Análise do Grupo IV Viral SSHHPS usando métodos in vitro e em silico

Immunology and Infection
 

Summary

Apresentamos um protocolo geral para identificar trechos curtos de sequências de proteínas homologous hospedeiras-patógenos (SSHHPS) incorporadas na poliproteína viral. SSHHPS são reconhecidos por proteases virais e direcionam a destruição direcionada de proteínas hospedeiras específicas por vários vírus do Grupo IV.

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Hu, X., Compton, J. R., Legler, P. M. Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods. J. Vis. Exp. (154), e60421, doi:10.3791/60421 (2019).

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Abstract

As enzimas alfavirais são sintetizadas em um único polipeptídeo. A poliproteína não estrutural (nsP) é processada por sua protease de cisteína nsP2 para produzir enzimas ativas essenciais para a replicação viral. Proteases virais são altamente específicos e reconhecem sequências conservadas de motivos do local de clivagem (~6-8 aminoácidos). Em vários vírus do Grupo IV, as sequências de motivos do local de clivagem nsP podem ser encontradas em proteínas hospedeiras específicas envolvidas na geração das respostas imunes inatas e, em alguns casos, as proteínas alvo parecem estar ligadas ao fenótipo induzido pelo vírus. Esses vírus utilizam trechos curtos de sequências de proteínas homologous de agengários de acolhimento-patógeno (SSHHPS) para destruição direcionada de proteínas hospedeiras. Para identificar sshhps o viral protease clivagem site motivo seqüências podem ser inseridas em blast e o host genoma (s) pode ser pesquisado. A clivagem inicialmente pode ser testada usando os substratos purificados de proteção viral nsP e fluorescência de ressonância (FRET) feitos em E. coli. Os substratos do FRET contêm a proteína fluorescente do ciano e do amarelo e a seqüência do local da clivagem (CFP-seqüência-YFP). Este ensaio protease pode ser usado continuamente em um leitor de placa ou descontinuadamente em géis SDS-PAGE. Modelos dos substratos peptídeos encadernados podem ser gerados em silico para orientar a seleção de substratos e estudos de mutagênese. Os substratos cfp/yfp também têm sido utilizados para identificar inibidores da protease. Estes métodos in vitro e em silico podem ser usados em combinação com ensaios baseados em células para determinar se a proteína hospedeira direcionada afeta a replicação viral.

Introduction

Evidências de transferência horizontal de genes do vírus para hospedeiro, ou hospedeiro para vírus, podem ser encontradas em uma variedade de genomas1,2,3,4. Exemplos de endogenização viral são as sequências de espaçador CRISPR encontradas em genomas de hospedeiros bacterianos4. Recentemente, encontramos evidências de sequências de proteínas hospedeiras incorporadas nas poliproteínas não estruturais dos vírus (+)ssRNA Group IV. Essas sequências dentro das regiões de codificação do genoma viral podem ser propagadas geracionalmente. Os curtos trechos de sequências de proteínas homologous de acolhimento-patógeno (SSHHPS) são encontrados no vírus ehospedeiros5,6. SSHHPS são as seqüências conservadas do motivo do local da clivagem reconhecidas pelas proteases virais que têm a homologia às proteínas específicas do anfitrião. Estas sequências direcionam a destruição de proteínas hospedeiras específicas.

Em nossa publicação anterior6, compilamos uma lista de todas as proteínas hospedeiras que foram alvo de proteases virais e descobrimos que a lista de alvos não era aleatória(Tabela 1). Duas tendências eram aparentes. Primeiro, a maioria das proteases virais que cortam proteínas hospedeiras pertencia aos vírus do Grupo IV (24 dos 25 casos envolveram proteases virais do Grupo IV) e uma protease pertencia aos retrovírus (+)ssRNA Group VI (HIV, vírus da imunodeficiência humana)7. Em segundo lugar, os alvos proteicos hospedeiros que estão sendo cortados pelas proteases virais estavam geralmente envolvidos na geração das respostas imunes inatas, sugerindo que as clivagens tinham a intenção de antagonizar as respostas imunes do hospedeiro. Metade das proteínas hospedeiras visadas pelas proteases virais eram componentes conhecidos de cascatas de sinalização que geram interferon (IFN) e citocinas proinflamatórias(Tabela 1). Outros estavam envolvidos na transcrição celular anfitrião 8,9,10 ou tradução11. Curiosamente, Shmakov et al.4 mostraram que muitas sequências de protospacer CRISPR correspondem a genes envolvidos na conjugação plasmídea ou replicação4.

Grupo IV inclui, entre outros, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae, e Togaviridae. Vários patógenos novos e emergentes pertencem ao Grupo IV, como o vírus Zika (ZIKV), Nilo Ocidental (WNV), Chikungunya (CHIKV), vírus grave da síndrome respiratória aguda (SARS) e vírus da síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS). O genoma (+)ssRNA é essencialmente um pedaço de mRNA. Para produzir as enzimas necessárias para a replicação do genoma, o genoma (+)ssRNA primeiro deve ser traduzido. Em alfavírus e outros vírus do Grupo IV, as enzimas necessárias para a replicação são produzidas em uma única poliproteína (ou seja, nsP1234 para VEEV). A poliproteína não estrutural (nsP) é processada proteolíticamente (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) pelo nsP2 protease para produzir enzimas ativas12 (Figura 1). A clivagem da poliproteína pela protease nsP2 é essencial para a replicação viral; isso tem sido demonstrado pela deleção e mutagênese dirigida pelo local da cisteína do site ativo do nsP2 protease13,14. Notavelmente, a tradução de proteínas virais precede eventos de replicação do genoma. Por exemplo, o nsP4 contém a polimererase de RNA dependente de RNA necessária para replicar o genoma (+)ssRNA. A replicação do genoma pode produzir intermediários do dsRNA; estes intermediários podem desencadear as respostas imunes inatas do hospedeiro. Assim, estes vírus podem apegar o hospedeiro proteínas de resposta imune inata no início da infecção, a fim de suprimir seus efeitos15,16,17.

Silenciar pode ocorrer no nível de DNA, RNA e proteína. O que é comum a cada um dos mecanismos de silenciamento mostrados na Figura 1 é que curto DNA estrangeiro, RNA ou sequências de proteínas são usados para guiar a destruição de alvos específicos para antagonizar sua função. Os mecanismos de silenciamento são análogos a programas de "busca e exclusão" que foram escritos em três idiomas diferentes. A seqüência do site de clivagem curta é análoga a uma "palavra-chave". Cada programa tem uma enzima que reconhece a correspondência entre a seqüência curta (a "palavra-chave") e uma palavra no "arquivo" que deve ser excluído. Uma vez que uma correspondência é encontrada, a enzima corta ("exclui") a sequência de alvo maior. Os três mecanismos mostrados na Figura 1 são usados para defender o hospedeiro de vírus, ou para defender um vírus do sistema imunológico de um hospedeiro.

Proteases virais reconhecem seqüências de motivos curtos do local de clivagem entre ~2-11 aminoácidos; em nucleotídeos, isso corresponderia a bases 6-33. Para comparação, as sequências de espaçadores CRISPR são ~26-72 nucleotídeos e RNAi são ~20-22 nucleotídeos18,19. Embora essas sequências sejam relativamente curtas, elas podem ser reconhecidas especificamente. Dada a maior diversidade de aminoácidos, a probabilidade de um evento de clivagem aleatória é relativamente baixa para uma protease viral reconhecendo sequências de proteínas de 6-8 aminoácidos ou mais. A previsão de SSHHPS em proteínas hospedeiras dependerá em grande parte da especificidade da protease viral que está sendo examinada. Se a protease tem requisitos rigorosos de especificidade seqüência a chance de encontrar uma seqüência de local de clivagem é 1/206 = 1 em 64 milhões ou 1/208 = 1 em 25,6 bilhões; no entanto, a maioria das proteases têm tolerâncias variáveis subsite (por exemplo, R ou K pode ser tolerado no site S1). Consequentemente, não há nenhuma exigência para a identidade da seqüência entre as seqüências encontradas no hospedeiro contra o vírus. Para proteases virais que têm requisitos de seqüência mais soltos (como aqueles pertencentes a Picornaviridae), a probabilidade de encontrar um local de clivagem em uma proteína hospedeira pode ser maior. Muitas das entradas na Tabela 1 são da família Picornaviridae.

A notação20 de Schechter & Berger é comumente usada para descrever os resíduos em um substrato protease e os subsites aos quais eles se ligam, utilizamos essa notação por toda parte. Os resíduos no substrato que são n-terminal da ligação scissile são denotados como P3-P2-P1, enquanto aqueles que são C-terminal são denotados como P1'-P2'-P3'. Os subsites correspondentes na protease que ligam esses resíduos de aminoácidos são S3-S2-S1 e S1'-S2'-S3', respectivamente.

Para determinar quais proteínas hospedeiras estão sendo direcionadas, podemos identificar SSHHPS nos locais de clivagem de poliproteína viral e procurar as proteínas hospedeiras que as contêm. Aqui, descrevemos procedimentos para identificar SSHHPS usando sequências conhecidas do site de clivagem protease viral. Os métodos bioinformatic, os ensaios do protease, e nos métodos do silico descritos são pretendidos ser usados conjuntamente com os ensaios pilha-baseados.

Alinhamentos sequenciais das proteínas hospedeiras alvo de proteases virais revelaram diferenças específicas de espécies dentro dessas sequências curtas do local de clivagem. Por exemplo, o vírus venezuelano da encefalite equina (VEEV) protease nsP2 foi encontrado para cortar trim14 humano, um motivo tripartite (TRIM) proteína6. Algumas proteínas TRIM são fatores de restrição viral (por exemplo, TRIM5α21), a maioria é pensada para ser ligases ubiquitin E3. TRIM14 não tem um anel (realmente interessante novo gene) domínio e não é pensado para ser um E3 ligase22. Trim14 foi proposto para ser um adaptador no signalosome antiviral mitocondrial (MAVS)22, mas pode ter outras funções antivirais23. Alinhamento de seqüências TRIM14 de várias espécies mostra que equino falta o local de clivagem e abrigar uma versão truncada de TRIM14 que está faltando o c-terminal PRY / domínio SPRY. Este domínio contém um site de poliubiquitinação (Figura 2). Em equino, estes vírus são altamente letais (~ 20-80% mortalidade), enquanto em seres humanos apenas ~ 1% morrem de infecções VEEV24. Clivagem do domínio PRY / SPRY pode transitoriamente curto-circuito do MAVS sinalização cascata. Esta cascata pode ser desencadeada por dsRNA e leva à produção de interferon e citocinas pró-inflamatórias. Assim, a presença do SSHHPS pode ser útil para prever quais espécies têm sistemas de defesa contra vírus específicos do Grupo IV.

Nos vírus do Grupo IV, acredita-se que os mecanismos de antagonismo ifn se multiplicam25redundantes. A clivagem da proteína do anfitrião pode ser transitória durante a infecção e as concentrações podem recuperar sobre o tempo. Encontramos nas células que os produtos de clivagem TRIM14 poderiam ser detectados muito cedo após a transfecção (6 h) com um plasmídeo codificando a protease (promotor de citomegalovírus). No entanto, em períodos mais longos, os produtos de clivagem não foram detectados. Em células infectadas pelo vírus, a cinética era diferente e produtos de clivagem podiam ser detectados entre 6-48 h6. Outros relataram o aparecimento de produtos de clivagem de proteína hospedeiro tão cedo quanto 3-6 h pós infecção9,11.

A atividade proteolítica nas células é muitas vezes difícil de capturar; os produtos de clivagem podem variar em sua solubilidade, concentração, estabilidade e vida. Em ensaios baseados em células, não se pode supor que os produtos de clivagem se acumularão em uma célula ou que as intensidades da banda de proteína cortada e sem cortes mostrarão aumentos e diminuições compensatórias à medida que a proteína cortada pode ser degradada muito rapidamente e pode não ser detectável em uma mancha ocidental com um peso molecular esperado (MW) (por exemplo, a região que contém a epítops poderia ser abarcada por outras proteases hospedeiras ou poderia ser ubiquitada). Se o substrato da protease viral é uma proteína de resposta imune inata, sua concentração pode variar durante a infecção. Por exemplo, algumas proteínas inatas de resposta imune estão presentes antes da infecção viral e são induzidas ainda mais pelo interferon26. A concentração da proteína alvo pode, portanto, flutuar durante a infecção e comparação de lysates celulares não infectados podem ser difíceis de interpretar. Além disso, todas as células podem não estar igualmente infectadas ou infectadas. Os ensaios de protease in vitro usando proteínas purificadas de E. coli, por outro lado, têm menos variáveis para controlar e tais ensaios podem ser feitos usando SDS-PAGE em vez de imunoblots. A contaminação de proteases pode ser inibida nos primeiros passos da purificação de proteínado substrato CFP/YFP, e proteases virais mutadas podem ser purificadas e testadas como controles para determinar se a clivagem é devido à protease viral ou a uma protease bacteriana contaminante.

Uma limitação dos ensaios protease in vitro é que eles não têm a complexidade de uma célula de mamíferos. Para que uma enzima corte seu substrato, os dois devem ser co-localizados. Proteases virais do grupo IV diferem na estrutura e localização. Por exemplo, a protease ZIKV está incorporada na membrana reticulum (ER) e enfrenta o citosol, enquanto a protease VEEV nsP2 é uma proteína solúvel no citoplasma e núcleo27. Algumas das seqüências do local da clivagem encontradas na análise de ZIKV SSHHPS estavam nos peptides do sinal que sugerem que a clivagem pudesse ocorrer co-translationally para alguns alvos. Assim, a localização da protease e do substrato na célula também precisa ser considerada nessas análises.

Os ensaios baseados em células podem ser valiosos para estabelecer um papel para a proteína hospedeira identificada (s) na infecção. Métodos que visam deter a clivagem protease viral de proteínas hospedeiras, como a adição de um inibidor de protease6 ou uma mutação no alvo hospedeiro16, podem ser usados para examinar seus efeitos na replicação viral. A superexpressão da proteína alvo também pode afetar a replicação viral28. Ensaios de placa ou outros métodos podem ser usados para quantificar a replicação viral.

Protocol

1. Bioinformática: Identificação de SSHHPS no genoma do anfitrião usando explosão

Nota: Proteína BLAST pode ser encontrada em blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

  1. Entrada ~ 20 aminoácidos em torno da ligação scissile na poliproteína viral. Selecione sequências de proteínanão redundantes e digite no genoma do hospedeiro para ser pesquisado (por exemplo, Homo sapiens).
    1. Se necessário, selecione PHI-BLAST. Digite uma seqüência de padrão (por exemplo, para os 25 resíduos de V12 mostrados abaixo digite o padrão "AG" sem citações).



      Nota: No PHI-BLAST, suportes quadrados [XY] indicam que o aminoácido X ou Y pode estar na posição do subsite (por exemplo, AG[AC][GAY]).
    2. Inspecione os resultados do BLAST e identifique os acertos que possuem identidade de alta sequência para resíduos conservados nos locais de clivagem de poliproteína (por exemplo, proteína de motivo tripartite 14) (Figura 3).
      Nota: Para proteases serinases maior conservação do resíduo P1 é esperado, enquanto para proteases cisteína maior conservação do resíduo P2 é esperado.
    3. Colorir os resíduos que são idênticos a uma seqüência do local de clivagem e estão em ordem sequencial (sem lacunas). Colorir os resíduos tolerados no subsite, mas presente em um local de clivagem diferente em uma segunda cor.
      Nota: Resíduos que representam substituições conservadoras (por exemplo, Leu vs Val) que não estão presentes em um local de clivagem viral também podem ser encontrados e podem ou não ser reconhecidos pela protease viral.
    4. Rank ordem o BLAST hits com base no número de resíduos idênticos ou tolerados consecutivos que correspondem a uma seqüência de site de clivagem. A partir da lista, selecione as proteínas contendo ≥6 resíduos idênticos ou similares para análise em ensaios protease.
    5. Repita o procedimento para os outros locais de clivagem (nsP2/3, nsP3/4, etc.) e gradualmente fortaleça a previsão adicionando resíduos mais altamente conservados ao padrão PHI-BLAST.

2. Ensaios in vitro: Projetar e preparar substratos protease

  1. Construa um plasmídeo codificando a proteína fluorescente ciana (PCP), ≤25 aminoácidos da seqüência do local da clivagem, seguido pela proteína fluorescente amarela (YFP, também conhecida como Vênus29).
    Nota: O plasmídeo pode ser construído usando a clonagem independente da seqüência e da ligadura (SLIC)30 ou a síntese comercial do gene. Um plasmid pet15b contendo a seqüência mostrada na Figura 4 foi sintetizado comercialmente e foi usado aqui.
    1. Para otimizar o comprimento do substrato, construa substratos adicionais de FRET de comprimento variável contendo 12-25 aminoácidos das sequências naturais do local de clivagem poliproteína viral usando uma reação slic de 2 fragmentos. Analise a clivagem usando o ensaio baseado em gel SDS-PAGE ou medindo parâmetros cinéticos estaduais estáveis usando os métodos abaixo.
      Nota: Em alguns casos, os locais de clivagem podem ser identificados pela homologia para locais de clivagem conhecidos31. Se a clivagem dos substratos que contêm as sequências de junção de poliproteína não for observada, pode haver uma exigência de resíduos adicionais ou um motivo estrutural (por exemplo, uma hélice alfa32). Alternativamente, a protease viral purificada pode ser inativa. Confirme a clivagem das sequências de poliproteína viral antes de prosseguir a análise do SSHHPS. O número de resíduos no substrato foi otimizado para a protease VEEV utilizando substratos de comprimento variável (12 a 25 aminoácidos), seguido s uma análise de Vmax e Km32,33. Os locais de clivagem protease ns2B/nsB viral do Zika usados nos exemplos foram publicados34,35.
  2. Prepare os substratos CFP/YFP transformando recentemente 8-20 μL de BL-21 (DE3)E. colicélulas competentes com o plasmid CFP-V12-YFP de acordo com as instruções do fabricante e placa em placas de ágar Luria Bertani (LB) contendo 50 μg/mL Ampicillin (37 °C).
    1. Autoclave quatro frascos 4 L contendo mídia LB (1,5 L media por frasco) e 100 mL de LB em um frasco de 250 mL. Tampe cada frasco com folha de alumínio.
    2. Inocular a cultura de 100 mL com uma colônia das bactérias recém-transformadas e crescer a 37 °C com agitação (200 rpm) durante a noite.
    3. Para fazer o substrato CFP/YFP, inocular quatro frascos 4 L com 25 mL de uma cultura durante a noite. Comece a agitar as culturas a 37 °C e monitorar o crescimento da espectroscopia UV-vis a 600 nm por hora.
    4. Quando as bactérias atingem uma absorção de ~1.0 em 600 nm (aproximadamente ~3-4 h do crescimento) induzem a expressão da proteína adicionando 0.5 mL de 1 M isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) por frasco. Depois de adicionar IPTG, baixar a temperatura da incubadora tremendo para 17 °C e permitir que a expressão continue durante a noite por 17-20 h.
    5. Pelotas as bactérias usando uma centrífuga de alta velocidade em 7.000 x g por 10 min (4 °C) e reter as pelotas. Retire e descarte os meios de comunicação líquidos. Armazenar as pelotas em -80 °C ou lyse imediatamente.
    6. Prepare 100 mL de ltampão de lúse contendo 50 mM Tris pH 7.6, 500 mM NaCl, 35 mL de reagente de extração de proteína bacteriana, 30 mg de lysozyme, 25 U de DNase e 1 comprimido inibidor de protease. Resuspenda as pelotas no amortecedor da lyse com uma pipeta e transfere ~25-35 mL em tubos cónicos descartáveis de 50 mL.
    7. Coloque os tubos em um copo de plástico contendo água gelada. Insira a ponta sonicator nos tubos para que a ponta é de ~ 1 cm da parte inferior do tubo e sonicate as lisates 10-20 vezes no nível 5 para intervalos de 15 s até que o lisato torna-se fluido e liquefeito.
      Nota: Use proteção auditiva durante a sonoridade.
    8. Transfira o lysate para tubos de centrífuga de alta velocidade e centrífuga a 20.500 x g por 30 min a 4 °C. Após a rotação, retenha o supernatant (~100 mL) e transfira-o a um frasco limpo. Descarte as pelotas.
    9. Prepare 1 L de Buffer A (50 mM Tris pH 7.6, 500 mM NaCl). Prepare 300 mL de Buffer B (50 mM Tris pH 7.6, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazole).
    10. Equilibre uma coluna de níquel de 100 mL usando 3 volumes de coluna de Buffer A e uma taxa de fluxo de 5 mL/min.
    11. Carregue o lysate na coluna de níquel usando uma taxa de fluxo de 2 a 5 mL/min. Lave a coluna com 2 volumes de coluna de Buffer A, seguido por ~ 5 volumes de coluna de 20% Buffer B. Durante a lavagem tampão B de 20%, a absorção em 280 nm (A280)aumentará à medida que os contaminantes eluteda da coluna durante a lavagem. Continue lavando a coluna até que o A280 do eluate tenha retornado aos valores de base.
    12. Elute a proteína com volumes de 2-3 colunas de 100% Buffer B usando uma taxa de fluxo de 2-5 mL/min e coletar 10 frações mL. Medir o A280 de cada fração.
    13. Combine e concentre frações contendo A280 > 0.1 usando uma unidade centrífuga de ultrafiltração de 15 mL. Gire as unidades de ultrafiltração em 5.000 x g por 15 min e continue a adicionar frações até que o volume tenha sido reduzido para ~50-75 mL.
    14. Corte um pedaço de 14 polegadas de tubos de diálise com um corte de peso molecular (MWCO) de 6-8 kDa. Hidrate a tubulação da diálise fervendo a inteiramente submersa em 300 mL da água para 10 min. desime um nó seguro em uma extremidade da membrana. Encha o saco com tampão da diálise para assegurar-se de que nenhuma rachadura ou escapes estejam atuais. Retire o tampão do saco e mantenha o saco submerso no tampão de diálise.
    15. Transfira a proteína concentrada de 2.2.13 no saco da diálise com uma pipeta plástica. Retire todas as bolhas de ar do saco. Feche o saco com um segundo nó ou um clipe de diálise. Diálise a proteína contra 500 mL de 50 mM Tris pH 7.6, 5 mM EDTA (ácido tetraástico etilediamina), 250 mM NaCl em um cilindro graduado de 500 mL durante a noite a 4 °C.
    16. Diálise a proteína uma segunda vez contra 500 mL de 50 mM Tris pH 7.6 a 4 °C para 2 h.
  3. Para a coluna de troca de anião prepare 500 mL de Buffer A (50 mM Tris pH 7.6) e 500 mL Buffer B (50 mM Tris pH 7.6, 1.0 M NaCl). Equilibre uma coluna de troca de anião de 30 mL com 3 volumes de coluna de Buffer A (2-5 mL/min).
    1. Retire a proteína do saco de diálise e transfira para uma garrafa. Mantenha a garrafa no gelo. Carregue a proteína dilívida na coluna (2-5 mL/min).
      Nota: A proteína CFP/YFP ligará a coluna e será amarela na aparência.
    2. Lave a coluna com Buffer A até que o A280 retorne à linha de base (5 mL/min). Elute a proteína usando um gradiente (0-50% Buffer B, 100 mL) e coletar 10 frações mL.
    3. Inspecione as frações de coluna usando sds-page. Combine aqueles que são >95% puros.
    4. Concentre a proteína em um A280 ~10-20 usando uma unidade centrífuga de ultrafiltração de 15 mL. Gire o concentrador em 4.500 x g por 10 min a 4 °C e continue a adicionar proteína até que todas as frações contendo proteína tenham sido combinadas.
  4. Retire cuidadosamente a proteína do concentrador com uma pipeta. Aliquot a proteína em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e congelamento de flash em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo a -80 °C. Buffer trocar a proteína à temperatura ambiente usando uma coluna PD-10 equilibrada com o buffer ensaio apropriado antes do uso.
  5. O uso da lei da Cerveja calcula a concentração de proteínas usando o A280 e um coeficiente de extinção calculado (por exemplo, para o substrato V12 = 47.790 M-1 cm-1).
    Nota: O coeficiente de extinção pode ser calculado a partir da sequência de proteínas na Figura 4 usando o programa Expasy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/).

3. Preparação do Alphaviral nsP2 Cysteine Protease

  1. Projete e construa um plasmídeo codificando a protease. Para proteases de cisteína, use o plasmídeo pet32 para construir uma proteína de fusão de tiaedoxina (Trx).
    Nota:O plasmídeo pet32 codifica um local de clivagem de trombina (LVPRGS) para a remoção da tiaoredoxina e sua marca (Figura 5). Thioredoxin ajudará a manter a cisteína do local ativo em um estado reduzido durante a expressão. Para proteases serinas, a tiaoredoxina não é necessária e as etapas que envolvem sua remoção pela trombina podem ser omitidas. A seqüência de protease veev nsP2 foi incorporada em um plasmídeo pet32b que foi preparado comercialmente para evitar o manuseio de agentes selecionados.
    1. Transformar recentemente o DNA plasmídeo em BL21 (DE3) pLysS E. coli de acordo com as instruções do fabricante. Placa da bactéria em placas de ágar LB contendo Ampicilina.
      Nota: Chloramphenicol é usado somente para as tensões de E. coli que carreg o plasmid do pLysS e é omitido se as pilhas BL21 (DE3) são usadas. Não é necessário incluir chloramphenicol na placa de ágar LB nesta etapa.
    2. Autoclave quatro frascos 4 L de 1,5 L de mídia LB (6 L volume total) e 100 mL de LB em um frasco de 250 mL. Tampe cada frasco com folha de alumínio.
    3. Inocular uma cultura de 100 mL durante a noite de LB / Ampicillin com uma colônia da placa e crescer em uma incubadora tremendo (200 rpm) em 37 °C.
    4. Inocular os frascos 4 L com 25 mL da cultura durante a noite e adicione os antibióticos apropriados.
      Nota: A mídia para as células pLysS BL21 (DE3) que transportam o plasmídeo pet32 deve ter concentrações finais de 25 μg/mL chloramphenicol e 50 μg/mL Ampicillin.
    5. Induja a expressão da proteína adicionando 0.5 mL de IPTG à cultura quando a absorção em 600 nm alcanga 1.0. Diminua a temperatura da incubadora de agitação para 17 °C. Permitir que a expressão continue durante a noite (~17 h).
    6. Pelotas as células por centrífuga (7.000 x g para 10 min em 4 °C). Retire e descarte os meios de comunicação líquidos.
      Nota: As pelotas podem ser armazenadas a -80 °C por meses ou lysed imediatamente.
    7. Prepare 100 mL de ltampão de lise (50 mM Tris pH 7.6, 500 mL NaCl, 2 mM beta mercaptoethanol (BME), 30 mg de lisozyme, 5% glicerol, 25 U DNase, 35 mL de extração de proteína bacteriana reagente). Abra garrafas de BME em um capô químico ao adicionar. Mantenha o lysate bacteriano no gelo ou em 4 °C para este e todas as etapas subseqüentes.
      Nota: Para proteases de cisteína, 2 mM BME está incluído para manter a cisteína nucleofílica reduzida. As colunas podem ser executadas à temperatura ambiente usando tampões refrigerados. Os amortecedores devem ser feitos com água deionizada fria resfriada a 4 °C.
    8. Resuspenda as pelotas bacterianas em ~25 mL do amortecedor da lyse e transfere ~25 mL do lysate em 4 x 50 mL tubos cónicos descartáveis. Coloque os tubos em taças de plástico contendo água gelada. Sonicate o lysate 10 vezes no nível 5 para intervalos de 15 s.
    9. Transfira o lysate em tubos de centrífuga de alta velocidade. Esclareça o lysate por centrífuga (30 min, 20.500 x g a 4 °C).
    10. Prepare 0,5 L de Buffer A (50 mM Tris pH 7.6, 500 mM NaCl, 5% glicerol, 2 mM BME) e frio para 4 °C.
    11. Prepare 250 mL de Buffer B (50 mM Tris pH 7.6, 500 mM NaCl, 5% glicerol, 2 mM BME, 300 mM imidazole) e frio para 4 °C.
    12. Equilibre uma coluna de níquel de 50 mL com 3 volumes de coluna de Buffer A. Carregue o lysate esclarecido na coluna a 2-5 mL/min e descarte as pelotas.
    13. Lave a coluna (2-5 mL/min) com 2 volumes de coluna de Buffer A seguidos por 5 volumes de coluna de Buffer A contendo 20% Buffer B (60 mM Imidazole). Elute a proteína (5 mL/min) com 100% Buffer B e coletar 10 frações mL.
    14. Combine e concentre frações contendo a protease que têm A280 ≥ 0.1 usando uma unidade centrífuga de ultrafiltração de 15 mL e 15 min gira a 5.000 x g a 4 °C. Depois que o volume foi reduzido para ~5 mL, buffer troca a proteína na unidade de concentração adicionando tampão de diálise fresca à proteína (50 mM Tris pH 7.6, 250 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM EDTA, 5% Glycerol). Gire novamente a 5.000 x g a 4 °C por 15 min; repita o passo de troca tampão 2-3 vezes. Adicione a trombina à proteína (20 μL de 1 unidade/μL) antes da diálise para remover a tiatoxina e sua marca.
    15. Transfira a proteína para um saco de diálise e diálise contra 500 mL do tampão de diálise (4 °C) em um cilindro graduado de 500 mL durante a noite.
      Nota: O sistema FPLC (cromatografia líquida de proteína rápida) e a coluna de níquel devem ser completamente limpos com tampão de stripping (2 M NaCl, 50 mM EDTA) antes de prosseguir para a coluna de troca de anião. Qualquer níquel residual nas linhas FPLC transformará as soluções tampão contendo dtt marrom quando misturado. Lave a coluna de níquel e o sistema FPLC com volumes de 4 colunas de água. Bomba lavar o sistema FPLC completamente com água. A coluna de níquel pode ser regenerada fluindo 2 volumes de coluna de 0,2 M de sulfato de níquel sobre a resina para purificações subseqüentes.
  2. Para a coluna de troca de anião prepare 1 L de Buffer A (50 mM Tris pH 7.6, 5 mM DTT, 5% glicerol).
    1. Prepare 0,5 L de Buffer B (50 mM Tris pH 7.6, 5 mM DTT, 5% glicerol, 1.25 M NaCl).
    2. Equilibre uma coluna de troca de anião de 30 mL com Buffer A (3 volumes de coluna, 2-5 mL/min). Coloque os tubos no coletor de fração para a coleta do fluxo através.
      Nota: O protease VEEV tem um ponto isoelétrico calculado (pI) de 8,7 e vai ligar colunas de troca de cation, mas fluirá através de colunas de troca de anião. O pI pode ser calculado a partir da sequência de proteínas usando o programa Expasy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/).
    3. Diluir a proteína dizada 1:3 com Buffer A, e depois carregar a proteína (5 mL/min). Colete o fluxo através de 10 frações mL.
  3. Retire a coluna de troca de anião do sistema FPLC. Conecte uma coluna de troca de cation ao sistema FPLC. Equilibre uma coluna de troca de 30 mL com 3 volumes de coluna de Buffer A (5 mL/min).
    1. Carregue o fluxo através da coluna de troca de anião na coluna de troca de cation em 2-5 mL/min. Lave a coluna com Buffer A até que o A280 retorne ao nível de linha de base. Elute a proteína com um gradiente de 100 mL (0-50% Buffer B) e colete 10 frações mL.
      Nota: O protease VEEV vai elute em torno de 0,6 M NaCl.
    2. Inspecione as frações de coluna usando sds-page. Combine frações que são >95% puras e concentrem-se em um A280 - 2 usando 15 unidades centrífugas de ultrafiltração. A enzima pode ser congelada em nitrogênio líquido e armazenada a -80 °C.

4. Como dizendo a enzima continuamente usando um leitor de placa

  1. Prepare 50 mL de buffer de ensaio (50 mM HEPES pH 7.0).
    1. Como as proteases alfavira têm valores relativamente baixos kgato, diluir a enzima no buffer ensaio para 4,7 μM (isso vai aproximadamente corresponder a um A280 = 0,2 para a protease VEEV sem Trx).
    2. Para medir a atividade da enzima, prepare um estoque de substrato no amortecedor de ensaios com uma concentração de 185 μM; isso vai aproximadamente corresponder a um A280 = 9. Em 8 tubos de microcentrífuga, prepare as misturas de reação mostradas na Tabela 2, combinando os volumes apropriados do estoque e buffer de substrato de 185 μM. Em uma meia-área preta 96-well placa pipet 45 μL da reação se mistura em 3 poços (colunas 1, 2, 3). A linha A deve conter a mistura de reação [S] = 5 μM, e a Linha H deve conter o mix de reação [S] = 140 μM.
    3. Defina o leitor da placa para detectar simultaneamente fluorescência em dois comprimentos de onda com um tubo fotomultiplicador fixo (PMT) configuração (por exemplo, baixa):
      Comprimento de onda 1 excitação = 434 nm,emission = 527 nm
      Comprimento de onda 2 excitação = 434 nm,emissão = 470 nm
    4. Defina o tempo de leitura para 20 min (medindo 1 leitura por minuto) e selecione os poços a serem lidos. Insira a placa no leitor da placa e meça a taxa espontânea de hidrise por 20 min. Monitore as proporções de emissão (emissão em 527/emissão em 470) ao longo do tempo.
    5. Executar uma leitura final da placa contendo o substrato "UNCUT".
      Nota: Esses valores serão usados nos cálculos de dados subsequentes. A média dos índices de emissão de 3 poços serão os valores do substrato "UNCUT" no t = 0 na Tabela 3.
    6. Retire a placa e pipet 5 μL de enzima em cada poço. Leia a placa novamente por 20 minutos com 1 leitura por minuto. Defina o leitor de placas para produzir valores absolutos.
      Nota: Para este ensaio, as pistas serão negativas. Cada poço conterá um volume total de 50 μL.
    7. No final da leitura, selar a placa com filme para evitar a evaporação. Deixe a placa à temperatura ambiente durante a noite para permitir que a enzima corte completamente o substrato.
    8. Depois de ~ 24 h, retire o filme de vedação e execute uma leitura final da placa usando o mesmo TPM que nas placas anteriores. Média desses índices de emissão e entrada na Tabela 3 em "CUT". Confirme a clivagem do substrato usando o ensaio descontínuo SDS-PAGE descrito abaixo (Passo 5.1.).
    9. Exportar os dados para uma planilha. Saída das unidades de fluorescência em cada ponto de tempo para os 2 comprimentos de onda(Tabela 4).
    10. Calcule o nmol de substrato que foram cortados no momento t usando equação (1) onde X é a razão de emissão (527 nm/470 nm) em um determinado ponto de tempo, neg é a razão de emissão do substrato "UNCUT" em t = 0, e pos é a razão de emissão do substrato completamente "CUT" medido após 24 h de corte (Tabela 3).



      Nota: Os dados representativos de fluorescência são mostrados para um poço (bem E7) contendo 80 μM substrato (4 nmol de S por poço) na Tabela 4. Os cálculos foram realizados para cada poço na placa.
    11. Para cada poço, enredo nmol vs tempo (min) e obter as velocidades iniciais (encostas), ajustando os dados para y = mx + b. Para os dados coletados em 4.1.5, enredo nmol vs. tempo (min) para cada poço. A inclinação será igual ao produto nmol produzido por minuto. Subtraia as taxas espontâneas de hidrise medidas em 4,1,5 a partir das taxas de reação enzima-catalisadas(Tabela 5).
      Nota: A primeira leitura pode ser cortada a partir dos dados se for artifactually alta devido ao movimento da placa para o leitor da placa.
    12. Calcule a quantidade de enzima em mg que foi adicionada a cada poço (por exemplo, 0,0009 mg). Uma unidade é definida como um μmol de produto produzido por minuto (μmol/min). Divida o nmol/min pela mg de enzima presente no poço para obter mU/mg; dividir por 1.000 para obter U/ mg.
    13. Enredo [S] μM no eixo x e U/mg no eixo y e ajustar os dados para a equação Michaelis-Menten para obter Vmax e Km. Isso pode ser feito no software (por exemplo, GraFit).

5. Como a tome a enzima descontinuadamente usando a análise sds-page

  1. Prepare uma reação de 50 μL contendo substrato e tampão de 10 μM no lugar de enzima e rótulo como "UNCUT".
    Nota: Os volumes de substrato e buffer são mostrados na Tabela 2. Se o ensaio contínuo foi executado, as amostras podem ser usadas diretamente da placa de 96 poços.
    1. Prepare uma reação de 50 μL contendo substrato de 10 μM e enzima 5 μL e rótulo como "CUT". Inicie o temporizador quando a enzima é adicionada ao substrato.
      Nota: Inibidores podem ser adicionados a tubos adicionais contendo enzima e substrato. Ajuste o volume de buffer adicionado para compensar o volume adicionado de inibidor. As concentrações de DMSO não devem exceder 2%.
    2. Incubar as reações para ~15-24 h à temperatura ambiente (22 ± 3 °C). Pare as reações adicionando 50 μL de 2x laemelli buffer. Depois de parar a reação ferver, cada tubo de 3-10 min.
    3. Monte o tanque de gel de acordo com as instruções do fabricante. Insira uma de gel de poliacrilamida de 17 poços e uma barragem tampão do outro lado. Encha o reservatório interior da célula com 1x SDS funcionando buffer até que o tampão atinja o topo da fita. Encha o reservatório externo meio cheio com o mesmo buffer.
    4. Para analisar a clivagem usando o ensaio descontínuo, carregue 5 μL de cada mistura de reação em uma pista de um gel SDS-PAGE começando com a reação "UNCUT". Inclua um marcador de peso molecular na primeira ou última pista.
    5. Anexar os eletrodos do tanque de gel para a fonte de alimentação e separar os produtos em 110 V para 60 min. Retire o gel da fita, inserindo a ferramenta de rachaduras entre as placas. Coloque o gel em uma bandeja de plástico e submergir o gel em 5-10 mL de solução de coloração gel; bandas serão visíveis dentro de 30 minutos. Após 1-24 horas remover a mancha em excesso, submergir o gel em água e usar um imager gel para tirar uma foto do gel.

6. Acoplamento Peptídeos substrato para o VEEV-nsP2 Cysteine Protease

  1. Baixe o arquivo de coordenada para a protease de cisteína VEEV do PDB(https://www.rcsb.org/). O código PDB é 2HWK. Salve o arquivo como 2HWK.pdb.
    1. Prepare a estrutura proteica usando MOE(https://www.chemcomp.com/). Carregue o arquivo PDB de proteína em MOE. Clique no Select e Solvente na barra lateral direita e exclua o solvente.
    2. Abra o painel de preparação da estrutura da proteínasuperior da barra do menu. Corrija automaticamente todos os itens estruturais clicando no Correto e protonate a estrutura clicando no Protonate3D. Adicione cargas parciais à proteína abrindo o painel parcial das cargas e selecionando o âmbar 99 e ajuste hidrogênios e pares solitários como exigido. Finalmente, salve o arquivo da estrutura como "2HWK_dock.pdb".
  2. Construa a estrutura para os peptídeos de substrato (nsP12, nsP23, nsP34) e TRIM14 usando MOE. Abra o painel Protein Builder, digite a seqüência de substrato, definir a geometria como estendida, e clique em Construir. A estrutura será mostrada na janela moe.
    1. Minimize a estrutura do peptídeo clicando minimizar no painel. Salve a estrutura como um arquivo PDB (Figura 6).
  3. Docasse os peptídeos de substrato para VEEV-nsP2 usando PyRx/AutoDock 4.2(http://autodock.scripps.edu/). Abra a ferramenta PyRx, eite a configuração de preferência, inativar todas as torções para a preparação da Ligand. Carregue a molécula de substrato, clique direito no nome da molécula no painel navigator, selecione Make ligand para preparar o arquivo de acoplamento do ligand. Carregue a proteína 2HWK_clean.pdb, e selecione Faça macromolecule para preparar o arquivo de acoplamento pdbqt (Figura 7).
    1. Comece o AutoDock Wizard no painel de encaixe na parte inferior. Selecione os arquivos de ligantes preparados e proteínas. Defina o bolso de ligação de proteína ajustando manualmente a dimensão da grade que é centrada no resíduo catalítico Cys-477. Usando o parâmetro de espaçamento padrão 0.375 Å. Clique na Run AutoGrid para gerar mapas de grade.
    2. Executar AutoDock e selecionar o algoritmo genético lamarckiano (LGA) método. Clique nos parâmetros de encaixe e defina o número de GA para 50. Use os parâmetros padrão para os outros. Clique no Forward para iniciar a execução de encaixe.
    3. Abra o painel de resultados da análise. Inspecione todas as poses de ligação previstas. Selecione o melhor modelo com a menor energia de ligação prevista e interações de ligação razoáveis entre o Cys-477 e substrato no local de clivagem. Salve o modelo de ligação como arquivo PDB para mais simulações de DM.

7. Simulações MD de complexos de substrato VEEV ancorados

  1. Prepare os arquivos de entrada usando Amber(http://ambermd.org/). Seguindo o protocolo padrão, simulações de DM são realizadas para os modelos de ligação de substrato previstos usando o pacote AMBER e o campo de força ff99SB.
    Nota: Os sistemas resolvidos são submetidos a uma minimização completa da energia antes das simulações de DM. Condições periódicas de limite são aplicadas para simular um sistema contínuo. O método de malha de partículas Ewald (PME) foi empregado para calcular as interações eletrostáticas de longo alcance. O sistema simulado foi submetido primeiramente a um aumento gradual da temperatura de 0 K a 300 K sobre 100 ps, e equilibrado então para 500 ps em 300 K, seguido pelos funcionamentos da produção de 2 ns comprimento no total.
    1. Executar o trabalho de simulação em uma instalação de computação de alto desempenho. Nossas simulações foram executadas no cluster Biowulf (https://hpc.nih.gov/) (Figura 8).
    2. Visualize a trajetória de saída usando o programa VMD(http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/). Analise as interações vinculativas e as alterações conformais dos substratos e da TRIM14 dentro do local ativo do nsP2(Figura 9).

Representative Results

A análise do SSHHPS da protease ZIKV ns2B/3 identificou 4 alvos proteicos hospedeiros: FOXG1, SFRP1, uma subunidadealfa de G de uma biblioteca de cDNA da retina e o NT5M mitocondrial 5',3'-nucleotidase (Figura 10)6. Notavelmente, nenhum outro método previu essas proteínas como alvos potenciais da protease ZIKV. Mutações no gene FOXG1 têm sido associadas a uma síndrome congênita caracterizada por desenvolvimento prejudicado e anormalidades estruturais cerebrais, como microcefalia. SFRP1 é uma proteína secretada relacionada com frizzled (SFRP); estes receptores solúveis podem ligar competitivamente os ligantes wnt a antagonizar e inibir a sinalização wnt. A via de sinalização Wnt está envolvida na regulação da resposta ifn durante a infecção por flavivírus36. Espera-se que a clivagem do SFRP1 melhore a replicação do flavivírus. SFRP1 também está envolvido na diferenciação de células Th1737. Alinhamentos sequenciais do SSHHPS mostraram diferenças específicas de espécies nas sequências do local de clivagem(Figura 10D). A seqüência do local da clivagem em SFRP1 era idêntica nos seres humanos e nas galinhas; ZIKV pode induzir mortalidade e microcefalia em embriões de frango38. Em roedores, o resíduo P1 altamente conservado (K/R)R'G é substituído por uma glicina (RGG). Cepas imunocompetentes de camundongos são geralmente resistentes à infecção zikv e doença39.

Parâmetros cinéticos estaduais estáveis e constantes de inibição podem ser medidos para as sequências de poliproteína viral e para as sequências de proteína hospedeira usando o ensaio contínuo em um leitor de placa31,40,41 ( Figura11A). Para informações qualitativas de clivagem, como clivagem de uma seqüência específica ou a inibição da protease por vários compostos, o ensaio descontínuo pode ser usado (Figura 11B).

A otimização do número de resíduos entre a PCP e a YFP pode ser necessária. Um modelo substrato-limitado pode ser feito usando os métodos no silico. Um modelo representativo encaixado da junção nsP1/nsP2 é mostrado na Figura 9. Para a protease veev nsP2, clivagem de um 12-aminoácido Semliki Forest Virus (SFV) seqüência tinha sido relatado (Km = 0,58 mM)33. Alongar a seqüência de substrato para 19, 22 e 25 resíduos e reduzir a força iônica do buffer levou a uma redução significativa no Km. O exame da estrutura cristalina VEEV nsP2 e embalagem de cristal também mostrou que uma parte de uma das junções foi embalado contra o domínio protease e foi helical. Assim, os substratos veev mais longos podem ligar-se melhor devido ao reconhecimento de um motivo estrutural secundário.

Para trim14, obtivemos um Km = 21 μM6,33. O Km para o substrato que transportava a sequência de proteína hospedeira foi comparável aos valores km dos substratos contendo as sequências virais do local de clivagem poliproteína (Km(V12) = 12 μM e Km(V34) = 21 μM). As seqüências do local da clivagem nas junções nsP1/nsP2, nsP2/nsP3, e nsP3/nsP4 foram cortadas com eficiências diferentes. Na célula, isso é pensado para permitir a clivagem sequencial da poliproteína42.

O cuidado deve ser tomado em interpretar resultados negativos. Se nenhuma clivagem ocorre, o local da clivagem pode ser demasiado curto ou o protease purificado pode ser inativo. Para substratos que são cortados, experimentos adicionais são necessários para confirmar a clivagem da proteína de comprimento total ou clivagem em células infectadas pelo vírus. Experimentos de acompanhamento apropriados devem ser escolhidos. Os efeitos da superexpressão ou silenciamento da proteína alvo na replicação viral também podem ser testados.

Figure 1
Figura 1: Três mecanismos de silenciamento. Silenciar pode ocorrer no nível de DNA, RNA ou proteína. Esses algoritmos de "pesquisa e exclusão" cada um usa uma "palavra-chave" para direcionar a clivagem de um arquivo contendo a palavra. Este número foi modificado a partir de Morazzani et al.32 e as referências nele. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Diferenças específicas de espécies nas sequências do local de clivagem. Os domínios C-terminal PRY/SPRY dos homologogues TRIM14 são mostrados no alinhamento. O domínio PRY/SPRY pode ser identificado pelos motivos conservados destacados em cinza. O TRIM14 humano é cortado no QEAGA-G pela protease de cisteína VEEV nsP2. A sequência SSHHP é mostrada em cores. O resíduo em verde é o resíduo do P1; em azul é o resíduo P4, e em vermelho são outros resíduos conservados dentro da seqüência de motivos do local de clivagem. Equine abrigar uma versão truncada de TRIM14 sem o domínio PRY / SPRY. A lisina destacada em ciano é poli-ubiquitinada e é importante para a montagem do signalosome MAVS. O domínio C-terminal PRY/SPRY pode ser cortado transitóriamente pela protease nsP2 para prejudicar a resposta antiviral do hospedeiro intracelularmente durante uma infecção viral aguda. Em equino, este domínio está sempre ausente. Isso sugere que o domínio PRY/SPRY da TRIM14 pode ter uma função protetora contra infecções veev. Esta figura foi reproduzida a partir de Morazanni et al.6Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Identificação sshhps usando blast. A seqüência de motivos do local de clivagem na junção VEEV nsP1/nsP2 está alinhada com a sequência sshhp na proteína hospedeira TRIM14. O resíduo colorido em verde é o resíduo p1'; em azul é o resíduo P4 e em vermelho são outros resíduos conservados da seqüência de motivos do local de clivagem. A maioria dos alinhamentos continha homologia para regiões fora do motivo conservado do local de clivagem ou não incluíam os resíduos de obrigações scissile do P1/P1. Trim14 mostrou uma correspondência de 6 resíduos em ordem sequencial, que incluiu P1 e P1'. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: Sequências de proteínas e DNA do substrato CFP-V12-YFP para a protezase cisteína VEEV nsP2. Os sites de restrição NdeI (CATATG) e XhoI (CTCGAG) são mostrados em letras maiúsculas. Em vermelho está a seqüência do local de clivagem da poliproteína viral que está entre nsP1 e nsP2. O resíduo em verde é o resíduo P1' e em azul é o resíduo P4 do local da clivagem. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5: Sequência de proteínas da construção de protease de cistese Trx-VEEV-nsP2. Thioredoxin (Trx) é mostrado em amarelo. O local de clivagem trombina e sua marca são mostrados em ciano. O díado de Cis-Seu são rotulados em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 6
Figura 6: Estruturas peptídeas no MOE. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 7
Figura 7: Acoplamento de peptídeo de substrato usando PyRx/AutoDock. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 8
Figura 8: Empregos em execução no cluster Biowulf. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 9
Figura 9: Modelo do substrato VEEV P12 contendo a seqüência do local de clivagem na junção nsP1/nsP2. O díado catalítico Cys-477/His-546 é mostrado em azul. Figura foi feita usando Pymol (https://pymol.org). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 10
Figura 10: Análise SSHHPS do vírus Zika ns2B/ns3 protease. (A)Metas de proteína de hospedeiro previsto si2B/ns3 protease ZIKV. Resíduos em vermelho correspondem a uma única seqüência de local de clivagem. Resíduos em verde são tolerados no subsite e combinam resíduos em outros locais de clivagem. SFRP1 apresentou o maior número de resíduos idênticos em ordem consecutiva. (B) As proteínas CFP-substrato-YFP (~50-60 kDa) foram expressas e purificadas contendo a sequência SSHHP prevista de cada proteína hospedeira (humana). O ZIKV protease cortou foxg1 humano, SFRP1, NT5M e um Gssubunidade alfa isolado de uma biblioteca cDNA retinal. Os produtos de clivagem são aproximadamente 28-30 kDa. As sequências de substrato estão disponíveis em Morazzani et al.6 (C)Enquanto o ns2B/ns3 protease cortou SFRP1, não cortou seus homologos (SFRP2 e SFRP4). (D)O alinhamento dos locais de clivagem de diferentes espécies animais pode ser útil na seleção de um modelo animal para um vírus grupo IV. Note-se que a seqüência R'G conservada difere entre humanos e roedores em SFRP1. Figura reproduzida a partir de Morazzani et al.6Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11: Análise cinética estável do estado usando os ensaios contínuos e descontínuos. (A)Os dados cinéticos mostrados na Tabela 5 foram traçados no GraFit. A inserção mostra o enredo Lineweaver-Burk. (B) Gel SDS-PAGE mostrando os produtos de clivagem do substrato CFP-V12-YFP. Na pista 1 está o substrato "UNCUT" (48 kDa). Na pista 2 está o substrato "CUT" (31 kDa e 27 kDa). Nas pistas 3-9 compostos diferentes foram incluídos para testar sua atividade inibil. A pista 4 contém o inibidor covalente E64d. Estas reações foram executados durante a noite para ~ 17 h à temperatura ambiente. A ebulição das amostras foi necessária para atingir o padrão de faixa afiada. A protease nsP2 é visível (56 kDa) nas reações contendo enzima, mas não na pista 1. A pista 1 é o controle "sem enzimas". Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Discussion

A destruição seqüência específica de uma proteína ou de um ácido nucleic guiado por uma seqüência extrangeira é vista somente em alguns casos na biologia. Os mecanismos mostrados na Figura 1 são mecanismos defensivos que protegem um hospedeiro de um vírus ou um vírus de um hospedeiro.

Usando métodos bioinformatic nós podemos identificar os alvos que são destruídos por estes sistemas. Em nossas análises de sequências de SSHHP, descobrimos que muitas delas poderiam ser encontradas em proteínas necessárias para gerar respostas imunes inatas. Alguns tinham papéis óbvios, como MAVS e TRIF (TIR-domínio contendo adaptação-induzindo interferon-β), enquanto outros estavam relacionados à imunidade, embora mecanismos mais complexos (por exemplo, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. As informações-alvo armazenadas na sequência sshhp tem o potencial de identificar vias que têm efeitos antivirais contra esses vírus. As respostas antivirais in vivo são muitas vezes26,43. Por exemplo, subconjuntos de proteínas TRIM têm efeitos antivirais em diferentes vírus43,44,45, alguns são fatores de restrição viral (por exemplo, HIV e TRIM5α). A especificidade das proteínas TRIM (~70 foram identificadas) ainda está sendo examinada44,45. As informações dentro sshhps pode contribuir para a nossa compreensão de como esses vírus evitar as respostas imunes inatas. Outros padrões e correlações podem ser descobertos à medida que mais SSHHPS são examinados.

Diferenças específicas de espécies foram aparentes em nossas análises (Figura 2, Figura 10). Estes vírus são conhecidos por afetar algumas espécies mais do que outros. Informações sobre a gama de acolhimento, susceptibilidade de acolhimento e defesas de acolhimento podem estar presentes no SSHHPS. Por exemplo, o equino, a espécie mais suscetível aos vírus da encefalite equina, não tinha a região de TRIM14 humano que foi cortada transitóriamente pela protease veev nsP2. Os seres humanos raramente morrem de infecções VEEV, mas pode ser infectado24. A proteína TRIM14 humana carregava uma seqüência de clivagem protease nsP26. A presença do local da clivagem sugere que os seres humanos têm um mecanismo de defesa contra esses vírus. As aves foram pensados para ser reservatórios potenciais destes vírus46. A sequência correspondente do SSHHP na proteína TRIM14 das galinhas diferia das sequências encontradas em seres humanos e outras espécies. Diferenças sutis como estas podem tornar uma proteína alvo hospedeiro impuro ou mais facilmente clleaved. Aguirre et al.16 mostraram que uma proteína string mutada imuncleavable induziu níveis mais elevados de IFN após a infecção pelo vírus da dengue e que os ratos carregam naturalmente uma versão da PICADA que não é cortada pela dengue ns2B3 protease. A proteína PICADA murine não foi cortada pela protease ZIKV47. Em nossa análise SSHHPS, também observamos diferenças nas sequências do local de clivagem de protease ZIKV quando comparamos as proteínas humanas com as dos roedores6 (Figura 10D). Reproduzir as clivagens proteolíticas específicas das espécies de proteínas hospedeiras pode ser importante em modelos animais usados para vírus do Grupo IV. A inibição da clivagem de proteína hospedeira também tem implicações no que diz respeito ao desenvolvimento de inibidores da protease do Grupo IV. Em nossa publicação anterior, mostramos que poderíamos inibir a clivagem TRIM14 pela protease veev nsP2 usando o éster de metilo CA0746. Este resultado sugere que os inibidores de moléculas pequenas dessas proteases podem ser capazes de modular as respostas imunes inatas que são capazes de suprimir a infecção6,31.

A variação genética dentro de uma espécie também tem o potencial de produzir diferenças na clivagem proteolítica. Diferenças sutis no uso de codon podem afetar a pausa de ribossoma48. Como algumas proteases virais do Grupo IV estão incorporadas na membrana do ER, as diferenças nessas pausas podem afetar a clivagem de um alvo se a clivagem ocorrer co-translationally. Alguns dos locais de clivagem que identificamos estavam em sequências de peptídeos de sinal previstos (por exemplo, SFRP1), enquanto outros eram internos.

A análise do SSHHPS pode produzir informações que diferem de outros métodos de análises de proteínas hospedeiras. A análise do SSHHPS foi barata e fácil de empregar. O uso de um sistema de expressão bacteriana permitiu o teste de segmentos curtos (~25 aminoácidos) de seqüências de mamíferos sem o uso da cultura das células de mamíferos. Verificou-se que os substratos CFP-YFP foram capazes de tolerar todas as sequências de proteínas humanas testadas; no entanto, os rendimentos variaram. Em ensaios semelhantes, substratos contendo sequências de proteínas humanas, desde que 63 aminoácidos foram expressos com sucesso, purificados e utilizados para análises cinéticas e triageminibidora 49,50,51. Uma vez que apenas pequenas quantidades do substrato são necessárias para o ensaio descontínuo, um grande número de alvos pode ser explorado. Uma vantagem do sistema é que os substratos CFP/YFP podem ser usados para análises SDS-PAGE e para análises cinéticas mais elaboradas (ou seja, IC50,Ki,Km,Vmax). Para a descoberta de medicamentos, compostos inibitórios podem produzir artefatos em ensaios fluorescentes. Assim, o ensaio descontínuo em combinação com um ensaio contínuo permite confirmar a clivagem ou inibição da clivagem. As amostras para o ensaio SDS-PAGE descontínuo podem ser retiradas diretamente das placas de 96 poços. Os substratos cfp/yfp têm sido utilizados para triagem de biblioteca composta52. No entanto, são necessárias análises adicionais para determinar se um substrato é adequado para triagem de alta taxa de rendimento, como o cálculo de um fator Z53.

Um desafio na concepção de um substrato é identificar a região em torno do vínculo scissile que está vinculado e reconhecido pela protease. Nos exemplos mostrados aqui, começamos com 12 sequências de resíduos que estavam centradas em torno da ligação scissile. Após a análise de alinhamentos seqüência da homologia locais de clivagem para os resíduos N-terminal da ligação scissile foi encontrado para a protease VEEV, enquanto que para a homologia protease ZIKV para vários dos resíduos C-terminal foi encontrado. Um modelo em silico do substrato ancorado pode ser usado para projetar experimentos de mutagênese dirigidos pelo local que sondam os locais de ligação do substrato. Uma vez que as sequências de substrato e enzima estão em plasmídeos, ou podem ser mutadas para testar os modelos em silico ou tolerâncias subsite. Isso pode ser vantajoso se uma estrutura cristalina do substrato vinculado (s) não estiver disponível.

A análise do SSHHPS também pode produzir novas informações sobre os mecanismos pelos quais fenótipos induzidos por vírus são produzidos por enzimas virais. Um dos alvos ZIKV, SFRP1, faz parte da via de sinalização Wnt e tem papéis no desenvolvimento do cérebro e dos olhos e em respostas imunes36,37,54,55,56,57. Descobrimos que as outras sequências de proteínas que poderiam ser cortadas pela protease ZIKV ns2B/ns3 também estavam em proteínas envolvidas no desenvolvimento cerebral e ocular; Anormalidades em ambos têm sido observadas na síndrome congênita de Zika e são pensados para ser parte do fenótipo induzido pelo vírus58.

A previsibilidade das interações hospedógenas-patógenos poderia ser explorada para uma variedade de aplicações: terapias virais oncolíticas específicas para o alvo; desarriscar vacinas contra vírus vivos; refinamento, previsão ou seleção de modelos animais; previsão de gama de hospedeiros ou susceptibilidade; previsão de eventos zoonóticos; e previsão de host-defesas. Uma vez que os métodos descritos são baseados em sequências, eles podem ser de valor para incorporar em software no futuro.

Disclosures

As opiniões expressas aqui são as dos autores e não representam as da Marinha dos EUA, do Exército dos EUA, do Departamento de Defesa dos EUA ou do governo dos EUA.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelos números do projeto Defense Threat Reduction Agency (DTRA) CB-SEED-SEED09-2-0061 e CBCall4-CBM-05-2-0019, e em parte pelo programa de pesquisa Intramural/Extramural dos fundos base do Laboratório de Pesquisa Naval NCATS, NIH (XH) e Naval Research Laboratory.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL Erlenmeyer Flask VWR 89000-362
2-mercaptoethanol Acros Organics (Fisher) 125472500 Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.
4 L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap Millipore Sigma CLS49954L-1EA
AKTA Prime Plus GE Healthcare 17-0729-01
AKTA XK 16/20 Column GE Healthcare 28988937
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC501096
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC901096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC801024
Ampicillin Sigma A0166 Danger: Allergic reactions (skin or breathing).
Chelating Sepharose Fast Flow GE Healthcare 17-0575-02 Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.
Chloramphenicol RPI C61000 Danger: May cause cancer.
Corning 50 mL centrifuge tubes Corning 430828 Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface Corning 3993
Dialysis Tubing Clips Fisher Scientific PI68011
Disposable PD-10 Desalting Column GE Healthcare 17-0851-01
DNAse Sigma DN25-1G
DTT (DL-Dithiothreitol) RPI D11000-50.0 Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation
EDTA Fisher Scientific S311-500
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
Glycerol Acros Organics (Fisher) 15892-0010
HEPES Millipore Sigma H4034-1KG
Imidazole Acros Organics 301870010 Danger: Toxic, Irritant
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) Calbiochem (Millipore Sigma) 420291 Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.
Laemmli Sample Buffer BIO-RAD 1610737
Luria Bertani Agar Fluka (Millipore Sigma) L3027-1KG Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.
Luria Bertani Media Fisher Bioreagents BP1426-2
Lysozyme Sigma L4919-5g
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box BIO-RAD
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes Nalgene (Thermo Scientific) 3119-0050
Nanodrop Thermo Fisher
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator Eppendorf M1335
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific N73-500 Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C600003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli Invitrogen (Thermo Fisher) C606003 May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.
pet15b plasmid DNA Novagen (Millipore Sigma) 69661 GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.
pet32b Novagen (Millipore Sigma) 69016-3 The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free Thermo Fisher A32955 Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage
Plate Reader Molecular Devices Model M5
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard BIO-RAD 161-0373
Protein Extraction Reagent Novagen (Millipore Sigma) 70584-4 BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)
Q-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0510-01 Anion exchange resin
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels Expedeon BCG01227 Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used
RunBlue 20x SDS Running Buffer Expedeon NXB50500 Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x
RunBlue Instant Blue Gel Stain Expedeon ISB1L Do not dilute, use as directed
Sodium Chloride Fisher Chemical S271-10
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator Branson Ultrasonics (VWR) Model No. 101-063-346R Sonicator was used on level 5
Spectra/Por 6-8 kD MWCO Spectrum Labs 132645T Dialysis Tubing
SP-Sepharose Fast Flow G.E. Healthcare 17-0729-01 Cation exchange resin
Thrombin from bovine plasma Sigma T6634-500UN
Tris Base Fisher Scientific BP152-500 Caution: Eye/Skin Irritant

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