Synthèse de Peptoïdes porteurs d’informations et de leur auto-assemblage dynamique covalent dirigé par séquence

Chemistry
 

Summary

Un protocole est présenté pour la synthèse d’oligomères peptoïdes codés par l’information et pour l’auto-assemblage séquencé de ces peptoïdes en échelles moléculaires utilisant des amines et des aldéhydes comme paires de réactifs covalentes dynamiques et Lewis acidité de la terre rare les trigoles métalliques en tant que réactifs multirôles.

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Leguizamon, S. C., Alqubati, A. F., Scott, T. F. Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly. J. Vis. Exp. (156), e60442, doi:10.3791/60442 (2020).

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Abstract

Ce protocole présente l’utilisation de réactifs multirôles acides Lewis pour contourner le piégeage cinétique observé lors de l’auto-assemblage de brins oligomériques codés par l’information-encodé négociés par des interactions covalentes dynamiques jumelées d’une manière imitant le cycle thermique couramment employé pour l’auto-assemblage des séquences d’acide nucléique complémentaires. Les monomères primaires d’amine portant l’aldéhyde et les moieties de pendentif d’amine sont fonctionnalisés avec des groupes de protection orthogonale pour l’usage comme paires covalentes dynamiques de réactif. À l’aide d’un synthétiseur de peptide automatisé modifié, les monomères d’amine primaires sont codés en brins d’oligo (peptoïde) par synthèse de submonomer de phase solide. Lors de la purification par chromatographie liquide haute performance (HPLC) et de la caractérisation par spectrométrie de masse d’ionisation électrospray (ESI-MS), les oligomères spécifiques à la séquence sont soumis à une charge élevée d’un triflate métallique acidulé de terre rare Lewis qui déproforme les moiéties d’aldéhyde et affecte l’équilibre de la paire réciproce de telle sorte que les brins se dissocient complètement. Par la suite, une fraction de l’acide DeLewis est extraite, permettant l’annexion de brins complémentaires spécifiques à la séquence pour former des échelles moléculaires codées par l’information assistée par la spectrométrie de masse de dessorption/ionisation du laser assistée par matrice (MALDI-MS). La procédure simple décrite dans ce rapport contourne les pièges cinétiques couramment expérimentés dans le domaine de l’assemblage covalent dynamique et sert de plate-forme pour la conception future d’architectures robustes et complexes.

Introduction

Les progrès de l’auto-assemblage, le processus par lequel les petites sous-unités génèrent des architectures plus grandes par des voies thermodynamiques, ont permis un meilleur contrôle sur les nanostructures macro- et supramoléculaires généralement en exploitant les interactions intermoléculaires telles que l’empilage et la liaison d’hydrogène1,2,3,4. En particulier, les acides nucléiques (c.-à-d. polynucléotides) sont apparus comme des nano-réseaux de nanoconstruction remarquablement polyvalents, car la forte densité d’information fournie par l’appariement de base Watson-Crick permet l’assemblage de structures complexes et sélectives par séquence4,5. Alors que la faible résistance inhérente de ces liaisons intermoléculaires transitoires permet le réarrangement des sous-unités et la correction des erreurs, les structures qui en résultent sont souvent sensibles à la dégradation thermique et mécanique6. En revanche, les interactions covalentes dynamiques7,8,9, une classe de réactions covalentes de formation de liaison qui sont réversibles ou réarrangeables dans des conditions douces et ont récemment été employées pour produire des macromolécules complexes telles que des échelles10,11,12,13, cages14,15,16, et les piles17, offrent l’augmentation des forces obligataires et des structures robustes. Malheureusement, la capacité de réarrangement et de vérification des erreurs est diminuée par les taux relativement faibles de réarrangement de ces espèces covalentes, ce qui réduit leur capacité d’auto-assemblage dans les produits désirés18. Pour faire face à ce piégeage cinétique, des catalyseurs ou des conditions de réaction difficiles sont souvent utilisés en conjonction avec de simples blocs de construction. Ici, nous rapportons un processus qui contourne le piégeage cinétique pour permettre l’auto-assemblage des échelles moléculaires à partir d’oligomères spécifiques à la séquence où l’hybridation est dirigée par l’information codée dans les séquences de résidus d’oligomères.

Compte tenu de leur accessibilité synthétique, poly (n-substitutde glycine) (c.-à-peptoïdes) sont utilisés comme précurseurs oligomériques à partir desquels les échelles moléculaires sont assemblés19. Les peptoïdes sont des isores structurels de peptides dans lesquels des groupes de pendentifs sont fixés à l’azote transmis par l’épine dorsale au lieu d’être couplés avec le carbone20. À l’aide de la synthèse en phase solide, le placement exact des groupes de pendentifs covalents dynamiques le long de la chaîne peptoïde est facilement réalisé, permettant la conception d’oligomères précurseurs qui peuvent s’assembler en structures supramoléculaires complexes21.

Le réarrangement covalent dynamique de la connectivité imine est employé dans cette procédure car la réaction de condensation imine-génératrice fournit un moyen commode de caractériser l’auto-assemblage par spectrométrie de masse car chaque liaison formée a comme conséquence une réduction de masse de 18 g/mol22. En outre, l’équilibre entre les réactifs d’amine et d’aldéhyde et le produit d’imine peut être varié en modifiant la concentration acide. Plus précisément, les triflates métalliques de terres rares sont utilisés pour affecter l’équilibre, et en outre déprotéger les aldéhydes acétal-protégés par l’éthylène23,24,25. A noter, le triflate scandium est déjà couramment utilisé dans le domaine de l’auto-assemblage covalent dynamique, y compris son récent succès dans la synthèse des cadres organiques covalents (COF) à température ambiante26,27. En outre, la solubilité contrastée des séquences oligo (peptoïde) et du triflate métallique de terre rare permet le contrôle de l’équilibre par l’extraction liquide-liquide. Le processus signalé utilise ce contrôle pour contourner les barrières cinétiques empêchant l’auto-assemblage dirigé par l’information.

Protocol

CAUTION: Plusieurs produits chimiques utilisés dans ce protocole sont corrosifs, inflammables ou toxiques et ne doivent être utilisés que sous une hotte de fumée chimique. Veuillez utiliser l’équipement de protection individuelle approprié et consulter toutes les fiches de données de sécurité pertinentes (SDS) avant d’être utilisées.

1. Synthèse Monomer

REMARQUE : Les amines primaires ont été synthétisées selon des approches publiées.

  1. Synthèse de 4-(2-aminoethyl)-N-(allylcarbonyloxy)phenylamine (Npam)25,28
    1. Ajouter 5,0 g (36,7 mmol) de 4-(2-aminoéthyle)aniline à 150 ml d’acide acétique à 10% (solution aqueuse, v/v).
      REMARQUE: L’utilisation d’acide faible permet une protection sélective de l’amine aromatique sans affecter l’amine aliphatique en raison de la grande différence de pKune valeur entre les deux groupes.
    2. Préparer une solution de 4,9 g (40,4 mmol; 1,1 équiv.) de chloroformate allié en 150 ml de 1,4 dioxane.
    3. Combinez les solutions dans un flacon de fond rond de 500 ml équipé d’une barre magnétique et remuez le mélange de réaction à température ambiante pendant la nuit.
    4. Pour accélérer la réaction, diluer avec 500 ml d’eau déionisée (DI) et laver avec de l’éther diéthyle (Et2O, 300 ml à 3). Jeter les fractions organiques.
    5. Ajuster la phase aqueuse au pH 14 en ajoutant 2 M NaOH (solution aqueuse), et extraire avec Et2O (150 ml à 3).
    6. Mélanger les fractions organiques et laver avec de l’eau DI (150 ml à 3).
    7. Sécher sur Na2SO4, puis filtrer.
    8. Évaporer à la sécheresse sous pression réduite.
    9. Confirmer l’identité du produit isolé, Npam, par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN). Attendez-vous aux résultats suivants: 1H RMN (500 MHz, CdCl3) :7,31 (d, J 8,0 Hz, 2H, Ar), 7,14 (d, J - 8,5 Hz, 2H, Ar), 6,65 (s, 1H, -NH-), 6,04 - 5,89 (m, 1H, -CH'CH2), 5,36 (dq, J - 17,1, 1,6z, 1H, -CH-CHH), 5,26 (dq, J - 10,5, 1,4 Hz, 1H, -CH-CHH), 4,66 (dt, J - 5,8, 1,5 Hz, 2H, -CH2-CH-CH2), 2,94 (t, J - 6,8 Hz, 2H, -CH 2-NH2), 2,70 (t, J -6,8 Hz, 2H, -CH2-Ar), 1,04 (s, 2H, -CH2-NH2). 13 (en) C RmN (125 MHz, CD3OD) :154,85, 137,00, 134,98, 133,51, 129,36, 119,41, 116,92, 65,62, 59,89, 43,47, 38,72.
      REMARQUE: Le produit est un solide jaune clair et a un rendement global de 69%. Utilisez le produit sans autre purification.
  2. Synthèse de 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benzonitrile29,30
    1. Dissoudre 25 g (0,19 mol) de 4-cyanobenzaldéhyde dans 200 ml de toluène.
    2. Ajouter 42,2 ml (0,768 mmol; 4 équiv.) d’éthylène glycol et 0,02 g (0,1 mmol; 0,05 mol%) de l’acidetoluène-p-sulfonique au mélange de réaction.
    3. Remuer et reflux pendant la nuit à 120 oC à l’aide d’un piège Dean-Stark (c.-à-d. distillation azéotrope) pour enlever l’eau produite pendant la réaction.
    4. Une fois la réaction terminée et refroidie à température ambiante, ajouter 40 ml de solution aqueuse NaHCO3 (w/v) de 5 %.
    5. Extraire la couche organique et laver avec de l’eau DI trois fois.
    6. Sécher sur Na2SO4, puis filtrer.
    7. Évaporer à la sécheresse sous pression réduite.
    8. Confirmer l’identité du produit isolé, par spectroscopie RMN. Attendez-vous aux résultats suivants: 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): 7,67 (d, J 8,0, 2H, Ar), 7,59 (d, J ' 8,4, 2H, Ar), 5,84 (s, 1H, CH), 4,12 - 4,03 (AABB, 4H, (CH2O)2). 13 (en) C RmN (100 MHz, CDCl3) :143,20, 132,34, 127,30, 118,72, 113,02, 102,56, 65,57.
      REMARQUE: Le produit est un solide cristallin blanc et a un rendement global de 86%. Utilisez le produit sans autre purification.
  3. Synthèse de 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benzylamine (Npal)29
    1. Préparer une solution de 10 g (0,057 mol) de 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benzonitrile en 100 ml d’anhydre Et2O.
    2. Ajouter délicatement 4,3 g (0,11 mol; 2 equiv.) de LiAlH4 à 100 ml d’anhydre Et2O dans un flacon de fond rond à 0 oC. Remuer pour créer une suspension bien mélangée et sceller le système dans une atmosphère inerte à l’aide d’un ballon rempli d’argon. Étanchez soigneusement avec de l’éthanol tout Résidu liAlH4 sur l’équipement utilisé pour la pesée.
      CAUTION: L’hydride d’aluminium de lithium (LiAlH4) est un pyrophore doux; manipuler sous le gaz inerte et se protéger de l’humidité.
    3. Ajouter la solution de benzonitrile 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl) lentement à l’aide d’un entonnoir d’ajout ou d’une pompe à seringues tout en maintenant le mélange de réaction à une température de 0 oC.
    4. Remuer le mélange de réaction pendant 4 h à 0 oC, suivi de 12 h à température ambiante.
    5. Une fois la réaction terminée et refroidie à 0 oC, ajouter lentement 95 % d’éthanol (30 ml). Étanchez encore en ajoutant 50 % d’éthanol dans l’eau (v/v, 20 ml). Un buller peut être utilisé pour surveiller le processus d’étanchéité.
      REMARQUE : Ajouter de l’anhydre supplémentaire Et2O au besoin pour maintenir un taux d’agitation adéquat.
    6. Séparer le supernatant d’éther et s’évaporer à la sécheresse sous pression réduite.
    7. Filtrer l’huile résultante à l’utilisation d’un filtre à seringues de 0,45 m.
    8. Confirmer l’identité du produit isolé, NpaI, par spectroscopie RMN. Attendez-vous aux résultats suivants: 1H RMN (400 MHz, CDCl3) :7,44 (d, J 8, 2H, Ar), 7,32 (d, J ' 8, 2H, Ar), 5,80 (s, 1H, CH), 4,14 - 4,0 (AA, 4H, (CH2O)2), 3,87 (s, 2H, -CH2-NH2). 13 (en) C RmN (100 MHz, CDCl3) :144,53, 136,53, 127,16, 126,77, 103,72, 65,39, 46,35.
      REMARQUE: Le produit est une huile jaune et a un rendement global de 70%. Utilisez le produit sans autre purification.
  4. Synthèse de 2-(2-ethoxyethoxy)éthylilate29,31
    1. Ajouter 20 g (0,15 mol) d’éther de diéthylène glycol monoéthylique et 50 ml de tétrahydrofuran (THF) dans un flacon rond de 250 ml à l’effile avec un agitateur magnétique.
    2. Refroidir jusqu’à 0 oC et sceller le système dans une atmosphère inerte à l’aide d’un ballon rempli d’argon.
    3. Ajouter 50 ml de 6 M aqueous NaOH (2 equiv.).
    4. Dissoudre 54 g (0,28 mol; 2 equiv.) de chlorure de tosyl dans 80 ml de THF et ajouter la solution au mélange de réaction dans le sens de la baisse. Remuer pendant 1 h à 0 oC.
    5. Laisser le mélange de réaction atteindre la température ambiante et remuer pendant une autre heure.
    6. Extraire le mélange de réaction avec Et2O (400 ml).
    7. Laver la couche biologique avec 1 M NaOH, puis avec de l’eau DI.
    8. Sécher sur Na2SO4, puis filtrer.
    9. Évaporer à la sécheresse sous pression réduite.
    10. Confirmer l’identité du produit isolé par spectroscopie RMN. Attendez-vous aux résultats suivants: 1H RmN (400 MHz, CDCl3 ): 7,78 (d, J - 8,0, 2H, -S-C-CH-CH), 7,33 (d, J ' 8,5, 2H, -S-C’CH-CH), 4,15 (t, J - 5.0, 2H, -CH2-CH2-O-Ts), 3.68 (t, J '5.0, 2H, CH2-CH2-O-Ts), 3.60-3.42 (m, 6H, O-CH2-CH2-O-CH2-CH3), 2.43 (s, 3H, C-CH3), 1,17 (t, J 7,0, 3H, O-CH2-CH3). 13 (en) C NMR (100 MHz, CDCl3) :144,79, 132,95, 130,26, 129,80, 127,90, 126,95, 70,75, 69,68, 69,29, 68,61, 66,57, 21,56, 15,11.
      REMARQUE: Le produit est un liquide incolore et a un rendement global de 98%. Utilisez le produit sans autre purification.
  5. Synthèse de 2-(2-ethoxyethoxy)ethyl azide29,31
    1. Dissoudre 40 g (0,14 mol) de 2-(2-ethoxyethoxy)éthylilate tosylate dans 250 mL de diméthylformamide (DMF) dans un flacon de fond rond avec un agitateur magnétique. Scellez le système sous une atmosphère inerte à l’aide d’un ballon rempli d’argon.
    2. Ajouter 32 g (0,49 mol; 3,5 equiv.) de NaN3 au mélange de réaction.
      CAUTION: Ne pas utiliser une spatule en métal lorsque vous pesez NaN3. NaN3 peut réagir avec le plomb et le cuivre, ce qui entraîne la formation d’azides métalliques hautement explosifs. Il est extrêmement toxique et mortel s’il est avalé ou en contact avec la peau.
    3. Chauffer le mélange de réaction à 60 oC et laisser courir pendant 36 h. Puis laisser refroidir à température ambiante.
    4. Diluer avec une grande quantité d’eau (500 ml) et extraire avec Et2O (150 ml à 3).
    5. Isoler la couche organique et effectuer des lavages d’eau.
    6. Sécher sur Na2SO4, puis filtrer.
    7. Évaporer à la sécheresse sous pression réduite.
    8. Confirmer l’identité du produit isolé par spectroscopie RMN. Attendez-vous aux résultats suivants: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) :3,64 (m, 4H, O-CH2-CH2-O), 3,58 (m, 2H, N3-CH2-CH2-O), 3.51 (q, J '7.5, 2H, O-CH2-CH3), 3.38 (t, J '5.0, 2H, N3-CH2-CH2-O), 1.19 (t, J '7.5, 3H, O-CH2-CH3). 13 (en) C RmN (100 MHz, CDCl3) :70,70, 69,97, 69,80, 66,63, 50,60, 15,08.
      REMARQUE: Le produit est un liquide jaune et a un rendement global de 85%. Utilisez le produit sans autre purification.
  6. Synthèse de 2-(2-ethoxyethoxy)ethylamine (Neee)29,31
    1. Dissoudre 20 g (0,13 mol) de 2-(2-ethoxyethoxy)azide éthylique dans 160 ml de THF dans un flacon rond de 500 ml à l’effile avec un agitateur magnétique.
    2. Ajouter 40 g (0,15 mol, 1,1 équiv.) de triphenylphosphine et remuer toute la nuit à température ambiante sous argon.
    3. Éteindre le mélange de réaction avec de l’eau (220 ml) et laisser remuer pendant un autre jour.
    4. Laver la solution résultante avec du toluène, suivi du dichlorométhane (DCM).
    5. Évaporer la couche aqueuse sous vide.
    6. Confirmer l’identité du produit isolé, Neee, par spectroscopie RMN. Attendez-vous aux résultats suivants: 1H RmN (400 MHz, CDCl3) :3,62-3,42 (m, 8H, NH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2 -O-CH2-CH3), 2,82 (m, 2H, NH2-CH2-CH2-O), 1,48 (s, 2H, NH2), 1,16 (t, J 7,5, 3H, O-CH2-CH3). 13 (en) C RMN (100 MHz, CDCl3) : 73,14, 70,72, 69,64, 66,45, 41,35, 15,00.
      REMARQUE: Le produit est un liquide jaune et a un rendement global de 58%. Utilisez le produit sans autre purification.

2. Synthèse submonomère en phase solide d’oligo (peptoïdes)

REMARQUE : L’approche submonomère de la synthèse en phase solide (SPS) a été utilisée car elle permet la production d’oligomères spécifiques à la séquence avec une efficacité de couplage élevée. Un synthétiseur de peptide automatisé a été adapté pour générer rapidement des oligo (peptoïdes). Les paramètres peuvent nécessiter des modifications pour différentes instrumentations.

  1. Préparation
    1. Peser 0,125 g de résine SS Fmoc-Photolabile (0,8 mmol/g de chargement typique, 0,1 échelle de mmol, 100-200 maille, 1% DVB) et ajouter à un récipient de réaction de synthétiseur automatisé fritted. Insérer le récipient dans la partie micro-ondes du synthétiseur.
    2. Remplissez la bouteille de solvant principal avec dMF et la bouteille de déprotection avec 20% 4-méthylpiperidine en DMF (v/v). Déchets vides.
    3. Préparer 1 M de solutions d’acide bromoacétique et N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) en DMF avec des volumes totaux de 1,5 ml (nombre de résidus dans l’ordre) - 5 mL. Les 5 ml supplémentaires garantissent qu’aucun air n’entre dans la machine. Ajouter 0,47 mL d’anhydride acétique à DMF pour faire une solution de plafonnement de 5 ml.
      CAUTION : LE DIC peut causer de graves lésions oculaires, une irritation et une sensibilisation de la peau, ainsi qu’une irritation et une sensibilisation respiratoires.
    4. Préparer 0,5 M de solutions de chaque amine primaire (Npam, Npal, Neee et Nma (2-méthoxyéthylamine)) en N-méthyl-2-pyrrolidone (NMP) utilisée pour l’étape de déplacement. Les volumes totaux des solutions d’amine primaire devraient être de 2,5 ml (nombre de résidus de l’amine primaire appropriée) à 2,5 ml.
    5. Ajoutez toutes les solutions au synthétiseur automatisé.
  2. Synthèse
    REMARQUE : Effectuez l’utilisation d’un synthétiseur de peptide automatisé.
    1. Gonfler la résine à température ambiante pendant 5 min avec 10 ml de DMF. Égoutter le vaisseau de réaction.
    2. Clivez le groupe Fmoc avec 3 ml de la solution de 20% 4-méthylpiperidine pour 30 s à 75 oC et 90 s à 90 oC. Égoutter le récipient. Répéter. Laver avec du DMF (2 ml à 2).
    3. Ajouter au récipient 1,5 ml de la solution d’acide bromoacétique et 1,5 ml de la solution DIC. Chauffer la réaction à 75 oC pendant 4,5 min pour effectuer la réaction de bromoacetylation. Laver la résine (5 ml de DMF 3).
    4. Effectuer la réaction de déplacement en additionnant la solution primaire de monomère d’amine de 2,5 ml au vaisseau de réaction. Chauffer à 75 oC pendant 4,5 min. Laver la résine (5 ml de DMF et 3).
    5. Répétez les étapes 2.2.3. et 2.2.4. tout en substituant séquentiellement le monomère primaire d’amine utilisé à l’étape 2.2.4. pour développer la chaîne oligo (peptoïde) d’une manière spécifique à la séquence.
    6. Après l’étape finale du déplacement, plafonner la séquence en ajoutant 2,5 ml de la solution d’anhydride acétique et 2 ml de la solution DIC. Chauffer à 50 oC pendant 2 min. Laver la résine (5 ml de DMF et 6).
    7. Transférer la résine dans un récipient de réaction en verre frité équipé d’un stopcock à trois voies. Le récipient de réaction en verre devrait être préalablement siliconé pour empêcher des perles d’adhérer aux murs. Silaniser les murs en remplissant le récipient d’une dichlorodiméthylsilane de 5 % en dichloroéthane (DCE) (v/v) solution au sommet et en le laissant s’asseoir pendant 30 min. Égoutter le navire et laver avec du DCE et du méthanol. Récipient en verre sec avant utilisation.
    8. Laver la résine avec du DCM (5 ml à 3), bouillonner avec N2 à travers un bras et tirer le vide avec un autre.
    9. Sécher et conserver la résine et l’oligo attaché (peptoïde) jusqu’à ce que la déprotection et le clivage.
  3. Déprotection d’Alloc-amine et clivage de résine
    1. Si la résine a été stockée pendant plus d’une journée, reswell la résine en bouillonnant avec 5 ml de DMF pendant 10 min. Ensuite, égoutter le récipient et ajouter une petite barre magnétique remuer.
    2. Ajouter 3 ml de DCM sec au récipient de peptide en verre.
    3. Peser 0,1 équivalent de tétrakis (triphenylphosphine)palladium(0) et 25 équivalents de phénylsilane par Alloc-groupe. Utilisez une pince pour positionner le récipient de réaction à un angle au-dessus d’une plaque d’agitation de sorte que la résine subit une agitation douce tout en restant suspendue dans le solvant. Pour empêcher le DCM de s’évaporer, bouchonner le vaisseau de réaction.
    4. Après 1 h, filtrer la solution et laver la résine avec du DCM (3 à 5 ml).
    5. Répétez les étapes 2.3.2. et 2.3.3.
    6. Rincer la résine séquentiellement avec du méthanol et du DCM deux fois.
    7. Transférer la résine et la barre magnétique dans un flacon de 20 ml.
    8. Immerger la résine dans le DMF, remuer et couper sous irradiation pendant 36 h à environ 25 mW.cm-2 avec 405 nm. Une petite partie de la résine peut être clivée et caractérisée dans ESI-MS avant cette étape pour assurer la déprotection complète d’Alloc de l’amine. Si des groupes Alloc restent, répétez les étapes 2.3.2 et 2.3.3.
    9. Séparer l’oligo libéré (peptoïde) de la résine via un filtre à seringues. Retirer le solvant sous vide.
  4. Purification et caractérisation des oligo (peptoïdes)
    1. Reconstituer les peptoïdes dans un mélange 50/50 d’eau/acetonitrile.
    2. Purifie avec hPLC préparatif en phase inverse (C18). Mélanger les fractions purifiées, congeler et lyophiliser pour produire de la poudre blanc cassé. La poudre peut être stockée pour une utilisation ultérieure.
    3. Analyser avec ESI-MS après purification.
    4. Effectuez la spectrométrie de masse MALDI en mode ion positif de réflecton. Mélanger 2 ll d’une solution de l’échantillon (1 mM) avec 6 l d’un mélange de 10 mg de matrice [2-(4-hydroxyyenylazo)acide benzoïque (HABA)] en 200 'L d’acétonitrile. Amarrer sur une plaque d’échantillon MALDI et laisser sécher à l’air.
    5. Pour la pureté, effectuer HPLC analytique d’oligo purifié (peptoïdes).

3. Auto-assemblage de l’échelle séquentielle

  1. Auto-assemblage par dissociation/extraction/annealing
    1. Préparer des solutions de stock de 10 mM de chaque séquence oligo (peptoïde) utilisée pour l’auto-assemblage et une solution de stock de 10 mM de triflate de scandium (Sc(OTf)3) en anhydrous acetonitrile.
    2. À une fiole de 3 ml équipée d’une barre magnétique, ajouter 20 ll de chaque solution de bouillon peptoïde. Ajouter 1,5 eq de Sc(OTf)3 par obligation imine potentielle de la solution d’actions. Ajouter suffisamment d’eau et d’acétonitrile pour former un total de 200 l 2 % (v/v) de solution d’eau/acetonitrile.
    3. Remuer délicatement à 70 oC pendant 2 h pour la déprotection acétal-dépréciée de l’aldéhyde et la dissociation de tous les brins.
    4. Chargez le flacon avec 200 l de chloroforme et 2 ml d’eau. Agiter doucement.
    5. Laisser reposer le mélange (au moins 15 min) et, après une séparation complète de la phase, extraire la couche organique avec une seringue microlitre.
    6. Incorporer une nouvelle fiole à 70 oC pour l’annexion de l’oligomère, généralement 6 h. L’hybridation de l’échelle peut également être effectuée à température ambiante, mais sur une plus longue période.
  2. Caractérisation des espèces auto-assemblées
    1. Effectuez la spectrométrie de masse MALDI-TOF sur les solutions de mélange de réaction après les étapes 3.1.3., 3.1.5., et 3.1.6. pour surveiller la réaction. Si l’hybridation est incomplète, ajoutez 1,5 eq de Sc(OTf)3 par obligation imine potentielle de la solution d’actions et répétez les étapes 3.1.3-3.1.6. jusqu’à ce qu’il soit terminé.
    2. Séchez l’échantillon sous un flux régulier d’azote et reconstituez-le en 1 ml d’acide nitrique de 2 % (solution aqueuse, v/v). Diluer 4 à 106-fold avec de l’eau HPLC. Déterminer la concentration de scandium post-extraction avec spectrométrie de masse plasmatique inductive couplée (ICP-MS).

Representative Results

Pour démontrer la capacité des peptoïdes codés d’information à subir l’auto-assemblage covalent dynamique séquence-sélectif dans les échelles moléculaires, un brin représentatif, H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma, a été synthétisé et hybridé avec sa séquence peptoïde complémentaire. Les monomères Npam et Npal (caractérisées par 1H RmN (500 MHz), Figure 1) ont été employées comme paires de réactifs covalents dynamiques avec Neee facilitant la solubilité des produits auto-assemblés finaux. En outre, l’incorporation du monomère Nma disponible dans le commerce permet une différenciation de masse entre les deux séquences complémentaires. À la fin de la synthèse de submonomer de phase solide, le groupe d’Alloc a été enlevé avec (PPh3)4. Avant et après la déprotection, des parties de la résine étaient clivées sous 405 nm de lumière et caractérisées par ESI-MS (figure 2). La séquence a été purifiée par la préparation HPLC, lyophilisée pour obtenir une poudre blanc cassé, et la pureté confirmée par HPLC analytique (Figure 3). L’oligo (peptoïde) a ensuite été hybridé avec sa séquence complémentaire, H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal, pour se permettre une échelle d’enregistrement confirmée par MALDI-MS (Figure 4).

Figure 1
Figure 1 : Schémas synthétiques Monomer et 1spectres H-NMR. (A) Schémas synthétiques Monomer avec réactifs et conditions : (i) chloroformate allié, 10% acide acétique aqueous, 1,4-dioxane, température ambiante, nuit; (ii) éthylène glycol, acide toluène-p-sulfonique, toluène, reflux, nuit; (iii) LiAlH4, anhydre Et2O, 0 oC pendant 4 h puis température ambiante pendant 12 h; (iv) chlorure de tosyle, THF, 0 oC; (v) NaN3, DMF, 60 oC, 36 h; (vi) triphenylphosphine, THF, nuit. (B) Monomer 1spectres H-NMR (500 MHz, CDCl3): (i) 4-(2-aminoethyl)-N-(allylcarbonyloxy)phenylamine (Npam); (ii) 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benzylamine (Npal); (iii) 2-(2-ethoxyethoxy)ethylamine (Neee). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Synthèse et déprotection d’un oligo (peptoïde) spécifique à une séquence. (A) Structures de H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma avant et après l’élimination du groupe Alloc-protection avec le spectre de masse ESI d’accompagnement (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Purification et caractérisation d’un peptoïde codé par l’information. (A) chromatogramme HPLC de la purification du brin par HPLC préparatif avec un gradient linéaire d’acétonitrile (MeCN) et d’eau: (1) 30% MeCN, 0.1-2.1 min; (2) 30-95% MeCN, 2.1-16.1 min; (3) 95 % MeCN, 16,1-23,1 min; (4) 95 % MeCN, 23,1-26,1 min. Les pics i et ii correspondent à une réaction de faible poids moléculaire, principalement les espèces DIC-uréa, et les espèces d’oligomeric, y compris le produit désiré, respectivement. (B) Chromatogramme analytique De Plc et (C) spectre de masse ESI de H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma après lyophilisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Auto-assemblage de H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma et sa séquence complémentaire, H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal. (A) Structures des deux séquences et de l’assemblage séquence-conduit résultant. (B) Spectre de masse MALDI de l’échelle moléculaire après l’annexion à température ambiante pendant la nuit. Masses: attendu [M-Na]- 3306,7, trouvé 3306.0; [M-1 imine'Na]- 3324,7, trouvé 3323,9; [M-2 imine 'Na]- 3342,7, trouvé 3342,8; attendu [M-2 imine 'CH3OH’H]' 3352.8, trouvé 3352.0. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

La technique décrit ici l’assemblage covalent dynamique des oligomères peptoïdes porteurs d’information, où l’information est codée dans la séquence de leurs groupes de pendentifs. L’utilisation d’un monomère amine protégé par Alloc en conjonction avec un monomère d’aldéhyde acétal protégé par l’éthylène permet une déprotection orthogonale, permettant à Alloc de se déprotection sur la perle et la déprotection acétale in situ lors de la réaction d’auto-assemblage, assurant ainsi que les séquences synthétisées ne réagissent pas prématurément avant la purification et la caractérisation de l’oligomère. Fait important, la synthèse en phase solide est effectuée à l’aide d’une résine photolabile pour permettre le clivage oligomère de la perle sous irradiation de lumière UV ou violette, empêchant la déprotection prématurée du groupe protecteur acide-labile à base d’acétal à base d’éthylène. Plusieurs autres systèmes de déprotection pourraient être envisagés. Par exemple, nous avons d’abord employé des groupes de protection à double acide-labile (Boc-amine et éthylène acétate-aldéhyde) avec l’intention d’une déprotection in situ par un acide fort suivi d’une neutralisation pour permettre à la réaction d’auto-assemblage de se poursuivre; cependant, cette approche a eu comme conséquence la génération immédiate de précipiter sur l’addition de base. Alternativement, la protection de l’amine avec un groupe de protection photolabile, 2-(2-nitrophenyl)propoxycarbonyl (NPPOC), a été envisagée pendant que l’aldéhyde pourrait être sélectivement déprotectedtisé sur le traitement avec l’acide trifluoacetic (TFA) avant la purification. Malheureusement, la photolyse in situ du groupe de protection avec la lumière UV n’a pas permis la déprotection quantitative, même en présence de photosensiizers et après des périodes d’irradiationprolongées 25. Trimethylsilylethoxycarbonyl (c.-à-d., Teoc) peut être employé comme groupe protecteur d’amine et est sujet au clivage sur le traitement avec des triflates en métal de terre rare ; cependant, la déprotection quantitative de Teoc exige des charges de triflate de métal de terre rare beaucoup plus élevées que cela nécessaire pour la déprotection acétale d’éthylène. Pour ce protocole, Teoc-amines peut être utilisé, mais la concentration d’acide Lewis doit être ajustée en conséquence que la déprotection sous-quantitative des mines pourrait s’avérer problématique pour les grandes structures auto-assemblées. Les groupes fonctionnels aliphatiques ont été brièvement considérés, mais la déprotection des aldéhydes aliphatiques exige des conditions dures qui tronquent des séquences peptoïdes32,33.

L’incorporation de Neee et de Nma comme résidus d’espaceur inertes sert à améliorer la solubilité des oligomères et à permettre le marquage de masse facile des oligomères précurseurs pour permettre l’identification facile des espèces générées par spectroscopie de masse. De plus, compte tenu de la conformation « brin » de peptoïdes où les segments d’épine dorsale adjacents adoptent des états de rotation opposés pour former un oligomère linéaire et sans torsion34,35, des séquences incorporant des résidus d’espaceurs dynamiques et inertes en alternance facilitent une structure dans laquelle les groupes de pendentifs réactifs sont orientés dans la même direction. Compte tenu de la polyvalence de la méthode submonomère, une grande et diversifiée bibliothèque d’amines primaires peut être utilisée pour modifier davantage les oligomères peptoïdes, mais peut nécessiter des ajustements au protocole pour maintenir une efficacité de couplage élevé.

Tandis que les oligo (peptoïdes) peuvent être synthétisés manuellement dans un récipient de réaction en verre19,l’automatisation du processus diminue le temps pour chaque ajout de résidus de plusieurs heures à une demi-heure. En outre, l’automatisation diminue la quantité de déchets de monomères et de lavage des solvants, particulièrement souhaitable lors de l’utilisation de monomères d’amine primaires qui ne sont pas disponibles dans le commerce. Bien que le clivage Alloc des résidus d’amine protégée soit une réaction efficace, l’oxydation du palladium peut entraîner une déprotection incomplète. Par conséquent, il est suggéré de tester le clivage d’une partie de la résine et de caractériser l’étendue de la déprotection avec ESI-MS. Pour les clivages d’essai, 30 min sous 405 nm d’irradiation libère suffisamment de peptoïde pour la spectrométrie de masse. La déprotection partielle peut être limitée avec l’utilisation de conditions anaérobies ou la répétition de la réaction de déprotection.

Alors que cet article se concentre sur Sc(OTf)3 en tant que réactif multirôle, d’autres triflates métalliques de terres rares, tels que le triflate d’ytterbium, ont été montrés pour servir de médiateur avec succès l’assemblage orienté vers l’information des échelles moléculaires. Notamment, Sc(OTf)3 est le plus acide Lewis des triflates métalliques de terres rares; ainsi, en raison de la capacité catalytique réduite offerte par d’autres triflates métalliques de terre rare24,36, de plus grands équivalents peuvent être exigés pour effectuer la déprotection acétale d’éthylène complète et la dissociation de brin. Le nombre d’équivalents requis peut être déterminé avec la spectrométrie de masse MALDI en observant le point où les brins se dissocient complètement. La dissociation est essentielle dans le processus d’auto-assemblage et est analogue à la fonte des brins d’acide nucléique à température élevée. L’extraction subséquente du catalyseur permet la formation et la perturbation d’appariements covalents dynamiques propulsant l’assemblage de duplex spécifiques à la séquence. Cette annexion progressive des brins oligomériques contourne le piégeage cinétique (qui, pour les échelles moléculaires, peut produire des espèces hors registre ou des séquences incorrectement paires) vécu par d’autres méthodes.

Le chloroforme est un excellent solvant car la séparation de phase dans le chloroforme/acétonitrile/système ternaire d’eau utilisé ici favorise l’extraction partielle de l’acide de Lewis sans avoir pour résultat la précipitation des structures auto-assemblées37. En outre, le chloroforme est l’un des rares solvants qui favorise la formation d’imine tout en maintenant la solubilité de l’échelle moléculaire. Des traces de duplex hors registre et mal appariés peuvent souvent être observées en raison de la nature dynamique du système. Bien que ce système ne soit en grande partie pas affecté par la faible variation des concentrations de triflate métallique de terres rares lors de l’extraction, à l’occasion, l’extraction insuffisante de catalyseurs génère une part importante d’hybridation incomplète et d’accouplements d’oligomères non spécifiques. Dans ce cas, il est généralement préférable de se dissocier d’abord avec un autre 1,5 équivalents de catalyseur, puis d’extraire une deuxième fois plutôt que de réextraire immédiatement, comme la dissociation complète des brins simples est essentielle au processus. Pour assembler simultanément plusieurs échelles moléculaires encodées par l’information, il peut être nécessaire d’augmenter la concentration de la solution de stock de triflate métallique de terre rare utilisée pour maintenir des équivalents et un volume de réaction total.

Bien que ces auto-assemblages soient principalement caractérisés par la spectrométrie de masse, d’autres techniques, y compris le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET), sont possibles. Les limites comprennent la quantité de matériel nécessaire, l’abordabilité des monomères et le rapport signal-bruit. Les techniques nécessitant des solvants, telles que 1H RmN, peuvent en outre souffrir d’insolubilité des structures auto-assemblées. En outre, les concentrations de triflate métallique de terres rares après l’extraction peuvent être déterminées par des méthodes telles que ICP-MS ou 19F NMR avec une norme interne.

Au fur et à mesure que les progrès vers un meilleur contrôle des nanostructures et des matériaux macro- et supramoléculaires progressent, le défi de concevoir et de fabriquer des assemblages réguliers, mais modifiables, se pose. Le protocole décrit dans ce rapport fournit une voie pour réaliser de telles nanostructures par des assemblages séquence-sélectifs par des interactions covalentes dynamiques.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Département de l’énergie des États-Unis, Office of Science, Basic Energy Sciences, dans le cadre de l'#DESC0012479. S.C.L. reconnaît le soutien du National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program et A.F.A. reconnaît le soutien de la Abu Dhabi National Oil Company (ADNOC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dioxane Fisher Scientific D1114 Certified ACS
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) Millipore-Sigma 54793 Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5%
4-(2-Aminoethyl)aniline Ontario Chemicals A2076 98%
4-Cyanobenzaldehyde Oakwood Chemical 049317 99%
4-Methylpiperidine TCI America P0445 ≥98.0%
4-Toluenesulfonyl chloride Oakwood Chemical BR1703 99%
50 mL High Performance Centrifuge Tubes VWR International 21008-240 Centrifuge Tubes used for automated synthesizer
Acetic acid Fisher Scientific A38-212 Glacial
Acetic anhydride Fisher Scientific A10 Certified ACS
Acetonitrile Millipore-Sigma 34851 For HPLC; Gradient grade; ≥99.9%
All-plastic Norm-Ject syringes Thermo Fisher Scientific S7510-10 Luer-Slip Syringe
Allyl chloroformate Acros Organics 221741000 97%
Bromoacetic acid Alfa Aesar A14403 ≥98.0%
Chloroform Millipore-Sigma 288306 Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Chloroform-d Acros Organics AC320690075 For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules
Dichlorodimethylsilane Acros Organics 1133100 ≥99.0%
Dichloroethane Fisher Scientific E175 Certified ACS
Dichloromethane Fisher Scientific D37-4 Stabalized; Certified ACS
Diethyl ether Acros Organics 615080010 Anhydrous; ACS reagent
Diethylene glycol monoethyl ether TCI America E0048 ≥99.0%
Ethanol Decon Labs 2701 200 Proof; Anhydrous
Ethylene glycol Fisher Scientific E178 Certified
Fmoc-Photolabile SS resin CreoSalus SA50785 100-200 mesh; 1% DVB
Glass Peptide Vessel Chemglass CG-1866-02 Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread
LC-6AD HPLC pumps Shimadzu Corporation Equipment
LED 405nm ThorLabs M405L2-C1 405 nm LED used for photocleavage of peptoid
LED Driver ThorLabs LEDD1B Driver for LED light used in photocleavage of peptoid
Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer CEM Corporation Equipment
Lithium aluminum hydride Millipore-Sigma 199877 Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture
Luna C18 analytical RP-HPLC column Phenomenex 00G-4252-E0 Equipment
Luna C18 prepatory RP-HPLC column Phenomenex 00G-4253-P0-AX Equipment
Methanol Fisher Scientific A412 Certified ACS
Microliter Syringe Hamilton Company 80700 Cemented Needle (N)
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) Oakwood Chemical M02889 ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization
N,N-Dimethylformamide Millipore-Sigma 319937 ACS reagent; ≥99.8%
Nitric acid Fisher Scientific A200-212 Certified ACS Plus
Nitrogen gas Cryogenic Gases Contents under pressure, may explode if heated
Phenylsilane Oakwood Chemical S13600 97%
Prominence SPD-10A UV/vis Detector Shimadzu Corporation Equipment
p-Toluenesulfonic acid monohydrate Millipore-Sigma 402885 ACS reagent; ≥98.5%
Scandium(III) triflate Oakwood Chemical 009343 99%
Single-use Needle Exel International 26420 18G x 1 1/2″
Sodium azide Oakwood Chemical 094448 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin.
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233 Powder; Certified ACS
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100 Pellets; Certified ACS
Sodium sulfate Fisher Scientific S421-500 Anhydrous; Granular; Certified ACS
Syringe Filter 0.45 µm VWR International 28145-497 PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing
Tetrahydrofuran Fisher Scientific T397 Certified
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) Oakwood Chemical 034279 98%
Toluene Fisher Scientific T324 Certified ACS
Triphenylphosphine Oakwood Chemical 037818 99%

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