Analyse av gruppe IV viral SSHHPS bruke in vitro og i Silisiummangan metoder

Immunology and Infection
 

Summary

Vi presenterer en generell protokoll for å identifisere korte strekninger av homologe vert-patogen protein sekvenser (SSHHPS) innebygd i viral polyprotein. SSHHPS er anerkjent av viral proteaser og direkte målrettet ødeleggelse av bestemte vert proteiner av flere gruppe IV virus.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hu, X., Compton, J. R., Legler, P. M. Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods. J. Vis. Exp. (154), e60421, doi:10.3791/60421 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Alphaviral enzymer er syntetisert i en enkelt polypeptid. Den nonstructural polyprotein (nsP) er behandlet av sin nsP2 cystein protease å produsere aktive enzymer avgjørende for viral replikering. Viral proteaser er svært spesifikke og anerkjenne bevart kløft nettsted motiv sekvenser (~ 6-8 aminosyrer). I flere gruppe IV virus, den nsP protease (s) kløft nettstedet motiv sekvenser kan finnes i bestemte vert proteiner involvert i å generere medfødt immunresponser og, i noen tilfeller, målrettede proteiner synes å være knyttet til virus-indusert fenotype. Disse virusene utnytte korte strekninger av homologe vert-patogen protein sekvenser (SSHHPS) for målrettet ødeleggelse av verten proteiner. For å identifisere SSHHPS viral protease kløft nettstedet motiv sekvenser kan angitt inn BLAST og verten Genova (e) kan søkes. Kløft utgangspunktet kan testes ved hjelp av renset nsP viral protease og fluorescens resonans energi overføring (SLITE) underlag laget i E. coli. BÅND underlaget inneholder cyan og gult fluorescerende protein og kløft området sekvensen (CFP-Sequence-YFP). Denne protease analysen kan brukes kontinuerlig i en plate leser eller discontinuously i SDS-PAGE gels. Modeller av bundet peptid underlag kan genereres i silisiummangan å veilede substrat utvalg og mutagenese studier. CFP/YFP underlag har også blitt benyttet for å identifisere protease hemmere. Disse in vitro og i silisiummangan metoder kan brukes i kombinasjon med celle-baserte analyser for å avgjøre om målrettede vert protein påvirker viral replikering.

Introduction

Bevis for horisontal genoverføring fra virus til vert, eller vertskap for virus, finnes i en rekke genomer1,2,3,4. Eksempler på viral endogenization er CRISPR spacer sekvenser funnet i bakteriell vert genomer4. I den seneste tid, vi har grunnlegge bevis av vert protein sekvenser lagt ned i inne det nonstructural polyproteins av (+) ssRNA gruppe IV viruser. Disse sekvensene innenfor koding regioner av viral Genova kan spres generationally. Den korte strekninger av homologe Host-patogen protein sekvenser (SSHHPS) er funnet i viruset og Host5,6. SSHHPS er den bevarte kløften området motiv sekvenser anerkjent av viral proteaser som har homologi til bestemte vert proteiner. Disse sekvensene direkte ødeleggelsen av bestemte vert proteiner.

I vår forrige utgivelse6, vi samlet en liste over alle de vert proteiner som ble målrettet av viral proteaser og fant at listen over mål var ikke tilfeldig (tabell 1). To trender var åpenbare. For det første, flertallet av viral proteaser det kutt vert protein tilhørte gruppe IV viruser (24 av 25 sakene involvert gruppe IV viral proteaser), og ettall protease tilhøre å det (+) ssRNA gruppe VI retroviruses (HIV, Human immunsviktvirus)7. For det andre, verten protein mål blir kuttet av viral proteaser var generelt involvert i å generere medfødte immunresponser antyder at splittelsene var ment å antagonize vertens immunresponser. Halvparten av verten proteiner målrettet av viral proteaser var kjent komponenter av signalering kaskader som genererer interferon (IFN) og proinflammatoriske cytokiner (tabell 1). Andre var involvert i Host Cell transkripsjon8,9,10 eller oversettelse11. Interessant, Shmakov et al.4 har vist at mange CRISPR protospacer sekvenser tilsvarer gener involvert i plasmider Bøyning eller replikering4.

Gruppe IV omfatter blant annet hvilken, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae og Togaviridae. Flere nye og framvoksende patogener tilhører gruppe IV som Zika-viruset (ZIKV), West Nile (WNV), Chikungunya (CHIKV), alvorlig akutt respiratorisk syndrom virus (SARS) og Midtøsten respiratorisk syndrom virus (MERS). Det (+) ssRNA Genova er i all vesentlighet en stykke mRNA. Å tilvirke det enzym på krevd for Genova replikering, det (+) ssRNA Genova for det første må være oversatt. I alphaviruses og andre gruppe IV-virus produseres enzymene som er nødvendige for replikering i en enkelt polyprotein (dvs. nsP1234 for VEEV). Nonstructural polyprotein (nsP) er proteolytically behandlet (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) av nsP2-protease for å produsere aktive enzymer12 (figur 1). Kløft av polyprotein av nsP2 protease er avgjørende for viral replikering; Dette har blitt demonstrert ved sletting og site-regissert mutagenese av det aktive nettstedet cystein av nsP2 protease13,14. Spesielt, oversettelsen av viral proteiner foran Genova replikering hendelser. NsP4 inneholder for eksempel den RNA-avhengige RNA-polymerase som trengs for å replikere (+) ssRNA-Genova. Genova replikering kan produsere dsRNA mellom produkter; disse mellom produkter kan utløse vertens medfødte immunresponser. Dermed kan disse virusene holde vert medfødt immunrespons proteiner tidlig i smitte for å undertrykke sine effekter15,16,17.

Å stanse kan forekomme på DNA-, RNA-og protein nivået. Det som er felles for hver av mekanismene for deaktivering som vises i figur 1 , er at korte, utenlandske DNA-, RNA-eller protein sekvenser brukes til å lede ødeleggelsen av bestemte mål for å antagonize deres funksjon. Mekanismene for demping er analoge til «søk og slett»-programmer som er skrevet på tre forskjellige språk. Den korte kløften området sekvensen er analogt til et "søkeord". Hvert program har et enzym som anerkjenner kampen mellom den korte sekvensen ("søkeordet") og et ord i "fil" som skal slettes. Når en kamp blir funnet, enzymet kutt ("sletter") den større mål sekvensen. De tre mekanismene som vises i figur 1 brukes til å forsvare verten mot virus, eller til å forsvare et virus fra en vertens immunsystem.

Viral proteaser anerkjenner kort kløft nettsted motiv sekvenser mellom ~ 2-11 aminosyrer; i nukleotider, ville dette tilsvare 6-33 baser. Til sammenligning er CRISPR spacer sekvenser ~ 26-72 nukleotider og RNAi er ~ 20-22 nukleotider18,19. Selv om disse sekvensene er relativt korte, kan de bli gjenkjent spesifikt. Gitt høyere mangfold av aminosyrer, sannsynligheten for en tilfeldig kløft hendelse er relativt lav for en viral protease gjenkjenne protein sekvenser av 6-8 aminosyrer eller lengre. Prediksjon av SSHHPS i vert proteiner vil i stor grad avhenge av spesifisitet av viral protease blir undersøkt. Hvis protease har strenge sekvens spesifisitet krav muligheten til å finne en kløft området sekvensen er 1/206 = 1 i 64 000 000 eller 1/208 = 1 i 25 600 000 000; imidlertid har de fleste proteaser variable toleranser (f.eks. R eller K kan tolereres på S1-nettstedet). Følgelig er det ingen krav til sekvens identitet mellom sekvensene funnet i verten versus viruset. For viral proteaser som har løsere sekvens krav (for eksempel de som tilhører Picornaviridae) sannsynligheten for å finne en kløft sted i en vert protein kan være høyere. Mange av oppføringene i tabell 1 er fra Picornaviridae -familien.

Schechter & Berger-notasjon20 brukes vanligvis til å beskrive restene i et protease substrat og de sekundære områdene som de binder, vi bruker denne notasjonen gjennom. Rester i underlaget som er N-Terminal av scissile Bond er betegnet som P3-P2-P1 mens de som er C-terminal er betegnet som P1'-P2'-P3 '. De tilsvarende sekundære områdene i protease som binder disse aminosyre-restene, er henholdsvis S3-S2-S1 og S1'-S2'-S3.

For å finne ut hvilken vert proteiner blir målrettet, kan vi identifisere SSHHPS i viral polyprotein kløften områder og søke etter verten proteiner som inneholder dem. Heri, skisserer vi prosedyrer for å identifisere SSHHPS bruke kjente viral protease kløft site sekvenser. De Bioinformatic metodene, protease analysene og silisiummangan metodene som er beskrevet, er ment å brukes sammen med cellebasert analyser.

Sekvens justering av verten proteiner målrettet av viral proteaser har avdekket arter-spesifikke forskjeller innenfor disse korte kløft området sekvenser. For eksempel, den venezuelanske Equine Encefalitt virus (VEEV) nsP2 protease ble funnet å kutte menneskelige TRIM14, en tre parts motiv (TRIM) protein6. Noen TRIM proteiner er viral begrensning faktorer (f. eks TRIM5α21), de fleste antas å være ubiquitin E3 ligases. TRIM14 mangler en RING (veldig interessant nytt gen) domene og er ikke antatt å være en E3 ligase22. TRIM14 har blitt foreslått å være en adapter i mitokondrie antiviral signalosome (MAVS)22, men kan ha andre antivirale funksjoner23. Justering av TRIM14 sekvenser fra ulike arter viser at equine mangler kløften området og havnen en avkortet versjon av TRIM14 som mangler C-terminal SNUSE/SPRY domene. Dette domenet inneholder et polyubiquitination område (figur 2). I equine, disse virusene er svært dødelige (~ 20-80% dødelighet), mens i mennesker bare ~ 1% dør av VEEV infeksjoner24. Kløft av det SNUSE/SPRY domenen kanskje midlertidig kort kretsløpet det MAVS signal Cascade. Dette Cascade kan utløses av dsRNA og fører til produksjon av interferon og Pro-inflammatorisk cytokiner. Dermed kan tilstedeværelsen av SSHHPS være nyttig for å forutsi hvilke arter som har forsvarssystemer mot bestemte gruppe IV virus.

I gruppe IV virus, IFN motsetningen mekanismer antas å være multiplisere redundant25. Vert protein kløft kan være forbigående under smitte og konsentrasjoner kan komme seg over tid. Vi fant i celler som TRIM14 kløft produkter kunne oppdages svært tidlig etter transfeksjoner (6 h) med en plasmider koding av protease (Cytomegalovirus promoter). Men i lengre perioder ble ikke kløft-produktene oppdaget. I virus-infiserte celler, Kinetics var forskjellige og kløft produkter kunne oppdages mellom 6-48 h6. Andre har rapportert utseendet på Host protein kløft produkter så tidlig som 3-6 h post infeksjon9,11.

Proteolytiske aktivitet i cellene er ofte vanskelig å fange; mat fra kløften kan variere i løselighet, konsentrasjon, stabilitet og levetid. I celle-baserte analyser det kan ikke antas at kløft produkter vil akkumuleres i en celle eller at bandet intensitet av kutt og Uncut protein vil vise kompenserende øker og avtar som kutt protein kan bli degradert svært raskt og kan ikke være synlig i en vestlig blot på en forventet molekylvekt (MW) (f. eks regionen inneholder epitope kunne kløyvde av andre vert proteaser eller kan være ubiquitinated). Hvis underlaget av viral protease er en medfødt immunrespons protein, konsentrasjonen kan variere under infeksjon. For eksempel, noen medfødt immunrespons proteiner er til stede før viral infeksjon og er indusert ytterligere ved interferon26. Konsentrasjonen av målet protein kan derfor svinge under infeksjon og sammenligning av infisert vs infisert celle lysater kan være vanskelig å tolke. I tillegg kan alle celler ikke være jevnt transfekterte eller infisert. In vitro protease analyser ved hjelp av renset proteiner fra E. coli på den annen side har færre variabler som å kontrollere og slike analyser kan gjøres ved hjelp av SDS-side i stedet for immunoblots. Forurensende proteaser kan bli hemmet i de tidlige trinnene av protein rensing av CFP/YFP substrat, og mutert viral proteaser kan renses og testes som kontroller for å avgjøre om kløften skyldes viral protease eller en forurensende bakteriell protease.

En begrensning av in vitro protease analyser er at de mangler kompleksiteten av en pattedyr celle. For et enzym for å kutte sitt substrat, må de to være co-lokaliserte. Gruppe IV viral proteaser varierer i struktur og lokalisering. For eksempel er ZIKV-protease innebygd i endoplasmatiske retikulum (ER)-membranen og vender mot stoffer, mens VEEV nsP2-protease er et løselig protein i cytoplasma og nucleus27. Noen av kløften området sekvenser funnet i ZIKV SSHHPS analysen var i signal peptider antyder at kløften kan oppstå co-translationally for noen mål. Dermed må plasseringen av protease og underlaget i cellen også vurderes i disse analysene.

Celle-baserte analyser kan være verdifulle for å etablere en rolle for identifiserte verts protein (er) i infeksjon. Metoder som tar sikte på å stanse viral protease kløft av verten proteiner som tillegg av en protease inhibitor6 eller en mutasjon i verten målet16 kan brukes til å undersøke deres effekter på viral replikering. Overuttrykte av det målrettede proteinet kan også påvirke viral replikering28. Plakk analyser eller andre metoder kan brukes til å kvantifisere viral replikering.

Protocol

1. bioinformatikk: identifisering av SSHHPS i verten Genova bruke BLAST

Merk: Protein BLAST kan finnes på blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

  1. Input ~ 20 aminosyrer rundt scissile bindingen i viral polyprotein. Velge ingen-redundant protein sekvenser og type inne det vert Genova å bli søkte (e.g., homo sapiens).
    1. Velg om nødvendig PHI-BLAST. Skriv inn et mønster sekvens (f. eks, for de 25 rester av V12 vist nedenfor inn i mønsteret "AG" uten anførselstegn).



      Merk: I PHI-BLAST, firkant parentes [XY] indikere at aminosyre X eller Y kan være på det sekundære området (f. eks AG [AC] [GAY]).
    2. Inspiser BLAST resultatene og identifisere treff som har høy sekvens identitet til rester som er bevart i polyprotein kløften steder (f. eks tre parts motiv protein 14) (Figur 3).
      Merk: For Serine proteaser høyere bevaring av P1 rester er forventet, mens for cystein proteaser høyere bevaring av P2 rester er forventet.
    3. Farge rester som er identiske med en kløft området sekvens og er i sekvensiell rekkefølge (ingen hull). Color rester tolerert på det sekundære området, men til stede i en annen kløft sted i en annen farge.
      Merk: Rester som representerer konservative erstatninger (for eksempel leu g. Val) som ikke er til stede i en viral kløft området også kan bli funnet og kan eller ikke kan bli gjenkjent av viral protease.
    4. Rank Bestill BLAST treff basert på antall påfølgende identiske eller tolerert rester som samsvarer med en kløft området sekvens. Fra listen velger du proteiner som inneholder ≥ 6 identiske eller lignende rester for analyse i protease analyser.
    5. Gjenta prosedyren for de andre stedene (nsP2/3, nsP3/4, etc.) og gradvis styrke prediksjon ved å legge til mer høyt bevarte rester til PHI-BLAST mønster.

2. in vitro-analyser: designe og klargjøre protease underlag

  1. Konstruere en plasmider koding av cyan fluorescerende protein (CFP), ≤ 25 aminosyrer av kløften sekvensen, etterfulgt av det gule fluorescerende proteinet (YFP, også kjent som Venus29).
    Merk: Det plasmider kan konstruert benytter orden og ligation selvstendig Klon (skive)30 eller reklamen gen syntese. En pet15b plasmider inneholder sekvensen vist i Figur 4 ble syntetisert kommersielt og ble brukt her.
    1. For å optimalisere underlaget lengde, konstruere ekstra variabel lengde bånd underlag som inneholder 12-25 aminosyrer av naturlig viral polyprotein kløft området sekvenser ved hjelp av en 2-fragment skive reaksjon. Analyser kløften ved hjelp av SDS-PAGE gel-basert analyse eller ved å måle steady state kinetisk parametre ved hjelp av metodene nedenfor.
      Merk: I noen tilfeller kan kløften bli identifisert av homologi til kjente kløft plass31. Hvis kløft av underlag som inneholder polyprotein krysset sekvenser ikke er observert, kan det være et krav for ytterligere rester eller en strukturell motiv (f. eks, en Alpha Helix32). Alternativt kan renset viral protease være inaktiv. Bekreft kløften av viral polyprotein sekvenser før forfølge SSHHPS analyse. Antall rester i underlaget var optimalisert for VEEV protease ved hjelp av variabel lengde underlag (12 til 25 aminosyrer) etterfulgt av analyse av VMax og Km32,33. Den Zika viral ns2B/nsB protease kløft nettsteder som brukes i eksemplene har blitt publisert34,35.
  2. Klargjør CFP/YFP underlag ved å transformere 8-20 μL av BL-21 (DE3)E. colikompetente celler med CFP-V12-YFP plasmider i henhold til produsentens anvisninger og plate på Luria Bertani (LB) agar plater som inneholder 50 μg/mL Ampicillin (37 ° c).
    1. Autoklav fire 4 L flasker som inneholder LB Media (1,5 L Media per kolbe) og 100 mL LB i en 250 mL kolbe. Cap hver kolbe med aluminiumsfolie.
    2. Vaksinere den 100 mL kultur med en koloni av fersk transformert bakterier og vokse ved 37 ° c med risting (200 RPM) over natten.
    3. For å gjøre CFP/YFP substrat, vaksinere fire 4 L flasker med 25 mL av en overnatting kultur. Begynn å riste kulturer på 37 ° c og overvåke vekst av UV-Vis spektroskopi på 600 NM hver time.
    4. Når bakteriene når en absorbansen på ~ 1,0 ved 600 NM (ca. ~ 3-4 h av vekst) induserer protein uttrykk ved å legge til 0,5 mL 1 M isopropylalkohol-β-D-thiogalactoside (IPTH) per kolbe. Etter å ha lagt IPTH, Senk temperaturen på den risting inkubator til 17 ° c og la uttrykket å fortsette over natten for 17-20 h.
    5. Pellet bakteriene ved hjelp av en høyhastighets sentrifuge ved 7 000 x g i 10 min (4 ° c) og beholde pellets. Fjern og kast flytende medier. Oppbevar pellets ved-80 ° c eller lyse umiddelbart.
    6. Klargjør 100 mL lyseringsbuffer med 50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 35 mL av bakteriell protein utvinnings reagens, 30 mg lysozyme, 25 U av DNase og 1 protease inhibitor tablett. Resuspend pellets i lyseringsbuffer med en pipette og Overfør ~ 25-35 mL til 50 mL en gangs koniske rør.
    7. Plasser rørene i et plast beger som inneholder isvann. Sett sonicator spissen inn i rørene slik at spissen er ~ 1 cm fra bunnen av røret og sonikere lysater 10-20 ganger på nivå 5 for 15 s intervaller til lysat blir flytende og flytende.
      Merk: Bruk Hørselvern under sonikering.
    8. Overfør lysat til høyhastighets sentrifugerør og sentrifuge ved 20 500 x g i 30 min ved 4 ° c. Etter spinn, Behold supernatanten (~ 100 mL) og overfør den til en ren flaske. Kast pellets.
    9. Forbered 1 L buffer A (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl). Klargjør 300 mL buffer B (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazole).
    10. Likevekt en 100 mL nikkel kolonne ved hjelp av 3 kolonne volumer av buffer A og en strømningshastighet på 5 mL/min.
    11. Legg lysat på nikkel-kolonnen med en strømningshastighet på 2 til 5 mL/min. vask kolonnen med 2 kolonne volumer av buffer A, etterfulgt av ~ 5 kolonne volumer på 20% buffer B. Under 20% buffer B vask, vil absorbansen ved 280 NM (A280) øker som forurensninger eluere fra kolonnen under vasken. Fortsett å vaske kolonnen til A280 -eluatet har returnert til opprinnelige verdier.
    12. Eluere proteinet med 2-3 Kol onne volumer på 100% buffer B ved hjelp av en strømningshastighet på 2-5 mL/min og samle 10 mL fraksjoner. Mål A280 for hver brøk.
    13. Kombiner og Konsentrer fraksjoner som inneholder A280 > 0,1 ved hjelp av en 15 ml sentrifugal ultrafiltrering enhet. Snurr ultrafiltrering enhetene på 5 000 x g i 15 min og Fortsett å legge til brøker til volumet er blitt redusert til ~ 50-75 ml.
    14. Skjær en 14 tommers stykke dialyse slange med en molekylær vekt cut-off (MWCO) av 6-8 kDa. Fukt dialyse slangen ved å koke den helt neddykket i 300 mL vann i 10 min. knyt en sikker knute i den ene enden av membranen. Fyll posen med dialyse buffer for å sikre at ingen sprekker eller lekkasjer er tilstede. Fjern bufferen fra posen og hold posen under vann i bufferen for dialyse.
    15. Overfør det konsentrerte proteinet fra 2.2.13 inn i posen med en plast pipette. Fjern eventuelle luftbobler fra posen. Lukk posen med en andre knute eller en dialyse klips. Dialyze proteinet mot 500 mL 50 mM Tris pH 7,6, 5 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic syre), 250 mM NaCl i en 500 mL gradert sylinder over natten ved 4 ° c.
    16. Dialyze proteinet for andre gang mot 500 mL 50 mM Tris pH 7,6 ved 4 ° c for 2 timer.
  3. For den anion utvekslings Kol onnen forbereder du 500 mL buffer A (50 mM Tris pH 7,6) og 500 mL buffer B (50 mM Tris pH 7,6, 1,0 M NaCl). Likevekt en 30 mL anion utveksling kolonne med 3 kolonne volumer av buffer A (2-5 mL/min).
    1. Fjern proteinet fra posen med dialyse og overfør den til en flaske. Hold flasken på isen. Legg det dialyzed proteinet på søylen (2-5 mL/min).
      Merk: CFP/YFP proteinet vil binde kolonnen og vil være gul i utseende.
    2. Vask kolonnen med buffer A til A280 returnerer til Baseline (5 ml/min). Eluere proteinet ved hjelp av en gradient (0-50% buffer B, 100 mL) og samle 10 mL fraksjoner.
    3. Inspiser kolonnen fraksjoner med SDS-PAGE. Kombiner de som er > 95% ren.
    4. Konsentrer proteinet til en A280 ~ 10-20 ved hjelp av en 15 ml sentrifugal ultrafiltrering enhet. Snurr munnstykket ved 4 500 x g i 10 min ved 4 ° c og Fortsett å tilføre protein til alle de protein inneholdende fraksjonene er kombinert.
  4. Fjern forsiktig proteinet fra konsentratoren med en pipette. Alikvot proteinet i 1,5 mL mikrosentrifugen rør og blits frysing i flytende nitrogen for langtidslagring ved-80 ° c. Buffer bytte proteinet ved romtemperatur ved hjelp av en PD-10 kolonne equilibrated med riktig analysen buffer før bruk.
  5. Bruke Beer lov beregne proteinkonsentrasjon ved hjelp av A280 og en beregnet utryddelse koeffisient (f. eks, for V12 substrat den ɛ = 47 790 M-1 cm-1).
    Merk: Den utryddelse koeffisient (ɛ) kan beregnes fra protein sekvensen i Figur 4 ved hjelp av Expasy ProtParam programmet (https://Web.expasy.org/protparam/).

3. utarbeidelse av Alphaviral nsP2 cystein protease

  1. Design og konstruere en plasmider koding av protease. For cystein proteaser, bruk PET32 plasmider å konstruere en thioredoxin (TRX) Fusion protein.
    Merk:Den PET32 plasmider koder en trombin kløft nettsted (LVPRGS) for fjerning av thioredoxin og His-tag (Figur 5). Thioredoxin vil bidra til å opprettholde det aktive nettstedet cystein i en redusert tilstand under uttrykket. For Serine proteaser, det thioredoxin er ikke behøvde og skritt innvolvere dens flytting av trombin kan utelatt. Den VEEV nsP2 protease sekvensen ble innlemmet i en pet32b plasmider som ble utarbeidet kommersielt for å unngå håndtering Velg agenter.
    1. Fersk transformere plasmider DNA til BL21 (DE3) pLysS E. coli i henhold til produsentens anvisninger. Plate bakteriene på LB agar plater som inneholder Ampicillin.
      Merk: Kloramfenikol brukes bare for E. coli stammer bærer pLysS plasmider og utelates hvis BL21 (DE3) celler brukes. Det er ikke nødvendig å inkludere kloramfenikol på LB agar plate i dette trinnet.
    2. Autoklav fire 4 L flasker av 1,5 L av LB Media (6 L totalt volum) og 100 mL LB i en 250 mL kolbe. Cap hver kolbe med aluminiumsfolie.
    3. Vaksinere en 100 mL over natten kultur LB/Ampicillin med en koloni fra platen og vokse i en risting inkubator (200 RPM) ved 37 ° c.
    4. Vaksinere de 4 L flaskene med 25 mL av natten kultur og legge til riktig antibiotika.
      Merk: Mediene for BL21 (DE3) pLysS-cellene som frakter PET32-plasmider bør ha endelige konsentrasjoner av 25 μg/mL-kloramfenikol og 50 μg/mL Ampicillin.
    5. Indusere protein uttrykk ved å legge 0,5 mL IPTH til kulturen når absorbansen på 600 NM når 1,0. Senk temperaturen på den skjelvende inkubator til 17 ° c. Tillat at uttrykket fortsetter over natten (~ 17 h).
    6. Pellet cellene ved sentrifugering (7 000 x g i 10 min ved 4 ° c). Fjern og kast væskemediene.
      Merk: Pellets kan oppbevares ved-80 ° c i måneder eller lysert umiddelbart.
    7. Forbered 100 mL av lyseringsbuffer (50 mM Tris pH 7,6, 500 mL NaCl, 2 mM beta mercaptoethanol (BME), 30 mg lysozyme, 5% glyserol, 25 U DNase, 35 mL bakteriell protein utvinning reagens). Åpne flasker med BME i en kjemisk hette når du legger til. Oppbevar bakteriell lysat på is eller ved 4 ° c for denne og alle etterfølgende trinn.
      Merk: For cystein proteaser er 2 mM BME inkludert for å holde nukleofil cystein redusert. Kolonnene kan kjøres ved romtemperatur ved hjelp av kjølt buffere. Buffere bør gjøres med kaldt deionisert vann avkjølt til 4 ° c.
    8. Resuspend bakterie pellets i ~ 25 mL lyseringsbuffer og Overfør ~ 25 mL av lysat til 4 x 50 mL en gangs koniske rør. Plasser rørene i plast kanner som inneholder isvann. Sonikere lysat 10 ganger på nivå 5 for 15 s intervaller.
    9. Overfør lysat til sentrifugerør med høy hastighet. Klargjør lysat ved sentrifugering (30 min, 20 500 x g ved 4 ° c).
    10. Forbered 0,5 liter buffer A (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 5% glyserol, 2 mM BME) og chill til 4 ° c.
    11. Klargjør 250 mL buffer B (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 5% glyserol, 2 mM BME, 300 mM imidazole) og chill til 4 ° c.
    12. Likevekt en 50 mL nikkel kolonne med 3 kolonne volumer av buffer A. Legg den avklart lysat på kolonnen ved 2-5 mL/min og kast pellets.
    13. Vask kolonnen (2-5 mL/min) med 2 kolonne volumer av buffer A etterfulgt av 5 kolonne volumer av buffer A inneholder 20% buffer B (60 mM Imidazole). Eluere proteinet (5 mL/min) med 100% buffer B og samle 10 mL fraksjoner.
    14. Kombiner og Konsentrer fraksjoner som inneholder protease som har A280 ≥ 0,1 ved bruk av en 15 ml sentrifugal ultrafiltrering enhet og 15 min spins ved 5 000 x g ved 4 ° c. Etter at volumet er redusert til ~ 5 mL, buffer utveksle proteinet i konsentrasjons enheten ved å legge til frisk dialyse buffer til proteinet (50 mM Tris pH 7,6, 250 mM NaCl, 5 mM dithiotreitol (DTT), 1 mM EDTA, 5% glyserol). Spinn igjen ved 5 000 x g ved 4 ° c i 15 min; Gjenta buffer utvekslingen trinn 2-3 ganger. Legg trombin til proteinet (20 μL av 1 enhet/μL) før dialyse for å fjerne thioredoxin og hans-tag.
    15. Overfør proteinet til en pose med dialyse og dialyze mot 500 mL av dialyse bufferen (4 ° c) i en 500 mL gradert sylinder over natten.
      Merk: Det FPLC (rask protein flytende kromatografi) system og det nikkel søylen burde være grundig renset med stripping buffer (2 M NaCl, 50 mM EDTA) tidligere fremgangsmåte å det anion bytte søylen. Eventuelle rester av nikkel i FPLC linjene vil slå buffer løsninger som inneholder DTT brun når blandet. Vask nikkel kolonnen og FPLC system med 4 kolonne volumer av vann. Pump vask FPLC-systemet grundig med vann. Den nikkel kolonnen kan genereres på nytt ved å strømme 2 kolonne volumer på 0,2 M nikkel sulfat over harpiks for påfølgende renselser.
  2. For anion Exchange-kolonnen forberede 1 L av buffer A (50 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 5% glyserol).
    1. Forbered 0,5 L av buffer B (50 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 5% glyserol, 1,25 M NaCl).
    2. Likevekt en 30 mL anion vekslings søyle med buffer A (3 Kol onne volumer, 2-5 mL/min). Plasser rørene i brøkdelen samleren for innsamling av flyten gjennom.
      Merk: VEEV-protease har et beregnet isoelectric-punkt (pI) på 8,7, og vil binde kolonnene for inn-utveksling, men vil flyte gjennom anion utvekslings Kol onner. PI kan beregnes fra protein sekvensen ved hjelp av Expasy ProtParam programmet (https://Web.expasy.org/protparam/).
    3. Fortynne dialyzed protein 1:3 med buffer A, og deretter laste proteinet (5 mL/min). Samle gjennomstrømning i 10 mL fraksjoner.
  3. Fjern den anion Exchange-kolonnen fra FPLC-systemet. Koble en kontakt utvekslings kolonne til FPLC-systemet. Likevekt en kolonne med 30 mL som veksler med 3 Kol onne volumer med buffer A (5 mL/min).
    1. Legg flyten gjennom den anion utvekslings Kol onnen på 2-5 mL/min. vask kolonnen med buffer A til A280 går tilbake til grunnlinje nivå. Eluere proteinet med en 100 mL gradient (0-50% buffer B) og samle 10 mL fraksjoner.
      Merk: Den VEEV protease vil eluere på rundt 0,6 M NaCl.
    2. Inspiser kolonnen fraksjoner med SDS-PAGE. Kombiner fraksjoner som er > 95% ren og Konsentrer deg om en A280 ≈ 2 ved hjelp av 15 ml sentrifugal ultrafiltrering enheter. Enzymet kan være flash-frosset i flytende nitrogen og oppbevares ved-80 ° c.

4. assaying enzymet kontinuerlig ved hjelp av en plate leser

  1. Klargjør 50 mL analysebuffer (50 mM HEPES pH 7,0).
    1. Som alphaviral proteaser har relativt lave kCat verdier, fortynne enzymet i analysen buffer til 4,7 μM (dette vil grovt tilsvare en A280 = 0,2 for VEEV protease uten TRX).
    2. For å måle aktiviteten av enzymet, utarbeide et lager av substrat i analysen buffer med en konsentrasjon av 185 μM; Dette vil grovt tilsvare en A280 = 9. I 8 mikrosentrifugen rør, klargjør reaksjonsblandingen som vist i tabell 2 ved å kombinere de riktige volumene av 185 μM substrat lager og buffer. I en svart halv-område 96-brønn plate Pipet 45 μL av reaksjonen blandes inn i 3 brønner (kolonne 1, 2, 3). Rad A skal inneholde reaksjons miksen [S] = 5 μM, og Row H skal inneholde [S] = 140 μM-reaksjonen.
    3. Sett plate leseren til å detektere samtidig fluorescens ved to bølgelengder med en fast photomultiplier Tube (PMT) innstilling (f. eks lav):
      Bølgelengde 1 eksitasjon = 434 NM, utslipp = 527 NM
      Bølgelengde 2 eksitasjon = 434 NM, utslipp = 470 NM
    4. Sett lese tiden til 20 min (måling 1 lese per minutt) og velg brønnene som skal leses. Sett platen inn i plate leseren og mål den spontane frekvensen av hydrolyse i 20 min. Overvåk utslipps forholdene (utslipp på 527/utslipp ved 470) over tid.
    5. Kjør et endepunkt lese av platen som inneholder "UNCUT" substrat.
      Merk: Disse verdiene vil bli brukt i etterfølgende databeregninger. Gjennomsnittet av utslipps forholdene fra 3 brønner vil være verdiene i "UNCUT" substrat ved t = 0 i tabell 3.
    6. Fjern platen og Pipet 5 μL enzym i hver brønn. Les platen igjen i 20 min med 1 lese per minutt. Sett plate leseren til å sende absolutte verdier.
      Merk: For denne analysen, vil bakkene være negativ. Hver brønn vil inneholde et total volum på 50 μL.
    7. På slutten av lese, forsegle plate med film for å hindre fordampning. La platen ved romtemperatur over natten for å tillate enzymet å kutte underlaget helt.
    8. Etter ~ 24 h, Fjern tetnings filmen og Utfør et endepunkt lest av platen med samme avdrag som i tidligere platene. Gjennomsnittlig disse utslipps forholdene og innspill til tabell 3 under "cut". Bekreft kløften på underlaget ved hjelp av SDS-PAGE usammenhengende analysen beskrevet nedenfor (trinn 5,1.).
    9. Eksporter dataene til et regneark. Output de fluorescens enhetene på hvert tidspunkt for de 2 bølgelengdene (Tabell 4).
    10. Beregn nmol av underlaget som har blitt kuttet på tid t ved hjelp av ligningen (1) der X er utslipp ratio (527 NM/470 NM) på et gitt tidspunkt, neg er utslipp forholdet mellom "Uncut" substrat på t = 0, og POS er utslipps forholdet av helt "cut" substrat målt etter 24 h av skjæring (tabell 3).



      Merk: Representative fluorescens data vises for en brønn (vel E7) som inneholder 80 μM substrat (4 nmol av S per brønn) i Tabell 4. Beregningene ble utført for hver brønn i platen.
    11. For hver brønn, plot nmol g. time (min) og få den første hastigheter (bakker) ved å tilpasse dataene til y = MX + b. For data samlet i 4.1.5, plot nmol kontra tid (min) for hver brønn. Skråningen vil tilsvare nmol produkt produsert per minutt. Trekke den spontane utbredelsen av hydrolyse målt i 4.1.5 fra enzymet-katalysert reaksjons rater (tabell 5).
      Merk: Det for det første lese kan avklipt fra informasjonen hvis det er en artifactually høy på grunn av bevegelse av tallerkenen inn i plate leseren.
    12. Beregn mengden av enzymet i mg som ble lagt til hver brønn (f. eks, 0,0009 mg). En enhet er definert som et mikromol produkt produsert per minutt (mikromol/min). Del nmol/min av mg enzym til stede i brønnen for å få mU/mg; dividere med 1 000 for å få U/mg.
    13. Plot [S] μM på x-aksen og U/mg på y-aksen og tilpasse dataene til Michaelis-Menten ligningen for å få VMax og Km. Dette kan gjøres i programvaren (f. eks, GraFit).

5. assaying enzymet discontinuously ved hjelp av SDS-side analyse

  1. Forbered en 50 μL-reaksjon som inneholder 10 μM substrat og buffer i stedet for enzym og etikett som "UNCUT".
    Merk: Volumene av substrat og buffer er vist i tabell 2. Hvis den kontinuerlige analysen er kjørt, kan prøvene brukes direkte fra 96-brønn platen.
    1. Forbered en 50 μL-reaksjon som inneholder 10 μM substrat og 5 μL enzym og etikett som "CUT". Start timeren når enzymet tilsettes til underlaget.
      Merk: Hemmere kan tilsettes flere rør som inneholder enzym og substrat. Juster volumet av ekstra buffer for å kompensere for det ekstra volumet av inhibitor. Konsentrasjoner av DMSO bør ikke overstige 2%.
    2. Ruge reaksjonene for ~ 15-24 h ved romtemperatur (22 ± 3 ° c). Stopp reaksjonene ved å tilsette 50 μL av 2x Laemelli buffer. Etter å ha stoppet reaksjonen koke, hver tube for 3-10 min.
    3. Monter gel tank i henhold til produsentens anvisninger. Sett inn en 17-brønn pre-cast 12% polyakrylamid gel kassett og en buffer demning på den andre siden. Fyll den innvendige reservoaret av cellen med 1x SDS kjører buffer til bufferen når toppen av kassetten. Fyll den utvendige reservoaret halv full med samme buffer.
    4. Å analysere kløft ved hjelp av usammenhengende analysen, Load 5 μL av hver reaksjon blandingen i et kjørefelt av en SDS-side gel begynner med "UNCUT" reaksjon. Ta med en molekylvekt markør i første eller siste kjørefelt.
    5. Fest elektrodene på gel tank til strømforsyningen og skille produktene på 110 V for 60 min. Fjern gelen fra kassetten ved å sette inn sprengning verktøyet i mellom platene. Plasser gelen i et plast brett og senk gelen i 5-10 mL farge oppløsning; band vil være synlig innen 30 min. Etter 1-24 timer fjerne overflødig flekken, Senk gel i vann og bruke en gel imager å ta et bilde av gel.

6. docking substrat peptider til VEEV-nsP2 cystein protease

  1. Last ned koordinat filen for VEEV-cystein protease fra PDB (https://www.rcsb.org/). PDB-koden er 2HWK. Lagre filen som 2HWK. pdb.
    1. Klargjør protein strukturen ved hjelp av MOE (https://www.chemcomp.com/). Last protein PDB-filen inn i MOE. Klikk på Velg og løsemiddel på høyre sidebar og slette løsningsmidlet.
    2. Åpne strukturen forberedelse panelet fra toppen menylinjen protein. Korriger automatisk alle strukturelle elementer ved å klikke på riktig og protonere strukturen ved å klikke på Protonate3D. Legg til delvise belastninger på proteinet ved å åpne delvise gebyrer -panelet og velge Amber 99 og justere bygget og Lone-par etter behov. Til slutt lagrer du strukturfilen som "2HWK_dock. pdb".
  2. Bygg strukturen for substrat peptider (nsP12, nsP23, nsP34) og TRIM14 ved hjelp av MOE. Åpne protein Builder-panelet, angi substrat sekvensen, angi geometri som utvidet, og klikk på bygg. Strukturen vil bli vist i MOE vinduet.
    1. Minimer peptid strukturen ved å klikke Minimer på panelet. Lagre strukturen som en PDB-fil (figur 6).
  3. Forankre substrat peptider til VEEV-nsP2 ved hjelp av PyRx/AutoDock 4,2 (http://Autodock.Scripps.edu/). Åpne PyRx-verktøyet, Rediger preferanse innstillingen, Deaktiver alle torsions for ligand klargjøring. Last substrat molekylet, høyreklikk molekylet navnet på Navigator panelet, Velg make ligand å forberede ligand docking-fil. Last inn proteinet 2HWK_clean. pdb, og velg make Makromolekyl for å klargjøre pdbqt docking-fil (figur 7).
    1. Start veiviseren for AutoDock på forankrings panelet nederst. Velg de klargjorte ligand og protein filene. Definer proteinbindingen lommen ved å manuelt justere rutenettet dimensjon som er sentrert på katalysatoren rester cys-477. Bruke standard avstands parameter 0,375 å. Klikk på Run AutoGrid å generere rutenett kart.
    2. Kjør AutoDock og velg Lamarckian Genetisk algoritme (LGA)-metoden. Klikk på docking parametere og angi antall GA går til 50. Bruk standardparametrene for andre. Falle i staver opp på videresende å starte det merke løpe.
    3. Åpne analyser resultater -panelet. Undersøk alle antatte bindende positurer. Velg den beste modellen med lavest anslått bindende energi og rimelig bindende interaksjoner mellom cys-477 og substrat på kløften stedet. Lagre bindings modellen som PDB-fil for videre MD-simuleringer.

7. MD simuleringer av forankret VEEV-substrat komplekser

  1. Klargjør inndatafilene med Amber (http://ambermd.org/). Etter standardprotokollen, er MD simuleringer utført for spådde substrat bindende modeller ved hjelp av AMBER-pakken og ff99SB kraftfeltet.
    Merk: Solvated systemer utsettes for en grundig energi minimering før MD-simuleringer. Periodiske grense betingelser brukes for å simulere et kontinuerlig system. Den partikkel mesh Ewald (PME) metoden ble brukt for å beregne langtrekkende elektrostatiske interaksjoner. Den simulerte systemet ble først utsatt for en gradvis temperaturøkning fra 0 K til 300 K over 100 PS, og deretter equilibrated for 500 PS på 300 K, etterfulgt av produksjonen går av 2 NS lengde totalt.
    1. Kjør simulerings jobben på et databehandlings anlegg med høy ytelse. Våre simuleringer ble kjørt på Biowulf klyngen (https://HPC.nih.gov/) (Figur 8).
    2. Visualiser banen utgang ved hjelp av VMD programmet (http://www.KS.uiuc.edu/Research/VMD/). Analysere bindende interaksjoner og conformational endringer av underlag og TRIM14 innenfor det aktive området av nsP2 (figur 9).

Representative Results

SSHHPS analyse av ZIKV ns2B/3 protease identifisert 4 vert protein mål: FOXG1, SFRP1, en Gs Alpha delenhet fra en retinal cDNA bibliotek, og NT5M mitokondrie 5 ', 3 '-Nucleotidase (Figur 10)6. Spesielt, ingen annen metode spådd disse proteinene som potensielle mål av ZIKV protease. Mutasjoner i FOXG1 genet har vært knyttet til en medfødt syndrom preget av nedsatt utvikling og strukturelle hjerne unormalt som microcephaly. SFRP1 er en utskilt frizzled-relatert protein (SFRP); disse oppløselige reseptorer kan konkurransedyktig bind wnt ligander å antagonize og hemme wnt signalering. Wnt signal vei er involvert i reguleringen av IFN-responsen under Flavivirus-infeksjon36. Kløften av SFRP1 ville forventes å forsterke Flavivirus replikering. SFRP1 er også involvert i Th17-celle differensiering37. Sekvens justering av SSHHPS viste arter-spesifikke forskjeller i kløften området sekvenser (Figur 10D). Stedet sekvensen i SFRP1 var identisk hos mennesker og kyllinger. ZIKV kan indusere dødelighet og microcephaly i kylling embryo38. I gnagere, den svært bevarte P1 rester (K/R) R ↓ G er erstattet av en Glycine (RGG). Immunkompetente stammer av mus er generelt motstandsdyktig mot ZIKV infeksjon og sykdom39.

Steady state kinetisk parametre og hemming konstanter kan måles for viral polyprotein sekvenser og for verten protein sekvenser ved hjelp av kontinuerlig analysen i en plate leser31,40,41 (Figur 11a). For kvalitative kløft informasjon, for eksempel kløft av en bestemt sekvens eller hemming av protease av ulike forbindelser, kan den usammenhengende analysen brukes (Figur 11B).

Optimalisering av antall rester i mellom CFP og YFP kan være nødvendig. En substrat bundet modell kan lages ved hjelp av silisiummangan metoder. En representant forankret modell av nsP1/nsP2 krysset er vist i figur 9. For VEEV nsP2 protease hadde kløften av en 12-amino acid Semliki Forest virus (SFV) sekvensen blitt rapportert (Km = 0,58 mM)33. Forlenge underlaget sekvensen til 19, 22 og 25 rester og redusere den joniske styrken i bufferen førte til en betydelig reduksjon i Km. Undersøkelse av VEEV nsP2 krystallstruktur og krystall pakking viste også at en del av et av veikryss var pakket mot protease-domenet og ble vinkel. Dermed kan lengre VEEV underlag binde bedre på grunn av anerkjennelse av en sekundær strukturelle motiv.

For TRIM14, fikk vi en Km = 21 μM6,33. Km for underlaget som frakter verts protein sekvensen var sammenlignbar med Km -verdiene på underlag som inneholdt de virale polyprotein for område sekvenser (km(V12) = 12 μm og Km(V34) = 21 μm). Kløften området sekvenser på nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 og nsP3/nsP4 kryss ble kuttet med ulike effektivitet. I cellen antas dette å muliggjøre sekvensiell kløft av polyprotein42.

Det bør utvises forsiktighet ved tolkning av negative resultater. Hvis det ikke oppstår noen kløft, kan kløften være for kort eller renset protease kan være inaktiv. For underlag som er kuttet, er det behov for ytterligere eksperimenter for å bekrefte kløften av full lengde protein eller kløft i virus-infiserte celler. Passende oppfølgingseksperimenter bør velges. Effektene av overuttrykte eller demping av mål proteinet på viral replikering kan også testes.

Figure 1
Figur 1: tre mekanismer for å stanse. Å stanse kan forekomme på DNA-, RNA-eller protein nivået. Disse "Søk og slett" algoritmer hver bruker et "søkeord" for å lede kløften av en fil som inneholder ordet. Dette tallet har blitt modifisert fra Morazzani et al.32 og referansene deri. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: arter-spesifikke forskjeller i kløft området sekvenser. C-terminalen SNUSE/SPRY domener av TRIM14 homologe vises i justeringen. Den SPRY domenet kan identifiseres ved de bevarte motivene uthevet i grått. Human TRIM14 er kuttet på QEAGA ↓ G av VEEV nsP2 cystein protease. SSHHP-sekvensen vises i farger. Rester i grønt er P1 ' rester; i blått er P4 rester, og i rødt er andre bevarte rester i kløften stedet motiv sekvensen. Equine Harbor en avkortet versjon av TRIM14 mangler SNUSE/SPRY domenet. Lysin uthevet i cyan er Poly-ubiquitinated og er viktig for montering av MAVS signalosome. C-terminal SNUSE/SPRY domenet kan være midlertidig kuttet av nsP2 protease å svekke vertens antiviral respons intracellulært under en akutt viral infeksjon. I equine, er dette domenet alltid fraværende. Dette tyder på at det SNUSE/SPRY domenet til TRIM14 kan ha en beskyttende funksjon mot VEEV infeksjoner. Dette tallet er gjengitt fra Morazanni et al.6Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: SSHHPS-identifikasjon ved hjelp av blast. Kløften nettstedet motiv sekvensen på VEEV nsP1/nsP2 krysset er på linje med SSHHP sekvensen i verten protein TRIM14. Rester farget i grønt er P1 ' rester; i blått er P4 rester og i rødt er andre bevarte rester av kløften stedet motiv sekvensen. De fleste tilpasninger inneholdt homologi til regioner utenfor den bevarte kløften stedet motiv eller ikke inkluderte P1/P1 ' scissile Bond rester. TRIM14 viste en kamp til 6 rester i sekvensiell rekkefølge som inkluderte P1 og P1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: protein og DNA sekvenser av CFP-V12-YFP substrat for VEEV nsP2 cystein protease. Restriksjons områdene NdeI (CATATG) og XhoI (CTCGAG) vises med store bokstaver. I rødt er kløften området sekvensen fra viral polyprotein som er i mellom nsP1 og nsP2. Rester i grønt er P1 ' rester og i blått er P4 rester av kløften stedet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: protein sekvens av TRX-VEEV-nsP2 cystein protease konstruere. Thioredoxin (TRX) er vist i gult. Den trombin kløften og hans-tag er vist i cyan. Cys-His Dyad er merket med rødt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: peptid strukturer i Moe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: docking av substrat peptid bruker PyRx/AutoDock. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: jobber som kjører på Biowulf-klyngen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: modell av VEEV P12-substratet som inneholdt nsP1/nsP2-krysset. Cys-477/His-546 katalysatorer Dyad er vist i blått. Figur ble gjort ved hjelp Pymol (https://pymol.org). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: SSHHPS-analyse av Zika-viruset ns2B/ns3-protease. (A) spådde vert protein mål av ZIKV ns2B/ns3 protease. Rester i rødt matche en enkelt kløft området sekvens. Rester i grønt tolereres på det sekundære området og matcher rester på andre steder i kløften. SFRP1 hadde det høyeste antallet identiske rester i rekkefølge. (B) CFP-SUBSTRAT-YFP proteiner (~ 50-60 KDA) ble uttrykt og renset inneholder spådde SSHHP sekvensen fra hvert vert protein (Human). Den ZIKV protease kuttet menneskelige FOXG1, SFRP1, NT5M og en GsAlpha delenhet isolert fra en retinal cDNA bibliotek. Produktene fra kløften er ca. 28-30 kDa. Underlaget sekvenser er tilgjengelig i Morazzani et al.6 (C) mens ns2B/ns3 protease cut SFRP1, det gjorde ikke klippe sin homologe (SFRP2 og SFRP4). (D) justering av kløften steder fra ulike dyrearter kan være nyttig i å velge en dyr modell for et gruppe IV virus. Merk at den bevarte R ↓ G sekvensen er forskjellig mellom mennesker og gnagere i SFRP1. Figur gjengitt fra Morazzani et al.6Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: steady state kinetisk analyse ved hjelp av kontinuerlige og usammenhengende analyser. (A) kinetisk data vist i tabell 5 ble tegnet inn i GraFit. Det innfelte feltet viser Lineweaver-Burk-plottet. (B) SDS-side gel som viser kløften produkter av CFP-V12-YFP substrat. I kjørefelt 1 er "UNCUT" substrat (48 kDa). I Lane 2 er "CUT" substrat (31 kDa og 27 kDa). I baner 3-9 ulike forbindelser ble inkludert for å teste sin hemmende aktivitet. Lane 4 inneholder E64d kovalente inhibitor. Disse reaksjonene ble kjørt over natten for ~ 17 timer ved romtemperatur. Koking av prøvene var nødvendig for å oppnå den skarpe striper mønster. NsP2-protease er synlig (56 kDa) i reaksjonene som inneholder enzym, men ikke i kjørefelt 1. Lane 1 er "ingen enzym" kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Sekvens-spesifikk ødeleggelse av et protein eller en nukleinsyre syre guidet av en utenlandsk sekvens er bare sett i noen tilfeller i biologi. Mekanismene som vises i figur 1 er defensive mekanismer som beskytter en vert fra et virus, eller et virus fra en vert.

Bruke Bioinformatic metoder vi kan identifisere de målene som er ødelagt av disse systemene. I vår analyse av SSHHP sekvenser, oppdaget vi at mange av dem kunne finnes i proteiner som trengs for å generere medfødte immunresponser. Noen hadde åpenbare roller som Mavs og TRIF (tir-domene-som inneholder adapter-inducing interferon-β), mens andre var relatert til immunitet om mer komplekse mekanismer (f. eks histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Målet informasjon som er lagret i SSHHP sekvensen har potensial til å identifisere trasé som har antivirale effekter mot disse virusene. Antivirale responser i Vivo er ofte virus spesifikke26,43. For eksempel, delsett av trim proteiner har antivirale effekter på ulike virus43,44,45, noen er viral begrensning faktorer (f. eks, HIV og TRIM5α). Det spesielle ved trim proteiner (~ 70 har blitt identifisert) fortsatt blir undersøkt44,45. Informasjonen innen SSHHPS kan bidra til vår forståelse av hvordan disse virusene unngå medfødte immunresponser. Andre mønstre og sammenhenger kan bli avdekket som mer SSHHPS er undersøkt.

Det var tydelige forskjeller i arten i analysene våre (figur 2, Figur 10). Disse virusene er kjent for å påvirke noen arter mer enn andre. Informasjon om vertsområde, verts mottakelighet og verts beskyttelse kan være til stede i SSHHPS. For eksempel, equine, den mest mottakelige arter til Equine Encefalitt virus, manglet regionen menneskelige TRIM14 som ble midlertidig kuttet av VEEV nsP2 protease. Mennesker sjelden dør av VEEV infeksjoner, men kan være infisert24. Den menneskelige TRIM14 protein gjennomført en nsP2 protease kløft sekvens6. Tilstedeværelsen av kløft stedet tyder på at mennesker har en forsvarsmekanisme mot disse virusene. Fugler har vært antatt å være potensielle reservoarer av disse virusene46. Den tilsvarende SSHHP sekvensen i TRIM14 protein fra kyllinger forskjellig fra sekvenser som finnes i mennesker og andre arter. Subtile forskjeller som dette kan gjøre en mål vert protein uncleavable eller lettere kløyvde. Aguirre et al.16 viste at en UNCLEAVABLE mutert streng protein indusert høyere nivåer av IFN etter Dengue virus infeksjon og at mus naturlig bære en versjon av STING som ikke er kuttet av Dengue ns2B3 protease. Det murine STING proteinet ble ikke kuttet av ZIKV protease47. I vår SSHHPS analyse observerte vi også forskjeller i ZIKV protease kløft side sekvenser når vi sammenlignet de menneskelige proteinene med de av gnagere6 (Figur 10D). Gjengivelse av arter-spesifikke proteolytiske splittelsene av verten proteiner kan være viktig i dyremodeller som brukes for gruppe IV virus. Den hemming av verten protein kløften har også implikasjoner med hensyn til utvikling av gruppe IV protease hemmere. I vår forrige utgivelse, viste vi at vi kunne hemme TRIM14 kløft av VEEV nsP2 protease bruker CA074 methyl ester6. Dette resultatet tyder på at små molekyl hemmere av disse proteaser kan være i stand til å modulere de medfødte immunresponser som er i stand til å undertrykke infeksjonen6,31.

Genetisk variasjon i en Art har også potensiale til å produsere forskjeller i proteolytiske kløft. Subtile forskjeller i Codon bruk kan påvirke ribosom pause48. Siden noen gruppe IV virale proteaser er innebygd i ER-membranen, kan forskjellene i disse pauser påvirke kløften av et mål hvis kløften oppstår translationally. Noen av kløften områder som vi identifiserte var i spådd signal peptid sekvenser (f. eks SFRP1) mens andre var interne.

SSHHPS analyse kan produsere informasjon som avviker fra andre metoder for vert protein analyser. SSHHPS analyse var billig og enkel å ansette. Bruken av et bakteriell uttrykks system tillot testing av korte segmenter (~ 25 aminosyrer) av pattedyr sekvenser uten bruk av pattedyr cellekultur. Vi fant at CFP-YFP underlag var i stand til å tolerere alle de testede menneskelige protein sekvenser; imidlertid gir varierte. I lignende analyser, underlag som inneholder menneskelige protein sekvenser så lenge som 63 aminosyrer ble vellykket uttrykt, renset, og benyttet for kinetisk analyser og hemmer screening49,50,51. Siden bare små mengder av underlaget er nødvendig for usammenhengende analysen, kan et stort antall mål utforskes. En fordel med systemet er at CFP/YFP underlag kan brukes til SDS-side analyser og for mer forseggjort kinetisk analyser (dvs. IC50, ki, km, VMax). For narkotika oppdagelse kan hemmende stoffer produsere artefakter i fluorescerende analyser. Således, den usammenhengende analysen i kombinasjon med en kontinuerlig analysen tillater en å bekrefte kløft eller hemming av kløft. Prøvene for den usammenhengende SDS-PAGE-analysen kan tas direkte ut av 96-brønn platene. CFP/YFP underlag har blitt brukt til sammensatte biblioteket screening52. Det er imidlertid nødvendig med flere analyser for å avgjøre om et substrat er egnet for screening med høy gjennomstrømning, for eksempel beregning av en Z-faktor53.

En utfordring i å designe et substrat er å identifisere regionen rundt scissile bånd som er bundet og anerkjent av protease. I eksemplene som vises her, begynte vi med 12 rester sekvenser som var sentrert rundt scissile obligasjon. Etter å ha analysert sekvens justering av kløften nettsteder homologi til rester N-Terminal av scissile bindingen ble funnet for VEEV protease, mens for ZIKV protease homologi til flere av C-terminalen rester ble funnet. En i silisiummangan modell av forankret underlaget kan brukes til å designe site-regissert mutagenese eksperimenter som sonde bindingen områder av underlaget. Siden underlaget og enzymet sekvenser er på plasmider, enten kan være mutert til å teste i silisiummangan modeller eller sekundært område toleranser. Dette kan være en fordel hvis en krystallstruktur av bundet substrat (er) ikke er tilgjengelig.

SSHHPS analyse kan også gi ny informasjon om de mekanismer som virus-indusert fenotyper er produsert av viral enzymer. En av de ZIKV mål, SFRP1, er en del av wnt signalering Pathway og har roller i både hjerne og øye utvikling og i immunresponser36,37,54,55,56,57. Vi fant at de andre protein sekvenser som kunne kuttes av ZIKV ns2B/ns3 protease var også i proteiner involvert i hjerne-og øye utvikling; unormalt i begge har blitt observert i medfødt Zika syndrom og antas å være en del av viruset-indusert fenotype58.

Den forutsigbarhet av verts-patogen interaksjoner kan utnyttes for en rekke bruksområder: Target-spesifikke oncolytic viral terapi; de-risikere levende virusvaksiner; raffinement, prediksjon eller valg av dyremodeller; prediksjon av Host-Range eller mottakelighet; prediksjon av zoonotiske hendelser; og prediksjon av Host-forsvar. Siden metodene som beskrives er sekvens BAS ert, kan de være av verdi å innlemme i programvare i fremtiden.

Disclosures

De synspunktene her er de av forfatterne og representerer ikke de av den amerikanske marinen, US Army, US Department of Defense, eller den amerikanske regjeringen, eller den amerikanske regjering.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Defense Threat Reduction Agency (DTRA) prosjektnumre CB-SEED-SEED09-2-0061 og CBCall4-CBM-05-2-0019, og delvis av intramural/ekstra forskningsprogram av NCATS, NIH (XH) og Naval Research Laboratory base fond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL Erlenmeyer Flask VWR 89000-362
2-mercaptoethanol Acros Organics (Fisher) 125472500 Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.
4 L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap Millipore Sigma CLS49954L-1EA
AKTA Prime Plus GE Healthcare 17-0729-01
AKTA XK 16/20 Column GE Healthcare 28988937
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC501096
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC901096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC801024
Ampicillin Sigma A0166 Danger: Allergic reactions (skin or breathing).
Chelating Sepharose Fast Flow GE Healthcare 17-0575-02 Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.
Chloramphenicol RPI C61000 Danger: May cause cancer.
Corning 50 mL centrifuge tubes Corning 430828 Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface Corning 3993
Dialysis Tubing Clips Fisher Scientific PI68011
Disposable PD-10 Desalting Column GE Healthcare 17-0851-01
DNAse Sigma DN25-1G
DTT (DL-Dithiothreitol) RPI D11000-50.0 Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation
EDTA Fisher Scientific S311-500
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
Glycerol Acros Organics (Fisher) 15892-0010
HEPES Millipore Sigma H4034-1KG
Imidazole Acros Organics 301870010 Danger: Toxic, Irritant
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) Calbiochem (Millipore Sigma) 420291 Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.
Laemmli Sample Buffer BIO-RAD 1610737
Luria Bertani Agar Fluka (Millipore Sigma) L3027-1KG Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.
Luria Bertani Media Fisher Bioreagents BP1426-2
Lysozyme Sigma L4919-5g
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box BIO-RAD
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes Nalgene (Thermo Scientific) 3119-0050
Nanodrop Thermo Fisher
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator Eppendorf M1335
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific N73-500 Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C600003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C606003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
pet15b plasmid DNA Novagen (Millipore Sigma) 69661 GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.
pet32b Novagen (Millipore Sigma) 69016-3 The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free Thermo Fisher A32955 Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage
Plate Reader Molecular Devices Model M5
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard BIO-RAD 161-0373
Protein Extraction Reagent Novagen (Millipore Sigma) 70584-4 BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)
Q-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0510-01 Anion exchange resin
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels Expedeon BCG01227 Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used
RunBlue 20x SDS Running Buffer Expedeon NXB50500 Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x
RunBlue Instant Blue Gel Stain Expedeon ISB1L Do not dilute, use as directed
Sodium Chloride Fisher Chemical S271-10
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator Branson Ultrasonics (VWR) Model No. 101-063-346R Sonicator was used on level 5
Spectra/Por 6-8 kD MWCO Spectrum Labs 132645T Dialysis Tubing
SP-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0729-01 Cation exchange resin
Thrombin from bovine plasma Sigma T6634-500UN
Tris Base Fisher Scientific BP152-500 Caution: Eye/Skin Irritant

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, H., et al. Widespread Horizontal Gene Transfer from Double-Stranded RNA Viruses to Eukaryotic Nuclear Genomes. Journal of Virology. 84, (22), 11876-11887 (2010).
  2. Hagai, T., Azia, A., Babu, M. M., Andino, R. Use of host-like peptide motifs in viral proteins is a prevalent strategy in host-virus interactions. Cell Reports. 7, (5), 1729-1739 (2014).
  3. Gorbalenya, A. E. Host-related sequences in RNA viral genomes. Seminars in Virology. 3, 359-371 (1992).
  4. Shmakov, S. A., et al. The CRISPR Spacer Space Is Dominated by Sequences from Species-Specific Mobilomes. MBio. 8, (5), 1-18 (2017).
  5. Legler, P. M., Morazzani, E., Glass, P. J., Compton, J. R. Proteome Editing System and A Biomarker of Veev Infection. United States patent application. (2018).
  6. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  7. Alvarez, E., Castello, A., Menendez-Arias, L., Carrasco, L. HIV protease cleaves poly(A)-binding protein. Biochemical Journal. 396, (2), 219-226 (2006).
  8. Falk, M. M., et al. Foot-and-mouth disease virus protease 3C induces specific proteolytic cleavage of host cell histone H3. Journal of Virology. 64, (2), 748-756 (1990).
  9. Grigera, P. R., Tisminetzky, S. G. Histone H3 modification in BHK cells infected with foot-and-mouth disease virus. Virology. 136, (1), 10-19 (1984).
  10. Li, W., Ross-Smith, N., Proud, C. G., Belsham, G. J. Cleavage of translation initiation factor 4AI (eIF4AI) but not eIF4AII by foot-and-mouth disease virus 3C protease: identification of the eIF4AI cleavage site. FEBS Letters. 507, (1), 1-5 (2001).
  11. Kuyumcu-Martinez, M., et al. Calicivirus 3C-like proteinase inhibits cellular translation by cleavage of poly(A)-binding protein. Journal of Virology. 78, (15), 8172-8182 (2004).
  12. Pietila, M. K., Hellstrom, K., Ahola, T. Alphavirus polymerase and RNA replication. Virus Research. 234, 44-57 (2017).
  13. Hardy, W. R., Strauss, J. H. Processing the nonstructural polyproteins of sindbis virus: nonstructural proteinase is in the C-terminal half of nsP2 and functions both in cis and in trans. Journal of Virology. 63, (11), 4653-4664 (1989).
  14. Strauss, E. G., De Groot, R. J., Levinson, R., Strauss, J. H. Identification of the active site residues in the nsP2 proteinase of Sindbis virus. Virology. 191, (2), 932-940 (1992).
  15. Wang, D., et al. Foot-and-mouth disease virus 3C protease cleaves NEMO to impair innate immune signaling. Journal of Virology. 86, (17), 9311-9322 (2012).
  16. Aguirre, S., et al. DENV inhibits type I IFN production in infected cells by cleaving human STING. PLoS Pathogens. 8, (10), e1002934 (2012).
  17. Barral, P. M., Sarkar, D., Fisher, P. B., Racaniello, V. R. RIG-I is cleaved during picornavirus infection. Virology. 391, (2), 171-176 (2009).
  18. Elbashir, S. M., Lendeckel, W., Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Development. 15, (2), 188-200 (2001).
  19. Deveau, H., Garneau, J. E., Moineau, S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annual Review of Microbiology. 64, 475-493 (2010).
  20. Schechter, I., Berger, A. On the size of the active site in proteases I. Papain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 27, (2), 157-162 (1967).
  21. Bieniasz, P. D. Intrinsic immunity: a front-line defense against viral attack. Nature Immunology. 5, (11), 1109-1115 (2004).
  22. Zhou, Z., et al. TRIM14 is a mitochondrial adaptor that facilitates retinoic acid-inducible gene-I-like receptor-mediated innate immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 111, (2), E245-E254 (2014).
  23. Wang, S., et al. TRIM14 inhibits hepatitis C virus infection by SPRY domain-dependent targeted degradation of the viral NS5A protein. Scientific Reports. 6, 32336 (2016).
  24. Zacks, M. A., Paessler, S. Encephalitic alphaviruses. Veterinary Microbiology. 140, (3-4), 281-286 (2010).
  25. Hollidge, B. S., Weiss, S. R., Soldan, S. S. The role of interferon antagonist, non-structural proteins in the pathogenesis and emergence of arboviruses. Viruses. 3, (6), 629-658 (2011).
  26. Carthagena, L., et al. Human TRIM gene expression in response to interferons. PLoS One. 4, (3), e4894 (2009).
  27. Montgomery, S. A., Johnston, R. E. Nuclear import and export of Venezuelan equine encephalitis virus nonstructural protein 2. Journal of Virology. 81, (19), 10268-10279 (2007).
  28. Nenasheva, V. V., et al. Enhanced expression of trim14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunologic Research. 62, (3), 255-262 (2015).
  29. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, (1), 87-90 (2002).
  30. Li, M. Z., Elledge, S. J. SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in Molecular Biology. 852, 51-59 (2012).
  31. Hu, X., et al. Kinetic, Mutational, and Structural Studies of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Nonstructural Protein 2 Cysteine Protease. Biochemistry. 55, (21), 3007-3019 (2016).
  32. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  33. Zhang, D., Tozser, J., Waugh, D. S. Molecular cloning, overproduction, purification and biochemical characterization of the p39 nsp2 protease domains encoded by three alphaviruses. Protein Expression and Purification. 64, (1), 89-97 (2009).
  34. Lei, J., et al. Crystal structure of Zika virus NS2B-NS3 protease in complex with a boronate inhibitor. Science. 353, (6298), 503-505 (2016).
  35. Shiryaev, S. A., et al. Characterization of the Zika virus two-component NS2B-NS3 protease and structure-assisted identification of allosteric small-molecule antagonists. Antiviral Research. 143, 218-229 (2017).
  36. Smith, J. L., Jeng, S., McWeeney, S. K., Hirsch, A. J. A MicroRNA Screen Identifies the Wnt Signaling Pathway as a Regulator of the Interferon Response during Flavivirus Infection. Journal of Virology. 91, (8), (2017).
  37. Lee, Y. S., et al. The Wnt inhibitor secreted Frizzled-Related Protein 1 (sFRP1) promotes human Th17 differentiation. European Journal of Immunology. 42, (10), 2564-2573 (2012).
  38. Goodfellow, F. T., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells and Development. 25, (22), 1691-1697 (2016).
  39. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91, (8), (2017).
  40. Morazzani, E. M., et al. Books of Abstracts, 254th American Chemical Society National Meeting. Washington, D.C. (2017).
  41. Compton, J. R., Mickey, M. J., Hu, X., Marugan, J. J., Legler, P. M. Mutation of Asn-475 in the Venezuelan Equine Encephalitis Virus nsP2 Cysteine Protease Leads to a Self-Inhibited State. Biochemistry. 56, (47), 6221-6230 (2017).
  42. Vasiljeva, L., et al. Regulation of the sequential processing of Semliki Forest virus replicase polyprotein. Journal of Biological Chemistry. 278, (43), 41636-41645 (2003).
  43. Uchil, P. D., Quinlan, B. D., Chan, W. T., Luna, J. M., Mothes, W. TRIM E3 ligases interfere with early and late stages of the retroviral life cycle. PLoS Pathogens. 4, (2), e16 (2008).
  44. Ozato, K., Shin, D. M., Chang, T. H., Morse, H. C. 3rd TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity. Nature Reviews Immunology. 8, (11), 849-860 (2008).
  45. van Tol, S., Hage, A., Giraldo, M. I., Bharaj, P., Rajsbaum, R. The TRIMendous Role of TRIMs in Virus-Host Interactions. Vaccines (Basel). 5, (3), (2017).
  46. Molaei, G., et al. Dynamics of Vector-Host Interactions in Avian Communities in Four Eastern Equine Encephalitis Virus Foci in the Northeastern U.S. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, (1), e0004347 (2016).
  47. Ding, Q., et al. Species-specific disruption of STING-dependent antiviral cellular defenses by the Zika virus NS2B3 protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 115, (27), E6310-E6318 (2018).
  48. Angov, E., Legler, P. M., Mease, R. M. Adjustment of codon usage frequencies by codon harmonization improves protein expression and folding. Methods in Molecular Biology. 705, 1-13 (2011).
  49. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Analytical Biochemistry. 411, (2), 200-209 (2011).
  50. Hu, X., et al. Structural insight into exosite binding and discovery of novel exosite inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A through in silico screening. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28, (7), 765-778 (2014).
  51. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Applied and Environmental Microbiology. 78, (21), 7687-7697 (2012).
  52. Nguyen, T. G., et al. Development of fluorescent substrates and assays for the key autophagy-related cysteine protease enzyme ATG4B. Assay and Drug Development Technologies. 12, (3), 176-189 (2014).
  53. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, (2), 67-73 (1999).
  54. Bovolenta, P., Esteve, P., Ruiz, J. M., Cisneros, E., Lopez-Rios, J. Beyond Wnt inhibition: new functions of secreted Frizzled-related proteins in development and disease. Journal of Cell Science. 121, (Pt 6), 737-746 (2008).
  55. Esteve, P., et al. SFRPs act as negative modulators of ADAM10 to regulate retinal neurogenesis. Nature Neuroscience. 14, (5), 562-569 (2011).
  56. Garcia-Hoyos, M., et al. Evaluation of SFRP1 as a candidate for human retinal dystrophies. Molecular Vision. 10, 426-431 (2004).
  57. Marcos, S., et al. Secreted frizzled related proteins modulate pathfinding and fasciculation of mouse retina ganglion cell axons by direct and indirect mechanisms. Journal of Neuroscience. 35, (11), 4729-4740 (2015).
  58. Moore, C. A., et al. Characterizing the Pattern of Anomalies in Congenital Zika Syndrome for Pediatric Clinicians. JAMA Pediatrics. 171, (3), 288-295 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics