Syntes av informationsbärande peptoider och deras Sekvensregisserade Dynamic Covalent Self-assembly

Chemistry
 

Summary

Ett protokoll presenteras för syntes av informationskodade peptoid oligomerer och för sekvens-regisserad självmontering av dessa peptoider i molekylära stegar med hjälp av aminer och aldehyder som dynamiska kovalenta reaktant par och Lewis sura sällsynta jorden metalltriflator som flerfaldiga reagenser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Leguizamon, S. C., Alqubati, A. F., Scott, T. F. Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly. J. Vis. Exp. (156), e60442, doi:10.3791/60442 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Detta protokoll presenterar användningen av Lewis sura multi-roll reagenser för att kringgå kinetiska fångstsom observerats under självmontering av information-kodade olidliga strängar medierad av parade dynamiska kovalenta interaktioner på ett sätt som härmar termisk cykling som vanligen används för självmontering av kompletterande nukleinsyra sekvenser. Primära amin monomers med aldehyd och amin hänge moieties är functionalized med ortogonal skydda grupper för användning som dynamiska kovalenta reactant par. Med hjälp av en modifierad automatiserad peptid synthesizer, de primära amin monomers kodas i oligo (peptoid) strängar genom solid-fas submonomer syntes. Vid rening av högpresterande flytande kromatografi (HPLC) och karakterisering genom elektrosprayjonisering massa spektrometri (ESI-MS), sekvensspecifika oligomerer utsätts för hög belastning av en Lewis sura sällsynta jordmetall triflate som både avskyddar aldehyd moieties och påverkar den reagerande par jämvikt så att strängar helt dissociate. Därefter utvinns en bråkdel av Lewis-syran, vilket gör det möjligt att glödgning av kompletterande sekvensspecifika strängar för att bilda informationskodade molekylära stegar som kännetecknas av matrisassisterad laserdesorption/joniseringmassaspektrometri (MALDI-MS). Det enkla förfarande som beskrivs i denna rapport kringgår kinetiska fällor som vanligen upplevs inom området dynamisk kovalent montering och fungerar som en plattform för den framtida utformningen av robusta, komplexa arkitekturer.

Introduction

Framsteg i självmontering, den process genom vilken små underenheter genererar större arkitekturer genom termodynamiskt drivna vägar, har gett förbättrad kontroll över makro- och supramolekylära nanostrukturer vanligtvis genom att utnyttja intermolekylära interaktioner som π-stapling och vätebindning1,2,3,4. I synnerhet nukleinsyror (dvs. polynukleotider) har framstått som anmärkningsvärt mångsidiga nano-konstruktion media som den höga informationstäthet som Watson-Crick bas ihopkoppling tillåter montering av komplexa, sekvens-selektiva strukturer4,5. Dessa övergående intermolekylära bindningar möjliggör omorganisering av subenheter och felkorrigering, men de resulterande strukturerna är ofta mottagliga för termisk och mekanisk nedbrytning6. Däremot dynamiska kovalenta interaktioner7,8,9, en klass av kovalent bindning-bildande reaktioner som är reversibla eller rearrangeable under milda förhållanden och har nyligen använts för att ge invecklade makromolekyler såsom stegar10,11,12,13, burar14,15,16, och staplar17, erbjuda ökade bindningsstyrkor och robusta strukturer. Tyvärr minskar kapaciteten för omorganisering och felkontroll av de relativt låga omorganiseringsgraderna för dessa kovalenta arter, vilket begränsar deras förmåga till självmontering till önskade produkter18. För att ta itu med denna kinetiska fångst, katalysatorer eller hårda reaktionsförhållanden används ofta tillsammans med enkla byggstenar. Här rapporterar vi en process som kringgår kinetisk svällning för att möjliggöra självmontering av molekylära stegar från sekvensspecifika oligomerer där hybridiseringen styrs av den information som kodas i oligomerrestsekvenserna.

Med tanke på deras syntetiska tillgänglighet används poly(N-ersatt glycin)s (dvs. peptoider) som de olidliga prekursorer från vilka de molekylära stegarna monteras19. Peptoids är strukturella isomerer av peptider där hänge grupper är anbringade på ryggraden-burna kväve istället för att kombineras med α-kol20. Med hjälp av solid-fas syntes, exakt placering av dynamiska kovalenta hängegrupper längs peptoid kedjan är lätt uppnås, vilket möjliggör utformningen av prekursor oligomerer som kan samlas i komplexa supramolekylära strukturer21.

Den dynamiska kovalentombildning av imine anslutning används i detta förfarande som imine-genererakondensation reaktion ger ett bekvämt sätt att karakterisera självmontering av masspektrometri som varje obligation bildas resulterar i en massreduktion av 18 g /mol22. Dessutom kan jämvikten mellan amin- och aldehydretrant och iminprodukten varieras genom att den sura koncentrationen ändras. Specifikt används sällsynta jordartsmetaller metalltriflater för att påverka jämvikt, och dessutom avskydda etenacetal-skyddade aldehyder23,24,25. För att notera, scandium triflate används redan ofta inom området dynamisk kovalent självmontering, inklusive dess senaste framgång i att hjälpa syntesen av kovalenta organiska ramar (COFs) vid rumstemperatur26,27. Dessutom möjliggör de kontrasterande lösligheten hos oligo(peptoid) sekvenser och den sällsynta jorden metalltriflate jämviktskontroll genom vätskevätskeextraktion. Processen rapporterade använder denna kontroll för att kringgå kinetiska hinder förhindra information-riktad självmontering.

Protocol

VARNING: Flera kemikalier som används i detta protokoll är frätande, brandfarliga eller giftiga och bör endast användas under en kemisk rökhuva. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och konsultera alla relevanta säkerhetsdatablad (SDS) före användning.

1. Monomersyntes

OBS: Primära aminer syntetiserades enligt publicerade metoder.

  1. Syntes av 4-(2-aminoethyl)-N-(allylcarbonyloxy)fenylamin (Npam)25,28
    1. Tillsätt 5,0 g (36,7 mmol) av 4-(2-aminoetyl)aninat till 150 ml 10% ättiksyra (vattenlösning, v/v).
      OBS: Användning av svag syra möjliggör selektivt skydd av den aromatiska aminen utan att påverka den aliphatiska aminen på grund av den stora skillnaden i pKett värde mellan de två grupperna.
    2. Förbered en lösning på 4,9 g (40,4 mmol; 1,1 equiv.) allyl klorformat i 150 ml 1,4-dioxan.
    3. Kombinera lösningarna i en rund kolv med 500 ml som är utrustade med en magnetisk rörstång och rör om reaktionsblandningen vid rumstemperatur över natten.
    4. För att arbeta upp reaktionen, späd med 500 ml avjoniserat (DI) vatten och tvätta med diethyl eter (Et2O, 300 ml × 3). Kassera de organiska fraktionerna.
    5. Justera vattenfasen till pH 14 genom att lägga till 2 M NaOH (vattenlösning) och extrahera med Et2O (150 ml × 3).
    6. Kombinera de organiska fraktionerna och tvätta med DI-vatten (150 ml × 3).
    7. Torka över Na2SO4,sedan filtrera.
    8. Avdunsta till torrhet under reducerat tryck.
    9. Bekräfta identiteten på den isolerade produkten, Npam, genom kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Räkna med följande resultat: 1H NMR (500 MHz, CdCl3) δ:7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H, Ar), 7.14 (d, J = 8.5 Hz, 2H, Ar), 6.65 (s, 1H, -NH-), 6.04 – 5.89 (m, 1H, -CH=CH2), 5.36 (dq, J = 17,1, 1,6 Hz, 1H, -CH=CHH), 5,26 (dq, J = 10,5, 1,4 Hz, 1H, -CH=CHH),4,66 (dt, J = 5,8, 1,5 Hz, 2H, -CH2-CH=CH2), 2,94 (t, J = 6,8 Hz, 2H, -CH H 2-NH2), 2,70 (t, J = 6,8 Hz, 2H, -CH2-Ar), 1,04 (s, 2H, -CH2-NH2). 13 C NMR (125 MHz, CD3OD) δ:154,85, 137,00, 134.98, 133.51, 129.36, 119.41, 116.92, 65.62, 59.89, 43.47, 38.72.
      OBS: Produkten är en ljusgul fast och har en total avkastning på 69%. Använd produkten utan ytterligare rening.
  2. Syntes av 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benzonitril 29,30
    1. Lös upp 25 g (0,19 mol) av 4-cyanobensaldehyd i 200 ml toluen.
    2. Tillsätt 42,2 ml (0,768 mmol; 4 equiv.) av etenglykol och 0,02 g (0,1 mmol; 0,05 mol%) toluen- p-sulfonsyra till reaktionsblandningen.
    3. Rör om och reflux över natten vid 120 °C med hjälp av en Dean-Stark fälla (dvs. azeotropdedestillation) för att avlägsna vatten som genereras under reaktionen.
    4. När reaktionen är klar och kyld till rumstemperatur, tillsätt 40 ml 5% NaHCO3 (w / v) vattenlösning.
    5. Extrahera det organiska lagret och tvätta med DI-vatten tre gånger.
    6. Torka över Na2SO4,sedan filtrera.
    7. Avdunsta till torrhet under reducerat tryck.
    8. Bekräfta identiteten på den isolerade produkten, genom NMR-spektroskopi. Räkna med följande resultat: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:7.67 (d, J = 8.0, 2H, Ar), 7.59 (d, J = 8.4, 2H, Ar), 5.84 (s, 1H, CH), 4.12 - 4.03 (AA中BB中, 4H, (CH2O)2). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ:143,20, 132.34, 127.30, 118.72, 113.02, 102.56, 65.57.
      OBS: Produkten är en vit kristallin fast och har en total avkastning på 86%. Använd produkten utan ytterligare rening.
  3. Syntes av 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benylamin (Npal)29
    1. Förbered en lösning på 10 g (0,057 mol) av 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)bensotoril i 100 ml vattenfri Et2O.
    2. Tillsätt försiktigt 4,3 g (0,11 mol; 2hästdjur4 till 100 ml vattenfri et2O i en rund bottenkolv vid 0 °C. Rör om för att skapa en välblandad fjädring och försegla systemet under en inert atmosfär med hjälp av en argonfylld ballong. Släck försiktigt med etanol eventuellkvarvarande LiAlH4 på utrustning som används för vägning.
      VARNING: Litium aluminiumhydrid (LiAlH4) är en mild pyrofor; under inert gas och skydda mot fukt.
    3. Tillsätt 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)bensoitrillösning långsamt med hjälp av en tillsatstratt eller en sprutpump samtidigt som reaktionsblandningen bibehålls vid en temperatur av 0 °C.
    4. Rör om reaktionsblandningen för 4 h vid 0 °C, följt med 12 h vid rumstemperatur.
    5. När reaktionen är klar och kyld till 0 °C, tillsätt långsamt 95 % etanol (30 ml). Ytterligare släckning genom att lägga till 50% etanol i vatten (v/v, 20 ml). En bubblare kan användas för att övervaka släckningsprocessen.
      OBS: Lägg till ytterligare vattenfri Et2O efter behov för att upprätthålla en tillräcklig omrörningshastighet.
    6. Separera etern supernatant och avdunsta till torrhet under reducerat tryck.
    7. Filtrera den resulterande oljan genom ett 0,45 μm sprutafilter.
    8. Bekräfta identiteten på den isolerade produkten, NpaI, genom NMR spektroskopi. Räkna med följande resultat: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:7.44 (d, J = 8, 2H, Ar), 7.32 (d, J = 8, 2H, Ar), 5.80 (s, 1H, CH), 4.14 - 4.0 (AA中BB中, 4H, (CH2O)2), 3.87 (s, 2H, -CH2-NH2). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ:144,53, 136.53, 127.16, 126.77, 103.72, 65.39, 46.35.
      OBS: Produkten är en gul olja och har en total avkastning på 70%. Använd produkten utan ytterligare rening.
  4. Syntes av 2-(2-etoxyetoxy)etyltosylate29,31
    1. Tillsätt 20 g dietylenglykolmonoeter och 50 ml tetrahydrofuran (THF) till en rund kolv med 250 ml med en magnetisk omrörare.
    2. Kyl till 0 °C och försegla systemet under en inert atmosfär med hjälp av en argonfylld ballong.
    3. Tillsätt 50 ml 6 M vattenhaltiga NaOH (2 equiv.).
    4. Lös upp 54 g (0,28 mol; 2 equiv.) av tosylklorid i 80 ml THF och tillsätt lösningen på reaktionsblandningen dropwise. Rör om i 1 h vid 0 °C.
    5. Låt reaktionsblandningen nå rumstemperatur och rör om i ytterligare en timme.
    6. Extrahera reaktionsblandningen med Et2O (400 ml).
    7. Tvätta det organiska lagret med 1 M NaOH, sedan med DI vatten.
    8. Torka över Na2SO4,sedan filtrera.
    9. Avdunsta till torrhet under reducerat tryck.
    10. Bekräfta identiteten på den isolerade produkten genom NMR-spektroskopi. Räkna med följande resultat: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:7.78 (d, J = 8.0, 2H, -S-C=CH-CH), 7.33 (d, J = 8.5, 2H, -S-C=CH-CH), 4.15 (t, J = 5.0, 2H, -CH2-CH2-O-Ts), 3.68 (t, J = 5.0, 2H,C H2-CH2-O-Ts), 3.60-3.42 (m, 6H, O-CH2-CH2-O-CH2-CH3), 2.43 (s, 3H, C-CH3), 1,17 (t, J = 7,0, 3H, O-CH2-CH3). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ:144,79, 132.95, 130,26, 129.80, 127.90, 126.95, 70.75, 69.68, 69.29, 68.61, 66.57, 21.56, 15.11.
      OBS: Produkten är en färglös vätska och har en total avkastning på 98%. Använd produkten utan ytterligare rening.
  5. Syntes av 2-(2-etoxyetoxy)etylazid29,31
    1. Lös upp 40 g (0,14 mol) av 2-(2-etoxyetoxy)etyltosylate i 250 ml dimetylformamid (DMF) i en rund bottenkolv med en magnetisk omrörare. Försegla systemet under en inert atmosfär med hjälp av en argonfylld ballong.
    2. Tillsätt 32 g (0,49 mol; 3,5 equiv.) av NaN3 till reaktionsblandningen.
      VARNING: Använd inte en metallspatel vid vägning Av NaN3. NaN3 kan reagera med bly och koppar vilket resulterar i bildandet av mycket explosiva metallazider. Det är akut giftigt och dödligt vid sväljd eller i kontakt med huden.
    3. Värm reaktionsblandningen till 60 °C och låt den gå i 36 timmar. Sedan svalna till rumstemperatur.
    4. Späd med stor mängd vatten (500 ml) och extrakt med Et2O (150 ml × 3).
    5. Isolera det organiska lagret och utför vattentvättar.
    6. Torka över Na2SO4,sedan filtrera.
    7. Avdunsta till torrhet under reducerat tryck.
    8. Bekräfta identiteten på den isolerade produkten genom NMR-spektroskopi. Räkna med följande resultat: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:3,64 (m, 4H, O-CH2-CH2-O), 3,58 (m, 2H, N3-CH2-CH2-O), 3,51 (q, J = 7,5, 2H, O-CH2-CH3), 3,38 (t, J = 5,0, 2H, N3-CH2-CH2-O), 1,19 (t, J = 7,5, 3H, O-CH2-CH3). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 70,70, 69.97, 69.80, 66.63, 50.60, 15.08.
      OBS: Produkten är en gul vätska och har en total avkastning på 85%. Använd produkten utan ytterligare rening.
  6. Syntes av 2-(2-etoxyetoxy)etylomin (Neee)29,31
    1. Lös upp 20 g (0,13 mol) av 2-(2-etoxyetoxy)etymeri azid i 160 ml THF i en 500 ml rund bottenkolv med en magnetisk omrörare.
    2. Tillsätt 40 g (0,15 mol, 1,1 equiv.) av triphenylphosphine och rör över natten i rumstemperatur under argon.
    3. Släcka reaktionsblandningen med vatten (220 ml) och låt den röra om en annan dag.
    4. Tvätta den resulterande lösningen med toluen, följt av diklormetan (DCM).
    5. Avdunsta det vattenhaltiga lagret under vakuum.
    6. Bekräfta identiteten på den isolerade produkten, Neee, genom NMR spektroskopi. Räkna med följande resultat: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:3.62-3.42 (m, 8H, NH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3),2,82 (m, 2H, NH2-CH2-CH2-O), 1,48 (s, 2H, NH2), 1,16 (t, J = 7,5, 3H, O-CH2-CH3). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 73.14, 70.72, 69.64, 66.45, 41.35, 15.00.
      OBS: Produkten är en gul vätska och har en total avkastning på 58%. Använd produkten utan ytterligare rening.

2. Solid-fas submonomer syntes av oligo (peptoids)

OBS: Submonomer-metoden för solid-phase syntes (SPS) användes eftersom det möjliggör produktion av sekvensspecifika oligomerer med hög kopplingseffektivitet. En automatiserad peptidsynthesizer anpassades för att snabbt generera oligo (peptoids). Inställningar kan kräva ändring för olika instrumentering.

  1. Förberedelser
    1. Väg 0,125 g Fmoc-Photolabile SS harts (0,8 mmol/g typisk lastning, 0,1 mmol skala, 100-200 mesh, 1% DVB) och lägg till en fritted automatiserad synthesizer reaktionskärl. För in kärlet i syntarens mikrovågsdel.
    2. Fyll huvudlösningsflaskan med DMF och skyddsflaskan med 20% 4-metylpiperidin i DMF (v/v). Tomt avfall.
    3. Förbered 1 M-lösningar av bromoacetisyra och N,N'-diisopropylkarbodiimide (DIC) i DMF med totala volymer på 1,5 ml × (antal resthalter i följd) + 5 ml. Den extra 5 ml säkerställer att ingen luft kommer in i maskinen. Lägg till 0,47 ml ättiksyraanhydrid till DMF för att göra en 5 ml cappinglösning.
      VARNING: DIC kan orsaka allvarliga ögonskador, hudirritation och sensibilisering, och andningsirritation och sensibilisering.
    4. Förbered 0,5 M-lösningar av varje primär amin (Npam, Npal, Neee och Nma (2-metoxiethylamine)) i N-metyl-2-pyrrolidon (NMP) som används för förskjutningssteget. De totala volymerna av de primära aminlösningarna bör vara 2,5 ml × (antal rester av lämplig primäramin) + 2,5 ml.
    5. Lägg till alla lösningar till den automatiserade synthesizer grenröret.
  2. Syntes
    OBS: Utför med hjälp av en automatiserad peptid synthesizer.
    1. Sväll hartsen i rumstemperatur i 5 min med 10 ml DMF. Töm reaktionskärlet.
    2. Klyva Fmoc-gruppen med 3 ml av 20% 4-metylpiperidinlösningen för 30 s vid 75 °C och 90 s vid 90 °C. Töm av kärlet. Upprepa. Tvätta med DMF (2 ml × 2).
    3. Lägg till kärlet 1,5 ml av bromoacetisyralösningen och 1,5 ml av DIC-lösningen. Värm reaktionen vid 75 °C i 4,5 min för att utföra bromoacetylationsreaktionen. Tvätta hartset (5 ml DMF × 3).
    4. Utför förskjutningsreaktionen genom tillsats av 2,5 ml primär aminmonomerlösning på reaktionskärlet. Värm vid 75 °C i 4,5 min. Tvättharts (5 ml DMF × 3).
    5. Upprepa steg 2.2.3. och 2.2.4. medan sekventiellt ersätter den primära aminmonomer som används i steg 2.2.4. att växa oligo (peptoid) kedja på ett sekvensspecifikt sätt.
    6. Efter det slutliga förskjutningssteget, kapa sekvensen genom att lägga till 2,5 ml av den ättiksyrade anhydridlösningen och 2 ml i DIC-lösningen. Värm vid 50 °C i 2 min. Tvätta hartset (5 ml DMF × 6).
    7. Överför hartsen till ett fritted glasreaktionskärl utrustat med en 3-vägs kran. Glasreaktionskärlet bör tidigare silikoniseras för att förhindra att pärlor na följer väggarna. Silanize väggarna genom att fylla kärlet med en 5% dichlorodimethylsilane i dikloretan (DCE) (v / v) lösning på toppen och låta den sitta i 30 min. Töm kärlet och tvätta med DCE och metanol. Torrt glaskärl före användning.
    8. Tvätta hartset med DCM (5 ml × 3), bubblande med N2 genom en arm och dra vakuum med en annan.
    9. Torr och lagra harts och bifogad oligo (peptoid) tills deprotection och klyvning.
  3. Alloc-amine deprotection och klyvning från harts
    1. Om hartsen har lagrats i mer än en dag, reswell hartsen genom att bubbla med 5 ml DMF i 10 min. Dränera sedan kärlet och tillsätt en liten magnetisk rörstång.
    2. Tillsätt 3 ml torr DCM till glaspeptidkärlet.
    3. Väg 0,1 motsvarigheter till tetrakis (triphenylphosphine)palladium(0) och 25 motsvarigheter till fenylsilane per Alloc-grupp. Använd en klämma för att placera reaktionskärlet i en vinkel ovanför en rörplatta så att hartsen genomgår mild omrörning samtidigt som den förblir upphängd i lösningsmedlet. För att förhindra att DCM avdunstar, täck reaktionskärlet.
    4. Efter 1 h, filtrera bort lösningen och tvätta hartset med DCM (3 × 5 ml).
    5. Upprepa steg 2.3.2. och 2.3.3.
    6. Skölj hartssekventiellt med metanol och DCM två gånger.
    7. Överför harts och magnetisk rörstång till en 20 ml injektionsflaskor.
    8. Doppa hartset i DMF, rör om och klyva under bestrålning för 36 h vid cirka 25 mW.cm-2 med 405 nm. En liten del av harts kan klynas och karakteriseras i ESI-MS innan detta steg för att säkerställa fullständig Alloc deprotection av amin. Om några Alloc-grupper finns kvar upprepar du steg 2.3.2 och 2.3.3.
    9. Separat befriad oligo (peptoid) från harts via ett sprutafilter. Ta bort lösningsmedel under vakuum.
  4. Rening och karakterisering av oligo (peptoids)
    1. Rekonstruera peptoids i en 50/50 blandning av vatten/ acetonitrile.
    2. Rena med omvänd fas preparative HPLC (C18). Kombinera renade fraktioner, frysa och lyophilize att ge off-white pulver. Pulvret kan förvaras för vidare användning.
    3. Analysera med ESI-MS efter rening.
    4. Utför MALDI massa pektrometri i reflectron positiv jonläge. Blanda 2 μL av en lösning av provet (1 mM) med 6 μL av en blandning av 10 mg matris [2-(4-hydroxyphenylazo)bensosyra (HABA)] i 200 μL acetonitril. Spot på en MALDI provplatta och låt lufttorka.
    5. För renhet, utför analytisk HPLC av renad oligo (peptoids).

3. Sekvensselektiv stege självmontering

  1. Självmontering genom dissociation/extraktion/glödgning
    1. Förbered 10 mM lagerlösningar av varje oligo(peptoid) sekvens som används för självmontering och en 10 mM lagerlösning av scandium triflate (Sc(OTf)3) i vattenfri acetonitrile.
    2. Till en 3 ml injektionsflaskor utrustad med en magnetisk rörstång, tillsätt 20 μL av varje peptoid lagerlösning. Lägg till 1,5 eq av Sc(OTf)3 per potentiell imine obligation från aktielösningen. Tillsätt tillräckligt med vatten och acetonitrile för att bilda en 200 μL 2% (v/v) vatten/acetonitrile lösning totalt.
    3. Rör försiktigt vid 70 °C för 2 h för acetal-deprotection av aldehyd och dissociation av alla strängar.
    4. Ladda injektionsflaskan med 200 μl kloroform och 2 ml vatten. Skaka försiktigt.
    5. Låt blandningen stå (minst 15 min) och vid fullständig fasseparation extrahera det organiska skiktet med en mikroliterspruta.
    6. Rör i en ny injektionsflaskor vid 70 °C för oligomerglödgning, vanligtvis 6 h. Stegehybridisering kan också utföras i rumstemperatur men under en längre period.
  2. Karakterisering av självmonterade arter
    1. Utför MALDI-TOF masspektrometri på reaktionsblandningslösningarna efter steg 3.1.3., 3.1.5., och 3.1.6. för att övervaka reaktionen. Om hybridiseringen är ofullständig, lägg till 1,5 eq av Sc(OTf)3 per potentiell imine obligation från aktielösningen och upprepa steg 3.1.3-3.1.6. tills den är klar.
    2. Torka provet under en stadig ström av kväve och rekonstruera i 1 ml 2% salpetersyra (vattenlösning, v/v). Späd 4 × 106gånger med HPLC vatten. Bestäm scandiumkoncentration efter extraktion med induktivt kopplad plasmamasspektrometri (ICP-MS).

Representative Results

För att visa möjligheten av information-kodade peptoider att genomgå sekvens-selektiv dynamisk kodande självmontering i molekylära stegar, en representativ sträng, H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma, var syntetiserad och hybridiserade med sin kompletterande peptoid sekvens. MonomersNpam och Npal (kännetecknas av 1H NMR (500 MHz), figur 1) användes som dynamiska kovalenta reaktantpar med Neee medhjälp löslighet av slutliga självmonterade produkter. Dessutom möjliggör införlivandet av den kommersiellt tillgängliga Nma monomer en massdifferentiering mellan de två kompletterande sekvenserna. Efter avslutad submonomersyntes i fast fas togs Alloc-gruppen bort med Pd(PPh3)4. Före och efter avskyddkdes delar av hartsunder 405 nm ljus och kännetecknades av ESI-MS (figur 2). Sekvensen renades av prep HPLC, lyophilized att uppnå en benvit pulver, och renhet bekräftas med analytiskA HPLC(Figur 3). Oligo (peptoid) hybridiserades därefter med sin kompletterande sekvens, H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal, för att ha råd med en stege i registret som bekräftades av MALDI-MS (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Monomer syntetiska system och 1H-NMR spektra. A) Syntetiska monomersystem med reagenser och förhållanden: i) allyl klorformat, 10 % vattensyra, 1,4-dioxan, rumstemperatur, över natten; ii) etylenglykol, toluen-p-sulfonsyra, toluen, reflux, över natten; iii) LialH4,vattenfri Et2O, 0 °C för 4 h och rumstemperaturen i 12 h. iv) Tosylklorid, THF, 0 °C, v) NaN3,DMF, 60 °C, 36 h; vi) triphenylphosphine, THF, över natten. (B) Monomer 1H-NMR spektra (500 MHz, CDCl3): i) 4-(2-aminoethyl)-N-(allylcarbonyloxy)fenylamin (Npam). ii) 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benylamin (Npal). iii) 2-(2-etoxyetoxy)etylomin (Neee). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Syntes och avskydd av en sekvensspecifik oligo(peptoid). (A) Strukturer av H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma före och efter Alloc-skyddande grupp borttagning med medföljande (B) ESI massspektrum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Rening och karakterisering av en informationskodad peptoid. A) HPLC-kromatogram av strandrening genom preparativ HPLC med en linjär lutning av acetonitri (MeCN) och vatten: (1) 30 % MeCN, 0,1-2,1 min. (2) 30-95% MeCN, 2,1-16,1 min; (3) 95% MeCN, 16.1-23.1 min. (4) 95% MeCN, 23.1-26.1 min. Toppar i och ii motsvarar biprodukter med låg molekylvikt, främst DIC-urea och oliligomerart inklusive önskad produkt. (B) Analytiskhplc-kromatogram och (C) ESI-massspektrum av H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma efter lyofilisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Självmontering av H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma och dess kompletterande sekvens, H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal. (A) Strukturer i de två sekvenserna och den resulterande sekvensdrivna monteringen. (B) MALDI-massspektrumet av molekylstegen efter glödgning vid rumstemperatur över natten. Massor: förväntade [M+Na]+ = 3306,7, funna 3306,0; förväntade [M-1 imine+Na]+ = 3324,7, hittades 3323,9; förväntade [M-2 imine +Na]+ = 3342,7, hittades 3342,8; förväntade [M-2 imine +CH3OH+H]+ = 3352,8, hittade 3352,0. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Tekniken häri beskriver den dynamiska kovalenta monteringen av informationsbärande peptoid oligomerer, där information kodas i sekvensen av deras hängegrupper. Användning av en Alloc-skyddad amin monomer tillsammans med en etenacetal-skyddad aldehyd monomer möjliggör ortopekolonde deprotection, vilket gör att Alloc deprotection på bead och acetal deprotection på plats under självmontering reaktion, vilket säkerställer syntetiserade sekvenser inte i förtid reagerar före oligomer rening och karakterisering. Viktigt, solid-fas syntes utförs med hjälp av en photolabile harts för att möjliggöra oligomer klyvning från pärlstav en UV eller violett ljus bestrålning, utesluter för tidigt avskydd av syra-labile, eten acetal-baserade skydda gruppen. Flera alternativa avskydd kan övervägas. Till exempel använde vi ursprungligen dubbla syra-labile skyddsgrupper (Boc-amine och eten acetal-aldehyd) med avsikt att in situ deprotection av en stark syra följt med neutralisering för att tillåta självmontering reaktion att fortsätta; Detta tillvägagångssätt resulterade dock i den omedelbara generationen fällning vid tillsats av bas. Alternativt, skydd av amin med en fotolabilskyddsgrupp, 2-(2-nitrophenyl)propoxycarbonyl (NPPOC), ansågs som aldehyd kunde selektivt avskyddas vid behandling med trifluoroacetic syra (TFA) före rening. Tyvärr, in situ photolysis av skyddsgruppen med UV-ljus inte råd kvantitativa deprotection, även i närvaro av photosensibiliserande och efter längre bestrålning perioder25. Trimethylsilylethoxycarbonyl (dvs. Teoc) kan användas som en aminskyddsgrupp och är föremål för klyvning vid behandling med sällsynta metalltriflater; Kvantitativt teoc-avskydd kräver dock mycket högre triflatladdningar av sällsynta jordartsmetaller än vad som krävs för etenacetaldeskydd. För detta protokoll kan Teoc-aminer användas, men Lewis syrakoncentrationen måste justeras i enlighet med detta som subkvantitativa amindeskydd kan visa sig vara problematiskt för större självmonterade strukturer. Aliphatic funktionella grupper övervägdes kort, men deprotection av aliphatic aldehyder kräver hårda förhållanden som trunkerar peptoid sekvenser32,33.

Införlivande av Neee och Nma som inert spacer rester tjänar till att förbättra oligomer löslighet och möjliggöra facile mass-märkning av föregångareoligomers att ge färdig identifiering av de genererade arterna genom masspektroskopi. Med tanke på konformationen "Σ-strand" av peptoids där intilliggande ryggradssegment antar motsatta rotationstillstånd för att bilda en linjär, twistfri oligomer34,35, underlättar sekvenser som innehåller alternerande dynamiska kovalenta och inert distansrester en struktur där reaktiva hängegrupper är orienterade i samma riktning. Med tanke på mångsidigheten hos submonomermetoden kan ett stort och varierat bibliotek av primära aminer användas för att ytterligare ändra peptoid oligomererna men kan kräva justeringar av protokollet för att upprätthålla hög kopplingseffektivitet.

Medan oligo (peptoids) kan syntetiseras manuellt i ett glasreaktionskärl19,minskar automatiseringen av processen tiden för varje resttillskott från flera timmar till en halvtimme. Dessutom minskar automatiseringen mängden monomer och tvättlösningsmedelavfall, särskilt önskvärt när man använder primära aminmonomerer som inte är kommersiellt tillgängliga. Även om Alloc klyvning från de skyddade amin restsubstanserna är en effektiv reaktion, palladium oxidation kan resultera i ofullständig aprotektion. Följaktligen föreslås att en del av hartsen ska kunna testas och karakterisera omfattningen av avskyddet med ESI-MS. För testklyvningar frigör 30 min under 405 nm bestrålning tillräckligt peptoid för masspektrometri. Partiellt skydd kan begränsas med hjälp av anaeroba förhållanden eller upprepa deprotection reaktionen.

Medan denna artikel fokuserar på Sc(OTf)3 som en multi-roll reagens, andra sällsynta jordmetall triflates, såsom ytterbium triflate, har visat sig framgångsrikt medla den informationsinriktade monteringen av molekylära stegar. Noterbart är Sc(OTf)3 den mest Lewis sura av sällsynta jordmetalltriflater; På grund av den minskade katalytiska förmåga som andra sällsynta jordmetalltriflator ger fårsåledes 24,36, krävs större motsvarigheter för att åstadkomma fullständig etenacetaldeprotection och stranddissociation. Antalet motsvarande som krävs kan bestämmas med MALDI masspektrometri genom att observera punkt där strängar helt separera. Dissociation är avgörande i självmonteringsprocessen och är jämförbar med smältningen av nukleinsyrasträngar vid förhöjd temperatur. Den efterföljande extraktionen av katalysator möjliggör bildande och avbrott av dynamiska kovalenta parningar som driver monteringen av sekvensspecifika duplex. Denna gradvisa glödgning av de olidliga strängarna kringgår kinetiska svällning (som för molekylära stegar kan ge out-of-registry arter eller felaktigt para sekvenser) upplevs av andra metoder.

Kloroform är ett utmärkt lösningsmedel som fasseparation i kloroform/acetonitrile/vattentärsystem som används här främjar partiell extraktion av Lewis syra utan att resultera i utfällning av självmonterade strukturer37. Dessutom är kloroform en av de få lösningsmedel som främjar imine bildning samtidigt som molekylär stege löslighet. Spårmängder av out-of-registry och felaktigt parade duplex kan ofta observeras på grund av systemets dynamiska karaktär. Även om detta system till stor del påverkas av liten variation i sällsynta jordartsmetaller triflate koncentrationer vid utvinning, ibland, otillräcklig katalysator utvinning genererar en betydande del av ofullständig hybridisering och icke-specifika oligomer kopplingar. I detta fall är det i allmänhet att föredra att först åter separera med ytterligare 1,5 motsvarigheter katalysator och sedan extrahera en andra gång snarare än att återextrahera omedelbart, eftersom fullständig dissociation av enskilda delar är avgörande för processen. För att samtidigt montera flera unika informationskodade molekylära stegar kan det vara nödvändigt att öka koncentrationen av den sällsynta jordmetalltriflalagerlösning som används för att upprätthålla motsvarigheter och total reaktionsvolym.

Medan dessa självförsamlingar kännetecknas främst av masspektrometri, andra tekniker inklusive fluorescens resonans energiöverföring (FRET) är möjliga. Begränsningar inkluderar mängd material som behövs, överkomliga priser på monomerer och signal-brusförhållande. Tekniker som kräver lösningsmedel, såsom 1H NMR, kan dessutom drabbas av insolubility av självmonterade strukturer. Dessutom kan sällsynta metalltriflatkoncentrationer efter extraktionen bestämmas genom metoder som ICP-MS eller 19F NMR med en intern standard.

Som framsteg mot förbättrad kontroll över makro- och supramolekylära nanostrukturer och material intäkter, utmaningen att utforma och fabricera regelbundna, men modifierbara, sammansättningar uppstår. Det protokoll som beskrivs i denna rapport ger en väg att uppnå sådana nanostrukturer genom sekvensselektiva sammansättningar via dynamiska kovalenta interaktioner.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av US Department of Energy, Office of Science, Basic Energy Sciences, under Award #DESC0012479. S.C.L. erkänner stöd från National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, och A.F.A. erkänner stöd från Abu Dhabi National Oil Company (ADNOC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dioxane Fisher Scientific D1114 Certified ACS
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) Millipore-Sigma 54793 Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5%
4-(2-Aminoethyl)aniline Ontario Chemicals A2076 98%
4-Cyanobenzaldehyde Oakwood Chemical 049317 99%
4-Methylpiperidine TCI America P0445 ≥98.0%
4-Toluenesulfonyl chloride Oakwood Chemical BR1703 99%
50 mL High Performance Centrifuge Tubes VWR International 21008-240 Centrifuge Tubes used for automated synthesizer
Acetic acid Fisher Scientific A38-212 Glacial
Acetic anhydride Fisher Scientific A10 Certified ACS
Acetonitrile Millipore-Sigma 34851 For HPLC; Gradient grade; ≥99.9%
All-plastic Norm-Ject syringes Thermo Fisher Scientific S7510-10 Luer-Slip Syringe
Allyl chloroformate Acros Organics 221741000 97%
Bromoacetic acid Alfa Aesar A14403 ≥98.0%
Chloroform Millipore-Sigma 288306 Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Chloroform-d Acros Organics AC320690075 For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules
Dichlorodimethylsilane Acros Organics 1133100 ≥99.0%
Dichloroethane Fisher Scientific E175 Certified ACS
Dichloromethane Fisher Scientific D37-4 Stabalized; Certified ACS
Diethyl ether Acros Organics 615080010 Anhydrous; ACS reagent
Diethylene glycol monoethyl ether TCI America E0048 ≥99.0%
Ethanol Decon Labs 2701 200 Proof; Anhydrous
Ethylene glycol Fisher Scientific E178 Certified
Fmoc-Photolabile SS resin CreoSalus SA50785 100-200 mesh; 1% DVB
Glass Peptide Vessel Chemglass CG-1866-02 Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread
LC-6AD HPLC pumps Shimadzu Corporation Equipment
LED 405nm ThorLabs M405L2-C1 405 nm LED used for photocleavage of peptoid
LED Driver ThorLabs LEDD1B Driver for LED light used in photocleavage of peptoid
Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer CEM Corporation Equipment
Lithium aluminum hydride Millipore-Sigma 199877 Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture
Luna C18 analytical RP-HPLC column Phenomenex 00G-4252-E0 Equipment
Luna C18 prepatory RP-HPLC column Phenomenex 00G-4253-P0-AX Equipment
Methanol Fisher Scientific A412 Certified ACS
Microliter Syringe Hamilton Company 80700 Cemented Needle (N)
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) Oakwood Chemical M02889 ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization
N,N-Dimethylformamide Millipore-Sigma 319937 ACS reagent; ≥99.8%
Nitric acid Fisher Scientific A200-212 Certified ACS Plus
Nitrogen gas Cryogenic Gases Contents under pressure, may explode if heated
Phenylsilane Oakwood Chemical S13600 97%
Prominence SPD-10A UV/vis Detector Shimadzu Corporation Equipment
p-Toluenesulfonic acid monohydrate Millipore-Sigma 402885 ACS reagent; ≥98.5%
Scandium(III) triflate Oakwood Chemical 009343 99%
Single-use Needle Exel International 26420 18G x 1 1/2″
Sodium azide Oakwood Chemical 094448 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin.
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233 Powder; Certified ACS
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100 Pellets; Certified ACS
Sodium sulfate Fisher Scientific S421-500 Anhydrous; Granular; Certified ACS
Syringe Filter 0.45 µm VWR International 28145-497 PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing
Tetrahydrofuran Fisher Scientific T397 Certified
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) Oakwood Chemical 034279 98%
Toluene Fisher Scientific T324 Certified ACS
Triphenylphosphine Oakwood Chemical 037818 99%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. Journal of Theoretical Biology. 99, (2), 237-247 (1982).
  2. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, March 297-302 (2006).
  3. Watt, A. A. R., Bothma, J. P., Meredith, P. The supramolecular structure of melanin. Soft Matter. 5, (19), 3754-3760 (2009).
  4. Tørring, T., Voigt, N. V., Nangreave, J., Yan, H., Gothelf, K. V. DNA origami: A quantum leap for self-assembly of complex structures. Chemical Society Reviews. 40, (12), 5636-5646 (2011).
  5. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485, (7400), 623-626 (2012).
  6. Clausen-Schaumann, H., Rief, M., Tolksdorf, C., Gaub, H. E. Mechanical stability of single DNA molecules. Biophysical Journal. 78, (4), 1997-2007 (2000).
  7. Rowan, S. J., Cantrill, S. J., Cousins, G. R. L., Sanders, J. K. M., Stoddart, J. F. Dynamic covalent chemistry. Angewandte Chemie - International Edition. 41, (6), (2002).
  8. Jin, Y., Yu, C., Denman, R. J., Zhang, W. Recent advances in dynamic covalent chemistry. Chemical Society Reviews. 42, (16), 6634-6654 (2013).
  9. Furgal, J. C., Dunn, M., Wei, T., Scott, T. F. Emerging Applications of Dynamic Covalent Chemistry from Macro- to Nanoscopic Length Scales. Dynamic Covalent Chemistry: Principles, Reactions, and Applications. 389-434 (2017).
  10. Hartley, C. S., Elliott, E. L., Moore, J. S. Covalent assembly of molecular ladders. Journal of the American Chemical Society. 129, (15), 4512-4513 (2007).
  11. Wei, T., Furgal, J. C., Jung, J. H., Scott, T. F. Long, self-assembled molecular ladders by cooperative dynamic covalent reactions. Polymer Chemistry. 8, (3), 520-527 (2017).
  12. Dunn, M. F., Wei, T., Scott, T. F., Zuckermann, R. N. Aqueous dynamic covalent assembly of molecular ladders and grids bearing boronate ester rungs. Polymer Chemistry. (18), 2337-2343 (2019).
  13. Furgal, J. C., Van Dijck, J. M., Leguizamon, S. C., Scott, T. F. Accessing sequence specific hybrid peptoid oligomers with varied pendant group spacing. European Polymer Journal. (118), 306-311 (2019).
  14. Tozawa, T., et al. Porous organic cages. Nature Materials. 8, (12), 973-978 (2009).
  15. Tian, J., Thallapally, P. K., Dalgarno, S. J., McGrail, P. B., Atwood, J. L. Amorphous molecular organic solids for gas adsorption. Angewandte Chemie - International Edition. 48, (30), 5492-5495 (2009).
  16. Jin, Y., Wang, Q., Taynton, P., Zhang, W. Dynamic covalent chemistry approaches toward macrocycles, molecular cages, and polymers. Accounts of Chemical Research. 47, (5), 1575-1586 (2014).
  17. Ren, F., Day, K. J., Hartley, C. S. Two- and three-tiered stacked architectures by covalent assembly. Angew. Chem. Int. Ed. 55, (30), 8620-8623 (2016).
  18. Elliott, E. L., Hartley, C. S., Moore, J. S. Covalent ladder formation becomes kinetically trapped beyond four rungs. Chemical Communications. 47, (17), 5028-5030 (2011).
  19. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. Journal of Visualized Experiments. (57), 1-6 (2011).
  20. Zuckermann, R. N. Peptoid origins. Biopolymers. 96, (5), 545-555 (2011).
  21. Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid polymers: A highly designable bioinspired material. ACS Nano. 7, (6), 4715-4732 (2013).
  22. Belowich, M. E., Stoddart, J. F. Dynamic imine chemistry. Chemical Society Reviews. 41, (6), 2003-2024 (2012).
  23. Giuseppone, N., Schmitt, J. L., Schwartz, E., Lehn, J. M. Scandium(III) catalysis of transimination reactions. Independent and constitutionally coupled reversible processes. Journal of the American Chemical Society. 127, (15), 5528-5539 (2005).
  24. Shū, K. Scandium triflate in organic synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 1999, (1), 15-27 (1999).
  25. Wei, T., Furgal, J. C., Scott, T. F. In situ deprotection and dynamic covalent assembly using a dual role catalyst. Chemical Communications. 53, (27), 3874-3877 (2017).
  26. Matsumoto, M., et al. Rapid, low temperature formation of imine-linked covalent organic frameworks catalyzed by metal triflates. Journal of the American Chemical Society. 139, (14), 4999-5002 (2017).
  27. Ma, X., Scott, T. F. Approaches and challenges in the synthesis of three-dimensional covalent-organic frameworks. Communications Chemistry. (2018).
  28. Perron, V., Abbott, S., Moreau, N., Lee, D., Penney, C., Zacharie, B. A method for the selective protection of aromatic amines in the presence of aliphatic amines. Synthesis. 2, (2), 283-289 (2009).
  29. Wei, T., Jung, J. H., Scott, T. F. Dynamic covalent assembly of peptoid-based ladder oligomers by vernier templating. Journal of the American Chemical Society. 137, (51), 16196-16202 (2015).
  30. Ouari, O., Chalier, F., Bonaly, R., Pucci, B., Tordo, P. Synthesis and spin-trapping behaviour of glycosylated nitrones. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions. 2, (10), 2299-2308 (1998).
  31. Sun, J., Stone, G. M., Balsara, N. P., Zuckermann, R. N. Structure-conductivity relationship for peptoid-based PEO-mimetic polymer electrolytes. Macromolecules. 45, (12), 5151-5156 (2012).
  32. Sartori, G., Ballini, R., Bigi, F., Bosica, G., Maggi, R., Righi, P. Protection (and deprotection) of functional groups in organic synthesis by heterogeneous catalysis. Chemical Reviews. 104, (1), 199-250 (2004).
  33. Kim, S., et al. Unusual truncation of N-acylated peptoids under acidic conditions. Organic & biomolecular chemistry. 12, (28), 5222-5226 (2014).
  34. Mannige, R. V., et al. Peptoid nanosheets exhibit a new secondary-structure motif. Nature. 526, (7573), 415-420 (2015).
  35. Edison, J. R., et al. Conformations of peptoids in nanosheets result from the interplay of backbone energetics and intermolecular interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, (22), 5647-5651 (2018).
  36. Kobayashi, S., Sugiura, M., Kitagawa, H., Lam, W. W. L. Rare-earth metal triflates in organic synthesis. Chemical Reviews. 102, (6), 2227-2302 (2002).
  37. Fujinaga, S., Hashimito, M., Tsukagoshi, K. Investigation of the composition for a ternary solvent system in tube radial distribution chromatography. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies. 38, (5), 600-606 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics