Analyse af gruppe IV-virale SSHHP'ER ved anvendelse af in vitro-og silico-metoder

Immunology and Infection
 

Summary

Vi præsenterer en generel protokol til at identificere korte strækninger af homologe Host-patogen protein sekvenser (SSHHPS) indlejret i viral polyprotein. SSHHPS er anerkendt af virale proteaser og direkte den målrettede ødelæggelse af specifikke Host proteiner af flere gruppe IV vira.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hu, X., Compton, J. R., Legler, P. M. Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods. J. Vis. Exp. (154), e60421, doi:10.3791/60421 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Alfa virale enzymer syntetiseres i et enkelt polypeptid. Det ikke-strukturelle polyprotein (nsP) behandles af dets nsP2 cystein proteasehæmmere for at producere aktive enzymer, der er essentielle for viral replikation. Virale proteaser er meget specifikke og genkender bevaret spaltningen motiv sekvenser (~ 6-8 aminosyrer). I flere gruppe IV vira, den nsP protease (s) spaltning site Motif sekvenser kan findes i specifikke vært proteiner involveret i at generere den medfødte immunrespons og, i nogle tilfælde, de målrettede proteiner synes at være knyttet til den virus-induceret fænotype. Disse vira udnytter korte strækninger af homologe vært-patogen protein sekvenser (SSHHPS) for målrettet destruktion af Host proteiner. For at identificere SSHHPS kan de virale proteasespaltende motiv sekvenser indlægges i BLAST, og der kan søges efter værts genom (s). Spaltning i første omgang kan testes ved hjælp af renset nsP viral proteasehæmmere og fluorescens resonans energioverførsel (FRET) substrater fremstillet i E. coli. FRET-substrater indeholder cyan og gult fluorescerende protein og spaltningen på sprækken (CFP-sekvens-YFP). Denne proteaseanalyse kan anvendes kontinuerligt i en plade læser eller diskontoert i SDS-side gels. Modeller af de bundne peptidsubstrater kan genereres i silico for at vejlede substrat udvælgelse og mutagenese undersøgelser. Den fælles fiskeripolitiks/YFP-substrater er også blevet udnyttet til at identificere proteasehæmmere. Disse in vitro-og silico-metoder kan anvendes i kombination med cellebaserede analyser for at afgøre, om det målrettede værts protein påvirker viral replikation.

Introduction

Tegn på horisontal genoverførsel fra virus til vært, eller vært for virus, kan findes i en række genomer1,2,3,4. Eksempler på viral endogenization er CRISPR spacer sekvenser fundet i bakteriel Host genomer4. For nylig har vi fundet tegn på host protein sekvenser indlejret i materialer polyproteiner af (+) ssrna gruppe IV vira. Disse sekvenser inden for kodnings områderne af det virale genom kan udbredes generationelt. De korte strækninger af homologe Host-patogen protein sekvenser (sshhps) findes i virus og vært5,6. SSHHPS er de bevaret spaltningen motiv sekvenser anerkendt af virale proteaser, der har homologi til specifikke Host proteiner. Disse sekvenser direkte ødelæggelse af specifikke Host proteiner.

I vores tidligere publikation6udarbejdede vi en liste over alle de værts proteiner, der var rettet mod virale proteaser, og fandt ud af, at listen over mål ikke var tilfældig (tabel 1). To tendenser var tydelige. For det første tilhørte størstedelen af de virale proteaser, der afskårne værts proteiner, gruppe IV-vira (24 ud af 25 tilfælde involverede gruppe IV viral proteaser), og en proteasehæmmere tilhørte (+) ssRNA gruppe VI retrovira (HIV, humant immundefektvirus)7. For det andet var værts protein målene, der blev skåret af de virale proteaser, generelt involveret i at generere de medfødte immunresponser, der antyder, at spalten var beregnet til at antagonisere værtens immunrespons. Halvdelen af de værts proteiner, som de virale proteaser var rettet mod, var kendte bestanddele af signal kaskader, der genererer interferon (IFN) og proinflammatoriske cytokiner (tabel 1). Andre var involveret i Host Cell transkriptionen8,9,10 eller oversættelse11. Interessant, Shmakov et al.4 har vist, at mange crispr protospacer sekvenser svarer til gener, der er involveret i plasmid konjugering eller replikation4.

Gruppe IV omfatter blandt andet Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae og Togaviridae. Flere nye og spirende patogener tilhører gruppe IV, såsom zikavirus (ZIKV), West Nile (WNV), Chikungunya (CHIKV), svær Akut respiratorisk syndrom virus (SARS) og Mellemøsten respiratorisk syndrom virus (MERS). Den (+) ssRNA genom er hovedsagelig et stykke mRNA. For at producere de enzymer, der er nødvendige for genom-replikation, skal (+) ssrna-genom først oversættes. I alfa vira og andre gruppe IV-vira produceres de enzymer, der er nødvendige for replikation, i et enkelt polyprotein (dvs. nsP1234 for VEEV). Det ikke-strukturelle polyprotein (nsP) er proteolytisk behandlet (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) af den nsP2 proteasehæmmere til fremstilling af aktive enzymer12 (figur 1). Spaltning af polyprotein af nsP2 proteasehæmmere er afgørende for viral replikation; Dette er blevet påvist ved sletning og site-instrueret mutagenese af den aktive site cystein af nsP2 proteasehæmmere13,14. Især oversættelse af virale proteiner går forud for genomreplikation hændelser. For eksempel indeholder nsP4 den RNA-afhængige RNA-polymerase, der er nødvendig for at replikere (+) ssRNA-genomet. Genome-replikation kan producere dsRNA-mellemprodukter; disse mellemprodukter kan udløse værtens medfødte immunrespons. Således, disse vira kan Kløve vært medfødte immunrespons proteiner tidligt i infektion for at undertrykke deres virkninger15,16,17.

Der kan opstå lyddæmpnings niveauer for DNA, RNA og protein. Det, der er fælles for hver af de lyddæmpnings mekanismer, som er vist i figur 1 , er, at korte fremmede DNA-, RNA-eller protein sekvenser bruges til at styre ødelæggelsen af specifikke mål for at antagonisere deres funktion. Lyddæmpnings mekanismerne er analoge med "Søg og slet"-programmer, der er skrevet på tre forskellige sprog. Den korte spaltnings sidesekvens er analog med et "nøgleord". Hvert program har et enzym, der genkender match mellem den korte sekvens ("søgeord") og et ord i "fil", der skal slettes. Når en kamp er fundet, enzymet nedskæringer ("sletter") den større mål sekvens. De tre mekanismer, der er vist i figur 1 , bruges til at forsvare værten mod virus eller til at forsvare en virus mod en værts's immunsystem.

Virale proteaser genkende kort spaltning site Motif sekvenser mellem ~ 2-11 aminosyrer; i nukleotider svarer dette til 6-33 baser. Til sammenligning er crispr spacer-sekvenser ~ 26-72 nukleotider og RNAi er ~ 20-22 nukleotider18,19. Mens disse sekvenser er relativt korte, kan de genkendes specifikt. I betragtning af den højere mangfoldighed af aminosyrer, sandsynligheden for en tilfældig spaltning begivenhed er relativt lav for en viral proteasehæmmere genkende protein sekvenser af 6-8 aminosyrer eller længere. Forudsigelsen af SSHHP'ER i værts proteiner vil i høj grad afhænge af specificiteten af den virale proteasehæmmere, der undersøges. Hvis proteasen har strenge sekvens specificitetskrav, er chancen for at finde en kavaler plads sekvens 1/206 = 1 i 64.000.000 eller 1/208 = 1 i 25.600.000.000; de fleste proteaser har dog variable underordnet websted tolerancer (f. eks. kan R eller K tolereres på S1-stedet). Derfor er der ingen krav om sekvens identitet mellemsekvenser fundet i værten versus virus. For virale proteaser, der har løsere sekvens krav (såsom dem, der tilhører Picornaviridae) sandsynligheden for at finde en spaltning sted i en Host protein kan være højere. Mange af posterne i tabel 1 er fra Picornaviridae -familien.

Schechter & Berger notation20 er almindeligt anvendt til at beskrive rester i et proteasesubstrat og de underordnede websteder, som de binder, vi udnytter denne notation hele vejen igennem. Restkoncentrationerne i substratet, der er N-terminal for scissile-obligationen, betegnes som P3-P2-P1, mens de, der er C-terminal, betegnes som P1'-P2'-P3. De tilsvarende underordnede steder i proteasen, der binder disse aminosyre rester, er henholdsvis S3-S2-S1 og S1'-S2'-S3.

For at afgøre, hvilke Host proteiner der målrettes, kan vi identificere SSHHPS i de virale polyproteinkavaler områder og søge efter de værts proteiner, der indeholder dem. Heri skitserer vi procedurer for identificering af SSHHPS ved hjælp af kendte virale proteasespaltningen. De bioinformatiske metoder, proteaseassays og de beskrevne silico-metoder er beregnet til brug sammen med cellebaserede assays.

Sekvens justeringer af værts proteinerne, som er målrettet mod virale proteaser, har afsløret artsspecifikke forskelle inden for disse korte spaltnings sekvenser. For eksempel, den venezuelanske equin encephalitis virus (VEEV) nsP2 proteasehæmmere blev fundet at skære menneskelige TRIM14, en treparts motiv (TRIM) protein6. Nogle TRIM proteiner er viral restriktion faktorer (f. eks TRIM5α21), de fleste menes at være ubiquitin E3 ligaser. TRIM14 mangler en RING (virkelig interessant nyt gen) domæne og menes ikke at være en E3 ubiquitinligase22. TRIM14 er blevet foreslået at være en adapter i mitokondrie antiviral signalosome (MAVS)22, men kan have andre antivirale funktioner23. Justering af TRIM14 sekvenser fra forskellige arter viser, at Equine mangler kavaler pladsen og havnen en trunkeret version af TRIM14, der mangler C-Terminal PRY/SPRY domæne. Dette domæne indeholder et polyubiquitination-websted (figur 2). I Equine, disse vira er meget dødelig (~ 20-80% dødelighed) hvorimod hos mennesker kun ~ 1% dør fra VEEV infektioner24. Spaltning af PRY/SPRY domæne kan forbigående kortslutning MAVS signalering Cascade. Denne kaskade kan udløses af dsRNA og fører til produktion af interferon og pro-inflammatoriske cytokiner. Således kan tilstedeværelsen af SSHHPS være nyttig til at forudsige, hvilke arter der har forsvarssystemer mod specifikke gruppe IV vira.

I gruppe IV vira menes IFN antagonisme mekanismer at være multiplicere redundante25. Host protein spaltning kan være forbigående under infektion og koncentrationer kan restituere sig over tid. Vi fandt i celler, der TRIM14 spaltning produkter kunne påvises meget tidligt efter transfektering (6 h) med en plasmid kodning proteasehæmmere (Cytomegalovirus promotor). I længere perioder blev spaltningen dog ikke påvist. I virusinficerede celler, kinetikken var forskellige og spaltning produkter kunne påvises mellem 6-48 h6. Andre har rapporteret udseendet af Host protein spaltning produkter så tidligt som 3-6 h post infektion9,11.

Proteolytisk aktivitet i celler er ofte vanskeligt at fange; spaltning produkter kan variere i deres opløselighed, koncentration, stabilitet, og levetid. I cellebaserede analyser kan det ikke antages, at spaltningen vil ophobes i en celle, eller at bånd intensiteterne for skåret og ubeskåret protein vil vise kompenserende stigninger og fald, da det afskårne protein kan nedbrydes meget hurtigt og ikke kan påvises i en Western blot ved en forventet molekylvægt (MW) (f. eks. den region, der indeholder epitop kunne spaltet af andre vært proteaser eller kunne være allestedsnærværende). Hvis substratet for den virale proteasehæmmere er et medfødte immunrespons protein, kan dets koncentration variere under infektion. For eksempel er nogle medfødte immunrespons proteiner til stede før virus infektion og induceres yderligere af interferon26. Koncentrationen af målproteinet kan derfor svinge under infektion og sammenligning af ikke-inficerede vs. inficerede celle lysater kan være vanskeligt at fortolke. Derudover kan alle celler ikke være ensartet transficeret eller inficeret. In vitro proteaseassays ved hjælp af renset proteiner fra E. coli på den anden side har færre variabler for at kontrollere og sådanne analyser kan gøres ved hjælp af SDS-side snarere end immunoblots. Kontaminerende proteaser kan hæmmes i de tidlige trin af protein rensningen af den fælles fiskeripolitiks/YFP-substratet, og muterede virale proteaser kan renses og testes som kontrol for at afgøre, om spalningen skyldes den virale proteasehæmmere eller en forurenende bakteriel proteasehæmmere.

En begrænsning af in vitro proteaseassays er, at de mangler kompleksiteten af en pattedyrscelle. For et enzym til at skære sit substrat, skal de to være co-lokaliseret. Gruppe IV virale proteaser adskiller sig i struktur og lokalisering. For eksempel er zikv proteasehæmmere indlejret i endoplasmatiske reticulum (er) membranen og vender mod cytosol, mens veev nsP2 proteasehæmmere er et opløseligt protein i cytoplasmaet og Nucleus27. Nogle af spaltningen site sekvenser fundet i ZIKV SSHHPS analyse var i signal peptider tyder på, at spaltning kan forekomme Co-translationelt for nogle mål. Således skal placeringen af proteasen og substratet i cellen også tages i betragtning i disse analyser.

Cellebaserede analyser kan være værdifulde for at fastslå en rolle for de identificerede værts proteiner i infektionen. Metoder, der har til formål at standse viral proteasespaltning af værts proteiner, såsom tilsætning af en proteasehæmmer6 eller en mutation i værts målet16 , kan anvendes til at undersøge deres virkninger på viral replikation. Over ekspression af det målrettede protein kan også påvirke viral replikation28. Plaque-assays eller andre metoder kan anvendes til at kvantificere viral replikation.

Protocol

1. bioinformatik: identifikation af SSHHP'ER i værts genomet ved hjælp af BLAST

Bemærk: Protein BLAST kan findes på blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

  1. Input ~ 20 aminosyrer omkring scissile obligation i viral polyprotein. Vælg ikke-overflødige protein sekvenser, og skriv det værts genom, der skal søges i (f. eks. homo sapiens).
    1. Vælg om nødvendigt PHI-BLAST. Type i en mønster sekvens (f. eks, for de 25 rester af V12 vist nedenfor indtaste mønsteret "AG" uden anførselstegn).



      Bemærk: I PHI-BLAST indikerer firkantede parenteser [XY], at aminosyre X eller Y kan være på det underordnede websteds position (f. eks. AG [AC] [GAY]).
    2. Undersøg BLAST resultaterne, og Identificer de hits, der har en høj sekvens identitet, til rester, der bevares i polyproteinspaltningen (f. eks. treparts motiv protein 14) (figur 3).
      Bemærk: For Serin-proteaser forventes en højere bevaring af P1-restkoncentrationer, mens der for cystein-proteaser forventes en højere bevaring af P2-restkoncentrationer.
    3. Farve de rester, der er identiske med en spaltning site sekvens og er i rækkefølge (ingen huller). Farve rester tolereret på det underordnede websted, men til stede i en anden spaltning sted i en anden farve.
      Bemærk: Rester, der repræsenterer konservative substitutioner (f. eks. Leu vs. Val), som ikke findes i en viral spaltning, kan også findes og kan eller ikke kan genkendes af viral protease.
    4. Rangorden BLAST hits baseret på antallet af fortløbende identiske eller tolererede rester, der matcher en spaltning site sekvens. Vælg de proteiner, der indeholder ≥ 6 identiske eller lignende rester til analyse i proteaseassays, på listen.
    5. Gentag proceduren for de andre spaltning (nsP2/3, nsP3/4, etc.) og gradvist styrke forudsigelse ved at tilføje mere stærkt bevaret rester til PHI-BLAST mønster.

2. in vitro-assays: designe og forberede Proteasesubstrater

  1. Konstruere en plasmid kodning af cyan fluorescerende protein (FFP), ≤ 25 aminosyrer af kavaler pladsen sekvens, efterfulgt af den gule fluorescerende protein (YFP, også kendt som Venus29).
    Bemærk: Plasmid kan konstrueres ved hjælp af sekvens og ligering uafhængig kloning (SLIC)30 eller kommerciel gen syntese. En pet15b plasmid indeholdende sekvensen vist i figur 4 blev syntetiseret kommercielt og blev brugt her.
    1. For at optimere substrat længde, konstruere yderligere variabel længde FRET substrater indeholdende 12-25 aminosyrer af de naturlige virale polyprotein spaltning site sekvenser ved hjælp af en 2-fragment SLIC reaktion. Analysér spaltning ved hjælp af SDS-SIDERS gel-baseret analyse eller ved at måle Steady State kinetiske parametre ved hjælp af metoderne nedenfor.
      Bemærk: I nogle tilfælde kan kavaler steder identificeres ved homologi til kendte kavaler steder31. Hvis spaltning af substrater, der indeholder polyproteinsamlings sekvenser, ikke overholdes, kan der være et krav om yderligere rester eller et strukturelt motiv (f. eks. en alpha Helix32). Alternativt kan den rensede virale proteasehæmmere være inaktiv. Bekræft spaltning af de virale polyprotein sekvenser, før du forfølger SSHHPS-analyse. Antallet af rester i substratet blev optimeret til VEEV proteasehæmmere ved hjælp af variable længde substrater (12 til 25 aminosyrer) efterfulgt af analyse af VMax og Km32,33. De Zika viral ns2B/NSB proteasehæmmere spaltning steder, der anvendes i eksemplerne er blevet offentliggjort34,35.
  2. Klargør den fælles fiskeripolitiks/YFP-substrater ved nyomdannelse af 8-20 μL BL-21 (DE3)E. colikompetente celler med den fælles fiskeripolitik-V12-YFP plasmid ifølge producentens anvisninger og plade på Luria Bertani (LB) agar plader indeholdende 50 μg/mL ampicillin (37 °C).
    1. Autoklave fire 4 L kolber indeholdende LB-medier (1,5 L medier pr. kolbe) og 100 mL LB i en 250 mL kolbe. Hætte hver kolbe med aluminiumsfolie.
    2. 100 mL kulturen inokuleres med en koloni af de nytransformerede bakterier og vokser ved 37 °C med omrystning (200 rpm) natten over.
    3. For at gøre den fælles fiskeripolitik/YFP substrat, inokulere fire 4 L kolber med 25 mL af en overnight kultur. Begynd at ryste kulturerne ved 37 °C og Overvåg væksten med UV-Vis-spektroskopi ved 600 nm hver time.
    4. Når bakterierne når en absorbans på ~ 1,0 ved 600 nm (ca. ~ 3-4 h vækst) inducerer protein ekspression ved tilsætning af 0,5 mL 1 M isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) pr. kolbe. Efter tilsætning af IPTG, Sænk temperaturen af ryste inkubator til 17 °C og lad ekspression fortsætte natten over for 17-20 h.
    5. Pellet bakterierne ved hjælp af en højhastigheds centrifuge ved 7.000 x g i 10 min (4 °c) og fastholde pellets. Fjern og kassér flydende medier. Træpillerne opbevares ved-80 °C eller lyse med det samme.
    6. 100 mL lysis-buffer, der indeholder 50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 35 mL bakterielt protein ekstraktions reagens, 30 mg Lysozym, 25 e DNase og 1 proteasehæmmer tablet, skal forberedes. Resuspension pellets i lysis buffer med en pipette og overføre ~ 25-35 mL til 50 mL engangs koniske rør.
    7. Anbring rørene i et plastikbæger, der indeholder isvand. Indsæt sonikator spidsen i rørene, så spidsen er ~ 1 cm fra bunden af røret og soniker lysaterne 10-20 gange på niveau 5 i 15 s intervaller, indtil lysatet bliver flydende og flydende.
      Bemærk: Brug høreværn under sonikering.
    8. Lyatet overføres til centrifugerør med høj hastighed og centrifugeres ved 20.500 x g i 30 minutter ved 4 °c. Efter spin, fastholde supernatanten (~ 100 mL) og overføre den til en ren flaske. Kassér pellets.
    9. Forbered 1 L buffer A (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl). Forbered 300 mL buffer B (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol).
    10. En 100 mL nikkel søjle ækvibrere med 3 kolonne volumener af buffer A og en strømningshastighed på 5 mL/min.
    11. Læg lysatet på nikkel søjlen ved hjælp af en strømningshastighed på 2 til 5 mL/min. vask kolonnen med 2 kolonne volumener af buffer A, efterfulgt af ~ 5 kolonne volumener på 20% buffer B. Under 20% buffer B-vask vil absorbansen ved 280 Nm (A280) stige, når kontaminanter elueret fra søjlen under vask. Fortsæt med at vaske kolonnen, indtil en280 af eluatet er vendt tilbage til baselineværdier.
    12. Elute proteinet med 2-3 kolonne volumener på 100% buffer B ved hjælp af en strømningshastighed på 2-5 mL/min og saml 10 mL fraktioner. Mål A280 for hver fraktion.
    13. Kombiner og koncentrer fraktioner indeholdende en280 > 0,1 ved hjælp af en 15 ml centrifugal ultrafiltrationsenhed. Drej ultrafiltrations enhederne ved 5.000 x g i 15 minutter, og Fortsæt med at tilføje fraktioner, indtil volumenet er blevet reduceret til ~ 50-75 ml.
    14. Skær et 14 tommer stykke dialyse slange med en molekylvægt cut-off (MWCO) på 6-8 kDa. Du skal Hydrere dialyse slangen ved at koge den helt nedsænket i 300 mL vand i 10 min. binde en sikker knude i den ene ende af membranen. Fyld posen med dialyse buffer for at sikre, at der ikke er revner eller lækager til stede. Fjern bufferen fra posen og hold posen nedsænket i dialyse bufferen.
    15. Overfør det koncentrerede protein fra 2.2.13 til dialyse posen med en plastik pipette. Fjern eventuelle luftbobler fra posen. Luk posen med en anden knude eller en dialyse clips. Dialysere proteinet mod 500 mL af 50 mM Tris pH 7,6, 5 mM EDTA (ethylenediaminetetraeddikesyre), 250 mM NaCl i en 500 mL gradueret cylinder natten over ved 4 °C.
    16. Dialysere proteinet en anden gang mod 500 mL 50 mM Tris pH 7,6 ved 4 °C i 2 timer.
  3. For anionbytnings kolonnen klargør 500 mL buffer A (50 mM Tris pH 7,6) og 500 mL buffer B (50 mM Tris pH 7,6, 1,0 M NaCl). En 30 mL anionudvekslings kolonne med 3 kolonne volumener af buffer A (2-5 mL/min).
    1. Fjern proteinet fra dialyse posen, og overfør det til en flaske. Hold flasken på is. Læg det dialyserede protein på søjlen (2-5 mL/min).
      Bemærk: Den fælles fiskeripolitik/YFP-protein binder kolonnen og vil være gul i udseende.
    2. Kolonnen vaskes med buffer A, indtil A280 vender tilbage til baseline (5 ml/min). Elute proteinet ved hjælp af en gradient (0-50% buffer B, 100 mL) og indsamle 10 mL fraktioner.
    3. Undersøg kolonne brøker ved hjælp af SDS-PAGE. Kombiner dem, der er > 95% ren.
    4. Koncentrer proteinet til en A280 ~ 10-20 ved hjælp af en 15 ml centrifugal ultrafiltrationsenhed. Drej koncentratoren på 4.500 x g i 10 minutter ved 4 °c, og Fortsæt med at tilføje protein, indtil alle de protein-holdige fraktioner er blevet kombineret.
  4. Fjern forsigtigt proteinet fra koncentratoren med en pipette. Alikvot proteinet til 1,5 mL mikrocentrifuge glas og flamme frysning i flydende nitrogen til langtidsopbevaring ved-80 °C. Buffer ombytter proteinet ved stuetemperatur ved hjælp af en PD-10-kolonne, der er ækvibreret med den relevante analyse buffer før brug.
  5. Ved hjælp af Ølret beregnes proteinkoncentrationen ved hjælp af A280 og en beregnet ekstinktionskoefficient (f. eks. for V12-substratet ɛ = 47.790 M-1 cm-1).
    Bemærk: Udslettelses koefficienten (ɛ) kan beregnes ud fra protein sekvensen i figur 4 ved hjælp af det Expasy ProtParam-program (https://Web.expasy.org/protparam/).

3. fremstilling af den Alfa virale nsP2 cystein protease

  1. Design og konstruere en plasmid kodning protease. For cystein proteaser skal du bruge pet32 plasmid til at konstruere et thioredoxin (TRX) fusionsprotein.
    Bemærk:Pet32 plasmid koder en thrombin spaltning site (LVPRGS) for fjernelse af thioredoxin og hans-tag (Figur 5). Thioredoxin vil hjælpe med at opretholde det aktive site cystein i en reduceret tilstand under ekspression. For serinproteaser er thioredoxin ikke nødvendig, og trin, der involverer dets fjernelse af thrombin, kan udelades. VEEV nsP2 proteasesekvensen blev indarbejdet i et pet32b plasmid, der blev fremstillet kommercielt for at undgå håndtering af udvalgte agenter.
    1. Frisk omdanne plasmid-DNA til BL21 (DE3) pLysS E. coli i henhold til producentens anvisninger. Bakterier på LB agar plader indeholdende ampicillin.
      Bemærk: Chloramphenicol anvendes kun til E. coli -stammer, der bærer plyss plasmid og udelades, hvis BL21 (DE3) celler anvendes. Det er ikke nødvendigt at inkludere chloramphenicol på LB-agar pladen i dette trin.
    2. Autoclave fire 4 L kolber af 1,5 L LB-medier (6 L total volumen) og 100 mL LB i en 250 mL kolbe. Hætte hver kolbe med aluminiumsfolie.
    3. Inokulere en 100 mL overnight kultur af LB/ampicillin med en koloni fra pladen og vokse i en ryste inkubator (200 rpm) ved 37 °C.
    4. De 4 L kolber med 25 mL af natkulturen og tilsæt passende antibiotika.
      Bemærk: Medierne for BL21 (DE3) pLysS celler, der bærer pet32 plasmid bør have endelige koncentrationer af 25 μg/mL chloramphenicol og 50 μg/mL ampicillin.
    5. Inducerer protein ekspression ved at tilsætte 0,5 mL IPTG til kulturen, når absorbansen ved 600 nm når 1,0. Sænk temperaturen på ryste inkubator til 17 °C. Tillad, at udtrykket fortsættes natten over (~ 17 timer).
    6. Cellerne ved centrifugering (7.000 x g i 10 minutter ved 4 °c). Fjern og kassér det flydende medie.
      Bemærk: Pellets kan opbevares ved-80 °c i måneder eller lyseres straks.
    7. Forbered 100 mL lyse buffer (50 mM Tris pH 7,6, 500 mL NaCl, 2 mM beta mercaptoethanol (BME), 30 mg Lysozym, 5% glycerol, 25 U DNase, 35 mL bakteriel protein ekstraktions reagens). Åbn flasker af BME i en kemisk hætte, når du tilføjer. Opbevar det bakterielle lysat på is eller ved 4 °C for dette og alle efterfølgende trin.
      Bemærk: For cystein proteaser er 2 mM BME inkluderet for at holde den nukleofile cystein reduceret. Kolonnerne kan køres ved stuetemperatur ved hjælp af afkølede buffere. Buffere skal laves med kold deioniseret vand afkølet til 4 °C.
    8. De bakterielle pellets opslæmmes i ~ 25 mL lysis-buffer og overføres ~ 25 mL af lysatet til 4 x 50 mL engangs koniske rør. Anbring rørene i plastikbægre, der indeholder isvand. Soniker lysatet 10 gange på niveau 5 i 15 s intervaller.
    9. Overfører lysatet til centrifugerør med høj hastighed. Præcis lysatet ved centrifugering (30 min., 20.500 x g ved 4 °c).
    10. Forbered 0,5 L buffer A (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 2 mM BME) og chill til 4 °C.
    11. Forbered 250 mL buffer B (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 2 mM BME, 300 mM imidazol) og Afkøl til 4 °C.
    12. Ækvibrere en 50 mL nikkel søjle med 3 kolonne volumener af buffer A. Læg det afklarede lysør på søjlen ved 2-5 mL/min og kassér pillerne.
    13. Kolonnen (2-5 mL/min) vaskes med 2 kolonne volumener af buffer A efterfulgt af 5 kolonne volumener af buffer A indeholdende 20% buffer B (60 mM imidazol). Elute proteinet (5 mL/min) med 100% buffer B og saml 10 mL fraktioner.
    14. Kombiner og koncentrer fraktioner indeholdende proteasehæmmere, der har en280 ≥ 0,1 ved hjælp af en 15 ml centrifugal ultrafiltrationsenhed og 15 min spins ved 5.000 x g ved 4 °c. Efter at volumenet er blevet reduceret til ~ 5 ml, udveksler bufferen proteinet i koncentrations enheden ved at tilføje frisk dialyse buffer til proteinet (50 mm Tris pH 7,6, 250 mm NaCl, 5 mm ditiotreitol (DTT), 1 mm EDTA, 5% glycerol). Spin igen ved 5.000 x g ved 4 °c i 15 min; Gentag buffer udvekslings trinnet 2-3 gange. Tilsæt Trombin til proteinet (20 μL af 1 enhed/μL) før dialyse for at fjerne thioredoxin og hans-tag.
    15. Proteinet overføres til en dialysepose og dialyserer mod 500 mL dialyse buffer (4 °C) i en 500 mL måle cylinder natten over.
      Bemærk: FPLC-systemet (fast protein Liquid kromatografi) og nikkel søjlen skal rengøres grundigt med stripping buffer (2 M NaCl, 50 mM EDTA), før der fortsættes til anionbytnings søjlen. Enhver rest nikkel i FPLC-linjerne vil vende de bufferopløsninger, der indeholder DTT Brown, når de blandes. Vask nikkel søjlen og FPLC-systemet med 4 kolonne volumener af vand. Pumpen vaskes FPLC-systemet grundigt med vand. Nikkel søjlen kan regenereres ved at flyde 2 kolonne volumener på 0,2 M nikkelsulfat over harpiksen til efterfølgende rensninger.
  2. For anionbytnings kolonnen klargør 1 L buffer A (50 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 5% glycerol).
    1. Forbered 0,5 L buffer B (50 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 5% glycerol, 1,25 M NaCl).
    2. En 30 mL anionbytnings kolonne med buffer A (3 kolonne volumener, 2-5 mL/min) ækvibrere. Placer rørene i fraktionen samler til opsamling af strømmen igennem.
      Bemærk: VEEV proteasehæmmere har et beregnet isoelektrisk punkt (pI) på 8,7 og vil binde kation-udvekslings kolonner, men vil flyde gennem anionudvekslings kolonner. PI kan beregnes ud fra protein sekvensen ved hjælp af det Expasy ProtParam program (https://Web.expasy.org/protparam/).
    3. Det dialyserede protein 1:3 fortyndes med buffer A, og derefter indlæses proteinet (5 mL/min). Saml gennemstrømningen i 10 mL fraktioner.
  3. Fjern anionbytnings kolonnen fra FPLC-systemet. Tilslut en kation udvekslings kolonne til FPLC-systemet. En 30 mL kation udvekslings kolonne med 3 kolonne volumener af buffer A (5 mL/min).
    1. Indlæs gennemstrømningen i anionbytnings kolonnen på kation udvekslings kolonnen ved 2-5 mL/min. vask kolonnen med buffer A, indtil A280 vender tilbage til Oprindelig plan. Elute proteinet med en 100 mL gradient (0-50% buffer B) og saml 10 mL fraktioner.
      Bemærk: VEEV proteasehæmmere vil eluere omkring 0,6 M NaCl.
    2. Undersøg kolonne brøker ved hjælp af SDS-PAGE. Kombiner fraktioner, der er > 95% ren, og Koncentrer dig til en A280 ≈ 2 ved hjælp af 15 ml centrifugal ultrafiltrationsenheder. Enzymet kan opfryses i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C.

4. assaying enzymet kontinuerligt ved hjælp af en plade læser

  1. Forbered 50 mL analyse buffer (50 mM HEPES pH 7,0).
    1. Da de alfa virale proteaser har relativt lave k-katværdier , fortyndes enzymet i analyse bufferen til 4,7 μM (dette vil groft svare til en A280 = 0,2 for veev proteasehæmmere uden TRX).
    2. For at måle aktiviteten af enzymet, forberede en bestand af substrat i analyse bufferen med en koncentration på 185 μM; Dette vil nogenlunde svare til en A280 = 9. I 8 mikrocentrifuge glas forberedes de reaktionsblandinger, der er vist i tabel 2 , ved at kombinere passende volumener af 185 μM substrat bestand og buffer. I et sort halvt område 96-brønd plade pipet 45 μL af reaktionen blandes i 3 brønde (kolonne 1, 2, 3). Række A skal indeholde [S] = 5 μM-reaktionsblandingen, og række H skal indeholde [S] = 140 μM-reaktionsblandingen.
    3. Indstil plade læseren til samtidig at detektere fluorescens ved to bølgelængder med en fast indstilling for fotomultiplier (PMT) (f. eks. lav):
      Bølgelængde 1 excitation = 434 nm, emission = 527 nm
      Bølgelængde 2 excitation = 434 nm, emission = 470 nm
    4. Indstil læsetiden til 20 min (måling af 1 læst pr. minut), og vælg de brønde, der skal læses. Læg pladen i plade læseren, og mål den spontane hydrolysehastighed i 20 min. Overvåg emissions ratioen (emission ved 527/emission ved 470) over tid.
    5. Kør et endepunkt læsning af pladen, der indeholder det "USKÅRNE" substrat.
      Bemærk: Disse værdier vil blive brugt i efterfølgende data beregninger. Gennemsnittet af emissions ratioen fra 3 brønde vil være værdierne af "UBESKÅRET" substrat ved t = 0 i tabel 3.
    6. Fjern pladen og pipet 5 μL enzym i hver brønd. Læs pladen igen i 20 minutter med 1 læst pr. minut. Indstil plade læseren til at udsende absolutte værdier.
      Bemærk: Til denne analyse vil skråningerne være negative. Hver brønd vil indeholde et samlet volumen på 50 μL.
    7. I slutningen af læse, forsegle pladen med film for at forhindre fordampning. Lad pladen være ved stuetemperatur natten over for at gøre det muligt for enzymet at skære substratet helt.
    8. Efter ~ 24 h, Fjern tætnings filmen og Udfør et endepunkt læsning af pladen med samme PMT som i de tidligere plader. Gennemsnitlige disse emissions forhold og input til tabel 3 under "cut". Bekræft spaltning af substratet ved hjælp af SDS-side diskontinuert assay beskrevet nedenfor (trin 5,1.).
    9. Eksporter dataene til et regneark. Udstille fluorescens enhederne ved hvert tidspunkt for de 2 bølgelængder (tabel 4).
    10. Beregn nmol af substrat, der er blevet skåret på tidspunktet t ved hjælp af ligning (1), hvor X er emissionsforholdet (527 nm/470 nm) på et givet tidspunkt, neg er emissionsforholdet for "ubeskåret" substrat ved t = 0, og pos er emissionsforholdet for det fuldstændigt "cut" substrat målt efter 24 timers skæring (tabel 3).



      Bemærk: Repræsentative fluorescens data vises for en brønd (brønd E7), der indeholder 80 μM substrat (4 nmol af S pr. brønd) i tabel 4. Beregningerne blev udført for hver brønd i pladen.
    11. For hver brønd, plot nmol vs. tid (min) og få de indledende hastigheden (skråninger) ved at tilpasse dataene til y = MX + b. For data indsamlet i 4.1.5, plot nmol vs. tid (min) for hver brønd. Hældningen vil svare til det producerede nmol-produkt pr. minut. De spontane hydrolyse rater, målt i 4.1.5, trækkes fra de enzym katalyserede reaktions rater (tabel 5).
      Bemærk: Den første læsning kan klippes fra dataene, hvis det er kunstnerisk højt på grund af bevægelsen af pladen i pladen læseren.
    12. Beregn mængden af enzym i mg, der blev tilsat til hver brønd (f. eks. 0,0009 mg). En enhed defineres som en μmol produkt produceret pr. minut (μmol/min). Del nmol/min med den mg enzym, som er til stede i brønden for at opnå mU/mg; divideres med 1.000 for at opnå U/mg.
    13. Plot [S] μM på x-aksen og U/mg på y-aksen og passe dataene til Michaelis-Menten ligningen for at opnå VMax og Km. Dette kan gøres i softwaren (f. eks. GraFit).

5. assaying enzymet Diskontoert ved hjælp af SDS-Sideanalyse

  1. Forbered en 50 μL reaktion indeholdende 10 μM substrat og buffer i stedet for enzym og etiket som "UNCUT".
    Bemærk: Mængden af substrat og buffer er vist i tabel 2. Hvis den kontinuerlige analyse er kørt, kan prøverne anvendes direkte fra 96-brønd pladen.
    1. Forbered en 50 μL reaktion indeholdende 10 μM substrat og 5 μL enzym og etiket som "CUT". Start timeren, når enzymet tilsættes til substratet.
      Bemærk: Hæmmere kan tilsættes til yderligere rør, der indeholder enzym og substrat. Juster mængden af tilsat buffer for at kompensere for den ekstra volumen af inhibitor. Koncentrationer af DMSO bør ikke overstige 2%.
    2. Reaktionerne for ~ 15-24 h ved stuetemperatur (22 ± 3 °C) inkubates. Stop Reaktionerne ved at tilføje 50 μL 2x Laemelli buffer. Efter standsning af reaktionen koge, hvert rør til 3-10 min.
    3. Geltanken samles i henhold til producentens anvisninger. Indsæt en 17-brønden præ-støbt 12% polyacrylamid gel kassette og en buffer dæmning på den anden side. Fyld den indvendige beholder af cellen med 1x SDS løbe buffer indtil bufferen når toppen af kassetten. Fyld det udvendige reservoir halvt fyldt med den samme buffer.
    4. For at analysere spaltning ved hjælp af diskontinuerlig analyse, belastning 5 μL af hver reaktionsblanding i en vognbane af en SDS-side gel begyndende med "UBESKÅRET" reaktion. Medtag en molekylvægt markør i den første eller sidste bane.
    5. Fastgør gel-tankens elektroer til strømforsyningen, og Adskil produkterne med 110 V i 60 min. Fjern gelen fra kassetten ved at indsætte kraknings værktøjet mellem pladerne. Gelen placeres i en plastik bakke, og gelen nedsænkes i 5-10 mL gel-farvningsopløsning. bands vil være synlige inden for 30 min. Efter 1-24 timer Fjern den overskydende plet, Nedsænk gelen i vand og brug en gel Imager til at tage et billede af gelen.

6. docking-substrat peptider til VEEV-nsP2 cystein protease

  1. Download koordinat filen for veev cystein proteasehæmmere fra FBF (https://www.rcsb.org/). FBF-koden er 2HWK. Gem filen som 2HWK. PDB.
    1. Forbered proteinstrukturen med MOE (https://www.chemcomp.com/). Indlæs filen med protein FBF i MOE. Klik på Vælg og opløsningsmiddel i højre sidebjælke og slette opløsningsmidlet.
    2. Åbn panelet for struktur klargøring fra det øverste menulinje protein. Automatisk korrigere alle strukturelle elementer ved at klikke på korrekt og protonate strukturen ved at klikke på Protonate3D. Tilføj delvise ladninger til proteinet ved at åbne delopladninger og vælge ravgult 99 og justere hydrogener og enlige par efter behov. Endelig gemme struktur filen som "2HWK_dock. FBF".
  2. Byg strukturen for substrat peptider (nsP12, nsP23, nsP34) og TRIM14 ved hjælp af MOE. Åbn panelet protein Builder, Indtast substrat sekvensen, Indstil geometrien som udvidet, og klik på Byg. Strukturen vil blive vist i MOE vindue.
    1. Minimer peptidstrukturen ved at klikke på Minimer på panelet. Gem strukturen som en PDB-fil (figur 6).
  3. Fastgør substrat peptider til VEEV-nsP2 ved hjælp af PyRx/AutoDock 4,2 (http://autodock.Scripps.edu/). Åbn pyrx værktøj, redigere præference indstilling, inaktivere alle vridninger for ligand forberedelse. Indlæs substrat molekyle, Højreklik på molekyle navnet på Navigator panelet, Vælg gør ligand for at forberede ligand docking-filen. Indlæs proteinet 2HWK_clean. PDB, og vælg Make Macro olecule for at forberede pdbqt-dockingfilen (figur 7).
    1. Start guiden Autodock i dockingpanelet nederst. Vælg de forberedte ligand og protein filer. Definer den proteinbindende lomme ved manuelt at justere gitter dimensionen, som er centreret ved de katalytiske rester cys-477. Brug af standard afstands parameteren 0,375 Å. Klik på Kør AutoGrid for at generere gitter kort.
    2. Kør Autodock , og vælg metoden Lamarckian Genetic algoritme (LGA). Klik på Dockingparametrene , og Indstil antallet af GA-kørsler til 50. Brug standardparametrene for andre. Klik på videresend for at starte docking-kørslen.
    3. Åbn panelet Analysér resultater . Undersøg alle forudsagte bindings poser. Vælg den bedste model med den laveste forventede bindingsenergi og rimelige bindende interaktioner mellem cys-477 og substrat på spaltningen. Gem bindings modellen som PDB-fil til yderligere MD-simuleringer.

7. MD-simuleringer af forankrede VEEV-substrat komplekser

  1. Klargør inputfilerne ved hjælp af Amber (http://ambermd.org/). Efter standardprotokollen udføres MD-simuleringer for de forudsagte substrat bindings modeller ved hjælp af AMBER-pakken og ff99SB Force-feltet.
    Bemærk: De solsolerede systemer er underkastet en grundig energi minimering forud for MD-simuleringer. Der anvendes periodiske Grænsebetingelser for at simulere et kontinuerligt system. Partikel mesh Ewald (PME) metoden blev anvendt til at beregne langtrækkende elektrostatiske interaktioner. Det simulerede system blev først udsat for en gradvis temperaturstigning fra 0 K til 300 K over 100 PS, og derefter ligevægt for 500 PS ved 300 K, efterfulgt af produktionsserier på 2 NS længde i alt.
    1. Kør simulerings jobbet på et højtydende databehandlingsanlæg. Vores simuleringer blev kørt på Biowulf-klyngen (https://HPC.NIH.gov/) (figur 8).
    2. Visualiser forløbs output ved hjælp af VMD-programmet (http://www.KS.uiuc.edu/Research/VMD/). Analyser de bindende interaktioner og konformationsmæssige ændringer af substrater og TRIM14 inden for det aktive sted på nsP2 (figur 9).

Representative Results

SSHHPS analyse af ZIKV ns2B/3 proteasehæmmere identificeret 4 Host protein Targets: FOXG1, SFRP1, en Gs Alpha underenhed fra et retinal cDNA bibliotek, og NT5M mitokondrie 5 ', 3 '-nukleotidase (figur 10)6. Især, ingen anden metode forudsagt disse proteiner som potentielle mål for ZIKV protease. Mutationer i FOXG1 genet har været forbundet med et medfødt syndrom karakteriseret ved nedsat udvikling og strukturelle hjerne abnormiteter såsom microcephaly. SFRP1 er et udskillet frizzled-relateret protein (SFRP); disse opløselige receptorer kan kompetitivt binde WNT ligander at irritere og hæmme WNT signalering. WNT signalering pathway er involveret i reguleringen af IFN respons under flavivirus infektion36. Kløvningen af SFRP1 forventes at forbedre flavivirus replikation. SFRP1 er også involveret i Th17 Celledifferentiering37. Sekvens justeringer af SSHHPS viste artsspecifikke forskelle i sekvenserne for spaltningen (figur 10D). Spaltningen site sekvens i SFRP1 var identisk i mennesker og kyllinger; ZIKV kan inducere dødelighed og microcephaly i kyllinge embryoner38. I gnavere erstattes den stærkt konserverede P1-rest (K/R) R ↓ G med en glycin (RGG). Immunkompetente stammer af mus er generelt resistente over for ZIKV infektion og sygdom39.

Steady State kinetiske parametre og hæmning konstanter kan måles for viral polyprotein sekvenser og for Host protein sekvenser ved hjælp af kontinuerlig analyse i en plade læser31,40,41 (Figur 11a). For kvalitativ spaltning information, såsom spaltning af en bestemt sekvens eller hæmning af proteasehæmmere af forskellige forbindelser, den diskontinuerlige analyse kan anvendes (Figur 11B).

Det kan være nødvendigt at optimere antallet af rester mellem den fælles fiskeripolitik og YFP. En substrat-bundet model kan laves ved hjælp af in silico metoder. En repræsentativ forankret model af nsP1/nsP2-krydset er vist i figur 9. For VEEV nsP2 protease var spaltning af en 12-aminosyre Semliki Forest virus (SFV) sekvens blevet rapporteret (Km = 0,58 mM)33. Forlængelse af substrat sekvensen til 19, 22 og 25 rester og reduktion af den ioniske styrke af bufferen førte til en signifikant reduktion i Km. Undersøgelsen af VEEV nsP2 Crystal-strukturen og krystal pakningen viste også, at en del af et af vejkryds var pakket mod proteasedomænet og var spiralformet. Således kan de længere VEEV-substrater binde bedre på grund af anerkendelsen af et sekundært strukturelt motiv.

For TRIM14 fik vi en Km = 21 μM6,33. Km for det substrat, der bærer værts protein sekvensen, var sammenlignelig med km -værdierne af de substrater, der indeholdt de virale polyproteinspaltningen (km(V12) = 12 μm og km(V34) = 21 μm). Spaltningen på nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 og nsP3/nsP4 vejkryds blev skåret med forskellige effektivitetsgevinster. I cellen menes dette at give mulighed for sekventiel spaltning af polyprotein42.

Der bør udvises forsigtighed ved tolkning af negative resultater. Hvis der ikke opstår spaltning, kan spaltnings stedet være for kort, eller den oprensede proteasehæmmere kan være inaktiv. For substrater, der skæres, yderligere eksperimenter er nødvendige for at bekræfte spaltning af fuld længde protein eller spaltning i virus-inficerede celler. Der bør vælges passende opfølgende eksperimenter. Virkningerne af overekspression eller hæmning af målproteinet på viral replikation kan også testes.

Figure 1
Figur 1: tre mekanismer til lyddæmpningen. Der kan opstå lyddæmpnings niveauer på DNA-, RNA-eller Proteinniveau. Disse "Søg og slet" algoritmer hver bruger et "søgeord" til at dirigere spaltning af en fil, der indeholder ordet. Dette tal er blevet ændret fra Morazzani et al.32 og henvisningerne deri. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: artsspecifikke forskelle i sekvenser af kavalergang. C-terminalen PRY/SPRY domæner af TRIM14 homologer er vist i tilpasningen. PRY/SPRY-domænet kan identificeres af de bevaret motiver, der er fremhævet med gråt. Human TRIM14 skæres ved QEAGA ↓ G ved VEEV nsP2 cystein protease. SSHHP-sekvensen vises i farver. Restkoncentration i grøn er P1 ' rest. i blåt er P4 rest, og i rødt er andre bevaret rester inden for spaltnings stedet motiv sekvens. Equine Harbor en afkortet version af TRIM14 mangler PRY/SPRY domæne. Lysin fremhævet i cyan er poly-allestedsnærværende og er vigtig for samlingen af MAVS signalosome. C-terminalen PRY/SPRY domæne kan være forbigående skåret af nsP2 proteasehæmmere at forringe værtens antiviral respons intracellulært under en akut viral infektion. I Equine, dette domæne er altid fraværende. Dette tyder på, at PRY/SPRY domæne af TRIM14 kan have en beskyttende funktion mod VEEV infektioner. Dette tal er blevet gengivet fra Morazanni et al.6venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: identifikation af SSHHPS ved hjælp af blast. Den spaltende motiv sekvens ved VEEV nsP1/nsP2-krydset er justeret med SSHHP-sekvensen i Host-protein TRIM14. Rest farve i grøn er P1 ' rest. i blåt er P4 rest og i rødt andre bevaret rester af spaltnings stedet motiv sekvens. De fleste justeringer indeholdt homologi til regioner uden for det konserverede spaltningen motiv eller omfattede ikke P1/P1 ' scissile obligations rester. TRIM14 viste en match til 6 rester i sekventiel rækkefølge, der omfattede P1 og P1 '. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: protein-og DNA-sekvenser i den fælles fiskeripolitik-V12-YFP-substrat for VEEV nsP2 cystein protease. Begrænsnings stederne NdeI (CATATG) og XhoI (CTCGAG) er vist med store bogstaver. I rødt er spaltningen site sekvens fra viral polyprotein, der er i mellem nsP1 og nsP2. Remanensen i grøn er P1 ' rest og i blåt er P4 resterne af spaltnings stedet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: protein sekvens af TRX-VEEV-nsP2 cystein-proteasekonstruktionen. Thioredoxin (TRX) er vist med gult. Trombin-kavaler pladsen og hans-tag vises i cyan. Cys-hans DYAD er mærket med rødt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Peptidstrukturer i Moe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: forankring af substrat peptid ved hjælp af PyRx/autodock. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: job, der kører på Biowulf-klyngen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: model af VEEV P12-substrat, der indeholder spaltings stedets sekvens ved nsP1/nsP2-krydset. Cys-477/His-546 katalytiske DYAD er vist med blåt. Figuren blev foretaget ved hjælp af PyMOL (https://pymol.org). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: SSHHPS-analyse af Zikavirus ns2B/ns3-protease. (A) forventet Host protein mål for Zikv ns2B/ns3 protease. Rester i rødt svarer til en enkelt spaltning. Rester i grøn tolereres på det underordnede sted og matcher rester på andre kavaler steder. SFRP1 havde det højeste antal identiske rester i fortløbende rækkefølge. (B) den fælles fiskeripolitik-substrat-yfp proteiner (~ 50-60 kDa) blev udtrykt og renset indeholdende den forventede SSHHP sekvens fra hver Host protein (Human). ZIKV proteasehæmmere skar Human FOXG1, SFRP1, NT5M og en GsAlpha underenhed isoleret fra et retinal cDNA-bibliotek. Spaltning produkterne er ca. 28-30 kDa. Substrat sekvenserne er tilgængelige i morazzani et al.6 (C), mens ns2B/ns3 proteasehæmmere cut SFRP1, det skar ikke sine homologer (SFRP2 og SFRP4). D) tilpasningen af spaltnings stederne fra forskellige dyrearter kan være nyttig ved udvælgelsen af en dyremodel for et gruppe IV-virus. Bemærk, at den konserverede R ↓ G-sekvens varierer mellem mennesker og gnavere i SFRP1. Figur gengivet fra Morazzani et al.6venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: steady state kinetisk analyse ved hjælp af kontinuerlige og diskontinuerlig assays. A) de kinetiske data, der er vist i tabel 5, er afbildet i GraFit. Justerings viser lineweaver-Burk plot. B) SDS-side gel, der viser spaltningen af den fælles fiskeripolitiks-V12-yfp-substrat. I Lane 1 er "UNCUT" substrat (48 kDa). I Lane 2 er "CUT" substrat (31 kDa og 27 kDa). I Lanes 3-9 blev forskellige forbindelser inkluderet for at teste deres hæmmende aktivitet. Lane 4 indeholder den E64d kovalente hæmmer. Disse reaktioner blev kørt natten over i ~ 17 timer ved stuetemperatur. Kogning af prøverne var nødvendig for at opnå den skarpe banding mønster. NsP2 proteasehæmmere er synlig (56 kDa) i de reaktioner, der indeholder enzymet, men ikke i Lane 1. Lane 1 er "ingen enzym" kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Sekvens specifik ødelæggelse af et protein eller en nukleinsyre, der styres af en fremmed sekvens, ses kun i nogle få tilfælde i biologi. Mekanismerne vist i figur 1 er defensive mekanismer, der beskytter en vært fra en virus, eller en virus fra en vært.

Ved hjælp af bioinformatiske metoder kan vi identificere de mål, der ødelægges af disse systemer. I vores analyser af SSHHP-sekvenser opdagede vi, at mange af dem kunne findes i proteiner, der var nødvendige for at generere medfødte immunresponser. Nogle havde indlysende roller såsom Mavs og TRIF (TIR-domæne-holdige adapter-inducerende interferon-β), mens andre var relateret til immunitet selv om mere komplekse mekanismer (f. eks histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. De måloplysninger, der er lagret i SSHHP-sekvensen, har potentialet til at identificere veje, som har antivirale virkninger mod disse vira. Antivirale reaktioner in vivo er ofte virus specifikke26,43. For eksempel, undergrupper af trim proteiner har antiviral virkning på forskellige vira43,44,45, nogle er virale restriktions faktorer (f. eks, hiv og TRIM5α). Specificiteten af trim proteiner (~ 70 er blevet identificeret) stadig er ved at blive undersøgt44,45. Oplysningerne i SSHHPS kan bidrage til vores forståelse af, hvordan disse vira unddrage sig den medfødte immunrespons. Andre mønstre og sammenhænge kan blive afsløret, da flere SSHHPS undersøges.

Artsspecifikke forskelle var tydelige i vores analyser (figur 2, figur 10). Disse vira er kendt for at påvirke nogle arter mere end andre. Oplysninger om værtsområde, værts modtagelighed og værts forsvar kan være til stede i SSHHPS. For eksempel, heste, de mest modtagelige arter til equin encephalitis vira, manglede den region af human TRIM14, der var forbigående skåret af VEEV nsP2 protease. Mennesker dør sjældent af VEEV infektioner, men kan være inficeret24. Det humane TRIM14-protein bar en nsP2 proteasehæmmere-kavaler sekvens6. Tilstedeværelsen af kavaler sitet tyder på, at mennesker har en forsvarsmekanisme mod disse vira. Fugle er blevet anset for at være potentielle reservoirer af disse vira46. Den tilsvarende SSHHP-sekvens i TRIM14-proteinet fra kyllinger afveg fra de sekvenser, som findes i mennesker og andre arter. Subtile forskelle som disse kan gøre et mål vært protein ucleavable eller mere let spaltet. Aguirre et al.16 viste, at et uncleavable MUTERET streng protein inducerede højere niveauer af IFN efter dengue virus infektion, og at mus naturligvis bære en version af sting, der ikke skæres af dengue ns2B3 protease. Murine STING proteinet blev ikke skåret af ZIKV proteasehæmmere47. I vores SSHHPS-analyse observerede vi også forskelle i ZIKV proteasespaltningen på stedet, da vi sammenlignede de menneskelige proteiner med dem fra gnavere6 (figur 10D). Det kan være vigtigt at gengive de artsspecifikke proteolytiske kavaler af værts proteiner i dyremodeller, der anvendes til gruppe IV-vira. Hæmning af Host protein spaltning har også konsekvenser med hensyn til udviklingen af gruppe IV proteasehæmmere. I vores tidligere publikation, vi viste, at vi kunne hæmme TRIM14 spaltning af VEEV nsP2 proteasehæmmere ved hjælp af CA074 methyl ester6. Dette resultat tyder på, at små molekyle hæmmere af disse proteaser kan være i stand til at moduere den medfødte immunrespons, der er i stand til at undertrykke infektionen6,31.

Genetisk variation inden for en art har også potentiale til at producere forskelle i proteolytisk spaltning. Subtile forskelle i codon skik kan påvirke ribosom pauser48. Da nogle virale proteaser i gruppe IV er indlejret i ER-membranen, kan forskelle i disse pauser påvirke spalningen af et mål, hvis spaltning sker medtranslationelt. Nogle af de kavaler steder, som vi identificerede, var i forudsagte signal peptidsekvenser (f. eks. SFRP1), mens andre var interne.

SSHHPS analyse kan producere oplysninger, der afviger fra andre metoder til Host proteinanalyser. SSHHPS analyse var billig og nem at ansætte. Brugen af et bakterielt udtryks system tillod afprøvning af korte segmenter (~ 25 aminosyrer) af pattedyrs sekvenser uden brug af pattedyrscelle kultur. Vi konstaterede, at den fælles fiskeripolitiks-YFP-substrater var i stand til at tolerere alle de testede humane protein sekvenser; men udbyttet varierede. I lignende analyser, substrater indeholdende humane protein sekvenser, så længe 63 aminosyrer blev med succes udtrykt, renset, og udnyttet til kinetiske analyser og inhibitor screening49,50,51. Da der kun er behov for små mængder af substratet til den diskontinuerlig analyse, kan et stort antal mål udforskes. En af fordelene ved systemet er, at den fælles fiskeripolitiks/YFP-substrater kan anvendes til SDS-side analyser og til mere udførlige kinetiske analyser (dvs. IC50, ki, km, VMax). For Drug opdagelse, hæmmende forbindelser kan producere artefakter i fluorescerende assays. Således gør den diskontinuerlige analyse i kombination med en kontinuerlig analyse det muligt at bekræfte spaltning eller hæmning af spaltning. Prøverne til den diskontinuerlige SDS-Sideanalyse kan tages direkte ud af 96-brønd pladerne. Den fælles fiskeripolitiks/YFP-substrater er blevet anvendt til sammensatte Biblioteks screening52. Der kræves dog yderligere analyser for at fastslå, om et substrat egner sig til screening af høj hastighed, såsom beregning af en Z-faktor53.

En udfordring i at designe et substrat er at identificere regionen omkring scissile Bond, der er bundet og anerkendt af proteasen. I eksemplerne vist her begyndte vi med 12 rest sekvenser, der var centreret omkring scissile Bond. Efter at have analyseret sekvens justeringer af spaltningen sites homologi til rester N-terminalen af scissile obligation blev fundet for VEEV proteasehæmmere, mens for ZIKV proteasehomologi til flere af C-terminalen rester blev fundet. En i silico model af det dockede substrat kan bruges til at designe site-instrueret mutagenese eksperimenter, der sonde bindingssteder af substratet. Da substratet og enzym sekvenserne er på plasmider, kan enten muteret for at teste i silico modeller eller underordnet websted tolerancer. Dette kan være fordelagtigt, hvis en krystalstruktur af de bundne substrat (er) ikke er tilgængelig.

SSHHPS-analyse kan også give nye oplysninger om de mekanismer, hvormed virus inducerede fænotyper produceres af virale enzymer. Et af zikv-målene, SFRP1, er en del af WNT signalering pathway og har roller i både hjerne-og øjen udvikling og i immunrespons36,37,54,55,56,57. Vi fandt, at de andre protein sekvenser, der kunne skæres af ZIKV ns2B/ns3 proteasehæmmere var også i proteiner involveret i hjernen og øjet udvikling; abnormiteter i begge er observeret i medfødt Zika syndrom og menes at være en del af den virus inducerede fænotype58.

Forudsigeligheden af vært-patogen interaktioner kan udnyttes til en række anvendelser: Target-specifikke onkolytisk viral terapier; de-risikere levende virusvacciner; forfinelse, forudsigelse eller udvælgelse af dyremodeller forudsigelse af værtsområde eller modtagelighed forudsigelse af zoonotiske hændelser og forudsigelse af værts forsvar. Da de beskrevne metoder er sekvens-baserede, kan de være af værdi for at indarbejde i software i fremtiden.

Disclosures

De udtalelser, der udtrykkes her, er de af forfatterne og ikke repræsenterer dem af U. S. Navy, U. S. Army, U. S. Department of Defense, eller den amerikanske regering.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Defense Threat reduktion Agency (DTRA) projektnumre CB-SEED-SEED09-2-0061 og CBCall4-CBM-05-2-0019, og delvis af Intramural/Extramural Research program af NCATS, NIH (XH) og Naval Research laboratorium base funds.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL Erlenmeyer Flask VWR 89000-362
2-mercaptoethanol Acros Organics (Fisher) 125472500 Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.
4 L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap Millipore Sigma CLS49954L-1EA
AKTA Prime Plus GE Healthcare 17-0729-01
AKTA XK 16/20 Column GE Healthcare 28988937
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC501096
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC901096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC801024
Ampicillin Sigma A0166 Danger: Allergic reactions (skin or breathing).
Chelating Sepharose Fast Flow GE Healthcare 17-0575-02 Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.
Chloramphenicol RPI C61000 Danger: May cause cancer.
Corning 50 mL centrifuge tubes Corning 430828 Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface Corning 3993
Dialysis Tubing Clips Fisher Scientific PI68011
Disposable PD-10 Desalting Column GE Healthcare 17-0851-01
DNAse Sigma DN25-1G
DTT (DL-Dithiothreitol) RPI D11000-50.0 Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation
EDTA Fisher Scientific S311-500
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
Glycerol Acros Organics (Fisher) 15892-0010
HEPES Millipore Sigma H4034-1KG
Imidazole Acros Organics 301870010 Danger: Toxic, Irritant
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) Calbiochem (Millipore Sigma) 420291 Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.
Laemmli Sample Buffer BIO-RAD 1610737
Luria Bertani Agar Fluka (Millipore Sigma) L3027-1KG Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.
Luria Bertani Media Fisher Bioreagents BP1426-2
Lysozyme Sigma L4919-5g
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box BIO-RAD
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes Nalgene (Thermo Scientific) 3119-0050
Nanodrop Thermo Fisher
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator Eppendorf M1335
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific N73-500 Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C600003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C606003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
pet15b plasmid DNA Novagen (Millipore Sigma) 69661 GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.
pet32b Novagen (Millipore Sigma) 69016-3 The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free Thermo Fisher A32955 Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage
Plate Reader Molecular Devices Model M5
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard BIO-RAD 161-0373
Protein Extraction Reagent Novagen (Millipore Sigma) 70584-4 BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)
Q-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0510-01 Anion exchange resin
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels Expedeon BCG01227 Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used
RunBlue 20x SDS Running Buffer Expedeon NXB50500 Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x
RunBlue Instant Blue Gel Stain Expedeon ISB1L Do not dilute, use as directed
Sodium Chloride Fisher Chemical S271-10
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator Branson Ultrasonics (VWR) Model No. 101-063-346R Sonicator was used on level 5
Spectra/Por 6-8 kD MWCO Spectrum Labs 132645T Dialysis Tubing
SP-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0729-01 Cation exchange resin
Thrombin from bovine plasma Sigma T6634-500UN
Tris Base Fisher Scientific BP152-500 Caution: Eye/Skin Irritant

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, H., et al. Widespread Horizontal Gene Transfer from Double-Stranded RNA Viruses to Eukaryotic Nuclear Genomes. Journal of Virology. 84, (22), 11876-11887 (2010).
  2. Hagai, T., Azia, A., Babu, M. M., Andino, R. Use of host-like peptide motifs in viral proteins is a prevalent strategy in host-virus interactions. Cell Reports. 7, (5), 1729-1739 (2014).
  3. Gorbalenya, A. E. Host-related sequences in RNA viral genomes. Seminars in Virology. 3, 359-371 (1992).
  4. Shmakov, S. A., et al. The CRISPR Spacer Space Is Dominated by Sequences from Species-Specific Mobilomes. MBio. 8, (5), 1-18 (2017).
  5. Legler, P. M., Morazzani, E., Glass, P. J., Compton, J. R. Proteome Editing System and A Biomarker of Veev Infection. United States patent application. (2018).
  6. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  7. Alvarez, E., Castello, A., Menendez-Arias, L., Carrasco, L. HIV protease cleaves poly(A)-binding protein. Biochemical Journal. 396, (2), 219-226 (2006).
  8. Falk, M. M., et al. Foot-and-mouth disease virus protease 3C induces specific proteolytic cleavage of host cell histone H3. Journal of Virology. 64, (2), 748-756 (1990).
  9. Grigera, P. R., Tisminetzky, S. G. Histone H3 modification in BHK cells infected with foot-and-mouth disease virus. Virology. 136, (1), 10-19 (1984).
  10. Li, W., Ross-Smith, N., Proud, C. G., Belsham, G. J. Cleavage of translation initiation factor 4AI (eIF4AI) but not eIF4AII by foot-and-mouth disease virus 3C protease: identification of the eIF4AI cleavage site. FEBS Letters. 507, (1), 1-5 (2001).
  11. Kuyumcu-Martinez, M., et al. Calicivirus 3C-like proteinase inhibits cellular translation by cleavage of poly(A)-binding protein. Journal of Virology. 78, (15), 8172-8182 (2004).
  12. Pietila, M. K., Hellstrom, K., Ahola, T. Alphavirus polymerase and RNA replication. Virus Research. 234, 44-57 (2017).
  13. Hardy, W. R., Strauss, J. H. Processing the nonstructural polyproteins of sindbis virus: nonstructural proteinase is in the C-terminal half of nsP2 and functions both in cis and in trans. Journal of Virology. 63, (11), 4653-4664 (1989).
  14. Strauss, E. G., De Groot, R. J., Levinson, R., Strauss, J. H. Identification of the active site residues in the nsP2 proteinase of Sindbis virus. Virology. 191, (2), 932-940 (1992).
  15. Wang, D., et al. Foot-and-mouth disease virus 3C protease cleaves NEMO to impair innate immune signaling. Journal of Virology. 86, (17), 9311-9322 (2012).
  16. Aguirre, S., et al. DENV inhibits type I IFN production in infected cells by cleaving human STING. PLoS Pathogens. 8, (10), e1002934 (2012).
  17. Barral, P. M., Sarkar, D., Fisher, P. B., Racaniello, V. R. RIG-I is cleaved during picornavirus infection. Virology. 391, (2), 171-176 (2009).
  18. Elbashir, S. M., Lendeckel, W., Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Development. 15, (2), 188-200 (2001).
  19. Deveau, H., Garneau, J. E., Moineau, S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annual Review of Microbiology. 64, 475-493 (2010).
  20. Schechter, I., Berger, A. On the size of the active site in proteases I. Papain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 27, (2), 157-162 (1967).
  21. Bieniasz, P. D. Intrinsic immunity: a front-line defense against viral attack. Nature Immunology. 5, (11), 1109-1115 (2004).
  22. Zhou, Z., et al. TRIM14 is a mitochondrial adaptor that facilitates retinoic acid-inducible gene-I-like receptor-mediated innate immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 111, (2), E245-E254 (2014).
  23. Wang, S., et al. TRIM14 inhibits hepatitis C virus infection by SPRY domain-dependent targeted degradation of the viral NS5A protein. Scientific Reports. 6, 32336 (2016).
  24. Zacks, M. A., Paessler, S. Encephalitic alphaviruses. Veterinary Microbiology. 140, (3-4), 281-286 (2010).
  25. Hollidge, B. S., Weiss, S. R., Soldan, S. S. The role of interferon antagonist, non-structural proteins in the pathogenesis and emergence of arboviruses. Viruses. 3, (6), 629-658 (2011).
  26. Carthagena, L., et al. Human TRIM gene expression in response to interferons. PLoS One. 4, (3), e4894 (2009).
  27. Montgomery, S. A., Johnston, R. E. Nuclear import and export of Venezuelan equine encephalitis virus nonstructural protein 2. Journal of Virology. 81, (19), 10268-10279 (2007).
  28. Nenasheva, V. V., et al. Enhanced expression of trim14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunologic Research. 62, (3), 255-262 (2015).
  29. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, (1), 87-90 (2002).
  30. Li, M. Z., Elledge, S. J. SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in Molecular Biology. 852, 51-59 (2012).
  31. Hu, X., et al. Kinetic, Mutational, and Structural Studies of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Nonstructural Protein 2 Cysteine Protease. Biochemistry. 55, (21), 3007-3019 (2016).
  32. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  33. Zhang, D., Tozser, J., Waugh, D. S. Molecular cloning, overproduction, purification and biochemical characterization of the p39 nsp2 protease domains encoded by three alphaviruses. Protein Expression and Purification. 64, (1), 89-97 (2009).
  34. Lei, J., et al. Crystal structure of Zika virus NS2B-NS3 protease in complex with a boronate inhibitor. Science. 353, (6298), 503-505 (2016).
  35. Shiryaev, S. A., et al. Characterization of the Zika virus two-component NS2B-NS3 protease and structure-assisted identification of allosteric small-molecule antagonists. Antiviral Research. 143, 218-229 (2017).
  36. Smith, J. L., Jeng, S., McWeeney, S. K., Hirsch, A. J. A MicroRNA Screen Identifies the Wnt Signaling Pathway as a Regulator of the Interferon Response during Flavivirus Infection. Journal of Virology. 91, (8), (2017).
  37. Lee, Y. S., et al. The Wnt inhibitor secreted Frizzled-Related Protein 1 (sFRP1) promotes human Th17 differentiation. European Journal of Immunology. 42, (10), 2564-2573 (2012).
  38. Goodfellow, F. T., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells and Development. 25, (22), 1691-1697 (2016).
  39. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91, (8), (2017).
  40. Morazzani, E. M., et al. Books of Abstracts, 254th American Chemical Society National Meeting. Washington, D.C. (2017).
  41. Compton, J. R., Mickey, M. J., Hu, X., Marugan, J. J., Legler, P. M. Mutation of Asn-475 in the Venezuelan Equine Encephalitis Virus nsP2 Cysteine Protease Leads to a Self-Inhibited State. Biochemistry. 56, (47), 6221-6230 (2017).
  42. Vasiljeva, L., et al. Regulation of the sequential processing of Semliki Forest virus replicase polyprotein. Journal of Biological Chemistry. 278, (43), 41636-41645 (2003).
  43. Uchil, P. D., Quinlan, B. D., Chan, W. T., Luna, J. M., Mothes, W. TRIM E3 ligases interfere with early and late stages of the retroviral life cycle. PLoS Pathogens. 4, (2), e16 (2008).
  44. Ozato, K., Shin, D. M., Chang, T. H., Morse, H. C. 3rd TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity. Nature Reviews Immunology. 8, (11), 849-860 (2008).
  45. van Tol, S., Hage, A., Giraldo, M. I., Bharaj, P., Rajsbaum, R. The TRIMendous Role of TRIMs in Virus-Host Interactions. Vaccines (Basel). 5, (3), (2017).
  46. Molaei, G., et al. Dynamics of Vector-Host Interactions in Avian Communities in Four Eastern Equine Encephalitis Virus Foci in the Northeastern U.S. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, (1), e0004347 (2016).
  47. Ding, Q., et al. Species-specific disruption of STING-dependent antiviral cellular defenses by the Zika virus NS2B3 protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 115, (27), E6310-E6318 (2018).
  48. Angov, E., Legler, P. M., Mease, R. M. Adjustment of codon usage frequencies by codon harmonization improves protein expression and folding. Methods in Molecular Biology. 705, 1-13 (2011).
  49. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Analytical Biochemistry. 411, (2), 200-209 (2011).
  50. Hu, X., et al. Structural insight into exosite binding and discovery of novel exosite inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A through in silico screening. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28, (7), 765-778 (2014).
  51. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Applied and Environmental Microbiology. 78, (21), 7687-7697 (2012).
  52. Nguyen, T. G., et al. Development of fluorescent substrates and assays for the key autophagy-related cysteine protease enzyme ATG4B. Assay and Drug Development Technologies. 12, (3), 176-189 (2014).
  53. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, (2), 67-73 (1999).
  54. Bovolenta, P., Esteve, P., Ruiz, J. M., Cisneros, E., Lopez-Rios, J. Beyond Wnt inhibition: new functions of secreted Frizzled-related proteins in development and disease. Journal of Cell Science. 121, (Pt 6), 737-746 (2008).
  55. Esteve, P., et al. SFRPs act as negative modulators of ADAM10 to regulate retinal neurogenesis. Nature Neuroscience. 14, (5), 562-569 (2011).
  56. Garcia-Hoyos, M., et al. Evaluation of SFRP1 as a candidate for human retinal dystrophies. Molecular Vision. 10, 426-431 (2004).
  57. Marcos, S., et al. Secreted frizzled related proteins modulate pathfinding and fasciculation of mouse retina ganglion cell axons by direct and indirect mechanisms. Journal of Neuroscience. 35, (11), 4729-4740 (2015).
  58. Moore, C. A., et al. Characterizing the Pattern of Anomalies in Congenital Zika Syndrome for Pediatric Clinicians. JAMA Pediatrics. 171, (3), 288-295 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics