Analys av grupp IV viral SSHHPS med in vitro-och silico-metoder

Immunology and Infection
 

Summary

Vi presenterar ett allmänt protokoll för att identifiera korta sträckor av homolog värd-patogen proteinsekvenser (SSHHPS) inbäddade i viral polyprotein. SSHHPS erkänns av virala proteaser och rikta den riktade förstörelsen av specifika värd proteiner av flera grupp IV virus.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hu, X., Compton, J. R., Legler, P. M. Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods. J. Vis. Exp. (154), e60421, doi:10.3791/60421 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Alphaviral enzymer syntetiseras i en enda polypeptid. Den icke-strukturella polyprotein (nsP) bearbetas av dess nsP2 cystein proteashämmare att producera aktiva enzymer som är viktiga för viral replikering. Viral proteaser är mycket specifika och erkänna bevaras klyvning webbplats motiv sekvenser (~ 6-8 aminosyror). I flera grupp IV-virus, kan nsP protease (s) klyvning webbplats motiv sekvenser hittas i specifika värd proteiner som är involverade i att generera det medfödda immunsvaret och, i vissa fall, de riktade proteinerna verkar vara kopplade till den virusinducerade fenotypen. Dessa virus utnyttjar korta sträckor av homolog värd-patogen proteinsekvenser (SSHHPS) för riktad förstörelse av värd proteiner. För att identifiera SSHHPS kan virus proteas klyvning av platssekvenserna matas in i BLAST och värd genomet (s) kan sökas. Klyvning initialt kan testas med hjälp av renad NSP viral proteas och fluorescens resonans energiöverföring (FRET) substrat gjorda i E. coli. BANDET substrat innehåller cyan och gult fluorescerande protein och klyvning webbplatssekvens (CFP-sekvens-YFP). Denna proteasanalys kan användas kontinuerligt i en Plattläsare eller inte kontinuerligt på SDS-PAGE Gels. Modeller av de bundna peptid substrat kan genereras i silico för att vägleda substrat urval och mutagenes studier. CFP/YFP-substrat har också utnyttjats för att identifiera proteashämmare. Dessa in vitro-och silico-metoder kan användas i kombination med cellbaserade analyser för att avgöra om det riktade värd proteinet påverkar virusreplikation.

Introduction

Bevis på horisontell genöverföring från virus till värd, eller värd för virus, kan hittas i en mängd av genomen hos1,2,3,4. Exempel på viral endogenisering är CRISPR-distanserna som finns i bakteriernas värd-genomen hos4. Nyligen har vi funnit bevis på värd proteinsekvenser inbäddade i icke-strukturella polyproteiner av (+) ssRNA grupp IV virus. Dessa sekvenser inom kodnings regionerna i viral genomet kan spridas generationellt. Den korta sträckor av homolog värd-patogen proteinsekvenser (sshhps) finns i viruset och värd5,6. SSHHPS är den bevarade klyvning webbplats motiv sekvenser erkänns av virala proteaser som har homologi till specifika värd proteiner. Dessa sekvenser direkt förstörelsen av specifika värd proteiner.

I vår tidigare publikation6, vi sammanställt en lista över alla de värden proteiner som var riktade av virala proteaser och fann att listan över mål var icke-slumpmässigt (tabell 1). Två trender var uppenbara. Först, majoriteten av de virala proteaser som skär värd proteiner tillhörde grupp IV virus (24 av 25 fall inblandade grupp IV virala proteaser), och en proteas tillhörde (+) ssRNA grupp VI retrovirus (HIV, humant immunbristvirus)7. För det andra var värd protein mål som skärs av virala proteaser i allmänhet inblandade i att generera den medfödda immunsvar tyder på att klyvning var avsedda att motverka värdens immunsvar. Hälften av de värden proteiner riktade av virala proteaser var kända komponenter av signalering kaskader som genererar interferon (IFN) och proinflammatoriska cytokiner (tabell 1). Andra var inblandade i värdcelltranskription8,9,10 eller Translation11. Intressant, SHmakov et al.4 har visat att många CRISPR protospacer sekvenser motsvarar gener inblandade i plasmid konjugering eller replikering4.

Grupp IV omfattar bland annat Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae och togaviridae. Flera nya och framväxande patogener tillhör grupp IV såsom zika virus (ZIKV), West Nile (WNV), chikungunya (CHIKV), svår akut respiratorisk syndrom virus (SARS) och Mellanöstern respiratoriskt syndrom virus (MERS). Den (+) ssRNA arvsmassan är i huvudsak en bit av mRNA. För att producera de enzymer som krävs för genomreplikering måste (+) ssRNA-genomet först översättas. I alphaviruses och andra grupp IV virus, de enzymer som krävs för replikering produceras i en enda polyprotein (dvs., nsP1234 för VEEV). Den icke-strukturella polyprotein (nsP) är proteolytically bearbetas (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) av nsP2 proteas att producera aktiva enzymer12 (figur 1). Klyvning av polyprotein av nsP2 proteas är viktigt för viral replikering; Detta har visats genom radering och platsriktade mutagenes av den aktiva webbplatsen cystein av nsP2 proteas13,14. I synnerhet, översättningen av virala proteiner föregår genomreplikering händelser. Till exempel innehåller nsP4 RNA-beroende RNA-polymeras som behövs för att replikera (+) ssRNA-genomet. Genomreplikering kan producera dsRNA-intermediärer. dessa intermediärer kan utlösa värdens medfödda immunsvar. Sålunda, dessa virus kan klyva värd medfödda immunsvar proteiner tidigt i infektionen för att undertrycka deras effekter15,16,17.

Ljuddämpning kan förekomma på DNA-, RNA-och proteinnivå. Vad som är gemensamt för var och en av de ljuddämpnings metoder som visas i figur 1 är att korta främmande DNA-, RNA-eller proteinsekvenser används för att vägleda förstörelsen av specifika mål för att motverka deras funktion. Ljuddämpnings mekanismerna är analoga med "Sök och ta bort"-program som har skrivits på tre olika språk. Den korta klyvning webbplats sekvens är jämförbar med ett "nyckelord". Varje program har ett enzym som erkänner matchen mellan den korta sekvensen ("sökordet") och ett ord i "filen" som ska raderas. När en match hittas, minskar enzymet ("raderar") den större målsekvensen. De tre mekanismerna som visas i figur 1 används för att försvara värden från virus, eller för att försvara ett virus från värdens immunförsvar.

Virala proteaser erkänna korta klyvning webbplats motiv sekvenser mellan ~ 2-11 aminosyror; i nucleotides, skulle detta motsvara till 6-33 baser. För jämförelse är CRISPR spacer sekvenser ~ 26-72 nukleotider och RNAi är ~ 20-22 nukleotider18,19. Även om dessa sekvenser är relativt korta, kan de kännas igen specifikt. Med tanke på den högre mångfalden av aminosyror, sannolikheten för en slumpmässig klyvning händelse är relativt låg för en viral proteas erkänner proteinsekvenser av 6-8 aminosyror eller längre. Prediktion av SSHHPS i värd proteiner kommer till stor del bero på specificiteten hos viral proteas undersöks. Om proteasen har strikta sekvens specificitet krav chansen att hitta en klyvning webbplats sekvens är 1/206 = 1 i 64 000 000 eller 1/208 = 1 i 25 600 000 000; de flesta proteaser har dock variabla toleranser för underwebbplatsen (t. ex. kan R eller K tolereras på S1-platsen). Därför finns det inget krav för sekvens identitet mellan sekvenser som finns i värden kontra viruset. För virala proteaser som har lösare sekvenskrav (t. ex. de som tillhör Picornaviridae) kan sannolikheten för att hitta en klyvning plats i ett värd protein vara högre. Många av posterna i tabell 1 är från familjen Picornaviridae .

Schechter & Berger notation20 används ofta för att beskriva resterna i ett proteassubstrat och de underwebbplatser som de binder, vi använder denna notation hela. Resterna i substratet som är N-terminalen på scissile Bond betecknas som P3-P2-P1 medan de som är C-Terminal betecknas som P1'-P2'-P3 ". Motsvarande underwebbplatser i proteasen som binder dessa aminosyrerester är S3-S2-S1 och S1'-S2'-S3 respektive.

För att avgöra vilka värden proteiner som riktas, kan vi identifiera SSHHPS i viral polyprotein klyvning platser och söka efter de värden proteiner som innehåller dem. Häri beskriver vi procedurer för att identifiera SSHHPS med hjälp av kända viral proteas klyvning webbplats sekvenser. De bioinformatiska metoderna, proteasanalyserna och de beskrivna silico-metoderna är avsedda att användas tillsammans med cellbaserade analyser.

Sekvensanpassningar av värden proteiner riktade av virala proteaser har avslöjat artspecifika skillnader inom dessa korta klyvning webbplatssekvens. Till exempel konstaterades att det venezuelanska Equine encefalit-viruset (VEEV) nsP2 proteashämmare var att skära humant TRIM14, ett treparts motiv (TRIM) protein6. Vissa TRIMPROTEINER är virala begränsnings faktorer (t. ex. TRIM5α21), de flesta tros vara ubiquitin E3 Ligaser. TRIM14 saknar en RING (riktigt intressant ny gen) domän och är inte tänkt att vara en E3 Ligase22. TRIM14 har föreslagits vara en adapter i mitokondrie antiviral signalosome (MAVS)22, men kan ha andra antivirala funktioner23. Anpassning av TRIM14 sekvenser från olika arter visar att Equine saknar klyvning plats och hamn en stympad version av TRIM14 som saknar C-terminalen PRY/SPRY domän. Denna domän innehåller en polvubiquitinering webbplats (figur 2). I Equine, dessa virus är mycket dödliga (~ 20-80% dödlighet) medan hos människor endast ~ 1% dör från VEEV infektioner24. Klyvning av PRY/SPRY-domänen kan transitivt kortslutning MAVS signalering kaskad. Denna kaskad kan utlösas av dsRNA och leder till produktion av interferon och pro-inflammatoriska cytokiner. Således kan närvaron av SSHHPS vara användbart för att förutsäga vilka arter har försvarssystem mot specifika grupp IV virus.

I grupp IV-virus tros IFN-antagonism-mekanismer multiplicera överflödig25. Host protein klyvning kan vara övergående under infektion och koncentrationer kan återhämta sig med tiden. Vi hittade i celler som TRIM14 klyvning produkter kan upptäckas mycket tidigt efter transfektion (6 h) med en Plasmid kodning proteasen (cytomegalovirus promotor). Vid längre perioder upptäcktes dock inte klyvning produkter. I virusinfekterade celler var kinetikerna olika och klyvning produkter kunde upptäckas mellan 6-48 h6. Andra har rapporterat uppkomsten av Host protein klyvning produkter så tidigt som 3-6 h post infektion9,11.

Proteolytisk aktivitet i celler är ofta svårt att fånga; klyvning produkter kan variera i deras löslighet, koncentration, stabilitet, och livslängd. I cellbaserade analyser kan man inte utgå från att klyvbara produkter ackumuleras i en cell eller att bandintensiteten i snitt och oklippt protein kommer att Visa kompenserande ökningar och minskningar eftersom det skurna proteinet kan brytas ned mycket snabbt och inte kan upptäckas i en västerländsk blot vid en förväntad molekylvikt (MW) (t. ex. den region som innehåller epitopen kan klyvas av andra värd proteaser eller kan vara ubiquitinated). Om substrat för viral proteas är ett medfödda immunsvar protein, dess koncentration kan variera under infektion. Till exempel, vissa medfödda immunsvar proteiner är närvarande före virusinfektion och induceras ytterligare av interferon26. Koncentrationen av målproteinet kan därför fluktuera under infektion och jämförelse av icke-infekterade vs. infekterade celllysat kan vara svåra att tolka. Dessutom, alla celler kan inte vara enhetligt transfekterade eller infekterade. In vitro-proteasanalyser med renade proteiner från E. coli å andra sidan har färre variabler för vilka man kan kontrollera och sådana analyser går att göra med SDS-Page snarare än Immunoblots. Kontaminerande proteaser kan hämmas i de tidiga stegen av Proteinrening av den gemensamma fiskeripolitiken/YFP-substrat, och muterade virala proteaser kan renas och testas som kontroller för att avgöra om klyvning beror på viral proteas eller en förorenande bakteriell proteas.

En begränsning av in vitro-proteasanalyser är att de saknar komplexiteten hos en däggdjurscell. För ett enzym att skära dess substrat, de två måste vara co-lokaliserade. Grupp IV viral proteaser skiljer sig åt i struktur och lokalisering. Till exempel är ZIKV proteashämmare inbäddad i endoplasmatiska Retikulum (ER) membranet och ansikten Cytosol, medan VEEV nsP2 proteashämmare är ett lösligt protein i cytoplasman och Nucleus27. Några av de klyvning webbplats sekvenser hittades i ZIKV SSHHPS analys var i signal peptider tyder på att klyvning kan förekomma samtranslationellt för vissa mål. Därför måste även placeringen av proteasen och underlaget i cellen övervägas i dessa analyser.

Cellbaserade analyser kan vara värdefulla för att fastställa en roll för de identifierade värd proteinet (-erna) vid infektion. Metoder som syftar till att stoppa viral proteas klyvning av värd proteiner såsom tillsats av en proteashämmare6 eller en mutation i värd mål16 kan användas för att undersöka deras effekter på viral replikering. Överuttryck av det riktade proteinet kan också påverka viral replikering28. Plack analyser eller andra metoder kan användas för att kvantifiera viral replikering.

Protocol

1. bioinformatik: identifiering av SSHHPS i värd arvsmassan med hjälp av BLAST

Anmärkning: Protein BLAST finns på blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

  1. Input ~ 20 aminosyror som omger scissile Bond i viral polyprotein. Välj icke-redundanta proteinsekvenser och skriv in den mottagande arvsmassan som ska sökas (t. ex. homo sapiens).
    1. Om det behövs väljer du PHI-BLAST. Skriv in en mönstersekvens (t. ex. för de 25 resterna av V12 som visas nedan, Skriv in mönstret "AG" utan citationstecken).



      Anmärkning: I PHI-BLAST, hakparenteser [XY] indikerar att aminosyran X eller Y kan vara på under platsen position (t. ex. AG [AC] [GAY]).
    2. Inspektera SPRÄNGNINGS resultaten och identifiera träffar som har hög sekvensidentitet till rester som bevaras i polyproteinklyvningsområdena (t. ex. trepartssammansatt protein 14) (figur 3).
      Anmärkning: För Serine proteaser högre bevarande av P1 återstoden förväntas, medan för cystein proteaser högre bevarande av P2 rester förväntas.
    3. Färga resterna som är identiska med en klyvning webbplatssekvens och är i sekventiell ordning (inga luckor). Färga resterna tolereras på under platsen, men förekommer i en annan klyvning plats i en andra färg.
      Anmärkning: Rester som representerar konservativa substitutioner (t. ex. Leu vs. val) som inte finns i en viral klyvning webbplats kan också hittas och kan eller inte kan kännas igen av viral proteas.
    4. Rang Beställ BLAST träffar baserat på antalet identiska eller tolererade rester i följd som matchar en klyvning webbplatssekvens. I listan väljer du de proteiner som innehåller ≥ 6 identiska eller liknande rester för analys i proteasanalyser.
    5. Upprepa proceduren för de andra klyvning platser (nsP2/3, nsP3/4, etc.) och gradvis stärka förutsägelsen genom att lägga till mer mycket bevarade rester till PHI-BLAST mönster.

2. in vitro-analyser: utformning och beredning av Proteassubstrat

  1. Konstruera en Plasmid kodning av cyan fluorescerande protein (CFP), ≤ 25 aminosyror i klyvning webbplatssekvens, följt av gult fluorescerande protein (YFP, även känd som Venus29).
    Anmärkning: Den plasmid kan konstrueras med hjälp av sekvens och ligering oberoende kloning (SLIC)30 eller kommersiell gen syntes. En pet15b plasmid innehållande sekvensen som visas i figur 4 var syntetiseras kommersiellt och användes här.
    1. För att optimera substrat längd, konstruera ytterligare variabel längd FRET substrat som innehåller 12-25 aminosyror i den naturliga viral polyprotein klyvning webbplats sekvenser med hjälp av en 2-fragment SLIC reaktion. Analysera klyvning med hjälp av den gel-baserade testmetoden för SDS-PAGE eller genom att mäta steady state-kinetiska parametrar med metoderna nedan.
      Anmärkning: I vissa fall kan klyvning webbplatser identifieras genom homologi till kända klyvning platser31. Om klyvning av substrat som innehåller polyproteinknutsekvenserna inte observeras, kan det finnas ett krav på ytterligare rester eller ett strukturellt motiv (t. ex. en alfa-Helix32). Alternativt kan den renade virala proteasen vara inaktiv. Bekräfta klyvning av de virala polyproteinsekvenserna innan du påbörjar SSHHPS-analys. Antalet rester i underlaget optimerades för VEEV-proteasen med hjälp av variabla längd substrat (12 till 25 aminosyror) följt av analys av VMax och Km32,33. Den zika viral ns2B/NSB proteashämmare klyvning platser som används i exemplen har publicerats34,35.
  2. Förbered den gemensamma fiskeripolitiken/YFP-substrat genom att nyligen omvandla 8-20 μL av BL-21 (DE3)E. colibehöriga celler med den gemensamma fiskeripolitiken-V12-YFP plasmid enligt tillverkarens anvisningar och skylt på Luria Bertani (LB) agar plattor som innehåller 50 μg/mL ampicillin (37 ° c).
    1. Autoklav fyra 4 L kolvar som innehåller LB-material (1,5 L Media per kolv) och 100 mL LB i en 250 mL kolv. Häll varje kolv med aluminiumfolie.
    2. Inokulera 100 mL-kulturen med en koloni av de nytransformerade bakterierna och växa vid 37 ° c med skakning (200 rpm) över natten.
    3. För att göra den CFP/YFP substrat, Inokulera fyra 4 L flaskor med 25 mL av en natt kultur. Börja skaka kulturerna vid 37 ° c och övervaka tillväxten med UV-VIS-spektroskopi vid 600 Nm per timme.
    4. När bakterierna når en absorbans av ~ 1,0 vid 600 Nm (ungefär ~ 3-4 h av tillväxt) inducera proteinuttryck genom att tillsätta 0,5 mL 1 M isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) per kolv. Efter tillsats av IPTG sänker du temperaturen på den skakande inkubatorn till 17 ° c och tillåter att uttrycket fortsätter över natten för 17-20 h.
    5. Pellets bakterierna med hjälp av en snabb centrifug på 7 000 x g i 10 min (4 ° c) och behålla pellets. Ta bort och kassera flytande media. Förvara pelletsen vid-80 ° c eller lyse omedelbart.
    6. Förbered 100 mL lyseringsbuffert som innehåller 50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 35 mL av bakteriellt protein extrahering reagens, 30 mg lysozym, 25 U DNase, och 1 proteashämmare tablett. Omsuspendera pellets i lyseringsbuffert med pipett och överför ~ 25-35 mL till 50 mL engångskoniska rör.
    7. Placera rören i en Plastbägare som innehåller isvatten. Sätt in sonikatorn spetsen i rören så att spetsen är ~ 1 cm från botten av röret och Sonikera celllysat 10-20 gånger på nivå 5 för 15 s intervall tills lysat blir flytande och flytande.
      Anmärkning: Använd hörselskydd under ultraljudsbehandling.
    8. Överför lysatet till snabba centrifugrör och centrifugera vid 20 500 x g i 30 min vid 4 ° c. Efter snurrande, Behåll supernatanten (~ 100 mL) och överför den till en ren flaska. Kassera pelletar.
    9. Bered 1 L buffert A (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl). Bered 300 mL buffert B (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazol).
    10. Equilibrate en 100 mL nickel kolumn med 3 kolumn volymer buffert A och en flödeshastighet av 5 mL/min.
    11. Fyll på lysatet på nickel-kolonnen med en flödeshastighet på 2 till 5 mL/min. Tvätta kolonnen med 2 kolumn volymer buffert A, följt av ~ 5 kolumn volymer 20% buffert B. Under den 20% buffert B tvätt, absorbans vid 280 nm (en280) kommer att öka som föroreningar eluera från kolonnen under tvätt. Fortsätt att tvätta kolonnen tills en280 av eluatet har återvänt till utgångsvärden.
    12. Eluera proteinet med 2-3 kolumn volymer på 100% buffert B med en flödeshastighet på 2-5 mL/min och samla 10 mL fraktioner. Mät A280 i varje bråk.
    13. Kombinera och koncentrera fraktioner som innehåller en280 > 0,1 med en 15 ml centrifugalultrafiltration enhet. Snurra ultrafiltrering enheter på 5 000 x g för 15 min och fortsätta att lägga bråk tills volymen har reducerats till ~ 50-75 ml.
    14. Skär en 14 tums bit dialys slang med en molekylvikt cut-off (MWCO) av 6-8 kDa. Återfukta dialys slangen genom att koka den helt nedsänkt i 300 mL vatten i 10 min. Knyt en säker Knut i ena änden av membranet. Fyll påsen med dialys buffert för att säkerställa att inga sprickor eller läckor finns. Ta bort bufferten från påsen och förvara påsen nedsänkt i dialys bufferten.
    15. Överför koncentrerat protein från 2.2.13 till dialys påsen med en plastpipett. Ta bort eventuella luftbubblor från påsen. Stäng påsen med en andra Knut eller ett dialys klipp. Dialysera proteinet mot 500 mL 50 mM Tris pH 7,6, 5 mM EDTA (etylendiamintetraättiksyra), 250 mM NaCl i en 500 mL graderad cylinder över natten vid 4 ° c.
    16. Dialysera proteinet en andra gång mot 500 mL 50 mM Tris pH 7,6 vid 4 ° c för 2 h.
  3. För anjonbörskolonnen Förbered 500 mL buffert A (50 mM Tris pH 7,6) och 500 mL buffert B (50 mM Tris pH 7,6, 1,0 M NaCl). Equilibrate en 30 mL anjonbyte kolumn med 3 kolumn volymer buffert A (2-5 mL/min).
    1. Ta bort proteinet från dialys påsen och överför till en flaska. Förvara flaskan på isen. Fyll på det dialyserade proteinet på kolonnen (2-5 mL/min).
      Anmärkning: Den gemensamma fiskeripolitiken/YFP protein kommer att binda kolonnen och kommer att vara gult i utseende.
    2. Tvätta kolonnen med buffert A tills A280 återgår till baslinjen (5 ml/min). Eluera proteinet med hjälp av en gradient (0-50% buffert B, 100 mL) och samla in 10 mL fraktioner.
    3. Undersök kolumn fraktionerna med SDS-PAGE. Kombinera dem som är > 95% ren.
    4. Koncentrera proteinet till en A280 ~ 10-20 med en 15 ml centrifugalultrafiltration enhet. Snurra koncentratorn på 4 500 x g i 10 min vid 4 ° c och fortsätt att lägga till protein tills alla proteinhaltiga fraktioner har kombinerats.
  4. Ta försiktigt bort proteinet från koncentratorn med en pipett. Alikvot proteinet i 1,5 mL microcentrifug rör och blixt frysa i flytande kväve för långtidslagring vid-80 ° c. Buffert byta proteinet vid rumstemperatur med hjälp av en PD-10 kolumn skakad med lämplig analysbuffert före användning.
  5. Med hjälp av öllagen beräknar man protein koncentrationen med hjälp av A280 och en beräknad utdöningskoefficient (t. ex. för V12-substratet ɛ = 47 790 M-1 cm-1).
    Anmärkning: Utrotningskoefficienten (ɛ) kan beräknas från proteinsekvensen i figur 4 med hjälp av ExPASy ProtParam-programmet (https://Web.ExPASy.org/protparam/).

3. beredning av Alphaviral nsP2 cystein proteas

  1. Designa och konstruera en Plasmid-kodning av proteasen. För cystein proteaser, Använd pet32 plasmid att konstruera en thioredoxin (TRX) fusionsprotein.
    Observera:Den pet32 plasmid kodar en trombin klyvning webbplats (LVPRGS) för avlägsnande av thioredoxin och hans-tagg (Figur 5). Thioredoxin hjälper till att bibehålla den aktiva webbplatsen cystein i ett reducerat tillstånd under uttrycket. För serinproteaser behövs inte tioredoxin och åtgärder som innebär att de avlägsnas med trombin kan utelämnas. Den VEEV nsP2 proteashämmare sekvens införlivades i en pet32b plasmid som var beredd kommersiellt för att undvika att hantera utvalda agenter.
    1. Nyligen omvandla plasmid DNA till BL21 (DE3) pLysS E. coli enligt tillverkarens anvisningar. Platta bakterier på LB agar plattor som innehåller ampicillin.
      Anmärkning: Kloramfenikol används endast för E. coli -stammar som bär plyss plasmid och utelämnas om BL21 (de3) celler används. Det är inte nödvändigt att inkludera kloramfenikol på LB-agarplattan i detta steg.
    2. Autoklav fyra 4 L kolvar av 1,5 L LB-media (6 L total volym) och 100 mL LB i en 250 mL kolv. Häll varje kolv med aluminiumfolie.
    3. Inokulera en 100 mL över natten kultur av LB/ampicillin med en koloni från plattan och växa i en skakning inkubator (200 rpm) vid 37 ° c.
    4. Inokulera 4 L kolvar med 25 mL av natten kulturen och Tillsätt lämplig antibiotika.
      Anmärkning: Medierna för BL21 (DE3) pLysS celler som transporterar pet32 plasmid bör ha slutliga koncentrationer av 25 μg/mL kloramfenikol och 50 μg/mL ampicillin.
    5. Inducera proteinuttryck genom att tillsätta 0,5 mL IPTG till kulturen när absorbansen vid 600 Nm når 1,0. Sänk temperaturen på den skakande inkubatorn till 17 ° c. Låt uttrycket fortsätta över natten (~ 17 h).
    6. Pelleten cellerna genom centrifugering (7 000 x g för 10 min vid 4 ° c). Ta bort och kassera vätske materialet.
      Anmärkning: Pelletsen kan förvaras vid-80 ° c i månader eller lyseras omedelbart.
    7. Bered 100 mL lyseringsbuffert (50 mM Tris pH 7,6, 500 mL NaCl, 2 mM beta merkaptoetanol (BME), 30 mg ljusozym, 5% glycerol, 25 U DNase, 35 mL bakterie protein utvinning reagens). Öppna flaskor med BME i en kemisk huva när du lägger. Håll bakterien lysat på is eller vid 4 ° c för detta och alla efterföljande steg.
      Anmärkning: För cystein proteaser, 2 mM BME ingår för att hålla den nukleofila cystein reduceras. Kolonnerna kan köras i rumstemperatur med kylda buffertar. Buffertar bör göras med kallt avjoniserat vattenkylt till 4 ° c.
    8. Omsuspendera de bakteriella pelletarna i ~ 25 mL lyseringsbuffert och överför ~ 25 mL av lysatet till 4 x 50 mL engångskoniska rör. Placera rören i Plastbägare som innehåller isvatten. Sonikera lysate 10 gånger på nivå 5 i 15 s intervaller.
    9. Överför lysatet till snabba centrifugrör. Förtydliga lysatet genom centrifugering (30 min, 20 500 x g vid 4 ° c).
    10. Bered 0,5 L buffert A (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 2 mM BME) och kyla till 4 ° c.
    11. Bered 250 mL buffert B (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 2 mM BME, 300 mM Imidazol) och kyla till 4 ° c.
    12. Equilibrate en 50 mL nickel kolonn med 3 kolumn volymer buffert A. Ladda den förtydligade lysate på kolonnen på 2-5 mL/min och kassera pelletar.
    13. Tvätta kolonnen (2-5 mL/min) med 2 kolumn volymer buffert A följt av 5 kolumn volymer buffert A som innehåller 20% buffert B (60 mM Imidazol). Eluera proteinet (5 mL/min) med 100% buffert B och samla 10 mL fraktioner.
    14. Kombinera och koncentrera fraktioner som innehåller proteasen som har en280 ≥ 0,1 med en 15 ml centrifugalultrafiltration enhet och 15 min snurrar vid 5 000 x g vid 4 ° c. Efter att volymen har reducerats till ~ 5 mL, buffertbyta proteinet i koncentrations enheten genom att tillsätta färsk dialys buffert till proteinet (50 mM Tris pH 7,6, 250 mM NaCl, 5 mM ditiothreitol (DTT), 1 mM EDTA, 5% glycerol). Snurra igen vid 5 000 x g vid 4 ° c i 15 min; Upprepa buffertutbytet steg 2-3 gånger. Tillsätt trombin till proteinet (20 μL av 1 enhet/μL) före dialys för att ta bort tioredoxin och hans-tagg.
    15. Överför proteinet till en dialys påse och dialysera mot 500 mL av dialys bufferten (4 ° c) i en 500 mL graderad cylinder över natten.
      Anmärkning: FPLC-systemet (fast proteinvätskekromatografi) och nickel-kolonnen bör rengöras grundligt med strippningsbuffert (2 M NaCl, 50 mM EDTA) innan man fortsätter till anjonbyteskolonnen. Eventuella kvarvarande nickel i FPLC-ledningarna kommer att vända buffertlösningarna som innehåller DTT Brown när de blandas. Tvätta nickel kolonnen och FPLC-systemet med 4 kolumn volymer vatten. Pumpen tvätta FPLC-systemet grundligt med vatten. Nickel kolumnen kan regenereras genom att flyta 2 kolumn volymer på 0,2 M nickelsulfat över hartset för efterföljande reningar.
  2. För anjonbörskolonnen Bered 1 L buffert A (50 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 5% glycerol).
    1. Bered 0,5 L buffert B (50 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 5% glycerol, 1,25 M NaCl).
    2. Equilibrate en 30 mL anjonbyte kolumn med buffert A (3 kolumn volymer, 2-5 mL/min). Placera rören i fraktions samlaren för uppsamling av flödet genom.
      Anmärkning: Den Veev proteashämmare har en beräknad isoelektrisk punkt (PI) av 8,7 och kommer att binda katjonbytarkolonner men kommer att flöda genom anjonbytarkolonner. PI kan beräknas från proteinsekvensen med hjälp av ExPASy ProtParam programmet (https://Web.ExPASy.org/protparam/).
    3. Späd det dialyserade proteinet 1:3 med buffert A och fyll sedan på proteinet (5 mL/min). Samla in flödet genom 10 mL fraktioner.
  3. Ta bort anjonbörskolonnen från FPLC-systemet. Anslut en katjonbytarkolonn till FPLC-systemet. Equilibrate en 30 mL katjonbytarkolonn med 3 kolumn volymer buffert A (5 mL/min).
    1. Ladda flödet genom anjonbytarkolonnen till katjonbytarkolonnen på 2-5 mL/min. Tvätta kolonnen med buffert A tills A280 återgår till baslinjenivå. Eluera proteinet med en 100 mL gradient (0-50% buffert B) och samla 10 mL fraktioner.
      Anmärkning: Den Veev proteashämmare kommer eluera på runt 0,6 M NaCl.
    2. Undersök kolumn fraktionerna med SDS-PAGE. Kombinera fraktioner som är > 95% ren och koncentrera sig till en A280 ≈ 2 med 15 ml centrifugalultrafiltration enheter. Enzymet kan frysas i flytande kväve och förvaras vid-80 ° c.

4. assaying enzymet kontinuerligt med hjälp av en Plattläsare

  1. Bered 50 mL analysbuffert (50 mM HEPES pH 7,0).
    1. Eftersom alphaviral proteaser har relativt låga kkatt värden, späd enzymet i analysbufferten till 4,7 μm (detta kommer ungefär att motsvara en A280 = 0,2 för Veev proteashämmare utan TRX).
    2. För att mäta aktiviteten av enzymet, Förbered ett lager av substrat i analysbufferten med en koncentration av 185 μM; Detta motsvarar ungefär en A280 = 9. I 8 mikrocentrifugrör förbereder du de reaktionsblandningar som visas i tabell 2 genom att kombinera lämpliga volymer av substrat lagret och bufferten på 185 μm. I en svart halv-område 96-well tallrik Pipettera 45 μL av reaktionen blandas i 3 brunnar (kolumnerna 1, 2, 3). Rad A bör innehålla reaktionsblandningen [S] = 5 μM och rad H ska innehålla reaktionsblandningen [S] = 140 μM.
    3. Ställ in plattan läsaren att upptäcka samtidigt fluorescens vid två våglängder med en fast Fotomultiplikator röret (PMT) inställning (t. ex. låg):
      Våglängd 1 excitation = 434 nm, emission = 527 nm
      Våglängd 2 excitation = 434 nm, emission = 470 nm
    4. Ställ in Läs tiden på 20 min (mäta 1 läsning per minut) och välj de brunnar som ska läsas. Sätt in plattan i plattläsaren och mät den spontana Hydrolyshastigheten i 20 min. övervaka utsläpps förhållandena (emission vid 527/emission vid 470) över tid.
    5. Kör en slutpunkt läsa av plattan som innehåller "OKLIPPT" substrat.
      Anmärkning: Dessa värden kommer att användas i efterföljande databeräkningar. Medelvärdet av emissions kvoterna från 3 brunnar kommer att vara värdena för det "OKLIPPTA" underlaget vid t = 0 i tabell 3.
    6. Ta bort plattan och Pipettera 5 μL enzym i varje brunn. Läsplattan igen i 20 minuter med 1 läsning per minut. Ställ in plattläsaren på att mata ut absoluta värden.
      Anmärkning: För denna analys, backarna kommer att vara negativ. Varje brunn kommer att innehålla en total volym på 50 μL.
    7. I slutet av läsa, täta plattan med film för att förhindra avdunstning. Lämna plattan vid rumstemperatur över natten så att enzymet kan skära substratet helt.
    8. Efter ~ 24 h, ta bort tätnings filmen och utföra en slutpunkt läsa av plattan med samma PMT som i de tidigare plattorna. Genomsnittliga dessa emissions kvoter och indata i tabell 3 under "cut". Bekräfta klyvning av underlaget med hjälp av den icke-kontinuerliga analysen av SDS-sidan som beskrivs nedan (steg 5,1.).
    9. Exportera data till ett kalkylblad. Mata ut fluorescensenheterna vid varje tidpunkt för de 2 våglängderna (tabell 4).
    10. Beräkna nmol av substrat som har skurits vid tiden t med ekvation (1) där X är emissions kvoten (527 nm/470 nm) vid en given tidpunkt, neg är emissions förhållandet för det "oklippta" substratet vid t = 0, och POS är emissions förhållandet för det helt "skurna" underlaget uppmätt efter 24 h skärning (tabell 3).



      Anmärkning: Representativa fluorescensdata visas för en brunn (brunn E7) innehållande 80 μM substrat (4 nmol av S per brunn) i tabell 4. Beräkningarna utfördes för varje brunn i plattan.
    11. För varje brunn, rita nmol vs. tid (min) och få den initiala hastigheter (sluttningar) genom att montera data till y = mx + b. För de data som samlas in 4.1.5, rita nmol kontra tid (min) för varje brunn. Lutningen kommer att motsvara nmol produkten produceras per minut. Subtrahera de spontana hydrolysfrekvenserna mätt i 4.1.5 från de enzymkatalyserade reaktions frekvenserna (tabell 5).
      Anmärkning: Den första lästa kan klippas från datan, om den är artifactually kicken på grund av rörelse av plätera in i plätera avläsaren.
    12. Beräkna mängden enzym i mg som lades till varje brunn (t. ex. 0,0009 mg). En enhet definieras som en μmol av produkten producerad per minut (μmol/min). Dela nmol/min av mg enzym som finns i brunnen för att få mU/mg; dividera med 1 000 för att få U/mg.
    13. Plot [S] μM på x-axeln och U/mg på y-axeln och passa in data till Michaelis-menten ekvation för att få VMax och Km. Detta kan göras i programvaran (t. ex. GraFit).

5. analys av enzymet med hjälp av SDS-PAGE analyser

  1. Bered en 50 μL-reaktion som innehåller 10 μM substrat och buffert i stället för enzym och etikett som "UNCUT".
    Anmärkning: Volymerna av substrat och buffert visas i tabell 2. Om den kontinuerliga analysen har körts, kan proverna användas direkt från 96-brunnen plattan.
    1. Bered en 50 μL-reaktion som innehåller 10 μM substrat och 5 μL enzym och etikett som "CUT". Starta timern när enzymet tillsätts till underlaget.
      Anmärkning: Hämmare kan tillsättas till ytterligare rör som innehåller enzym och substrat. Justera volymen av tillsatta bufferten för att kompensera för den extra volymen av inhibitor. Koncentrationer av DMSO bör inte överstiga 2%.
    2. Inkubera reaktionerna för ~ 15-24 h vid rumstemperatur (22 ± 3 ° c). Stoppa reaktionerna genom att tillsätta 50 μL 2x Laemelli buffert. Efter avslutad reaktion koka, varje tub för 3-10 min.
    3. Montera gel behållaren enligt tillverkarens anvisningar. Sätt i en 17-välgjuten 12% polyakrylamidgel kassett och en buffertdamm på den andra sidan. Fyll insidan reservoar av cellen med 1x SDS löpbuffert tills bufferten når toppen av kassetten. Fyll den externa behållaren halvfull med samma buffert.
    4. För att analysera klyvning med den diskontinuerliga analysen, Fyll på 5 μL av varje reaktionsblandning i en körfält på en gel med SDS-sida som börjar med den "OKLIPPTA" reaktionen. Inkludera en molekylvikt markör i den första eller sista körfältet.
    5. Fäst elektrodernas elektroder på strömförsörjningen och separera produkterna på 110 V i 60 min. ta bort gelen från kassetten genom att sätta in sprickverktyget i mellan plattorna. Placera gelen i en plastbricka och dränera gelen i 5-10 mL gel färgning lösning; band kommer att synas inom 30 min. Efter 1-24 timmar ta bort överflödig fläck, dränera gelen i vatten och använda en gel Imager att ta en bild av gelen.

6. dockningssubstrat peptider till VEEV-nsP2 cystein-proteas

  1. Ladda ner koordinatfilen för VEEV cystein proteashämmare från det preliminära budgetförslaget (https://www.rcsb.org/). Den PDB koden är 2HWK. Spara filen som 2HWK. pdb.
    1. Förbered proteinstrukturen med hjälp av MOE (https://www.chemcomp.com/). Ladda proteinet PDB filen till MOE. Klicka på Välj och lösningsmedel på höger sida bar och ta bort lösningsmedlet.
    2. Öppna struktur förberedelse panelen från det övre menyfältet protein. Automatiskt korrigera alla strukturella objekt genom att klicka på rätt och protonate strukturen genom att klicka på Protonate3D. Lägg till partiella laddningar till proteinet genom att öppna panelen del avgifter och välja Amber 99 och Justera hydrogener och ensamma par efter behov. Spara slutligen struktur filen som "2HWK_dock. pdb".
  2. Bygga strukturen för substrat peptider (nsP12, nsP23, nsP34) och TRIM14 med hjälp av MOE. Öppna panelen protein Builder, ange substratsekvensen, ange geometrin som utökad och klicka på Skapa. Strukturen kommer att visas i MOE fönstret.
    1. Minimera peptid strukturen genom att klicka på minimera på panelen. Spara strukturen som en PDB-fil (figur 6).
  3. Docka substrat peptider till VEEV-nsP2 med hjälp av PyRx/AutoDock 4,2 (http://autodock.Scripps.edu/). Öppna verktyget PyRx, redigera inställningen, inaktivera alla torsions för ligand beredning. Fyll på substrat molekylen, högerklicka på molekyl namnet på panelen Navigator, Välj gör ligand för att förbereda ligand-dockningsfilen. Ladda proteinet 2HWK_clean. pdb och välj Skapa makromolekyl för att förbereda docknings filen för pdbqt (figur 7).
    1. Starta Autodockningsguiden på docknings panelen längst ned. Välj de förberedda ligand och proteinfilerna. Definiera proteinbindnings fickan genom att manuellt justera rutnäts dimensionen som är centrerad vid det katalytiska restmaterialet CYS-477. Använda standard avstånds parametern 0,375 Å. Klicka på Kör AutoGrid för att generera rutnäts kartor.
    2. Kör autodock och välj metoden Lamarckian genetisk algoritm (LGA). Klicka på docknings parametrarna och ange antalet ga-körningar till 50. Använd standardparametrarna för andra. Klicka på vidarebefordra för att starta docknings körningen.
    3. Öppna panelen analysera resultat . Inspektera alla förväntade bindning poser. Välj den bästa modellen med den lägsta förväntade bindningen energi och rimliga bindande interaktioner mellan CYS-477 och substrat på klyvning platsen. Spara bindnings modellen som PDB-fil för ytterligare MD-simuleringar.

7. MD-simuleringar av dockade VEEV-substrat komplex

  1. Förbered indatafilerna med Amber (http://ambermd.org/). Efter standardprotokollet utförs MD-simuleringar för de förutspådda substrat bindnings modellerna med AMBER-paketet och ff99SB Force-fältet.
    Anmärkning: De solvatiserade systemen genomgår en grundlig energiminimering före MD-simuleringar. Periodiska randvillkor tillämpas för att simulera ett kontinuerligt system. Partikel mesh Ewald (PME) metod användes för att beräkna långväga elektrostatiska interaktioner. Det simulerade systemet först utsattes för en gradvis temperaturökning från 0 k till 300 K över 100 PS, och sedan skakad för 500 PS på 300 K, följt av produktion körningar av 2 ns längd totalt.
    1. Kör simulerings jobbet på en högpresterande datoranläggning. Våra simuleringar kördes på Biowulf Cluster (https://HPC.NIH.gov/) (figur 8).
    2. Visualisera utdata från förloppet med hjälp av VMD-programmet (http://www.KS.uiuc.edu/Research/VMD/). Analysera bindningsinteraktioner och kon Formations förändringar av substrat och TRIM14 inom det aktiva området nsP2 (figur 9).

Representative Results

SSHHPS analys av ZIKV ns2B/3 proteas identifierade 4 värd protein mål: FOXG1, SFRP1, en Gs alfa-subenhet från en retinal cDNA bibliotek, och NT5M mitokondrie 5 ', 3 '-nukleotidase (figur 10)6. Särskilt, ingen annan metod förutspådde dessa proteiner som potentiella mål för ZIKV proteas. Mutationer i FOXG1-genen har kopplats till ett medfött syndrom som kännetecknas av försämrad utveckling och strukturella störningar i hjärnan såsom mikrocefali. SFRP1 är ett utsöndras Frizzled-relaterat protein (SFRP); dessa lösliga receptorer kan konkurrenskraftigt binda WNT ligander att motverka och hämma WNT signalering. Den WNT signalering vägen är involverad i regleringen av IFN svar under flavivirus infektion36. Klyvning av SFRP1 skulle förväntas förbättra och replikering. SFRP1 är också involverad i Th17-celldifferentiering37. Sekvensanpassningar av SSHHPS visade artspecifika skillnader i klyvning webbplatssekvens (figur 10D). Klyvning webbplats sekvens i SFRP1 var identisk hos människor och kycklingar; ZIKV kan framkalla dödlighet och mikrocefali i kyckling embryon38. I gnagare ersätts den mycket bevarade P1-återstoden (K/R) R ↓ G med en glycin (RGG). Immunkompetenta stammar av möss är i allmänhet resistenta mot ZIKV infektion och sjukdom39.

Steady state kinetiska parametrar och hämning konstanter kan mätas för viral polyproteinsekvenser och för värden proteinsekvenser med hjälp av kontinuerlig analys i en tallrik läsare31,40,41 (figur 11a). För kvalitativ klyvning, till exempel klyvning av en viss sekvens eller hämning av proteas av olika föreningar, kan den diskontinuerliga analysen användas (figur 11B).

Det kan krävas optimering av antalet restsubstanser mellan den gemensamma fiskeripolitiken och YFP. En substrat bunden modell kan göras med hjälp av in silico metoder. En representativ dockad modell av korsningen nsP1/nsP2 visas i figur 9. För VEEV nsP2 proteas hade klyvning av en 12-Amino Acid Semliki Forest virus (SFV) sekvens rapporterats (Km = 0,58 mM)33. Att förlänga substrat ordningen till 19, 22 och 25 rester och minska den joniska styrkan hos bufferten ledde till en signifikant minskning av Km. Undersökning av VEEV nsP2 kristallstruktur och kristall packning visade också att en del av en av korsningar var packad mot proteashämmare domänen och var spiralformade. Därför kan de längre VEEV-substrat binda bättre på grund av erkännandet av ett sekundärt konstruktions motiv.

För TRIM14 erhöll vi ett Km = 21 μm6,33. Km för underlaget som bär värd proteinsekvensen var jämförbar med km -värdena för de substrat som innehåller de virala polyproteinklyvningssekvenserna (km(V12) = 12 μm och km(V34) = 21 μm). Den klyvning webbplats sekvenser på nsP1/nsP2, nsP2/nsP3, och nsP3/nsP4 korsningar klipptes med olika effektivitetsvinster. I cellen, detta är tänkt att möjliggöra sekventiell klyvning av polyprotein42.

Försiktighet bör iakttas vid tolkning av negativa resultat. Om ingen klyvning inträffar kan klyvnings platsen vara för kort eller så kan den renade proteasen vara inaktiv. För substrat som skärs, behövs ytterligare experiment för att bekräfta klyvning av full längd protein eller klyvning i virusinfekterade celler. Lämpliga uppföljningsexperiment bör väljas. Effekterna av överuttryck eller Tystning av målproteinet på virusreplikation kan också testas.

Figure 1
Figur 1: tre dämpnings metoder. Ljuddämpning kan förekomma på DNA-, RNA-eller proteinnivå. Dessa "Sök och ta bort" algoritmer varje använder ett "nyckelord" för att styra klyvning av en fil som innehåller ordet. Denna siffra har modifierats från Morazzani et al.32 och referenserna däri. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: artspecifika skillnader i webbplatsekvenser för klyvning. C-terminalen PRY/Spry domäner TRIM14 homologer visas i justeringen. Den PRY/SPRY domän kan identifieras genom bevarade motiv markerade i grått. Human TRIM14 skärs vid QEAGA ↓ G av VEEV nsP2 cystein proteas. SSHHP-sekvensen visas i färg. Restmaterialet i grönt är P1-rester. i blått är P4-rester, och i rött finns andra bevarade rester inom klyvning webbplats motiv sekvens. Equine Harbor en stympad version av TRIM14 saknar PRY/SPRY domän. Den lysin markeras i cyan är Poly-ubiquitinated och är viktigt för montering av MAVS signalosome. C-terminalen PRY/SPRY domän kan vara transitivt skära av nsP2 proteashämmare att försämra värdens antivirala svar intracellulärt under en akut virusinfektion. I Equine är denna domän alltid frånvarande. Detta tyder på att PRY/SPRY domän TRIM14 kan ha en skyddande funktion mot VEEV infektioner. Denna siffra har reproducerats från Morazanni et al.6vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: SSHHPS identifiering med blast. Den klyvning webbplats motiv sekvens vid VEEV nsP1/nsP2 korsningen är i linje med SSHHP sekvensen i Host protein TRIM14. Återstoden färgade i grönt är P1 restsubstanser; i blått är P4 rester och i rött är andra bevarade rester av klyvning webbplats motiv sekvens. De flesta anpassningar innehöll homologi till regioner utanför det bevarade klyvningsområdet eller omfattade inte P1/P1 ' scissile Bond-rester. TRIM14 visade en matchning till 6 rester i sekventiell ordning som inkluderade P1 och P1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: protein och DNA-sekvenser av den gemensamma fiskeripolitiken-V12-YFP substrat för VEEV nsP2 cystein proteas. Restriktionssajterna NdeI (CATATG) och XhoI (CTCGAG) visas med versaler. I rött är klyvning webbplatssekvens från viral polyprotein som är i mellan nsP1 och nsP2. Återstoden i grönt är P1 restprodukt och i blått är P4 rester av klyvning platsen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: proteinsekvens av TRX-VEEV-nsP2 cystein proteas konstruera. Tioredoxin (TRX) visas i gult. Den trombin klyvning webbplats och hans-tagg visas i cyan. CYS-hans dyad är märkta i rött. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: peptid strukturer i Moe. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: dockning av substrat peptid med PyRx/autodock. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: jobb som körs på Biowulf-klustret. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: modell av VEEV P12-substrat som innehåller klyvningsplatssekvens vid nsP1/nsP2-korsningen. CYS-477/his-546 katalytisk dyad visas i blått. Figur gjordes med pymol (https://pymol.org). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: SSHHPS-analys av zikaviruset ns2B/Ns3-proteas. (A) förväntade värd protein mål för Zikv ns2B/NS3-proteasen. Rester i rött matchar en enda klyvning webbplatssekvens. Rester i grönt tolereras på under platsen och matchar rester vid andra klyvning platser. SFRP1 hade det högsta antalet identiska rester i ordningsföljd. (B) CFP-substrat-yfp-proteiner (~ 50-60 kDa) uttrycktes och renades innehållande den förutspådda sshhp-sekvensen från varje värd protein (human). Den zikv proteashämmare klippa Human FOXG1, SFRP1, NT5M och en Gsalfa subenhet isolerade från en retinal cDNA bibliotek. Klyvning produkterna är cirka 28-30 kDa. Underlaget sekvenser finns i morazzani et al.6 (C) medan ns2B/NS3 proteas skära SFRP1, det inte klippa sina homologer (SFRP2 och SFRP4). Danpassning av klyvningssajter från olika djurarter kan vara användbar vid val av en djurmodell för ett grupp IV-virus. Observera att den bevarade R ↓ G-sekvensen skiljer sig mellan människor och gnagare i SFRP1. Figur återges från Morazzani et al.6vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11: steady state kinetisk analys med kontinuerliga och diskontinuerliga analyser. Ade kinetiska data som visas i tabell 5 har ritades i GraFit. Den infälld visar Lineweaver-burk tomt. B) gel av SDS-Page som visar klyvningsprodukterna i den gemensamma fiskeripolitiken-V12-yfp-substrat. I Lane 1 är "UNCUT" substrat (48 kDa). I Lane 2 är "CUT" substrat (31 kDa och 27 kDa). I Lanes 3-9 ingick olika föreningar för att testa deras hämmande aktivitet. Lane 4 innehåller E64d kovalent hämmare. Dessa reaktioner kördes över natten för ~ 17 h vid rumstemperatur. Kokande av proverna krävdes för att uppnå skarpa ränder mönster. Den nsP2 proteasen är synlig (56 kDa) i de reaktioner som innehåller enzymet, men inte i Lane 1. Lane 1 är "No enzym"-kontrollen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Sekvens-specifik förstörelse av ett protein eller en nukleinsyra styrs av en utländsk sekvens ses endast i ett fåtal fall i biologi. Mekanismerna som visas i figur 1 är defensiva mekanismer som skyddar en värd från ett virus, eller ett virus från en värd.

Med hjälp av bioinformatiska metoder kan vi identifiera de mål som förstörs av dessa system. I våra analyser av SSHHP sekvenser upptäckte vi att många av dem kunde hittas i proteiner som behövs för att generera medfödda immunsvar. Vissa hade uppenbara roller som Mavs och TRIF (TIR-domän-innehållande adapter-inducerande interferon-β), medan andra var relaterade till immunitet men mer komplexa mekanismer (t. ex., histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Målinformationen som lagras i SSHHP-sekvensen har potential att identifiera vägar som har antivirala effekter mot dessa virus. Antivirala svar in vivo är ofta virusspecifika26,43. Till exempel, delmängder av trim proteiner har antiviral effekter på olika virus43,44,45, vissa är virus begränsning faktorer (t. ex., hiv och TRIM5α). Specificiteten hos trim proteiner (~ 70 har identifierats) fortfarande undersöks44,45. Informationen inom SSHHPS kan bidra till vår förståelse av hur dessa virus kringgå det medfödda immunsvaret. Andra mönster och korrelationer kan avslöjas som mer SSHHPS undersöks.

Artspecifika skillnader var uppenbara i våra analyser (figur 2, figur 10). Dessa virus är kända för att påverka vissa arter mer än andra. Information om värd omfång, värdmottaglighet och värd försvar kan förekomma inom SSHHPS. Till exempel, Equine, de mest mottagliga arter till Equine encefalit virus, saknade den region av Human TRIM14 som var transitivt skuren av VEEV nsP2 proteas. Människor dör sällan från VEEV infektioner men kan infekteras24. Human TRIM14 proteinet bar en nsP2 proteas klyvning sekvens6. Närvaron av klyvning webbplats tyder på att människor har en försvarsmekanism mot dessa virus. Fåglar har tros vara potentiella reservoarer av dessa virus46. Motsvarande SSHHP sekvens i TRIM14 protein från kycklingar skilde sig från de sekvenser som finns i människor och andra arter. Subtila skillnader som dessa kan göra ett mål värd protein uncleavable eller mer lätt klyvs. Aguirre et al.16 visade att en uncleavable MUTERAT String protein inducerade högre nivåer av IFN efter denguefeber infektion och att möss naturligtvis bära en version av STING som inte skärs av Dengue ns2B3 proteas. Det murina STING proteinet klipptes inte av ZIKV-proteasen47. I vår SSHHPS-analys observerade vi också skillnader i ZIKV proteashämmare-klyvningssekvenserna när vi jämförde människans proteiner med de hos gnagare6 (figur 10D). Reproduktion av artspecifika proteolytiska klyvning av värd proteiner kan vara viktigt i djurmodeller som används för grupp IV virus. Hämning av Host protein klyvning har också konsekvenser när det gäller utvecklingen av grupp IV proteashämmare. I vår tidigare publikation visade vi att vi kunde hämma TRIM14 klyvning av VEEV nsP2 proteas med CA074 metylester6. Detta resultat tyder på att små molekyler hämmare av dessa proteaser kan kunna modulera den medfödda immunsvar som kan undertrycka infektionen6,31.

Genetisk variation inom en art har också potential att producera skillnader i proteolytisk klyvning. Subtila skillnader i kodon användning kan påverka ribosom pausa48. Eftersom vissa grupp IV virala proteaser är inbäddade i ER-membranet, kan skillnader i dessa pauser påverka klyvning av ett mål om klyvning sker samtranslationellt. Några av de klyvning webbplatser som vi identifierade var i förväntad signal peptid sekvenser (t. ex., SFRP1) medan andra var interna.

SSHHPS analys kan producera information som skiljer sig från andra metoder för värd protein analyser. SSHHPS analys var billig och lätt att anställa. Användningen av ett bakteriellt uttrycks system tillät testning av korta segment (~ 25 aminosyror) av däggdjurs sekvenser utan användning av däggdjurscell kulturer. Vi konstaterade att den gemensamma fiskeripolitiken-YFP-substrat kunde tolerera alla testade humana proteinsekvenser; avkastningen varierade dock. I liknande analyser, substrat som innehåller mänskliga proteinsekvenser så länge som 63 aminosyror var framgångsrikt uttryckt, renas, och utnyttjas för kinetiska analyser och inhibitor screening49,50,51. Eftersom endast små mängder av substratet behövs för den diskontinuerliga analysen, kan ett stort antal mål utforskas. En fördel med systemet är att den gemensamma fiskeripolitiken/YFP-substrat kan användas för SDS-PAGE analyser och för mer avancerade kinetiska analyser (dvs. IC50, ki, km, VMax). För läkemedels upptäckt, inhibitoriska föreningar kan producera artefakter i fluorescerande analyser. Sålunda, den diskontinuerliga analysen i kombination med en kontinuerlig analys tillåter en att bekräfta klyvning eller hämning av klyvning. Proverna för den diskontinuerliga SDS-PAGE-analysen kan tas direkt ur plattorna 96-well. CFP/YFP-substrat har använts för sammansatt biblioteks screening52. Emellertid, ytterligare analyser krävs för att avgöra om ett substrat är lämplig för hög genomströmning screening såsom beräkning av en Z-faktor53.

En utmaning i utformningen av ett substrat är att identifiera regionen runt scissile Bond som är bunden och erkänd av proteasen. I exemplen som visas här, började vi med 12 rester sekvenser som var centrerad kring scissile Bond. Efter att ha analyserat sekvens anpassningar av klyvning platser homologi till rester N-terminalen av scissile Bond hittades för Veev proteashämmare, medan för zikv proteashämmare homologi till flera av C-terminalen rester hittades. En in silico modell av det dockade underlaget kan användas för att utforma platsriktade mutagenes experiment som sond bindningsställen av underlaget. Eftersom substrat och enzymsekvenser är på plasmider, antingen kan muteras för att testa i silico modeller eller under plats toleranser. Detta kan vara fördelaktigt om en kristallstruktur av det bundna underlaget (s) inte är tillgänglig.

SSHHPS analys kan också ge ny information om de mekanismer genom vilka virusinducerade fenotyper produceras av virala enzymer. En av de zikv mål, SFRP1, är en del av WNT signalvägen och har roller i både hjärna och ögon utveckling och i immunsvar36,37,54,55,56,57. Vi fann att de andra proteinsekvenser som skulle kunna skäras av ZIKV ns2B/NS3 proteashämmare var också i proteiner inblandade i hjärnans och ögats utveckling; avvikelser i båda har observerats i medfött zika syndrom och tros vara en del av den virusinducerade fenotyp58.

Förutsägbarheten för interaktioner mellan värd och patogener kan utnyttjas för en mängd olika tillämpningar: målspecifika onkolytiska virus terapier. de-riskera levande virusvacciner; förfining, förutsägelse eller urval av djurmodeller; förutsägelse av värd-spänna eller mottaglighet; Prediktion av zoonotiska händelser. och Prediktion av Host-försvar. Eftersom metoderna som beskrivs är sekvensbaserade, kan de vara av värde att införliva i programvara i framtiden.

Disclosures

Åsikterna uttryckte här är de av författarna och föreställer inte de av US-marinen, US-armé, US-departement av försvar, eller US-regeringen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Defense Threat minskning Agency (DTRA) projektnummer CB-SEED-SEED09-2-0061 och CBCall4-CBM-05-2-0019, och delvis av intramural/Extramural forskningsprogram av NCATS, NIH (XH) och marin forskning laboratorie bas fonder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL Erlenmeyer Flask VWR 89000-362
2-mercaptoethanol Acros Organics (Fisher) 125472500 Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.
4 L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap Millipore Sigma CLS49954L-1EA
AKTA Prime Plus GE Healthcare 17-0729-01
AKTA XK 16/20 Column GE Healthcare 28988937
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC501096
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC901096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC801024
Ampicillin Sigma A0166 Danger: Allergic reactions (skin or breathing).
Chelating Sepharose Fast Flow GE Healthcare 17-0575-02 Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.
Chloramphenicol RPI C61000 Danger: May cause cancer.
Corning 50 mL centrifuge tubes Corning 430828 Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface Corning 3993
Dialysis Tubing Clips Fisher Scientific PI68011
Disposable PD-10 Desalting Column GE Healthcare 17-0851-01
DNAse Sigma DN25-1G
DTT (DL-Dithiothreitol) RPI D11000-50.0 Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation
EDTA Fisher Scientific S311-500
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
Glycerol Acros Organics (Fisher) 15892-0010
HEPES Millipore Sigma H4034-1KG
Imidazole Acros Organics 301870010 Danger: Toxic, Irritant
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) Calbiochem (Millipore Sigma) 420291 Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.
Laemmli Sample Buffer BIO-RAD 1610737
Luria Bertani Agar Fluka (Millipore Sigma) L3027-1KG Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.
Luria Bertani Media Fisher Bioreagents BP1426-2
Lysozyme Sigma L4919-5g
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box BIO-RAD
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes Nalgene (Thermo Scientific) 3119-0050
Nanodrop Thermo Fisher
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator Eppendorf M1335
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific N73-500 Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C600003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C606003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
pet15b plasmid DNA Novagen (Millipore Sigma) 69661 GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.
pet32b Novagen (Millipore Sigma) 69016-3 The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free Thermo Fisher A32955 Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage
Plate Reader Molecular Devices Model M5
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard BIO-RAD 161-0373
Protein Extraction Reagent Novagen (Millipore Sigma) 70584-4 BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)
Q-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0510-01 Anion exchange resin
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels Expedeon BCG01227 Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used
RunBlue 20x SDS Running Buffer Expedeon NXB50500 Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x
RunBlue Instant Blue Gel Stain Expedeon ISB1L Do not dilute, use as directed
Sodium Chloride Fisher Chemical S271-10
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator Branson Ultrasonics (VWR) Model No. 101-063-346R Sonicator was used on level 5
Spectra/Por 6-8 kD MWCO Spectrum Labs 132645T Dialysis Tubing
SP-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0729-01 Cation exchange resin
Thrombin from bovine plasma Sigma T6634-500UN
Tris Base Fisher Scientific BP152-500 Caution: Eye/Skin Irritant

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, H., et al. Widespread Horizontal Gene Transfer from Double-Stranded RNA Viruses to Eukaryotic Nuclear Genomes. Journal of Virology. 84, (22), 11876-11887 (2010).
  2. Hagai, T., Azia, A., Babu, M. M., Andino, R. Use of host-like peptide motifs in viral proteins is a prevalent strategy in host-virus interactions. Cell Reports. 7, (5), 1729-1739 (2014).
  3. Gorbalenya, A. E. Host-related sequences in RNA viral genomes. Seminars in Virology. 3, 359-371 (1992).
  4. Shmakov, S. A., et al. The CRISPR Spacer Space Is Dominated by Sequences from Species-Specific Mobilomes. MBio. 8, (5), 1-18 (2017).
  5. Legler, P. M., Morazzani, E., Glass, P. J., Compton, J. R. Proteome Editing System and A Biomarker of Veev Infection. United States patent application. (2018).
  6. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  7. Alvarez, E., Castello, A., Menendez-Arias, L., Carrasco, L. HIV protease cleaves poly(A)-binding protein. Biochemical Journal. 396, (2), 219-226 (2006).
  8. Falk, M. M., et al. Foot-and-mouth disease virus protease 3C induces specific proteolytic cleavage of host cell histone H3. Journal of Virology. 64, (2), 748-756 (1990).
  9. Grigera, P. R., Tisminetzky, S. G. Histone H3 modification in BHK cells infected with foot-and-mouth disease virus. Virology. 136, (1), 10-19 (1984).
  10. Li, W., Ross-Smith, N., Proud, C. G., Belsham, G. J. Cleavage of translation initiation factor 4AI (eIF4AI) but not eIF4AII by foot-and-mouth disease virus 3C protease: identification of the eIF4AI cleavage site. FEBS Letters. 507, (1), 1-5 (2001).
  11. Kuyumcu-Martinez, M., et al. Calicivirus 3C-like proteinase inhibits cellular translation by cleavage of poly(A)-binding protein. Journal of Virology. 78, (15), 8172-8182 (2004).
  12. Pietila, M. K., Hellstrom, K., Ahola, T. Alphavirus polymerase and RNA replication. Virus Research. 234, 44-57 (2017).
  13. Hardy, W. R., Strauss, J. H. Processing the nonstructural polyproteins of sindbis virus: nonstructural proteinase is in the C-terminal half of nsP2 and functions both in cis and in trans. Journal of Virology. 63, (11), 4653-4664 (1989).
  14. Strauss, E. G., De Groot, R. J., Levinson, R., Strauss, J. H. Identification of the active site residues in the nsP2 proteinase of Sindbis virus. Virology. 191, (2), 932-940 (1992).
  15. Wang, D., et al. Foot-and-mouth disease virus 3C protease cleaves NEMO to impair innate immune signaling. Journal of Virology. 86, (17), 9311-9322 (2012).
  16. Aguirre, S., et al. DENV inhibits type I IFN production in infected cells by cleaving human STING. PLoS Pathogens. 8, (10), e1002934 (2012).
  17. Barral, P. M., Sarkar, D., Fisher, P. B., Racaniello, V. R. RIG-I is cleaved during picornavirus infection. Virology. 391, (2), 171-176 (2009).
  18. Elbashir, S. M., Lendeckel, W., Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Development. 15, (2), 188-200 (2001).
  19. Deveau, H., Garneau, J. E., Moineau, S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annual Review of Microbiology. 64, 475-493 (2010).
  20. Schechter, I., Berger, A. On the size of the active site in proteases I. Papain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 27, (2), 157-162 (1967).
  21. Bieniasz, P. D. Intrinsic immunity: a front-line defense against viral attack. Nature Immunology. 5, (11), 1109-1115 (2004).
  22. Zhou, Z., et al. TRIM14 is a mitochondrial adaptor that facilitates retinoic acid-inducible gene-I-like receptor-mediated innate immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 111, (2), E245-E254 (2014).
  23. Wang, S., et al. TRIM14 inhibits hepatitis C virus infection by SPRY domain-dependent targeted degradation of the viral NS5A protein. Scientific Reports. 6, 32336 (2016).
  24. Zacks, M. A., Paessler, S. Encephalitic alphaviruses. Veterinary Microbiology. 140, (3-4), 281-286 (2010).
  25. Hollidge, B. S., Weiss, S. R., Soldan, S. S. The role of interferon antagonist, non-structural proteins in the pathogenesis and emergence of arboviruses. Viruses. 3, (6), 629-658 (2011).
  26. Carthagena, L., et al. Human TRIM gene expression in response to interferons. PLoS One. 4, (3), e4894 (2009).
  27. Montgomery, S. A., Johnston, R. E. Nuclear import and export of Venezuelan equine encephalitis virus nonstructural protein 2. Journal of Virology. 81, (19), 10268-10279 (2007).
  28. Nenasheva, V. V., et al. Enhanced expression of trim14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunologic Research. 62, (3), 255-262 (2015).
  29. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, (1), 87-90 (2002).
  30. Li, M. Z., Elledge, S. J. SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in Molecular Biology. 852, 51-59 (2012).
  31. Hu, X., et al. Kinetic, Mutational, and Structural Studies of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Nonstructural Protein 2 Cysteine Protease. Biochemistry. 55, (21), 3007-3019 (2016).
  32. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  33. Zhang, D., Tozser, J., Waugh, D. S. Molecular cloning, overproduction, purification and biochemical characterization of the p39 nsp2 protease domains encoded by three alphaviruses. Protein Expression and Purification. 64, (1), 89-97 (2009).
  34. Lei, J., et al. Crystal structure of Zika virus NS2B-NS3 protease in complex with a boronate inhibitor. Science. 353, (6298), 503-505 (2016).
  35. Shiryaev, S. A., et al. Characterization of the Zika virus two-component NS2B-NS3 protease and structure-assisted identification of allosteric small-molecule antagonists. Antiviral Research. 143, 218-229 (2017).
  36. Smith, J. L., Jeng, S., McWeeney, S. K., Hirsch, A. J. A MicroRNA Screen Identifies the Wnt Signaling Pathway as a Regulator of the Interferon Response during Flavivirus Infection. Journal of Virology. 91, (8), (2017).
  37. Lee, Y. S., et al. The Wnt inhibitor secreted Frizzled-Related Protein 1 (sFRP1) promotes human Th17 differentiation. European Journal of Immunology. 42, (10), 2564-2573 (2012).
  38. Goodfellow, F. T., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells and Development. 25, (22), 1691-1697 (2016).
  39. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91, (8), (2017).
  40. Morazzani, E. M., et al. Books of Abstracts, 254th American Chemical Society National Meeting. Washington, D.C. (2017).
  41. Compton, J. R., Mickey, M. J., Hu, X., Marugan, J. J., Legler, P. M. Mutation of Asn-475 in the Venezuelan Equine Encephalitis Virus nsP2 Cysteine Protease Leads to a Self-Inhibited State. Biochemistry. 56, (47), 6221-6230 (2017).
  42. Vasiljeva, L., et al. Regulation of the sequential processing of Semliki Forest virus replicase polyprotein. Journal of Biological Chemistry. 278, (43), 41636-41645 (2003).
  43. Uchil, P. D., Quinlan, B. D., Chan, W. T., Luna, J. M., Mothes, W. TRIM E3 ligases interfere with early and late stages of the retroviral life cycle. PLoS Pathogens. 4, (2), e16 (2008).
  44. Ozato, K., Shin, D. M., Chang, T. H., Morse, H. C. 3rd TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity. Nature Reviews Immunology. 8, (11), 849-860 (2008).
  45. van Tol, S., Hage, A., Giraldo, M. I., Bharaj, P., Rajsbaum, R. The TRIMendous Role of TRIMs in Virus-Host Interactions. Vaccines (Basel). 5, (3), (2017).
  46. Molaei, G., et al. Dynamics of Vector-Host Interactions in Avian Communities in Four Eastern Equine Encephalitis Virus Foci in the Northeastern U.S. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, (1), e0004347 (2016).
  47. Ding, Q., et al. Species-specific disruption of STING-dependent antiviral cellular defenses by the Zika virus NS2B3 protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 115, (27), E6310-E6318 (2018).
  48. Angov, E., Legler, P. M., Mease, R. M. Adjustment of codon usage frequencies by codon harmonization improves protein expression and folding. Methods in Molecular Biology. 705, 1-13 (2011).
  49. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Analytical Biochemistry. 411, (2), 200-209 (2011).
  50. Hu, X., et al. Structural insight into exosite binding and discovery of novel exosite inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A through in silico screening. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28, (7), 765-778 (2014).
  51. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Applied and Environmental Microbiology. 78, (21), 7687-7697 (2012).
  52. Nguyen, T. G., et al. Development of fluorescent substrates and assays for the key autophagy-related cysteine protease enzyme ATG4B. Assay and Drug Development Technologies. 12, (3), 176-189 (2014).
  53. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, (2), 67-73 (1999).
  54. Bovolenta, P., Esteve, P., Ruiz, J. M., Cisneros, E., Lopez-Rios, J. Beyond Wnt inhibition: new functions of secreted Frizzled-related proteins in development and disease. Journal of Cell Science. 121, (Pt 6), 737-746 (2008).
  55. Esteve, P., et al. SFRPs act as negative modulators of ADAM10 to regulate retinal neurogenesis. Nature Neuroscience. 14, (5), 562-569 (2011).
  56. Garcia-Hoyos, M., et al. Evaluation of SFRP1 as a candidate for human retinal dystrophies. Molecular Vision. 10, 426-431 (2004).
  57. Marcos, S., et al. Secreted frizzled related proteins modulate pathfinding and fasciculation of mouse retina ganglion cell axons by direct and indirect mechanisms. Journal of Neuroscience. 35, (11), 4729-4740 (2015).
  58. Moore, C. A., et al. Characterizing the Pattern of Anomalies in Congenital Zika Syndrome for Pediatric Clinicians. JAMA Pediatrics. 171, (3), 288-295 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics