Sintesi dei Peptoidi a informazione e del loro autoassemblaggio covalente dinamico diretto in sequenza

Chemistry
 

Summary

Viene presentato un protocollo per la sintesi di oligomeri peptoidi codificati in informazioni e per l'autoassemblaggio di questi peptoidi diretti in sequenza in scale molecolari utilizzando ammine e aldeidi come coppie dinamiche di reazione covalenti e Lewis acida rara terra triflates in metallo come reagenti multiruolo.

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Leguizamon, S. C., Alqubati, A. F., Scott, T. F. Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly. J. Vis. Exp. (156), e60442, doi:10.3791/60442 (2020).

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Abstract

Questo protocollo presenta l'uso di reagenti multiruolo acidi di Lewis per aggirare l'intrappolamento cinetico osservato durante l'autoassemblaggio di fili oligomerici codificati in informazioni mediati da interazioni covalenti dinamiche accoppiate in modo da imitare il ciclo termico impiegato comunemente per l'auto-assemblaggio di sequenze di acido nucleico complementari. I monomeri di ammina primaria che portano aldeide e le moieties acionte di ammina sono funzionalizzati con gruppi di protezione ortogonale per l'uso come coppie dinamiche di reattori covalenti. Utilizzando un sintetizzatore peptide automatizzato modificato, i monomeri di ammina primaria sono codificati in filamenti oligo (peptoide) attraverso la sintesi di submonomeri in fase solida. Dopo la purificazione mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e la caratterizzazione mediante spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray (ESI-MS), gli oligomeri specifici della sequenza sono sottoposti ad alto carico di un triflate di metalli acidi nocivi Lewis che sconvolge entrambe le mogli di aldeide e colpisce l'equilibrio della coppia di reattori in modo tale che i filamenti completamente dissociati. Successivamente, viene estratta una frazione dell'acido di Lewis, consentendo l'analizzazione di fili complementari specifici della sequenza di formare scale molecolari codificate in informazioni caratterizzate da spettrometria di massa di desorption/ionizzazione laser assistita a matrice (MALDI-MS). La semplice procedura descritta in questo rapporto aggira le trappole cinetiche comunemente sperimentate nel campo dell'assemblaggio covalente dinamico e funge da piattaforma per la progettazione futura di architetture robuste e complesse.

Introduction

Il progresso nell'auto-assemblaggio, il processo mediante il quale piccole sottounità generano architetture più grandi attraverso percorsi termodinamicamente guidati, ha offerto un migliore controllo sulle nanostrutture macro e sopra-molecolari tipicamente sfruttando interazioni intermolecolari come l'impilamento z e il legame di idrogeno1,2,3,4. In particolare, gli acidi nucleici (cioè i polinucleotidi) sono emersi come mezzi di nanocostruzione straordinariamente versatili, in quanto l'elevata densità di informazione fornita dall'abbinamento base Watson-Crick consente l'assemblaggio di strutture complesse e selettive in sequenza4,5. Mentre la resistenza intrinsecamente bassa di questi legami intermolecolari transitori consente il riarrangiamento e la correzione degli errori delle sottounità, le strutture risultanti sono spesso suscettibili alla degradazione termica e meccanica6. Al contrario, le interazioni covalenti dinamiche7,8,9, una classe di reazioni covalenti che formano obbligazioni che sono reversibili o riordinabili in condizioni miti e sono state recentemente impiegate per produrre complesse macromolecole come scale10,11,12,13, gabbie14,15,16e pile17, offrono maggiori punti di forza del legame e strutture robuste. Purtroppo, la capacità di riarrangiamento e di controllo degli errori è diminuita dai tassi di riorganizzazione relativamente bassi di queste specie covalenti, riducendo la loro capacità di auto-assemblaggio nei prodotti desiderati18. Per affrontare questa intrappolamento cinetico, i catalizzatori o le dure condizioni di reazione vengono spesso utilizzati in combinazione con semplici blocchi di costruzione. Qui, riportiamo un processo che aggira l'intrappolamento cinetico per consentire l'autoassemblaggio di scale molecolari da oligomeri specifici della sequenza in cui l'ibridazione è diretta dalle informazioni codificate nelle sequenze residue dell'oligomero.

Data la loro accessibilità sintetica, i poli (glicine sostituiti con N) (cioè peptoidi) sono impiegati come precursori oligomerici da cui vengono assemblate le scale molecolari19. I peptoidi sono isomeri strutturali di peptidi in cui i gruppi di ciondolo sono apposti sull'azoto trasmesso dalla spina dorsale invece di essere accoppiati con il20. Utilizzando la sintesi in fase solida, si ottiene prontamente il posizionamento esatto di gruppi di ciondolo covalenti dinamici lungo la catena peptoide, consentendo la progettazione di oligomeri precursori in grado di assemblarsi in complesse strutture sopramolecolari21.

Il riarrangiamento covalente dinamico della connettività imine è impiegato in questa procedura come la reazione di condensazione che genera imine fornisce un mezzo conveniente per caratterizzare l'auto-assemblaggio da spettrometria di massa come ogni legame formato si traduce in una riduzione di massa di 18 g/mol22. Inoltre, l'equilibrio tra i reati dell'ammina e l'aldeide e il prodotto dell'imine può essere variato alterando la concentrazione acida. In particolare, i triflati metallici di terre rare sono usati per influenzare l'equilibrio e inoltre deproteggere le aldeidi acetali protette con etilene23,24,25. Da notare, il triflate di scandio è già comunemente usato nel campo dell'autoassemblaggio covalente dinamico, compreso il suo recente successo nell'aiutare la sintesi di quadri organici covalenti (COF) a temperatura ambiente26,27. Inoltre, la solubilità contrastante delle sequenze oligo (peptoide) e del trigonfio metallico di terre rare consente il controllo dell'equilibrio attraverso l'estrazione di liquidi. Il processo riportato utilizza questo controllo per aggirare le barriere cinetiche che impediscono l'auto-assemblaggio diretto dalle informazioni.

Protocol

AVVISO: Diverse sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono corrosive, infiammabili o tossiche e devono essere utilizzate solo sotto una cappa di fumi chimici. Si prega di utilizzare adeguate attrezzature di protezione personale e consultare tutte le schede tecniche di sicurezza pertinenti (SDS) prima dell'uso.

1. Sintesi monomer

NOTA: le aree primarie sono state sintetizzate in base agli approcci pubblicati.

  1. Sintesi di 4-(2-aminoethyl)-N-(allelcarbonyloxy)phenylamina (Npam)25,28
    1. Aggiungere 5,0 g (36,7 mmol) di 4-(2-aminoethyl)anilina a 150 mL di 10% di acido acetico (soluzione acquosa, v/v).
      NOTA: L'uso di acido debole consente la protezione selettiva dell'ammina aromatica senza influenzare l'ammina alofarica dovuta alla grande differenza in pKun valore tra i due gruppi.
    2. Preparare una soluzione di 4,9 g (40,4 mmol; 1.1 equiv.) cloroformate alleato in 150 mL di 1,4 dioxane.
    3. Unire le soluzioni in un flacone rotondo da 500 mL dotato di una barra magnetica e mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente durante la notte.
    4. Per elaborare la reazione, diluire con 500 mL di acqua deionizzata (DI) e lavare con etere dietillo (Et2O, 300 mL - 3). Scartare le frazioni organiche.
    5. Regolare la fase acquosa a pH 14 aggiungendo 2 M NaOH (soluzione acquosa), ed estrarre con Et2O (150 mL e 3).
    6. Unire le frazioni organiche e lavare con acqua DI (150 mL .
    7. Asciugare su Na2SO4, quindi filtrare.
    8. Evaporare a secco sotto pressione ridotta.
    9. Confermare l'identità del prodotto isolato, Npam, con la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR). Aspettatevi i seguenti risultati: 1H NMR (500 MHz, CdCl3) :7,31 (d, J - 8,0 Hz, 2H, Ar), 7,14 (d, J - 8,5 Hz, 2H, Ar), 6,65(s, 1H, -NH-), 6,04 – 5,89 (m, 1H, -CH J - 17,1, 1,6 Hz, 1H, -CH-CHH), 5,26 (dq, J - 10,5, 1,4 Hz, 1H, -CH -CHH), 4,66 (dt, J - 5,8, 1,5 Hz, 2H,-CH 2 -CH2), 2,94 (t, J - 6,8 Hz, 2H,H 2-NH2), 2,70 (t, J - 6,8 Hz, 2H, -CH2-Ar), 1,04 (s, 2H, -CH2-NH2). 13 del sistema C NMR (125 MHz, CD3OD) :154,85, 137,00, 134,98, 133,51, 129,36, 119.41, 116.92, 65.62, 59.89, 43.47, 38.72.
      NOTA: Il prodotto è un solido giallo chiaro e ha una resa complessiva del 69%. Utilizzare il prodotto senza ulteriore purificazione.
  2. Sintesi di 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benzonitrile29,30
    1. Sciogliere 25 g (0,19 mol) di 4-cianobenzaldedei in 200 mL di toluene.
    2. Aggiungere 42,2 mL (0,768 mmol; 4 equiv.) di glicole di etilene e 0,02 g (0,1 mmol; 0,05 mol%) di acido toluene-p -sulfonico alla miscela di reazione.
    3. Mescolare e refluire durante la notte a 120 gradi centigradi utilizzando una trappola Dean-Stark (cioè la distillazione azeotropica) per rimuovere l'acqua generata durante la reazione.
    4. Dopo che la reazione è stata completata e raffreddata a temperatura ambiente, aggiungere 40 mL del 5% NaHCO3 (w/v) soluzione aqueous.
    5. Estrarre lo strato organico e lavare con acqua DI tre volte.
    6. Asciugare su Na2SO4, quindi filtrare.
    7. Evaporare a secco sotto pressione ridotta.
    8. Confermare l'identità del prodotto isolato, mediante spettroscopia NMR. Aspettatevi i seguenti risultati: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) :7,67 (d, J - 8,0, 2H, Ar), 7,59 (d, J - 8,4, 2H, Ar), 5,84 (s, 1H, CH), 4.12 - 4.03 (AA-BB, 4H, (CH2O)2). 13 del sistema C NMR (100 MHz, CDCl3 ): 143,20, 132,34, 127,30, 118,72, 113.02, 102,56, 65,57.
      NOTA: Il prodotto è un solido cristallino bianco e ha una resa complessiva dell'86%. Utilizzare il prodotto senza ulteriore purificazione.
  3. Sintesi di 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benzylamine (Npal)29
    1. Preparare una soluzione di 10 g (0,057 mol) di 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benzonitrile in 100 mL di anhydrous Et2O.
    2. Aggiungere con attenzione 4,3 g (0,11 mol; 2 equiv.) di LiAlHda 4 a 100 mL di anidrio Et2O in una fiaschetta inferiore rotonda a 0 gradi centigradi. Mescolare per creare una sospensione ben miscelata e sigillare il sistema in un'atmosfera inerte utilizzando un palloncino pieno di argon. Spegni con attenzione con etanolo qualsiasi residuo LiAlH4 su attrezzature utilizzate per la pesatura.
      AVVISO: l'idrato di alluminio litio (LiAlH4) è un lieve piroforo; sotto gas inerte e proteggere dall'umidità.
    3. Aggiungere lentamente la soluzione 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)con un imbuto aggiuntivo o una pompa di siringa mantenendo la miscela di reazione a una temperatura di 0 gradi centigradi.
    4. Mescolare la miscela di reazione per 4 h a 0 oC, seguita con 12 h a temperatura ambiente.
    5. Dopo che la reazione è stata completata e raffreddata a 0 gradi centigradi, aggiungere lentamente il 95% di etanolo (30 mL). Ulteriore spegnimento aggiungendo il 50% di etanolo in acqua (v/v, 20 mL). Un gorgogliatore può essere utilizzato per monitorare il processo di spegnimento.
      NOTA: Aggiungere l'anidrio Et2O in base alle esigenze per mantenere una velocità di agitazione adeguata.
    6. Separare il supernatale etere ed evaporare a secco sotto pressione ridotta.
    7. Filtrare l'olio risultante con un filtro di siringa da 0,45 m.
    8. Confermare l'identità del prodotto isolato, NpaI, mediante spettroscopia NMR. Aspettatevi i seguenti risultati: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) che ;7,44 (d, J , 8, 2H, Ar), 7,32 (d, J ) 8, 2H, Ar), 5,80 (s, 1H, CH), 4.14 - 4.0 (AA , 4H, (CH2O)2), 3,87 (s, 2H, -CH-NH2). 13 del sistema C NMR (100 MHz, CDCl3 ): 144.53, 136.53, 127.16, 126.77, 103.72, 65.39, 46.35.
      NOTA: Il prodotto è un olio giallo e ha una resa complessiva del 70%. Utilizzare il prodotto senza ulteriore purificazione.
  4. Sintesi di 2-(2-ethoxyethoxy)etioardo29,31
    1. Aggiungere 20 g (0,15 mol) di etere monoetilice di glicole dietilene e50 mL di tetraidrofurano (THF) a un pallone rotondo rotondo da 250 ml con amitrice magnetica.
    2. Raffreddare a 0 gradi centigradi e sigillare il sistema sotto un'atmosfera inerte utilizzando un palloncino pieno di argon.
    3. Aggiungere 50 mL di 6 M aqueous NaOH (2 equiv.).
    4. Sciogliere 54 g (0,28 mol; 2 equiv.) di cloruro di tosilio in 80 mL di THF e aggiungere la soluzione alla miscela di reazione dropwise. Mescolare per 1 h a 0 gradi centigradi.
    5. Lasciare che la miscela di reazione raggiunga la temperatura ambiente e si muova per un'altra ora.
    6. Estrarre la miscela di reazione con Et2O (400 mL).
    7. Lavare lo strato organico con 1 M NaOH, quindi con acqua DI.
    8. Asciugare su Na2SO4, quindi filtrare.
    9. Evaporare a secco sotto pressione ridotta.
    10. Confermare l'identità del prodotto isolato mediante spettroscopia NMR. Aspettatevi i seguenti risultati: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) :7,78 (d, J - 8,0, 2H, -S-C-CH-CH), 7,33 (d, J - 8,5, 2H, -S-C-CH-CH), 4,15 (t, J - 5,0, 2H, -CH2-CH 2-O-Ts), 3,68 (t, J - 5,0, 2H, CH2-CH2-O-Ts), 3,60-3,42 (m, 6H, O-CH2-CH2-O-CH2-CH3), 2,43 (s, 3H, C-CH3), 1,17 (t, J - 7,0, 3H, O-CH2-CH3). 13 del sistema C NMR (100 MHz, CDCl3 ): 144,79, 132,95, 130,26, 129,80, 127,90, 126,95, 70,75, 69,68, 69,29, 68.61, 66.57, 21.56, 15.11.
      NOTA: Il prodotto è un liquido incolore e ha un rendimento complessivo del 98%. Utilizzare il prodotto senza ulteriore purificazione.
  5. Sintesi di 2-(2-ethoxyethoxy)azide etile29,31
    1. Sciogliere il tosilato di 2-(2-ethoxyethoxy) in 250 mL di dimetilformamide (DMF) in una fiaschetta inferiore rotonda con un'agita magnetica. Sigillare il sistema sotto un'atmosfera inerte utilizzando un palloncino pieno di argon.
    2. Aggiungere 32 g (0,49 mol; 3,5 equiv.) di NaN3 alla miscela di reazione.
      AVVISO: Non utilizzare una spatola metallica quando si pesa NaN3. NaN3 può reagire con piombo e rame che si traduce nella formazione di azides metallici altamente esplosivi. È acutamente tossico e fatale se ingerito o a contatto con la pelle.
    3. Riscaldare la miscela di reazione a 60 gradi centigradi e lasciarla correre per 36 h. Quindi raffreddare a temperatura ambiente.
    4. Diluire con una grande quantità di acqua (500 mL) ed estrarre con Et2O (150 mL e 3).
    5. Isolare lo strato organico ed eseguire lavature d'acqua.
    6. Asciugare su Na2SO4, quindi filtrare.
    7. Evaporare a secco sotto pressione ridotta.
    8. Confermare l'identità del prodotto isolato mediante spettroscopia NMR. Aspettatevi i seguenti risultati: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) -3,64 (m, 4H, O-CH2-CH2-O), 3,58 (m, 2H, N3-CH2-CH2-O), 3,51 (q, J - 7,5, 2H, O-CH2-CH3), 3,38 (t, J - 5,0, 2H, N3-CH2-CH2-O), 1,19 (t, 0 - 7,5, 3H, O-CH2-CH3). 13 del sistema C NMR (100 MHz, CDCl3 ) :70,70, 69,97, 69,80, 66,63, 50,60, 15,08.
      NOTA: Il prodotto è un liquido giallo e ha un rendimento complessivo dell'85%. Utilizzare il prodotto senza ulteriore purificazione.
  6. Sintesi di 2-(2-ethoxyethoxy)etilamina (Neee)29,31
    1. Sciogliere 20 g (0,13 mol) di 2-(2-ethoxyethoxy)ezide in 160 mL di THF in un pallone rotondo rotondo da 500 mL con un amistatore magnetico.
    2. Aggiungere 40 g (0,15 mol, 1,1 equiv.) di triphenylfossphine e mescolare durante la notte a temperatura ambiente sotto argon.
    3. Soffrite la miscela di reazione con acqua (220 mL) e lasciateche mescolare per un altro giorno.
    4. Lavare la soluzione risultante con toluene, seguita da diclorometanotano (DCM).
    5. Evaporare lo strato acquoso sotto vuoto.
    6. Confermare l'identità del prodotto isolato, Neee, con la spettroscopia NMR. Aspettatevi i seguenti risultati: 1H NMR (400 MHz, CDCl3)8H, NH2-CH2-C2-O-CH2-C 2-O-CH2-CH),2,82 (m, 2H, NH2-CH2-CH2-O), 1,48 (s, 2H,H2), 1,16 (t, J - 7,5, 3H, O-CH2-CH3). 13 del sistema C NMR (100 MHz, CDCl3) : 73,14, 70,72, 69,64, 66,45, 41,35, 15,00.
      NOTA: Il prodotto è un liquido giallo e ha un rendimento complessivo del 58%. Utilizzare il prodotto senza ulteriore purificazione.

2. Sintesi di submonomeri in fase solida di oligo (peptoidi)

NOTA: l'approccio submonomero alla sintesi in fase solida (SPS) è stato utilizzato in quanto consente la produzione di oligomeri specifici della sequenza con elevata efficienza di accoppiamento. Un sintetizzatore peptide automatizzato è stato adattato per generare rapidamente oligo (peptoidi). Le impostazioni potrebbero richiedere modifiche per una strumentazione diversa.

  1. Preparazione
    1. Pesa 0,125 g di resina Fmoc-Photolabile SS (0,8 mmol/g carico tipico, scala 0,1 mmol, 100-200 mesh, 1% DVB) e aggiungilo a un vaso di reazione sintetizzatore automatizzato fritte. Inserire il recipiente nella parte a microonde del sintetizzatore.
    2. Riempire la bottiglia di solvente principale con DMF e la bottiglia di deprotection con 20% 4-methylpiperidine in DMF (v/v). Rifiuti vuoti.
    3. Preparare 1 M soluzioni di acido bromoacetico e N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) in DMF con volumi totali di 1,5 mL (numero di residui in sequenza) 5 mL. I 5 mL in eattività assicurano che l'aria non entri nella macchina. Aggiungere 0,47 mL di anidride acetica a DMF per creare una soluzione di capping da 5 mL.
      AVVISO: DIC può causare gravi danni agli occhi, irritazione cutanea e sensibilizzazione, e irritazione respiratoria e sensibilizzazione.
    4. Preparare le soluzioni da 0,5 M di ogni ammina primaria (Npam, Npal, Neee e Nma (2-methoxyethylamine)) in N-metil-2-pyrrolidone (NMP) utilizzato per la fase di spostamento. I volumi totali delle soluzioni per l'ammina primaria devono essere pari a 2,5 mL (numero di residui dell'amine primaria appropriata) pari a 2,5 mL.
    5. Aggiungi tutte le soluzioni al collettore sintetizzatore automatizzato.
  2. Sintesi
    NOTA: Eseguire utilizzando un sintetizzatore peptide automatizzato.
    1. Gonfiare la resina a temperatura ambiente per 5 min con 10 mL di DMF. Scolare il recipiente di reazione.
    2. Cleave il gruppo Fmoc con 3 mL della soluzione 20% 4-metilpiperidine per 30 s a 75 s e 90 s a 90 gradi centigradi. Scolare il vaso. Ripetere. Lavare con DMF (2 mL e 2).
    3. Aggiungere alla nave 1,5 mL della soluzione di acido bromoacetico e 1,5 mL della soluzione DIC. Riscaldare la reazione a 75 gradi centigradi per 4,5 min per eseguire la reazione di bromoacetylation. Lavare la resina (5 mL di DMF - 3).
    4. Eseguire la reazione di spostamento aggiungendo una soluzione di 2,5 ml di monomero di ammina primaria al vaso di reazione. Riscaldare a 75 gradi centigradi per 4,5 min. Resina di lavaggio (5 mL di DMF - 3).
    5. Ripetere i passaggi 2.2.3. e 2.2.4. sostituendo in sequenza il monomero dell'ammina primaria utilizzato nel passaggio 2.2.4. per far crescere la catena di oligo (peptoide) in modo specifico per la sequenza.
    6. Dopo la fase di spostamento finale, capovolgere la sequenza aggiungendo 2,5 mL della soluzione acetica di anidride e 2 mL della soluzione DIC. Riscaldare a 50 gradi centigradi per 2 min. Lavare la resina (5 mL di DMF - 6).
    7. Trasferire la resina in un recipiente di reazione in vetro fritte dotato di un tappo a 3 vie. Il recipiente di reazione al vetro deve essere precedentemente siliciato per evitare che le perline aderiscano alle pareti. Silanizzare le pareti riempiendo la nave con una soluzione dicloromeilsila Vaso di vetro secco prima dell'uso.
    8. Lavare la resina con DCM (5 mL e 3), spumeggiando con N2 attraverso un braccio e tirando il vuoto con un altro.
    9. Asciugare e conservare la resina e attaccare oligo (peptoide) fino alla deprotezione e alla scissione.
  3. Deprotezione di alloc-amine e scissione dalla resina
    1. Se la resina è stata conservata per più di un giorno, reswell la resina gorgogliando con 5 mL di DMF per 10 min. Quindi scolare il vaso e aggiungere una piccola barra di agitazione magnetica.
    2. Aggiungere 3 mL di DCM secco al recipiente peptide di vetro.
    3. Pesa 0,1 equivalenti di tetrakis (triphenylfossphine)palladio(0) e 25 equivalenti di fenilsila per gruppo Alloc. Utilizzare un morsetto per posizionare il recipiente di reazione ad un angolo sopra una piastra di agitazione in modo che la resina subisca un'agitazione delicata pur rimanendo sospesa nel solvente. Per evitare che il DCM evapora, capovolgi il recipiente di reazione.
    4. Dopo 1 h, filtrare la soluzione e lavare la resina con DCM (3 x 5 mL).
    5. Ripetere i passaggi 2.3.2. e 2.3.3.
    6. Sciacquare la resina in sequenza con metanolo e DCM due volte.
    7. Trasferire la resina e la barra magnetica di agitazione su una fiala da 20 mL.
    8. Immergere la resina in DMF, mescolare e sciacquare sotto irradiazione per 36 h a circa 25 mW.cm-2 con 405 nm. Una piccola porzione di resina può essere scissa e caratterizzata in ESI-MS prima di questo passaggio per garantire la completa deprotezione Alloc dell'ammina. Se rimangono gruppi Alloc, ripetere i passaggi 2.3.2 e 2.3.3.
    9. Separare l'oligo (peptoide) liberato dalla resina tramite un filtro di siringa. Rimuovere il solvente sotto vuoto.
  4. Purificazione e caratterizzazione degli oligo (peptoidi)
    1. Ricostituire i peptoidi in una miscela 50/50 di acqua/acetonitrile.
    2. Purificare con HPLC preparativo in fase inversa (C18). Combinare le frazioni purificate, congelare e liofilizzare per produrre polvere bianca. La polvere può essere conservata per un ulteriore utilizzo.
    3. Analizzare con ESI-MS dopo la purificazione.
    4. Eseguire la spettrometria di massa MALDI in modalità ione positivo riflettore. Mescolare 2 - L di una soluzione del campione (1 mM) con 6 -L di una miscela di 10 mg di matrice [2-(4-idrossifenilazo)benzoic acid (HABA)] in 200 . Individuare su una piastra campione MALDI e lasciare asciugare all'aria.
    5. Per la purezza, eseguire HPLC analitico di oligo purificato(peptoide).

3. Auto-assemblaggio della scala selettiva in sequenza

  1. Auto-assemblaggio attraverso la dissociazione/estrazione/annessione
    1. Preparare 10 mM di soluzioni stock di ogni sequenza oligo (peptoid) utilizzata per l'autoassemblaggio e una soluzione di 10 mM di scandium triflate (Sc(OTf)3) in acetonitrile anhydrous.
    2. A una fiala da 3 mL dotata di barra magnetica, aggiungere 20 -L di ogni soluzione di stock peptoid. Aggiungere 1,5 eq di Sc(OTf)3 per potenziale obbligazione imine dalla soluzione azionaria. Aggiungere abbastanza acqua e acetonitrile per formare un 200 -L 2% (v/v) di acqua / acetonitrile soluzione totale.
    3. Mescolare delicatamente a 70 gradi centigradi per 2 h per la deprotezione acetaldella dell'aldeide e la dissociazione di tutti i fili.
    4. Caricare la fiala con 200 litri di cloroformio e 2 mL d'acqua. Agitare delicatamente.
    5. Lasciare riposare la miscela (almeno 15 minuti) e, al momento della completa separazione di fase, estrarre lo strato organico con una siringa microlitro.
    6. Mescolare in una nuova fiala a 70 gradi centigradi per l'annessione dell'oligomero, in genere 6 h. L'ibridazione ladder può essere eseguita anche a temperatura ambiente ma per un periodo più lungo.
  2. Caratterizzazione delle specie auto-assemblate
    1. Eseguire la spettrometria di massa MALDI-TOF sulle soluzioni della miscela di reazione dopo i passaggi 3.1.3., 3.1.5. e 3.1.6. per monitorare la reazione. Se l'ibridazione è incompleta, aggiungere 1,5 eq di Sc(OTf)3 per potenziale obbligazione imine dalla soluzione azionaria e ripetere i passaggi 3.1.3-3.1.6. fino al completamento.
    2. Asciugare il campione sotto un flusso costante di azoto e ricostituire in 1 mL di acido nitrico del 2% (soluzione acquosa, v/v). Diluire 4 x 106volte con acqua HPLC. Determinare la concentrazione di scandium post-estrazione con spettrometria di massa plasma (ICP-MS) accoppiata ininduttivamente.

Representative Results

Per dimostrare la capacità dei peptoidi con codifica di informazioni di sottoporsi all'autoassemblaggio covalente dinamico selettivo in scale molecolari, un filamento rappresentativo, H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma, è stato sintetizzato e ibridato con la sua sequenza peptoide complementare. I monotgi Npam e Npal (caratterizzati da 1H NMR (500 MHz), Figura 1) sono stati impiegati come coppie dinamiche di reattori covalenti con Neee aiutando solubilità dei prodotti auto-assemblati finali. Inoltre, l'incorporazione del monomero Nma disponibile in commercio consente una differenziazione di massa tra le due sequenze complementari. Al termine della sintesi di submonomeri in fase solida, il gruppo Alloc è stato rimosso con Pd(PPh3)4. Prima e dopo la deprotection, parti della resina sono state screpolate sotto la luce 405 nm e caratterizzate da ESI-MS (Figura 2). La sequenza è stata purificata dalla prep HPLC, linfoofilizzata per ottenere una polvere bianca e la purezza confermata con HPLC analitico (Figura 3). L'oligo(peptoide) è stato successivamente ibridato con la sua sequenza complementare, H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal, per permettersi una scala nel registro confermata da MALDI-MS (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: schemi sintetici Monomer e 1spettri H-NMR. (A) Schemi sintetici monomerici con reagenti e condizioni: (i) cloroformato allealle, acido acetico acquoso al 10%, 1,4 dioxane, temperatura ambiente, durante la notte; ii) glicole di etilene, acido toluene-p-sulfonico, toluene, reflusso, durante la notte; (iii) LiAlH4, anidroso Et2O, 0 C per 4 h quindi temperatura ambiente per 12 h; (iv) cloruro di tosil, THF, 0 c; (v) NaN3, DMF, 60 gradi centigradi, 36 h; (vi) trehenylphosphine, THF, durante la notte. (B) Monomer 1spettri H-NMR (500 MHz, CDCl3): (i) 4-(2-aminoethyl)-N-(allelcarbonyloxy)fenylamina (Npam); ii) 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benzylamine (Npal); (iii) 2-(2-ethoxyethoxy)etilamina (Neee). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Sintesi e deprotezione di un oligo (peptoide) specifico della sequenza. (A) Strutture di H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma prima e dopo la rimozione del gruppo di protezione dell'Alloc con lo spettro di massa ESI di accompagnamento (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Purificazione e caratterizzazione di un peptoide con codifica informativa. (A) cromatogramma HPLC della purificazione del filamento mediante salatificazione HPLC con gradiente lineare di acetonitrile (MeCN) e acqua: (1) 30% MeCN, 0.1-2.1 min; (2) 30-95% MeCN, 2,1-16,1 min; (3) 95% MeCN, 16.1-23.1 min; (4) 95% MeCN, 23.1-26.1 min. I picchi i e ii corrispondono rispettivamente a sottoprodotti a bassa reazione molecolare, principalmente DIC-urea, e specie oligomeriche tra cui il prodotto desiderato. (B) Cromatogramma HPLC analitico e (C) spettro di massa ESI di H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma dopo liofilizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Auto-assemblaggio di H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma e la sua sequenza complementare, H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal. (A) Strutture delle due sequenze e dell'assieme risultante basato su sequenza. (B) Spettro di massa MALDI della scala molecolare dopo l'annealing a temperatura ambiente durante la notte. Masse: attese [M-Na]- 3306,7, trovate 3306.0; previsto [M-1 imines.r.l., 3324.7, trovato 3323.9; previsto [M-2 imine s.r.l., 3342,7, trovato 3342,8; previsto [M-2 imine s.l.m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La tecnica qui descritta descrive l'assemblaggio covalente dinamico di oligomeri peptoidi che portano informazioni, dove le informazioni sono codificate nella sequenza dei loro gruppi di ciondolo. L'uso di un monomero di ammina protetto da Alloc in combinazione con un monomero di aldeide etilene protetto da acetal consente la deprotection ortogonale, consentendo la deprotezione di Alloc sul tallone e la deprotezione acetale in situ durante la reazione di auto-assemblaggio, garantendo così che le sequenze sintetizzate non reagiscano prematuramente prima della purgomerificazione e della caratterizzazione delle oligogoni. È importante sottolineare che la sintesi in fase solida viene eseguita utilizzando una resina fotolabile per consentire la scissione dell'oligomero dal tallone sotto l'irradiazione UV o della luce viola, precludendo la deprotezione prematura del gruppo di protezione acido-labile e basato sull'etilene acetal. Si potrebbero considerare diversi sistemi alternativi di disprotezione. Per esempio, inizialmente abbiamo impiegato gruppi dual acid-labile di protezione (Boc-ammine e etilene acetal-aldeide) con l'intenzione di deprotection in situ da un forte acido seguito con neutralizzazione per consentire alla reazione di auto-assemblaggio di procedere; tuttavia, questo approccio ha provocato l'immediata generazione di precipitati dopo l'aggiunta di base. In alternativa, la protezione dell'ammina con un gruppo di protezione fotolabile, 2-(2-nitrophenyl)propoxycarbonyl (NPPOC), è stata concepita in quanto l'aldeide potrebbe essere deprotetta selettivamente dopo il trattamento con acido trifluoroacetico (TFA) prima della purificazione. Purtroppo, la fotolisi in situ del gruppo protettore con luce UV non ha permesso la deprotection quantitativa, anche in presenza di fotosensibilizzanti e dopo lunghi periodi di irradiazione25. Trimethylsilylethoxycarbonyl (cioè Teoc) può essere impiegato come gruppo di protezione delle ammine ed è soggetto a scissione dopo il trattamento con trigoni metallici di terre rare; tuttavia, la deprotection quantitativa del Teoc richiede carichi triflate metallici di terre rare molto più elevati di quelli necessari per la deprotection acetale di etilene. Per questo protocollo, possono essere utilizzate aree di Teoc-ammine, ma la concentrazione di acido di Lewis deve essere regolata di conseguenza in quanto la deprotection dell'ammina sottoquantitativa potrebbe rivelarsi problematica per le strutture più grandi auto-assemblate. I gruppi funzionali alipatici sono stati brevemente considerati, ma la deprotezione delle aldeidi alipatiche richiede condizioni difficili che troncano le sequenze peptoidi32,33.

L'incorporazione di Neee e Nma come residui di stanziamento inerte serve a migliorare la solubilità degli oligomeri e a consentire alla facile marcatura di massa degli oligomeri precursori di permettersi una pronta identificazione delle specie generate mediante spettroscopia di massa. Inoltre, data la conformazione "strand" dei peptoidi in cui i segmenti della spina dorsale adiacenti adottano stati rotazionali opposti per formare un oligomero lineare, senza torsioni34,35, sequenze che incorporano residui di distanziali dinamici e inerti alternati facilita notori in cui i gruppi di pendenti reattivi sono orientati nella stessa direzione. Data la versatilità del metodo dei submonomeri, è possibile impiegare una vasta e diversificata libreria di ammine primarie per modificare ulteriormente gli oligomeri peptoidi, ma può richiedere modifiche al protocollo per mantenere un'elevata efficienza di accoppiamento.

Mentre gli oligo(peptoidi) possono essere sintetizzati manualmente in un vaso di reazione di vetro19, l'automazione del processo riduce il tempo per ogni aggiunta di residuo da diverse ore a mezz'ora. Inoltre, l'automazione riduce la quantità di rifiuti di solvibili monomeri e di lavaggio, particolarmente desiderabili quando si utilizzano monomeri di ammina primaria che non sono disponibili in commercio. Anche se la cleavazione Alloc dai residui di ammina protetta è una reazione efficiente, l'ossidazione del palladio può provocare una deprotezione incompleta. Di conseguenza, si suggerisce di testare una parte della resina e caratterizzare l'entità della deprotection con ESI-MS. Per i scissioni di prova, 30 min under 405 nm irradia peptoide sufficienti per la spettrometria di massa. La deprotection parziale può essere limitata con l'uso di condizioni anaerobiche o ripetendo la reazione di deprotection.

Mentre questo articolo si concentra su Sc(OTf)3 come reagente multiruolo, altri triflate di metallo di terre rare, come lo ytterbium triflate, hanno dimostrato di mediare con successo l'assemblaggio di scale molecolari orientato alle informazioni. In particolare, Sc(OTf)3 è il più acido Lewis dei triflate metallici di terre rare; pertanto, a causa della ridotta capacità catalitica offerta da altri trigoni metallici di terre rare24,36, possono essere necessari equivalenti maggiori per effettuare la completa deprotection acetale di etilene e la dissociazione del filo. Il numero di equivalenti necessari può essere determinato con la spettrometria di massa MALDI osservando il punto in cui i fili si dissociano completamente. La dissociazione è fondamentale nel processo di auto-assemblaggio ed è analoga allo scioglimento dei filamenti di acido nucleico a temperature elevate. La successiva estrazione del catalizzatore consente la formazione e l'interruzione di accoppiamenti covalenti dinamici che propagano l'assemblaggio di duplex specifici della sequenza. Questa graduale annessione dei fili oligomerici aggira l'intrappolamento cinetico (che, per le scale molecolari, può produrre specie fuori registro o sequenze di coppia in modo errato) sperimentate con altri metodi.

Cloroformio è un ottimo solvente come separazione di fase nel sistema cloroformio / acetonitrile / acqua ternaria utilizzato qui promuove l'estrazione parziale di acido Lewis senza provocare precipitazioni di strutture auto-assemblate37. Inoltre, il cloroformio è uno dei pochi solventi che promuove la formazione di imine pur mantenendo la solubilità della scala molecolare. Le quantità di tracce di duplex out-of-registry e accoppiati in modo non corretto possono essere spesso osservati a causa della natura dinamica del sistema. Anche se questo sistema è in gran parte inalterato da piccole variazioni nelle concentrazioni di triflate di metalli di terre rare al momento dell'estrazione, a volte, l'insufficiente estrazione del catalizzatore genera una porzione significativa di ibridazione incompleta e accoppiamenti di oligomeri non specifici. In questo caso, è generalmente preferibile ri-dissociare con altri 1,5 equivalenti di catalizzatore e quindi estrarre una seconda volta piuttosto che riestrarre immediatamente, poiché la dissociazione completa di singoli fili è vitale per il processo. Per assemblare contemporaneamente diverse scale molecolari con codifica di informazioni uniche, potrebbe essere necessario aumentare la concentrazione della soluzione di stock triflate metallico di terre rare utilizzata per mantenere equivalenti e volume di reazione totale.

Mentre questi auto-assemblaggi sono principalmente caratterizzati da spettrometria di massa, sono possibili altre tecniche tra cui il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza (FRET). Le limitazioni includono la quantità di materiale necessaria, la convenienza dei monomeri e il rapporto segnale-rumore. Le tecniche che richiedono solventi, come 1H NMR, possono inoltre soffrire di insolubilità di strutture auto-assemblate. Inoltre, le concentrazioni di triflate metallici di terre rare dopo l'estrazione possono essere determinate attraverso metodi come ICP-MS o 19F NMR con uno standard interno.

Man mano che progredisce verso un migliore controllo sulle nanostrutture e sui materiali macro e sopra-molecolari, si pone la sfida di progettare e fabbricare assiemi regolari, ma modificabili. Il protocollo descritto in questa relazione fornisce un percorso per raggiungere tali nanostrutture attraverso assembly selettivi di sequenza attraverso interazioni covalenti dinamiche.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, Ufficio delle Scienze, Scienze dell'Energia di base, sotto il premio #DESC0012479. S.C.L. riconosce il sostegno del National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, e A.F.A. riconosce il sostegno di Abu Dhabi National Oil Company (ADNOC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dioxane Fisher Scientific D1114 Certified ACS
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) Millipore-Sigma 54793 Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5%
4-(2-Aminoethyl)aniline Ontario Chemicals A2076 98%
4-Cyanobenzaldehyde Oakwood Chemical 049317 99%
4-Methylpiperidine TCI America P0445 ≥98.0%
4-Toluenesulfonyl chloride Oakwood Chemical BR1703 99%
50 mL High Performance Centrifuge Tubes VWR International 21008-240 Centrifuge Tubes used for automated synthesizer
Acetic acid Fisher Scientific A38-212 Glacial
Acetic anhydride Fisher Scientific A10 Certified ACS
Acetonitrile Millipore-Sigma 34851 For HPLC; Gradient grade; ≥99.9%
All-plastic Norm-Ject syringes Thermo Fisher Scientific S7510-10 Luer-Slip Syringe
Allyl chloroformate Acros Organics 221741000 97%
Bromoacetic acid Alfa Aesar A14403 ≥98.0%
Chloroform Millipore-Sigma 288306 Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Chloroform-d Acros Organics AC320690075 For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules
Dichlorodimethylsilane Acros Organics 1133100 ≥99.0%
Dichloroethane Fisher Scientific E175 Certified ACS
Dichloromethane Fisher Scientific D37-4 Stabalized; Certified ACS
Diethyl ether Acros Organics 615080010 Anhydrous; ACS reagent
Diethylene glycol monoethyl ether TCI America E0048 ≥99.0%
Ethanol Decon Labs 2701 200 Proof; Anhydrous
Ethylene glycol Fisher Scientific E178 Certified
Fmoc-Photolabile SS resin CreoSalus SA50785 100-200 mesh; 1% DVB
Glass Peptide Vessel Chemglass CG-1866-02 Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread
LC-6AD HPLC pumps Shimadzu Corporation Equipment
LED 405nm ThorLabs M405L2-C1 405 nm LED used for photocleavage of peptoid
LED Driver ThorLabs LEDD1B Driver for LED light used in photocleavage of peptoid
Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer CEM Corporation Equipment
Lithium aluminum hydride Millipore-Sigma 199877 Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture
Luna C18 analytical RP-HPLC column Phenomenex 00G-4252-E0 Equipment
Luna C18 prepatory RP-HPLC column Phenomenex 00G-4253-P0-AX Equipment
Methanol Fisher Scientific A412 Certified ACS
Microliter Syringe Hamilton Company 80700 Cemented Needle (N)
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) Oakwood Chemical M02889 ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization
N,N-Dimethylformamide Millipore-Sigma 319937 ACS reagent; ≥99.8%
Nitric acid Fisher Scientific A200-212 Certified ACS Plus
Nitrogen gas Cryogenic Gases Contents under pressure, may explode if heated
Phenylsilane Oakwood Chemical S13600 97%
Prominence SPD-10A UV/vis Detector Shimadzu Corporation Equipment
p-Toluenesulfonic acid monohydrate Millipore-Sigma 402885 ACS reagent; ≥98.5%
Scandium(III) triflate Oakwood Chemical 009343 99%
Single-use Needle Exel International 26420 18G x 1 1/2″
Sodium azide Oakwood Chemical 094448 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin.
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233 Powder; Certified ACS
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100 Pellets; Certified ACS
Sodium sulfate Fisher Scientific S421-500 Anhydrous; Granular; Certified ACS
Syringe Filter 0.45 µm VWR International 28145-497 PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing
Tetrahydrofuran Fisher Scientific T397 Certified
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) Oakwood Chemical 034279 98%
Toluene Fisher Scientific T324 Certified ACS
Triphenylphosphine Oakwood Chemical 037818 99%

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References

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