V12-YFP в соответствии с указаниями производителя и пластиной на агарных пластинах Luria Bertani (LB), содержащих 50 мкг/мл ампициллин (37 градусов по Цельсию).
    1. Autoclave четыре 4 l фляги, содержащие LB СМИ (1,5 л средств массовой информации на колбу) и 100 мл LB в 250 мл колбы. Крышка каждой колбы с алюминиевой фольгой.
    2. Прививать 100 мл культуры с колонией свежепреобразованных бактерий и расти при 37 градусов по Цельсию с встряхивания (200 об/мин) в одночасье.
    3. Чтобы сделать субстрат CFP/YFP, привить четыре 4 l фляги с 25 мл ночной культуры. Начните встряхивая культуры при 37 градусах Цельсия и следите за ростом с помощью УФ-вис спектроскопии при 600 нм в час.
    4. Когда бактерии достигают абсорбции в размере 1,0 евро при 600 нм (примерно 3-4 л роста), они вызывают экспрессию белка, добавляя 0,5 мл изопропил-и-Д-тиогалактозид (IPTG) на колбу. После добавления IPTG, снизить температуру встряхивания инкубатора до 17 градусов по Цельсию и позволить экспрессии продолжать ночь на 17-20 ч.
    5. Гралет бактерии с помощью высокоскоростной центрифуги на 7000 х г в течение 10 мин (4 кС) и сохранить гранулы. Удалите и отбросьте жидкие носители. Храните гранулы при -80 градусах по Цельсию или лиза немедленно.
    6. Приготовьте 100 мл буфера лизиса, содержащего 50 мм Tris pH 7.6, 500 мМ NaCl, 35 мл реагента экстракции бактериального белка, 30 мг лизозима, 25 U DNase и 1 таблетку ингибитора протеазы. Отдохните гранулы в буфере из лисиса с помощью пипетки и перенесите 25-35 мл в одноразовые конические трубки мощностью 50 мл.
    7. Поместите трубки в пластиковый стакан, содержащий ледяную воду. Вставьте наконечник звукового в трубки так, чтобы наконечник был 1 см от нижней части трубки и снотировать lysates 10-20 раз на уровне 5 в течение 15 с интервалами, пока лизат становится жидкости и сжижения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте защиту слуха во время звуковой защиты.
    8. Перенесите лизат на высокоскоростные центрифуги и центрифуги при 20500 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. После спина, сохранить супернатант (100 мл) и передать его в чистую бутылку. Отбросьте гранулы.
    9. Подготовка 1 L буфера A (50 мм Tris pH 7.6, 500 mM NaCl). Подготовка 300 мл буфера B (50 мм Tris pH 7.6, 500 мМ NaCl, 300 мм Имидазол).
    10. Равновесие никельной колонки 100 мл, используя 3 колонки объемов буфера А и скорость потока 5 мл/мин.
    11. Загрузите лисат на столбец никеля, используя скорость потока от 2 до 5 мл/мин. Вымойте столбец с 2 объемами столбцов Буфера А, а затем 5 столбцов объемами 20% Буфер А. Во время 20% Буфер B мыть, поглощение на 280 нм(A 280) увеличится, как загрязняющие вещества elute из колонки во время мытья. Продолжайте мыть колонну до тех пор, покаA 280 eluate не вернется к базовым значениям.
    12. Выясните белок с 2-3 объемами столбцов 100% Буфер B, используя скорость потока 2-5 мл/мин и соберите 10 мл фракций. ИзмерьтеA 280 каждой фракции.
    13. Комбинат и концентрировать фракции, содержащие280 йgt; 0.1 с помощью 15 мл центробежного ультрафильтрации единицы. Вращайте ультрафильтрационные агрегаты при 5000 х г в течение 15 мин и продолжайте добавлять фракции до тех пор, пока объем не будет уменьшен до 50-75 мл.
    14. Вырезать 14-дюймовый кусок диализа трубки с молекулярным отсечения веса (MWCO) 6-8 kDa. Гидрат диализные трубки, кипятив ее полностью погруженной в 300 мл воды в течение 10 мин. Свяжите безопасный узел на одном конце мембраны. Заполните мешок с буфером диализа, чтобы убедиться, что никаких трещин или утечек присутствуют. Удалите буфер из мешка и держите сумку погруженной в буфер диализа.
    15. Перенесите концентрированный белок от 2.2.13 в диализный мешок с пластиковой пипеткой. Удалите любые пузырьки воздуха из мешка. Закройте сумку вторым узелком или клипом на диализ. Диализ белка против 500 мл 50 мм Tris pH 7,6, 5 мМ EDTA (этилендедиаминтетраацетическая кислота), 250 мм NaCl в 500 мл окончил цилиндр ночь при 4 градусах Цельсия.
    16. Диализ белок во второй раз против 500 мл 50 мм Tris pH 7,6 при 4 градусах по Цельсию на 2 ч.
  3. Для колонки обмена анионов подготовьте 500 мл буфера A (50 мм Tris pH 7.6) и 500 мл Buffer B (50 мм Tris pH 7.6, 1.0 M NaCl). Равновесие колонки обмена анионом 30 мл с 3 колонками буфера A (2-5 мл/мин).
    1. Выньте белок из диализа и перенесите в бутылку. Держите бутылку на льду. Загрузите диализированный белок на столбец (2-5 мл/мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белок CFP/YFP свяжет столбец и будет желтым по внешнему виду.
    2. Вымойте столбец с буфером A до тех пор, покаA 280 не вернется к исходной линии (5 мл/мин). Выясните белок с помощью градиента (0-50% буфера B, 100 мл) и соберите 10 мл фракций.
    3. Проинспектировать фракции столбцов с помощью SDS-PAGE. Объедините те, которые являются чистыми.
    4. Сосредоточьтесь на белке на A280 -10-20 с помощью центробежного ультрафильтрационного блока 15 мл. Спин концентратор на 4500 х г в течение 10 минут при 4 градусах По Цельсию и продолжать добавлять белок, пока все белок-содержащие фракции были объединены.
  4. Тщательно удалите белок из концентратора с помощью пипетки. Aliquot белка в 1,5 мл микроцентрифуговых труб и флэш заморозить в жидком азоте для длительного хранения при -80 градусов по Цельсию. Буфер обменивает белок при комнатной температуре с помощью столбца PD-10, уравновешненных с соответствующим буфером анализов перед использованием.
  5. Используя закон пива рассчитать концентрацию белка с использованием A280 и рассчитанный коэффициент вымирания (например, для субстрата V12 47,790 M-1 см-1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент вымирания (к) может быть рассчитан из последовательности белка на рисунке 4 с помощью программы Expasy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/).

3. Подготовка альфавирусной nsP2 Cysteine Protease

  1. Дизайн и конструкция плазмиды кодирования протеаза. Для протеаз цистеина, используйте pet32 плазмид, чтобы построить тиоделоксин (Trx) синтез белка.
    Примечание:Пэт32 плазмида кодирует тромбиновый расщепление (LVPRGS) для удаления тиоделоксина и его-тега (Рисунок 5). Тиоделоксин поможет поддерживать активный участок цистеина в уменьшенном состоянии во время выражения. Для протеаз ысин, тиоредоксин не требуется, и шаги, связанные с его удалением тромбин может быть опущен. VEEV nsP2 протеаза последовательность была включена в pet32b плазмида, которая была подготовлена коммерчески, чтобы избежать обработки Выберите агентов.
    1. Свежее преобразование плазмидной ДНК в BL21(DE3)pLysS E. coli в соответствии с указаниями производителя. Плита бактерий на LB агар пластин, содержащих Ампициллин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хлорамфеникол используется только для штаммов e. coli, несущих плазмид пластида, и опускается при использовании клеток BL21(DE3). Не обязательно включать хлорамфеникол на пластине агара LB в этом шаге.
    2. Autoclave четыре 4 l фляги 1,5 л LB средств массовой информации (6 L общий объем) и 100 мл LB в 250 мл колбы. Крышка каждой колбы с алюминиевой фольгой.
    3. Прививать 100 мл ночной культуры LB / Ампициллин с колонией из пластины и расти в тряски инкубатор (200 об/мин) при 37 градусов по Цельсию.
    4. Привить 4 l фляги с 25 мл ночной культуры и добавить соответствующие антибиотики.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Средства массовой информации для BL21 (DE3) pLysS клеток, несущих pet32 плазмида должны иметь окончательную концентрацию 25 мкг/мл хлорамфеникол и 50 мкг/мл Ампициллин.
    5. Побудить экспрессию белка, добавив 0,5 мл IPTG в культуру, когда абсорбция на 600 нм достигает 1,0. Понизите температуру дрожащего инкубатора до 17 градусов по Цельсию. Разрешить выражение, чтобы продолжить ночь (17 ч).
    6. Пелле клетки центрифугации (7000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия). Удалите и отбросьте жидкие носители.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы могут храниться при -80 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев или немедленно лизованы.
    7. Приготовьте 100 мл буфера лизиса (50 мм Tris pH 7.6, 500 мл NaCl, 2 мМ бета меркаптоэтанол (BME), 30 мг лизозима, 5% глицерола, 25 U DNase, 35 мл реагента для экстракции бактериального белка). Открытые бутылки BME в химическом капюшоне при добавлении. Держите бактериальный лизат на льду или при 4 градусах По Цельсию для этого и всех последующих шагов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для протеаз цистеина, 2 мМ BME включен, чтобы сохранить нуклеофильные цистеин снижается. Колонны могут работать при комнатной температуре с помощью охлажденных буферов. Буферы должны быть сделаны с холодной деионизированной водой, охлажденой до 4 градусов по Цельсию.
    8. Отдохните бактериальные гранулы в буфере лисиса в 25 мл и перенесите 25 мл лисата в одноразовые конические трубки 4 х 50 мл. Поместите трубки в пластиковые клюви, содержащие ледяную воду. Снофите лисат 10 раз на уровне 5 для 15 с интервалами.
    9. Перенесите лизат в высокоскоростные центрифуги. Уточните лизат центрифугированием (30 мин, 20 500 х г при 4 градусах Цельсия).
    10. Приготовьте 0,5 л буфера A (50 мм Tris pH 7.6, 500 mM NaCl, 5% глицерол, 2 мМ БМ) и охладите до 4 градусов по Цельсию.
    11. Подготовка 250 мл буфера B (50 мм Tris pH 7,6, 500 мМ NaCl, 5% глицерол, 2 мМ BME, 300 мм имидазола) и холод до 4 градусов по Цельсию.
    12. Равновесие 50 мл никеля колонки с 3 объемами столбцов A. Загрузите уточненный lysate на колонку на 2-5 мл/мин и отбросьте гранулы.
    13. Вымойте столбец (2-5 мл/мин) с 2 объемами столбцов A, а затем 5 объемов столбцов A, содержащего 20% буфера B (60 мм Имидазол). Выясните белок (5 мл/мин) 100% буфером B и соберите 10 мл фракций.
    14. Комбинат и концентрируйте фракции, содержащие протеазу, которые имеютA 280 q 0.1 с помощью центробежного ультрафильтрационного блока 15 мл и 15 мин спинов при 5000 х г при 4 градусах Цельсия. После того, как объем был уменьшен до 5 мл, буфер обмена белка в блоке концентрации, добавив свежий буфер диализа в белок (50 мм Tris pH 7.6, 250 mM NaCl, 5 мМ дитиотрейтол (DTT), 1 мМ EDTA, 5% Глицерол). Спин снова на 5000 х г при 4 кв кв 15 мин; повторить шаг буферного обмена 2-3 раза. До диализа до диализа додионтора добавляйте тромбин в белок (20 л от 1 единицы/л).
    15. Перенесите белок в диализный мешок и диализ против 500 мл диализа буфера (4 кВ) в 500 мл окончил цилиндр на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система FPLC (быстрая белковая жидкая хроматография) и колонка никеля должны быть тщательно очищены с помощью зачистки буфера (2 M NaCl, 50 mM EDTA), прежде чем приступить к столбцу обмена анионов. Любой остаточный никель в линиях FPLC превратит буферные растворы, содержащие DTT коричневый при смешивании. Вымойте колонку никеля и систему FPLC с 4 объемами колонки воды. Насос тщательно промыть систему FPLC водой. Колонка никеля может быть регенерирована путем проточного 2 столбцового объема 0,2 М сульфата никеля над мисиной для последующей очистки.
  2. Для колонки обмена анионов подготовьте 1 л буфера A (50 мм Tris pH 7.6, 5 mM DTT, 5% глицерола).
    1. Подготовка 0,5 л буфера B (50 мм Tris pH 7,6, 5 мМ DTT, 5% глицерола, 1,25 М NaCl).
    2. Уравновесить колонку обмена анионом 30 мл с буфером A (3 комбинезонов, 2-5 мл/мин). Поместите трубки в фракционный коллектор для сбора потока через.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протеаза VEEV имеет расчетную изоэлектрическую точку (pI) 8,7 и будет связывать столбцы катион-обмена, но будет проходить через столбцы обмена анионами. PI можно вычислить из последовательности белка с помощью программы Expasy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/).
    3. Разбавить диализированный белок 1:3 с буфером А, а затем загрузить белок (5 мл/мин). Соберите поток через в 10 мл фракций.
  3. Удалите столбец обмена анионами из системы FPLC. Подключите столбец обмена катиона к системе FPLC. Равновесие 30 мл катионной колонки обмена с 3 объемами столбцов Буфера А (5 мл/мин).
    1. Загрузите поток через столбец обмена анионом на колонку обмена катионов на 2-5 мл/мин. Вымойте столбец с буфером A до тех пор, пока A280 не вернется на базовый уровень. Выясните белок с градиентом 100 мл (0-50% буфера B) и соберите 10 мл фракций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: VeEV протеаза будет elute около 0,6 M NaCl.
    2. Проинспектировать фракции столбцов с помощью SDS-PAGE. Объедините фракции, которые являются чистыми и концентрируются на A280'2 с использованием 15 мл центробежных ультрафильтрационных блоков. Фермент может быть флэш-замороженным в жидком азоте и храниться при -80 градусах Цельсия.

4. Произнося фермент постоянно используя плиты Reader

  1. Подготовьте 50 мл буфера асссе (50 мМ HEPES pH 7.0).
    1. Поскольку альфавирусные протеазы имеют относительно низкие значения kcat, разбавьте фермент в буфере ассседов до 4,7 мкм (это будет примерно соответствовать A280 и 0,2 для протеаза VEEV без Trx).
    2. Для измерения активности фермента подготовьте запас субстрата в буфере ассеа с концентрацией 185 мкм; это примерно соответствует A280 и 9. В 8 микроцентрифуговых трубках подготовьте реакционные смеси, показанные в таблице 2, объединив соответствующие объемы запаса и буфера субстрата 185 мкм. В черной полурайоне 96-ну хорошо пластины пипетка 45 л реакции смешивается в 3 скважины (колонны 1, 2, 3). Строка А должна содержать речную реакционную смесь «S» 5 мкм, а строка H должна содержать набор реакций «S» 140 мкм.
    3. Установите считыватель пластин для обнаружения одновременно флуоресценции на двух длинах волн с фиксированной настройкой фотомультипликатора (PMT) (например, низкий):
      Длина волны 1 возбуждение - 434 нм, эмиссия - 527 нм
      Длина волны 2 возбуждения 434 нм, эмиссия 470 нм
    4. Установите время чтения до 20 минут (измерение 1 читать в минуту) и выберите колодцы для чтения. Вставьте пластину в считыватель пластин и измерьте спонтанную скорость гидролизиса в течение 20 мин. Мониторинг соотношения выбросов (излучение на уровне 527/выброс на 470) с течением времени.
    5. Выполнить конечную точку читать пластины, содержащие "UNCUT" субстрат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения будут использоваться в последующих расчетах данных. Среднее соотношение выбросов из 3 скважин будет значения "UNCUT" субстрат на т 0 в таблице 3.
    6. Удалите пластину и пипетку по 5 л фермента в каждую скважину. Прочитайте тарелку снова в течение 20 минут с 1 чтение в минуту. Установите считыватель пластин для вывода абсолютных значений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого асссе, склоны будут отрицательными. Каждая скважина будет содержать общий объем 50 зл.
    7. В конце чтения, печать пластины с пленкой, чтобы предотвратить испарение. Оставьте пластину при комнатной температуре на ночь, чтобы фермент полностью сократить субстрат.
    8. После 24 ч снимите пленку для уплотнения и выполните конечную точку считывания пластины с помощью того же ПМТ, что и в предыдущих пластинах. Усреднение этих коэффициентов выбросов и ввод в таблицу 3 в соответствии с "CUT". Подтвердите расщепление субстрата с помощью описанного ниже прерывисового просаса SDS-PAGE (Шаг 5.1.).
    9. Экспорт данных в электронную таблицу. Выход флуоресценции единиц в каждой точке времени для 2 длин волн (Таблица 4).
    10. Рассчитайте нмоль субстрата, которые были сокращены в то время т с помощью уравнения (1), где X является коэффициент выбросов (527 нм/470 нм) в данный момент времени, neg является коэффициент выбросов "UNCUT" субстрат на т 0, и pos является коэффициент выбросов полностью "CUT" субстрат измеряется после 24 нм / 3).



      ПРИМЕЧАНИЕ: Представитель флуоресценции данные показаны для одного колодца (хорошо E7), содержащий 80 мКм субстрата (4 нмоль S на скважину)в таблице 4 . Расчеты проводились для каждой скважины в пластине.
    11. Для каждой скважины, участок nmol против времени (мин) и получить начальные скорости (склоны) путем установки данных на у й мхб. Для данных, собранных в 4.1.5, участок нмоль против времени (мин) для каждой скважины. Склон будет равен nmol продукт производится в минуту. Вычесть спонтанные темпы гидролизов, измеренные в 4.1.5 из ферментно-катализированной реакции(таблица 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первое чтение может быть обрезано из данных, если оно хитро высокое из-за движения пластины в считыватель пластины.
    12. Рассчитайте количество фермента в мг, который был добавлен к каждому колодцу (например, 0,0009 мг). Единица определяется как змоль продукта, производимого в минуту (Змол/мин). Разделите нмол/мин на мг фермента, присутствуютвого в колодце, чтобы получить мУ/мг; разделить на 1000 для получения U/mg.
    13. Участок «S» на оси x и U/mg на y-оси и приспосабливает данные к уравнению Michaelis-Menten для того чтобы получить vмакс и Km. Это можно сделать в программном обеспечении (например, GraFit).

5. Анализ фермента непрерывно с использованием SDS-PAGE анализ

  1. Подготовьте реакцию 50 км, содержащую субстрат и буфер номинала в размере 10 км/ вместо фермента и этикетки как "UNCUT".
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы субстрата и буфера отображаются в таблице 2. Если непрерывный ассс был запущен, образцы могут быть использованы непосредственно с 96-хорошо пластины.
    1. Подготовьте реакцию 50 л, содержащую субстрат 10 мкм и фермент 5 мл и этикетку под названием "CUT". Запустите таймер, когда фермент добавляется в субстрат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибиторы могут быть добавлены к дополнительным трубкам, содержащим фермент и субстрат. Отрегулируйте объем добавленного буфера, чтобы компенсировать дополнительный объем ингибитора. Концентрация ДМСО не должна превышать 2%.
    2. Инкубировать реакции для 15-24 ч при комнатной температуре (22 и 3 градуса по Цельсию). Остановите реакцию, добавив 50 кЛ 2x буфера Laemelli. После остановки реакции кипятят, каждая трубка в течение 3-10 мин.
    3. Соберите гелевый бак в соответствии с указаниями производителя. Вставьте 17-хорошо предварительно йожей 12% полиакриламид гель кассеты и буферной плотины на другой стороне. Заполните внутренний резервуар ячейки с 1x SDS работает буфер, пока буфер достигает верхней части кассеты. Заполните внешний резервуар наполовину полным с тем же буфером.
    4. Для анализа расщепления с помощью прерывистого анализа, загрузите 5 зл каждой реакционной смеси в полосу геля SDS-PAGE, начиная с реакции "UNCUT". Включите маркер молекулярного веса в первую или последнюю полосу.
    5. Прикрепите электроды гелевого бака к блоку питания и разделите продукты на 110 В в течение 60 мин. Удалите гель из кассеты, вставив инструмент растрескивания между пластинами. Поместите гель в пластиковый лоток и погрузите гель в 5-10 мл раствора гель-окрашивания; полосы будут видны в течение 30 минут. Через 1-24 часа удалите излишки пятна, погрузите гель в воду и используйте гель-образ, чтобы сфотографировать гель.

6. Стыковочная субстратная пептиды к протеазам систеина VEEV-nsP2

  1. Скачать файл координат для протеазы цистеина VEEV от PDB(https://www.rcsb.org/). Код PDB 2HWK. Сохранить файл как 2HWK.pdb.
    1. Подготовка структуры белка с помощью МЧС(https://www.chemcomp.com/). Загрузите файл белка PDB в МЧС. Нажмите Select и Solvent на правой панели стороны и удалите растворитель.
    2. Откройте панель подготовки структуры от верхнего протеина адвокатского сословияменю . Автоматически исправить все структурные элементы, нажав на правильный и протонатить структуру, нажав на Protonate3D. Добавьте частичные заряды к белку, открыв панель частичных сборов и выбрав Amber 99 и отрегулируйте пары водородов и одинокихпар по мере необходимости. Наконец, сохраните файл структуры как "2HWK_dock.pdb".
  2. Создайте структуру субстратных пептидов (nsP12, nsP23, nsP34) и TRIM14 с помощью МЧС. Откройте панель Protein Builder, введите последовательность субстрата, установите геометрию как расширенную, и нажмите на сборку. Конструкция будет показана в окне МЧС.
    1. Свести к минимуму структуру пептида, нажав на минимизацию на панели. Сохранить структуру в виде файла PDB(рисунок 6).
  3. Док субстрат пептиды veEV-nsP2 с помощью PyRx/AutoDock 4.2(http://autodock.scripps.edu/). Откройте pyRx Tool, отрежируйте настройки предпочтений, активируйте все кручения для Ligand Preparation. Загрузите молекулу субстрата, нажмите правое название молекулы на панели Navigator, выберите Make ligand, чтобы подготовить лигандовый файл стыковки. Загрузите белок 2HWK_clean.pdb, и выберите Сделать макромолекулы для подготовки pdbqt стыковочный файл(рисунок 7).
    1. Запустите AutoDock Мастера на стыковочной панели в нижней части. Выберите подготовленные файлы лиганда и белка. Определите карман связывания белка, вручную регулируя размер сетки, которая сосредоточена на каталитическом остатке Cys-477. Используя параметр интервала по умолчанию 0.375 З. Нажмите на Run AutoGrid для генерации карт сетки.
    2. Выполнить AutoDock и выбрать метод Ламаркского генетического алгоритма (LGA). Нажмите на параметры стыковки и установите количество GA работает до 50. Используйте параметры по умолчанию для других. Нажмите на кнопку "Вперед", чтобы начать стыковку.
    3. Откройте панель аналитических результатов. Проинспектировать все прогнозируемые обязательные позы. Выберите лучшую модель с самой низкой прогнозируемой связывающей энергией и разумными связывающими взаимодействиями между Cys-477 и субстратом на участке расщепления. Сохраните привязывающую модель в качестве файла PDB для дальнейшего моделирования MD.

7. MD Моделирование пристыкованных VEEV-субстратов комплексов

  1. Подготовьте входные файлы с помощью янтаря(http://ambermd.org/). Следуя стандартному протоколу, моделирование MD выполняется для прогнозируемых моделей связывания субстрата с использованием пакета AMBER и силового поля ff99SB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Солятированные системы подвергаются тщательной минимизации энергии до моделирования MD. Периодические пограничные условия применяются для имитации непрерывной системы. Для расчета электростатических взаимодействий на длинные дистанции использовался метод сетки частиц Ewald (PME). Смоделированная система была сначала подвергнута постепенному повышению температуры от 0 K до 300 K свыше 100 с, а затем уравновешлись на 500 с с при 300 K, а затем производство работает 2 нс длиной в общей сложности.
    1. Запустите задание моделирования на высокопроизводительном вычислительном объекте. Наши симуляции были запущены на кластере Biowulf(https://hpc.nih.gov/)(рисунок 8).
    2. Визуализируйте выход траектории с помощью программы VMD(http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/). Проанализируйте связывающие взаимодействия и конформанзивные изменения субстратов и TRIM14 в активном месте nsP2(рисунок 9).

Representative Results

SSHHPS анализ протеазы qyKV ns2B/3 определил 4 цели протеина хозяина: FOXG1, SFRP1, gs альфа-подразделение из библиотеки кДНК сетчатого матки, и NT5M митохондриальной 5',3'-нуклеотидаза(рисунок 10)6. Примечательно, что ни один другой метод не предсказал эти белки в качестве потенциальных целей протеазы ЗИКВ. Мутации в гене FOXG1 были связаны с врожденным синдромом, характеризующимся нарушением развития и структурными аномалиями мозга, такими как микроцефалия. SFRP1 является секретированным белоком, связанным с фризлированным (SFRP); эти растворимые рецепторы могут конкурентоспособно связывать лиганды Wnt, чтобы антагонизировать и ингибировать сигнализацию Wnt. Путь сигнализации Wnt участвует в регулировании ответа IFN во время флавивирусной инфекции36. Ожидается, что расщепление SFRP1 повысит репликацию флавивирусов. SFRP1 также участвует в дифференциации37-клетокTh17. Последовательность выравниваний SSHHPS показала видово-специфические различия в последовательности участка расщепления(рисунок 10D). Последовательность участка расщепления в SFRP1 была идентична у людей и кур; ЗИКВ может вызвать смертность и микроцефалию у куриных эмбрионов38. У грызунов, высоко консервированных остатков P1 (K /R)R ЗГ заменяется глицином (RGG). Иммунокомпетентные штаммы мышей, как правило, устойчивы к инфекции и болезни39.

Устойчивые кинетические параметры состояния и константы ингибирования могут быть измерены для вирусных последовательностей полипротеина и для последовательностей белка хозяина, используя непрерывный анализ в тарелке читателя31,40,41 (Рисунок 11A). Для качественной информации о расщеплении, такой как расщепление определенной последовательности или ингибирование протеазы различными соединениями, можно использовать прерывистый ассс(рисунок 11В).

Может потребоваться оптимизация количества остатков между CFP и YFP. Модель, связанная с субстратом, может быть изготовлена с использованием методов силико. На рисунке 9показана представительная пристыкованая модель соединения nsP1/nsP2. Для протеаза VEEV nsP2 было сообщено о расщеплении 12-аминокислоты Semliki Forest Virus (SFV) (Km 0.58 mM)33. Удлинение последовательности субстрата до 19, 22 и 25 остатков и уменьшение ионной прочности буфера привело к значительному сокращению Km. Изучение кристаллической структуры VEEV nsP2 и кристаллической упаковки также показало, что часть одного из узлов была упакована против домена протеазы и была спирали. Таким образом, более длинные субстраты VEEV могут связываться лучше из-за признания вторичного структурного мотива.

Для TRIM14, мы получили Kм 21 мМ6,33. Km для субстрата, несущего последовательность белка хозяина, был сопоставим с значениями Km субстратов, содержащих последовательности места расщепления вирусных полипротеинов (Km(V12) и Km(V34) Последовательности участка расщепления на nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 и nsP3/nsP4 соединения были вырезаны с различной эффективностью. В клетке, это, как полагают, позволяет последовательное расщепление полипротеина42.

Следует проявлять осторожность при интерпретации отрицательных результатов. Если расщепления не происходит, расщепление сайт может быть слишком коротким или очищенной протеаза может быть неактивным. Для подсеченных субстратов необходимы дополнительные эксперименты для подтверждения расщепления белка полной длины или расщепления в зараженных вирусом клетках. Следует выбрать соответствующие последующие эксперименты. Эффекты переэкспрессии или замалчивания целевого белка на репликацию вируса также могут быть проверены.

Figure 1
Рисунок 1: Три механизма замалчивания. Замалчивание может происходить на уровне ДНК, РНК или белка. Эти алгоритмы поиска и удаления используют "ключевое слово", чтобы направить расщепление файла, содержащего слово. Эта цифра была изменена с Morazzani et al.32 и ссылки на него. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Различия в последовательности участка расщепления. C-терминальные домены PRY/SPRY homologues TRIM14 отображаются в выравнивании. Домен PRY/SPRY может быть идентифицирован по сохраненным мотивам, выделенным серым цветом. Human TRIM14 разрезается на протеазе ЦИстеина VEEV nsP2. Последовательность SSHHP отображается в цвете. Остаток в зеленом цвете является остатком P1'; в синий является остатком P4, а красным цветом другие сохраненные остатки в секвойе участка мотив последовательности. Equine гавани усеченной версии TRIM14 не хватает PRY / SPRY домена. Лизин, выделенный в циане, поли-убиквитинат и имеет важное значение для сборки сигналосомы MAVS. C-терминал PRY/ SPRY домен может быть временно сокращен nsP2 протеаза, чтобы ухудшить противовирусной реакции хозяина внутриклеточного во время острой вирусной инфекции. В лошади, этот домен всегда отсутствует. Это говорит о том, что область PRY/SPRY TRIM14 может иметь защитную функцию против инфекций VEEV. Эта цифра была воспроизведена из Morazanni и др.6Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Идентификация SSHHPS с помощью BLAST. Последовательность мотива участка расщепления на перекрестке VEEV nsP1/nsP2 выровнена с последовательностью SSHHP в протеине хозяина TRIM14. Остаток, окрашенный в зеленый цвет, является остатком P1'; в синий является остатком P4 и красным цветом другие сохраненные остатки декольте сайта мотив последовательности. Большинство выравниваний содержали гомологию в регионах за пределами сохраненного мотива участка расщепления или не включали остатки ножниц P1/P1. TRIM14 показал соответствие 6 остатков в последовательном порядке, которые включали P1 и P1'. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Белковые и ДНК-последовательности субстрата CFP-V12-YFP для протеазы цистеина VEEV nsP2. Сайты ограничения NdeI (CATATG) и XhoI (CTCGAG) отображаются заглавными буквами. В красном цвете является секвайд сайта последовательности из вирусного полипротеина, который находится между nsP1 и nsP2. Остаток в зеленом цвете является остатком P1 и синим цветом является остатком P4 участка расщепления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Белковая последовательность конструкции цистеина протеина Trx-VEEV-nsP2. Тиоедоксин (Trx) показан желтым цветом. Thrombin расщепления сайта и его-тег показаны в циане. Dyad Cys-His помечены красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Пептидные структуры в МЧС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Стыковка пептида субстрата с использованием PyRx/AutoDock. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Вакансии, работающие на кластере Biowulf. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9: Модель субстрата VEEV P12, содержащего последовательность участка расщепления на перекрестке nsP1/nsP2. Каталитическая диада Cys-477/His-546 показана синим цветом. Рисунок был сделан с помощью Pymol (https://pymol.org). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 10
Рисунок 10: SSHHPS Анализ вируса Зика ns2B/ns3 протеазы. (A) Прогнозируемые цели протеина хозяина protease s2B/ns3. Остатки в красном цвете соответствуют одной последовательности участка расщепления. Остатки зеленого цвета допускаются на подсайте и соответствуют остаткам на других участках расщепления. SFRP1 имел наибольшее количество идентичных остатков в последовательном порядке. (B) белки CFP-субстрата-YFP (50-60 kDa) были выражены и очищены, содержащие прогнозируемую последовательность SSHHP из каждого белка-хозяина (человека). Протеаза ЗИКВ вырезала человека FOXG1, SFRP1, NT5M и альфа-субъединицуG,изолированную из библиотеки кДНК с коры. Продукты расщепления составляют примерно 28-30 кДа. Последовательности субстрата доступны в Morazzani et al.6 (C) В то время как протеазы ns2B/ns3 вырезали SFRP1, он не вырезал своих гомологов (SFRP2 и SFRP4). (D) Выравнивание участков расщепления от различных видов животных может быть полезным при выборе модели животных для вируса группы IV. Обратите внимание, что в SFRP1 сохранивется последовательность R- G между людьми и грызунами. Рисунок, воспроизведенный из Morazzani et al.6Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 11
Рисунок 11: Устойчивый кинетический анализ состояния с использованием непрерывных и прерывистых анализов. (A) Кинетические данные, показанные в таблице 5, были построены в GraFit. Вставка показывает сюжет Lineweaver-Burk. (B) Гель SDS-PAGE, показывающий продукты расщепления субстрата CFP-V12-YFP. В полосе 1 находится субстрат "UNCUT" (48 кДа). В полосе 2 находится субстрат "CUT" (31 kDa и 27 kDa). В полосы движения были включены 3-9 различных соединений для проверки их ингибирующей активности. Лейн 4 содержит ингибитор ковалента E64d. Эти реакции были запущены на ночь в течение 17 ч при комнатной температуре. Кипение образцов было необходимо для достижения резкого схемы полоскания. Протеаза nsP2 видна (56 кДа) в реакциях, содержащих фермент, но не в полосе 1. Лейн 1 является "нет фермента" контроль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Последовательность конкретных уничтожения белка или нуклеиновой кислоты руководствоваться иностранной последовательности только видели в нескольких случаях в биологии. Механизмы, показанные на рисунке 1, являются защитительными механизмами, которые защищают хозяина от вируса или вируса от узла.

Используя биоинформатические методы, мы можем определить цели, которые уничтожаются этими системами. В нашем анализе последовательностей SSHHP, мы обнаружили, что многие из них могут быть найдены в белках, необходимых для создания врожденных иммунных реакций. Некоторые из них были очевидные роли, такие как MAVS и TRIF (TIR-домен-содержащих адаптер вызывающих интерферон-я), в то время как другие были связаны с иммунитетом, хотя и более сложные механизмы (например, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Целевая информация, хранящаяся в последовательности SSHHP, имеет потенциал для выявления путей, которые имеют противовирусные эффекты против этих вирусов. Противовирусные ответы in vivo часто являются вирусными26,43. Например, подмножества белков TRIM оказывают противовирусное воздействие на различные вирусы43,44,45, некоторые из них являются факторами вирусного ограничения (например, ВИЧ и ТРИМ5). Специфика белков TRIM (70 евро были определены) до сих пор изучается44,45. Информация в SSHHPS может способствовать нашему пониманию того, как эти вирусы уклоняются от врожденных иммунных реакций. Другие закономерности и корреляции могут быть обнаружены по мере изучения большего количества SSHHPS.

Видовые различия были очевидны в нашем анализе(Рисунок 2, Рисунок 10). Эти вирусы, как известно, влияют на некоторые виды больше, чем другие. Информация о диапазоне хоста, восприимчивости хоста и защите хоста может присутствовать в SSHHPS. Например, лошади, наиболее восприимчивые виды к вирусам конского энцефалита, не хватало области человека TRIM14, который был временно сокращен протеазой VEEV nsP2. Люди редко умирают от инфекций VEEV, но могут быть инфицированы24. Человеческий белок TRIM14 нес последовательность расщепления протеазы nsP26. Присутствие места расщепления свидетельствует о том, что люди имеют защитный механизм против этих вирусов. Птицы считались потенциальными резервуарами этих вирусов46. Соответствующая последовательность SSHHP в белке TRIM14 от кур отличалась от последовательностей, встречаемых у людей и других видов. Тонкие различия, как это может сделать целевой хозяин белка дяди или более легко расщепляться. Aguirre et al.16 показали, что неудающийся мутировавший белок STRING индуцировал более высокие уровни IFN после заражения вирусом Денге и что мыши, естественно, несут версию STING, которая не вырезана протеазой Dengue ns2B3. Белок murine STING не был вырезан протеизами47. В нашем анализе SSHHPS, мы также наблюдали различия в последовательности участка расщепления протеазы, когда мы сравнили человеческие белки с белками грызунов6 (Рисунок 10D). Воспроизведение видов конкретных протеолитических расщеплений белков-хозяев может иметь важное значение в животных моделях, используемых для вирусов группы IV. Ингибирование расщепления белка хозяина также имеет последствия в отношении развития ингибиторов протеазы группы IV. В нашей предыдущей публикации, мы показали, что мы могли бы ингибировать РАСщепление TRIM14 по протеазаve VEEV nsP2 с помощью CA074 метиловый эфир6. Этот результат показывает, что небольшие молекулы ингибиторы этих протеаз может быть в состоянии модулировать врожденные иммунные реакции, которые способны подавлять инфекцию6,31.

Генетические изменения в пределах вида также имеет потенциал для того чтобы произвести разницы в протеолическом расщеплении. Тонкие различия в использовании кодона может повлиять на рибосому паузы48. Так как некоторые группы IV вирусные протеазы встроены в мембрану ER, различия в этих паузах может повлиять на расщепление цели, если расщепление происходит совместно. Некоторые из участков расщепления, которые мы определили, были в прогнозируемых последовательности пептида сигнала (например, SFRP1), в то время как другие были внутренними.

Анализ SSHHPS может дать информацию, которая отличается от других методов анализа белка хозяина. Анализ SSHHPS был недорогим и простым в использовании. Использование бактериальной системы экспрессии позволило проверить короткие сегменты (25 аминокислот) последовательностей млекопитающих без использования культуры клеток млекопитающих. Мы обнаружили, что субстраты CFP-YFP были в состоянии переносить все проверенные последовательности белка человека; однако урожайность варьировалась. В аналогичных анализах субстраты, содержащие последовательности белка человека, до тех пор, пока 63 аминокислоты были успешно выражены, очищены и использованы для кинетической анализа и ингибитора скрининга49,50,51. Поскольку для прерывистого исследования требуется лишь небольшое количество субстрата, можно изучить большое количество целей. Одним из преимуществ системы является то, что субстраты CFP/YFP могут быть использованы для анализа SDS-PAGE и для более сложных кинетический анализ (т.е. IC50, Ki, Km,Vmax). Для обнаружения наркотиков, ингибирующие соединения могут производить артефакты в флуоресцентных анализов. Таким образом, прерывистое анализ в сочетании с непрерывным анализом позволяет подтвердить расщепление или ингибирование декольте. Образцы для прерывистого SDS-PAGE-асссса могут быть взяты непосредственно из 96-колодцев. CFP / YFP субстраты были использованы для комплексного скринингабиблиотеки 52. Тем не менее, необходимы дополнительные анализы, чтобы определить, подходит ли субстрат для скрининга высокой пропускной всей входной, например, для расчетакоэффициента 53.

Одной из задач при проектировании субстрата является определение региона вокруг ножниц, которые связаны и распознаны протеаза. В приведенных здесь примерах мы начали с 12 последовательностей остатков, которые были сосредоточены вокруг ножниц. После анализа последовательности выравнивания расщепления сайтов гомологии остатков N-терминал аж ножницы была найдена для протеазы VEEV, в то время как для гомологии протеазы ЗИКВ к нескольким c-терминал остатков был найден. В силико модель состыковатого субстрата может быть использована для разработки на сайте направлены мутагенез эксперименты, которые зондируют связывающих сайтов субстрата. Так как субстрат и ферментные последовательности находятся на плазмидах, либо можно мутировать, чтобы проверить в силико-моделях или допусков подсайта. Это может быть выгодно, если кристаллическая структура связанного субстрата (ы) недоступна.

Анализ SSHHPS может также дать новую информацию о механизмах, с помощью которых вирус-индуцированные фенотипы производятся вирусными ферментами. Одна из целей ЗИКВ, SFRP1, является частью Пути Сигнализации Wnt и играет роль в развитии мозга и глаз и в иммунных реакциях36,37,54,55,56,57. Мы обнаружили, что другие белковые последовательности, которые могут быть сокращены протеазой ziKV ns2B/ns3, также содержатся в белках, участвующих в развитии мозга и глаз; аномалии в обоих наблюдались при врожденном синдроме Зика и, как полагают, являются частью вирус-индуцированного фенотипа58.

Предсказуемость взаимодействий между хозяином и патогеном может быть использована для различных применений: специфических онколитических вирусных методов; де-риск живых вирусных вакцин; уточнение, прогнозирование или выбор моделей животных; прогнозирование дальности или восприимчивости к хозяину; прогнозирование зоонозных событий; и прогнозирование защиты хозяев. Поскольку описанные методы основаны на последовательности, они могут иметь ценность для включения в программное обеспечение в будущем.

Disclosures

Мнения, высказанные здесь, являются мнениями авторов и не представляют мнения ВМС США, армии США, Министерства обороны США или правительства США.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Агентством по уменьшению оборонной угрозы (DTRA) номерами проектов CB-SEED-SEED09-2-0061 и CBCall4-CBM-05-2-0019, а отчасти - программой интрамальных/экстраморальных исследований фондов NCATS, NIH (XH) и военно-морской исследовательской лаборатории.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL Erlenmeyer Flask VWR 89000-362
2-mercaptoethanol Acros Organics (Fisher) 125472500 Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.
4 L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap Millipore Sigma CLS49954L-1EA
AKTA Prime Plus GE Healthcare 17-0729-01
AKTA XK 16/20 Column GE Healthcare 28988937
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC501096
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC901096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC801024
Ampicillin Sigma A0166 Danger: Allergic reactions (skin or breathing).
Chelating Sepharose Fast Flow GE Healthcare 17-0575-02 Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.
Chloramphenicol RPI C61000 Danger: May cause cancer.
Corning 50 mL centrifuge tubes Corning 430828 Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface Corning 3993
Dialysis Tubing Clips Fisher Scientific PI68011
Disposable PD-10 Desalting Column GE Healthcare 17-0851-01
DNAse Sigma DN25-1G
DTT (DL-Dithiothreitol) RPI D11000-50.0 Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation
EDTA Fisher Scientific S311-500
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
Glycerol Acros Organics (Fisher) 15892-0010
HEPES Millipore Sigma H4034-1KG
Imidazole Acros Organics 301870010 Danger: Toxic, Irritant
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) Calbiochem (Millipore Sigma) 420291 Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.
Laemmli Sample Buffer BIO-RAD 1610737
Luria Bertani Agar Fluka (Millipore Sigma) L3027-1KG Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.
Luria Bertani Media Fisher Bioreagents BP1426-2
Lysozyme Sigma L4919-5g
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box BIO-RAD
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes Nalgene (Thermo Scientific) 3119-0050
Nanodrop Thermo Fisher
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator Eppendorf M1335
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific N73-500 Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C600003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C606003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
pet15b plasmid DNA Novagen (Millipore Sigma) 69661 GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.
pet32b Novagen (Millipore Sigma) 69016-3 The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free Thermo Fisher A32955 Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage
Plate Reader Molecular Devices Model M5
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard BIO-RAD 161-0373
Protein Extraction Reagent Novagen (Millipore Sigma) 70584-4 BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)
Q-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0510-01 Anion exchange resin
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels Expedeon BCG01227 Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used
RunBlue 20x SDS Running Buffer Expedeon NXB50500 Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x
RunBlue Instant Blue Gel Stain Expedeon ISB1L Do not dilute, use as directed
Sodium Chloride Fisher Chemical S271-10
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator Branson Ultrasonics (VWR) Model No. 101-063-346R Sonicator was used on level 5
Spectra/Por 6-8 kD MWCO Spectrum Labs 132645T Dialysis Tubing
SP-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0729-01 Cation exchange resin
Thrombin from bovine plasma Sigma T6634-500UN
Tris Base Fisher Scientific BP152-500 Caution: Eye/Skin Irritant

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, H., et al. Widespread Horizontal Gene Transfer from Double-Stranded RNA Viruses to Eukaryotic Nuclear Genomes. Journal of Virology. 84, (22), 11876-11887 (2010).
  2. Hagai, T., Azia, A., Babu, M. M., Andino, R. Use of host-like peptide motifs in viral proteins is a prevalent strategy in host-virus interactions. Cell Reports. 7, (5), 1729-1739 (2014).
  3. Gorbalenya, A. E. Host-related sequences in RNA viral genomes. Seminars in Virology. 3, 359-371 (1992).
  4. Shmakov, S. A., et al. The CRISPR Spacer Space Is Dominated by Sequences from Species-Specific Mobilomes. MBio. 8, (5), 1-18 (2017).
  5. Legler, P. M., Morazzani, E., Glass, P. J., Compton, J. R. Proteome Editing System and A Biomarker of Veev Infection. United States patent application. (2018).
  6. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  7. Alvarez, E., Castello, A., Menendez-Arias, L., Carrasco, L. HIV protease cleaves poly(A)-binding protein. Biochemical Journal. 396, (2), 219-226 (2006).
  8. Falk, M. M., et al. Foot-and-mouth disease virus protease 3C induces specific proteolytic cleavage of host cell histone H3. Journal of Virology. 64, (2), 748-756 (1990).
  9. Grigera, P. R., Tisminetzky, S. G. Histone H3 modification in BHK cells infected with foot-and-mouth disease virus. Virology. 136, (1), 10-19 (1984).
  10. Li, W., Ross-Smith, N., Proud, C. G., Belsham, G. J. Cleavage of translation initiation factor 4AI (eIF4AI) but not eIF4AII by foot-and-mouth disease virus 3C protease: identification of the eIF4AI cleavage site. FEBS Letters. 507, (1), 1-5 (2001).
  11. Kuyumcu-Martinez, M., et al. Calicivirus 3C-like proteinase inhibits cellular translation by cleavage of poly(A)-binding protein. Journal of Virology. 78, (15), 8172-8182 (2004).
  12. Pietila, M. K., Hellstrom, K., Ahola, T. Alphavirus polymerase and RNA replication. Virus Research. 234, 44-57 (2017).
  13. Hardy, W. R., Strauss, J. H. Processing the nonstructural polyproteins of sindbis virus: nonstructural proteinase is in the C-terminal half of nsP2 and functions both in cis and in trans. Journal of Virology. 63, (11), 4653-4664 (1989).
  14. Strauss, E. G., De Groot, R. J., Levinson, R., Strauss, J. H. Identification of the active site residues in the nsP2 proteinase of Sindbis virus. Virology. 191, (2), 932-940 (1992).
  15. Wang, D., et al. Foot-and-mouth disease virus 3C protease cleaves NEMO to impair innate immune signaling. Journal of Virology. 86, (17), 9311-9322 (2012).
  16. Aguirre, S., et al. DENV inhibits type I IFN production in infected cells by cleaving human STING. PLoS Pathogens. 8, (10), e1002934 (2012).
  17. Barral, P. M., Sarkar, D., Fisher, P. B., Racaniello, V. R. RIG-I is cleaved during picornavirus infection. Virology. 391, (2), 171-176 (2009).
  18. Elbashir, S. M., Lendeckel, W., Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Development. 15, (2), 188-200 (2001).
  19. Deveau, H., Garneau, J. E., Moineau, S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annual Review of Microbiology. 64, 475-493 (2010).
  20. Schechter, I., Berger, A. On the size of the active site in proteases I. Papain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 27, (2), 157-162 (1967).
  21. Bieniasz, P. D. Intrinsic immunity: a front-line defense against viral attack. Nature Immunology. 5, (11), 1109-1115 (2004).
  22. Zhou, Z., et al. TRIM14 is a mitochondrial adaptor that facilitates retinoic acid-inducible gene-I-like receptor-mediated innate immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 111, (2), E245-E254 (2014).
  23. Wang, S., et al. TRIM14 inhibits hepatitis C virus infection by SPRY domain-dependent targeted degradation of the viral NS5A protein. Scientific Reports. 6, 32336 (2016).
  24. Zacks, M. A., Paessler, S. Encephalitic alphaviruses. Veterinary Microbiology. 140, (3-4), 281-286 (2010).
  25. Hollidge, B. S., Weiss, S. R., Soldan, S. S. The role of interferon antagonist, non-structural proteins in the pathogenesis and emergence of arboviruses. Viruses. 3, (6), 629-658 (2011).
  26. Carthagena, L., et al. Human TRIM gene expression in response to interferons. PLoS One. 4, (3), e4894 (2009).
  27. Montgomery, S. A., Johnston, R. E. Nuclear import and export of Venezuelan equine encephalitis virus nonstructural protein 2. Journal of Virology. 81, (19), 10268-10279 (2007).
  28. Nenasheva, V. V., et al. Enhanced expression of trim14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunologic Research. 62, (3), 255-262 (2015).
  29. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, (1), 87-90 (2002).
  30. Li, M. Z., Elledge, S. J. SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in Molecular Biology. 852, 51-59 (2012).
  31. Hu, X., et al. Kinetic, Mutational, and Structural Studies of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Nonstructural Protein 2 Cysteine Protease. Biochemistry. 55, (21), 3007-3019 (2016).
  32. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  33. Zhang, D., Tozser, J., Waugh, D. S. Molecular cloning, overproduction, purification and biochemical characterization of the p39 nsp2 protease domains encoded by three alphaviruses. Protein Expression and Purification. 64, (1), 89-97 (2009).
  34. Lei, J., et al. Crystal structure of Zika virus NS2B-NS3 protease in complex with a boronate inhibitor. Science. 353, (6298), 503-505 (2016).
  35. Shiryaev, S. A., et al. Characterization of the Zika virus two-component NS2B-NS3 protease and structure-assisted identification of allosteric small-molecule antagonists. Antiviral Research. 143, 218-229 (2017).
  36. Smith, J. L., Jeng, S., McWeeney, S. K., Hirsch, A. J. A MicroRNA Screen Identifies the Wnt Signaling Pathway as a Regulator of the Interferon Response during Flavivirus Infection. Journal of Virology. 91, (8), (2017).
  37. Lee, Y. S., et al. The Wnt inhibitor secreted Frizzled-Related Protein 1 (sFRP1) promotes human Th17 differentiation. European Journal of Immunology. 42, (10), 2564-2573 (2012).
  38. Goodfellow, F. T., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells and Development. 25, (22), 1691-1697 (2016).
  39. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91, (8), (2017).
  40. Morazzani, E. M., et al. Books of Abstracts, 254th American Chemical Society National Meeting. Washington, D.C. (2017).
  41. Compton, J. R., Mickey, M. J., Hu, X., Marugan, J. J., Legler, P. M. Mutation of Asn-475 in the Venezuelan Equine Encephalitis Virus nsP2 Cysteine Protease Leads to a Self-Inhibited State. Biochemistry. 56, (47), 6221-6230 (2017).
  42. Vasiljeva, L., et al. Regulation of the sequential processing of Semliki Forest virus replicase polyprotein. Journal of Biological Chemistry. 278, (43), 41636-41645 (2003).
  43. Uchil, P. D., Quinlan, B. D., Chan, W. T., Luna, J. M., Mothes, W. TRIM E3 ligases interfere with early and late stages of the retroviral life cycle. PLoS Pathogens. 4, (2), e16 (2008).
  44. Ozato, K., Shin, D. M., Chang, T. H., Morse, H. C. 3rd TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity. Nature Reviews Immunology. 8, (11), 849-860 (2008).
  45. van Tol, S., Hage, A., Giraldo, M. I., Bharaj, P., Rajsbaum, R. The TRIMendous Role of TRIMs in Virus-Host Interactions. Vaccines (Basel). 5, (3), (2017).
  46. Molaei, G., et al. Dynamics of Vector-Host Interactions in Avian Communities in Four Eastern Equine Encephalitis Virus Foci in the Northeastern U.S. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, (1), e0004347 (2016).
  47. Ding, Q., et al. Species-specific disruption of STING-dependent antiviral cellular defenses by the Zika virus NS2B3 protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 115, (27), E6310-E6318 (2018).
  48. Angov, E., Legler, P. M., Mease, R. M. Adjustment of codon usage frequencies by codon harmonization improves protein expression and folding. Methods in Molecular Biology. 705, 1-13 (2011).
  49. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Analytical Biochemistry. 411, (2), 200-209 (2011).
  50. Hu, X., et al. Structural insight into exosite binding and discovery of novel exosite inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A through in silico screening. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28, (7), 765-778 (2014).
  51. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Applied and Environmental Microbiology. 78, (21), 7687-7697 (2012).
  52. Nguyen, T. G., et al. Development of fluorescent substrates and assays for the key autophagy-related cysteine protease enzyme ATG4B. Assay and Drug Development Technologies. 12, (3), 176-189 (2014).
  53. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, (2), 67-73 (1999).
  54. Bovolenta, P., Esteve, P., Ruiz, J. M., Cisneros, E., Lopez-Rios, J. Beyond Wnt inhibition: new functions of secreted Frizzled-related proteins in development and disease. Journal of Cell Science. 121, (Pt 6), 737-746 (2008).
  55. Esteve, P., et al. SFRPs act as negative modulators of ADAM10 to regulate retinal neurogenesis. Nature Neuroscience. 14, (5), 562-569 (2011).
  56. Garcia-Hoyos, M., et al. Evaluation of SFRP1 as a candidate for human retinal dystrophies. Molecular Vision. 10, 426-431 (2004).
  57. Marcos, S., et al. Secreted frizzled related proteins modulate pathfinding and fasciculation of mouse retina ganglion cell axons by direct and indirect mechanisms. Journal of Neuroscience. 35, (11), 4729-4740 (2015).
  58. Moore, C. A., et al. Characterizing the Pattern of Anomalies in Congenital Zika Syndrome for Pediatric Clinicians. JAMA Pediatrics. 171, (3), 288-295 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics