والتحليل الطيفي رامان المتكاملة وكتله الطيف الكتلي لدراسة امتصاص المخدرات خليه واحده, الأيض, والآثار

Biochemistry
 

Summary

هذا البروتوكول يقدم متكاملة رامان الطيفي-كتله الطيف (MS) المنصة التي هي قادره علي تحقيق دقه خليه واحده. يمكن استخدام التحليل الطيفي لرامان لدراسة الاستجابة الخلوية للادويه ، في حين يمكن استخدام MS للتحليل الكمي والمستهدف لامتصاص المخدرات والأيض.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ali, A., Abouleila, Y., Germond, A. An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects. J. Vis. Exp. (155), e60449, doi:10.3791/60449 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ومن المعروف ان الخلايا غير متجانسة بطبيعتها في ردودها علي المخدرات. ولذلك ، فانه من الضروري ان يتم احتساب تغاير أحاديه الخلية في دراسات اكتشاف المخدرات. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق قياس عدد كبير من التفاعلات الخلوية بين الخلية والمخدرات علي مستوي خليه واحده (اي امتصاص المخدرات ، والأيض ، والتاثير) بدقه. تصف هذه الورقة نظاما طيفيا أحادي الخلية من رامان والطيف الكتلي (MS) لرصد التغيرات الايضيه في الخلايا ردا علي المخدرات. باستخدام هذا النظام الأساسي ، يمكن قياس التغيرات الايضيه في الاستجابة للدواء بواسطة الطيفي رامان ، في حين ان المخدرات والمستقلب لها يمكن تحديدها كميا باستخدام الطيف الكتلي في نفس الخلية. وتشير النتائج إلى انه من الممكن الوصول إلى المعلومات حول امتصاص المخدرات, الأيض, والاستجابة علي مستوي خليه واحده.

Introduction

تستجيب الخلايا بشكل مختلف للتغيرات في بيئتها الصغرى علي مستوي الخلية الواحدة ، وهي ظاهره تسمي التغاير الخلوي1. وعلي الرغم من هذا ، فان دراسات اكتشاف المخدرات الحالية تستند إلى قياسات متوسطه لسكان الخلايا ، والتي تشوش المعلومات حول السكانالفرعيين المحتملينوكذلك الاختلافات في الخلية الواحدة 2. قد تفسر هذه المعلومات المفقودة لماذا بعض الخلايا أكثر عرضه للادويه بينما البعض الآخر مقاوم. ومن المثير للاهتمام ، ان نقص المعلومات أحاديه الخلية عن الاستجابة للمخدرات هو سبب محتمل لفشل المرحلة الثانية التجارب السريرية للمخدرات3. لذلك ، لمعالجه هذه المشكلة ، يجب قياس التفاعلات الخلوية مع الدواء (اي ، الامتصاص ، الأيض ، والاستجابة) علي مستوي الخلية الواحدة.

ولتحقيق ذلك ، قمنا بتصميم نظام فريد من نوعه يتم فيه فحص الخلايا الحية الوحيدة باستخدام الطيف الطيفي رامان الخالي من التسمية ، ثم يتميز باستخدام الطيف الكتلي4. الطيفي رامان يوفر بصمه الجزيئية للدولة الخلوية, طيف معقده الناتجة عن مساهمات العديد من الجزيئات داخل الخلية. علي الرغم من هذا تعقيد, هو يستطيع كنت اعتبرت ان [رامان] بصمات يعكس بنيه خليه كامله وأيض5,6. الطيفي رامان تتفوق في قياس الدول الخلوية في طريقه الانتاجيه غير الغازية وعاليه نسبيا ، مما يجعل من المفيد لفحص وتقييم الاستجابة للمخدرات علي مستوي خليه واحده.

وعلي النقيض من ذلك ، توفر الMS الحساسية المطلوبة والانتقائية لقياس امتصاص المخدرات علي مستوي الخلية الواحدة. بما ان MS هو مدمر (يتم استهلاك عينه [خليه] عاده اثناء التحليل) ، ودمجها مع غير تدميري ، والتصنيف الطيفي رامان الخالية من التسمية يمكن ان توفر إنتاجيه عاليه ونظام حساس. هذه المنصة مجتمعه قادره علي توفير المزيد من المعلومات حول امتصاص المخدرات, الأيض, والآثار علي مستوي خليه واحده.

توضح هذه المخطوطة بروتوكولا يستخدم لدراسة التفاعلات الخلوية مع المخدرات علي مستوي الخلية الواحدة باستخدام الثقافات الانبوبيه باستخدام منصة رامان-MS متكاملة. للقيام بذلك ، يتم استخدام خلايا سرطان الخلية الكبدية (HepG2) و تاموكسيفين كنموذج. تم اختيار الخلايا HepG2 لأنها تاخذ تاموكسيفين واستقلاب المخدرات, وتتاثر في وقت واحد بسبب اثارها سميه كبديه. وتستخدم دولتان في هذه المخطوطة: الخلايا المعالجة بالمخدرات مقابل الخلايا غير المعالجة (السيطرة).

Protocol

1-ثقافة الخلية

  1. ثقافة الخلايا ذات الاهتمام في وسائل الاعلام الثقافة المناسبة. يمكن أضافه البنسلين-ستربتومايسين لتجنب التلوث. في حاله الخلايا الHepG2ه ، والخلايا الثقافية في وسائل الاعلام الثقافية التي تحتوي علي متوسط النسر المعدلة دولبيكو (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية (ن) و 0.1 ٪ البنسلين-ستربتوميسين. لمرافق القياسات الطيفية رامان ، يمكن ان تزرع الخلايا علي 0.1 ٪ الجيلاتين المغلفة الزجاج أسفل الطبق أو الشرائح الكوارتز.
  2. احتضان الخلايا لمده يومين عند 37 درجه مئوية و 5% CO2 في حاضنه مرطبه.
  3. مزامنة ثقافات الخلايا للوصول إلى 70% كونفلوينسي.
  4. خلايا الثقافة الفرعية في طبق الشبكة الزجاجية السفلية 35 مم أو شرائح الكوارتز باستخدام نفس الوسيطة في كثافة البذر من 0.7 × 106، ثم احتضان في 37 درجه مئوية ل 24 ساعة.
    ملاحظه: الاطباق الثقافية أو الشرائح يمكن ان تكون مغلفه مسبقا مع محلول الكولاجين أو طلاء الجيلاتين مع نسبه سطح الثقافة من 5 ميكروغرام/سم2 للسماح لهم لإصلاح ، وضمان بقائهم اثناء القياس.

2-العلاج من المخدرات

  1. أزاله الخلايا الثقافات من الحاضنة وغسل 2x مع المخزن المؤقت بالحرارة المسبقة (37 درجه مئوية).
    ملاحظه: فمن الأمثل لأزاله الخلايا لعلاج المخدرات في كونفلوينسي من 50 ٪-60 ٪.
  2. تقسيم الخلايا إلى مجموعات فرعيه معالجه المخدرات وغير المعالجة في الاطباق الثقافية 35 مم.
  3. مزيج المخدرات من الاختيار مع وسائل الاعلام الثقافة. علي سبيل المثال, حل تاموكسيفين في سلفوكسيد ثنائي الميثيل (dmso) وتخلط مع وسائل الاعلام الثقافة للحصول علي حجم النهائي من 2 مل وتركيز تاموكسيفين من 10 μM. ستكون هذه المجموعة المعالجة بالمخدرات.
  4. خلط حجم المقابلة من المذيبات (DMSO) في الوسط كعنصر تحكم لدراسة اثار DMSO. ستكون هذه هي مجموعه التحكم.
  5. احتضان كلا المجموعتين في 2 مل من وسائل الاعلام ارتفعت أعدت في الخطوات 2.3-2.4 لمده 24 ساعة. وينبغي ان يكون كونفلوينسي المتوقع بعد الحضانة 70 ٪-80 ٪.

3. رامان التصوير الطيفي والمعالجة الطيفية

ملاحظه: علي الرغم من ان أنظمه الطيف الطيفي رامان متاحه تجاريا ، فان نظام الطيف الطيفي المستخدم هنا هو المجهر المركزي الذي تم بناؤه في المنزل والذي سبق وصفه بأنه7،8. لفتره وجيزة ، وقد تم تجهيز هذا النظام مع صمام ثنائي 532 nm ضخ الليزر الحالة الصلبة. يتم تشكيل ضوء الليزر إلى طائره باستخدام عدسه اسطوانيه ، والذي يسمح قياس 400 الأطياف في التعرض واحد. تم تسجيل الأطياف رامان باستخدام كاميرا CCD المبردة التي شنت علي polychromator الذي يستخدم 1,200 الأخاديد/مم صريف لتعظيم الدقة الطيفية للمنطقة بصمات الأصابع (من 500-1800 سم-1). هذه المنطقة الطيفية تحتوي علي كثافة عاليه من الترددات الخاصة بالجزيئات التي تولد رامان تشتت. وتستخدم أيضا عدسه المياه-غمر الهدف (NA = 0.95). القرار المكاني لهذا النظام هو ~ 300 nm والقرار الطيفي هو 1 سم-1. لضمان بقاء الخلية اثناء التجربة ، يتم استخدام ميكروغرفه ثابته علي مرحله المجهر اليه.

  1. قبل القياسات الطيفية ، تحقق من محاذاة البصريات. ويمكن استخدام ثقب الدبوس 50 μm للتحقق من ان الثقب والليزر تطابق موقف تماما. ادخل فتحه المقياس الطيفي عندما ضاقت قدر الإمكان.
  2. استخدام الايثانول لمعايره مقياس الطيف قبل كل تجربه. للقيام بذلك ، ضع EtOH في طبق الزجاج السفلي ، وقياس الطيف في كثافة الليزر معينه (تقاس في عينه) ل 1 ثانيه ، وربط الذروة إلى موجات المعروفة7.
  3. تقليل كثافة الليزر في العينة إلى ~ 2.4 mW/μm2 بحيث الخلايا البقاء علي قيد الحياة التعرض لأشعه الليزر.
  4. اعداد ميكروغرفه في 5 ٪ CO2 و 37 درجه مئوية.
  5. مره واحده في نظام المجهر جاهزه ، وأزاله الخلايا من الحاضنة وفورا شطف الخلايا 2x مع تحسنت بالحرارة (37 درجه مئوية) المخزن المؤقت ، ثم أضافه 2 مل من تحسنت تلفزيوني (37 درجه مئوية) أو DMEM لأعاده تعليق الخلايا.
    ملاحظات: كلا من الوسائط التلفزيونية و الفلوروبورايت DMEM المستندة إلى وسائل الاعلام هي خيارات كافيه لقياسات الطيفي رامان لأنها تنتج اشاره الحد الأدنى من الخلفية.
  6. أضافه 10 μL من الماء علي عدسه الغمر المياه الهدف ووضع بدقه طبق الخلية الزجاجية أسفل علي مرحله المجهر.
  7. قياس كل خليه من خلال التركيز علي خط الليزر. وقت التعرض 15 s لكل خليه كافيه هنا للحصول علي مقطع عرضي من خليه مع اشاره رامان واضحة. مراه galvano يسمح مسح خليه واحده أو مجموعه من الخلايا في غضون عده عشرات دقائق.
    ملاحظات: يتطلب الدقة العالية للتصوير الطيفي الكامل للخلايا مزيدا من الوقت ويمكن ان يؤدي إلى التصوير الضوئي. هنا ، تم قياس الخلايا باستخدام التعرض للخط الواحد للحصول علي مقطع عرضي لكل خليه. وهذا النهج هو مقايضه جيده لزيادة الانتاجيه والحصول علي معلومات كافيه للتمييز بين الخلايا ، في الوقت الذي تكفل فيه أيضا بقاء الخلية عن طريق الحد من الصور الضوئية.

4-المعالجة المسبقة للبيانات الطيفية والتحليلات المتعددة المتغيرات

ملاحظه: المعالجة المسبقة خطوه ضرورية قبل التحليل الإضافي من أجل أزاله الاختلافات التقنية غير المرغوب فيها ضمن البيانات الطيفية. نظرا لتنوع الأساليب والبرمجيات ، لا يمكن تقديم قائمه شامله ، وهناك العديد من الاستعراضات المفيدة التي وجدت في الأدب7،8. في هذا القسم ، نقدم وصفا موجزا للنهج المستخدم في تحليل وتفسير بيانات رامان الطيفية التي تم الحصول عليها من خلايا واحده حيه.

  1. استخراج والتجهيز المسبق للصور رامان لأزاله احتمال تداخل الشعاع الكوني.
    ملاحظه: قد يتضمن المحور الطيفي لأطياف التي يتم الحصول عليها خلال أيام/أسابيع/أشهر مختلفه بعض الاختلافات بسبب الاختلافات التقنية الصغيرة اثناء المعايرة باستخدام الايثانول. سيؤثر ذلك بشده علي التحليلات المتعددة المتغيرات والمقارنات الاحصائيه. في حاله اجراء التجارب خلال أسابيع/أشهر مختلفه ، من المتوقع وجود اختلافات بصريه صغيره. وفي هذه الحالة ، يجب ان تكون البيانات محرفه لتصحيح التحولات الطيفية المحتملة للبيانات عبر التجارب. يتم استخدام الاستيفاء باستخدام شريحة مكعب هنا. بعد هذه الخطوة ، يجب محاذاة كل محور الأطياف. وتعتبر مجموعه من 500-1800 سم-1 للتحليل اللاحق.
  2. استخراج البيانات الطيفية من الخلايا والخلفية (غياب الخلايا) من كل صوره باستخدام خوارزميه محليه الصنع. اطرح اشاره الخلفية من اشاره الخلية. ثم ، متوسط أطياف البيكسلات المتبقية ، والتي ينبغي ان تتوافق مع خليه واحده. يتم تنفيذ الخطوات التالية باستخدام أطياف 2D من الخلايا.
  3. اجراء تصحيح خط الأساس باستخدامModpoly9 أو اي خوارزميه أخرى انه يقدر لتناسب بما فيه الكفاية. تقليم النطاق الطيفي إلى 600-1700 سم-1 لتحديد منطقه بصمات الأصابع والتاكد من انه لا توجد اثار حافه غير المرغوب فيها علي الأطياف بسبب تركيب متعدد الحدود سيئه.
  4. اجراء خطوه تطبيع مثل تطبيع المتجات (يتم تقسيم الكثافة عند كل واحد منها بواسطة المعيار l2 العالمي أو القيمة المفردة القصوى لطيف) لتطبيع الكثافة الطيفية10، علي الرغم من انه يمكن النظر في التطبيع الأخرى.
  5. اعداد مجموعه بيانات مع التسمية المناسبة لكل فئة/شرط.
    ملاحظه: يمكن للتحليلات الطيفية المقارنة ان تستكشف طبيعة الاختلافات المحتملة بين فئة/شروط الخلية (علي سبيل المثال ، عن طريق طرح متوسط طيف مجموعه المراقبة إلى مجموعات أخرى لتحديد مناطق الاهتمام [مثل المؤشرات البيولوجية المحتملة]). ويمكن أيضا ان يتم اجراء الحسابات ANOVA والعشرات فيشر10.
  6. ولتحديد الخلايا المعالجة وغير المعالجة استنادا إلى السمات الطيفية ، يمكن تطبيق تحليلات متعددة المتغيرات. وينبغي استخدام البيانات الطيفية التي تم تطبيعها كمجموعه بيانات للتدريب ، وينبغي استخدام مجموعه بيانات غير معروفه (بدون تسميه) من تجربه النسخ المتماثل بوصفها معطيات اختبار ، ان أمكن.
    ملاحظه: التحليل التمييزي الذي اجري علي بعض المتجات لتحليل المكون الرئيسي (PCA-DA10) ، والإسقاط علي العشرات الكامنة متبوعا بتحليل التمايز (PLS-da) ، وآلات ناقلات الدعم (svm)11 هي نماذج تستخدم في كثير من الأحيان في الميدان ، وكلها تقدم اعتبارات احصائيه مختلفه. التالي ينبغي اجراء المعالجة المسبقة للبيانات.
  7. استخدام التعلم الألى الذي يناسب الأهداف التجريبية. هنا ، تم بناء إسقاط علي هيكل الكامنة (الثابتة والمتنقلة) نموذج باستخدام منطقه بصمات الأصابع الطيفية من الأطياف رامان (600-1710 سم-1)11،12. يعني-توسيط البيانات حسب الضرورة. للتحقق من صحة النموذج ، يمكن تطبيق تقنيات مختلفه.
    ملاحظه: هنا ، يتم تطبيق التدقيق العرضي الأعمى البندقية مع 10 انشقاقات. يجب اختبار تعقيد الطراز (عدد المكونات أو المتغير الكامن) بحيث يقلل النموذج الأفضل من قيمه الخطا التربيعي التربيعي (RMSE). وقد وجد ان ثلاثه ناقلات الكامنة (LVs) قدمت أفضل التمييز مع مجموعه البيانات لدينا.
  8. تحديد القمم الطيفية رامان التي تسهم في التمييز من الخلايا (علي سبيل المثال ، عن طريق التامر علي درجه من اهميه متغيرة في الإسقاط [VIP] لكل الأفندي رامان أو حجم معامل الانحدار).
    ملاحظات: يتم حساب درجه كبار الشخصيات من متغير كمبلغ مرجح من الارتباطات التربيعية بين مكونات الثابتة والمتنقلة-DA والمتغير الأصلي. ويمكن الاطلاع علي تفاصيل بشان الثابتة والمتنقلة ودرجات كبار الشخصيات خوارزميه في الأدب11،12.

5-إنشاء وإجراءات أخذ العينات من خليه واحده

  1. إصلاح نظام أخذ العينات الخلية علي المجهر رامان كما هو مبين في الشكل 1. ربط الجزئي 3D إلى حامل الشعرية الزجاجية التي تعلق علي حقنه فارغه لامتصاص العينة عن طريق تطبيق الضغط السلبي (الشكل 1).
  2. تعيين المجهر إلى حقل التكبير عاليه (40x) لمراقبه غيض من الزجاج الشعرية وتاكد من انها ليست مكسوره. السيطرة علي موقف الشعرية الزجاج باستخدام الجزئي (x-، y-، z-محاور). تاكد من ان الطرف الشعري يتركز في مجال الرؤية ، ثم حرك الشعيرات الشعرية علي المحور z لإعطاء تصريح لطبق الثقافة في وقت لاحق.
    ملاحظه: يتم تنفيذ صغريه من الخلايا الشعرية الزجاجية للخلايا مع أقطار بين 10-15 μm. ويوصي الشعرية مع حجم تتحمل من ~ 5 μm. إذا كان حجم التجويف صغيرا جدا ، سيتم توصيل الطرف الشعري بالخلية ، وإذا كان كبيرا جدا ، فقد يتم اختراق حساسية قياسات MS اللاحقة.
  3. وضع لوحه عينه/طبق علي خشبه المسرح من المجهر ، وضبط التكبير والتركيز ، حدد الخلية المستهدفة علي طبق الشبكة ، ونقله إلى مركز العرض. ثم ، بعناية أسفل الشعرية الزجاج باستخدام الجزئي (z-المحور) حتى ياتي الطرف في التركيز.
    ملاحظه: تاكد من عدم نقل الشعرية في المحورين س و ص حتى الشعرية في التركيز.
  4. تحت الملاحظة المجهرية ، لمس خليه واحده الهدف مع الطرف الشعرية ، ثم البدء في تطبيق الضغط السلبي باستخدام حقنه لفخ الخلية داخل الطرف الشعرية. تسجيل هذا الاجراء عن طريق التقاط صوره أو فيديو للتحقق من توقيت وامتص موقع الخلية علي وجه التحديد ، إذا لزم الأمر.
  5. حرك الشعيرات الشعرية علي المحور z. ثم ، فصل الشعرية من حامل الشعرية باستخدام ملقط في التحضير لتحليل MS.

6-قياسات الطيف الكتلي

  1. معايره الدقة الشاملة للاداه MS وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. بعد المعايرة ، تاكد من ان الخطا الشامل لا يزيد عن 3 جزء في المليون.
  2. تحسين أداه MS إلى المعلمات التي هي الأنسب للتحليل من الفائدة.
    ملاحظه: في حاله تاموكسيفين وتحليل 4 OHT ، يتم تعيين المعلمات الصك إلى ما يلي: درجه الحرارة مدخل الشعرية: 400 درجه مئوية ، رذاذ الجهد: 1500 V ، التلقائي الهدف السيطرة علي الكسب (النائب العام): 5.00 E + 06 ، S-عدسه RF المستوي: 90 ٪ ، سيم نطاق: 347-397 م 200 ms ، القرار سيم: 140,000 FWHM ، MS/MS المدى: 50-400 م/ض ، MS/MS الهدف الأول: 2.00 E + 05 ، MS/MS الحد الأقصى للحقن الوقت: 100 ms ، ms/ms القرار: 17,500 FWHM ، MS/MS العزلة النافذة: 1 م/ض ، MS/MS تطبيع الطاقة الاصطدام
  3. قم باعداد طريقه اكتساب تلقائية بمده 5 دقائق لوضع SIM لتحقيق الكمية النسبية ، وطريقه MS/MS أخرى للتعرف الإيجابي علي الدواء والمستقلب الخاص به. يجب تعيين معلمات أسلوب الاكتساب إلى القيم المحسنة المذكورة في الخطوة 6.2.
  4. اعداد مذيب التاين تحت غطاء الدخان. تكوين المذيبات يعتمد علي التحليلية من الفائدة. هنا ، والمذيبات العضوية المستخدمة تتكون من 80 ٪ MeOH ، 10 ٪ DMSO ، و 0.1 ٪ حمض فورميك.
  5. امزج معيارا داخليا مناسبا مع المذيب العضوي قبل القياسات. في هذه التجربة ، يتم استخدام 5.31 nM من d5-تاموكسيفين كمعيار داخلي.
  6. لتجنب الإيجابيات كاذبه, يستنشق وسائل الاعلام المحيطة الخلايا التعامل مع المخدرات باستخدام 1 μm تجويف حجم الشعرية مع الملاحظة المجهرية المستمرة لتجنب أخذ عينات اي أجزاء الخلوية.
  7. أضف 2 μL من مذيب التاين إلى الطرف الواسع من الشعيرات الشعرية التي تحتوي علي الوسائط باستخدام ماصه مرفقه بنصائح اللودر. ثم ، تحليل الوسائط عينات من قبل MS ، والتحقق من وجود التحليل من الفائدة (عاده ، فانه لا ينبغي ان تكون قابله للكشف).
  8. أضافه 2 μL المذيبات التاين إلى الشعرية التي تحتوي علي الخلية ، وإصلاح الشعرية إلى محول نانوكهروكهربي (نانو-ESI) متصلة مطياف كتله مناسبه ، والبدء في طريقه الاكتساب التلقائي.

7-معالجه وتحليل بيانات قياس الطيف الكتلي

ملاحظه: يمكن استخدام اي برنامج مناسب لاجراء تحليل البيانات. ومع ذلك ، إذا كان الباحثون يرغبون في اجراء تحليل البيانات باستخدام برنامج لم يتم توفيره من قبل البائع MS ، ثم يجب تحويل البيانات الخام من تنسيق البائع الملكية إلى تنسيق مفتوح أو كملف نصي أولا (الذي تم القيام به هنا).

  1. تطبيع البيانات عن طريق تقسيم منطقه الذروة للتحليل من الفائدة (ق) من قبل ان من المعيار الداخلي من نفس المسح الضوئي MS. ثم ، سجل تحويل نسب الذروة للحد من الانحراف.
  2. ارسم الكثافة الطبيعية للدواء أو المستقلب الخاص به كمؤامرة أو منحني كثافة لتصور التوزيع عبر الخلايا المفردة. هنا ، يتم استخدام R البرمجيات الاحصائيه ، جنبا إلى جنب مع حزمه ggplot2.
  3. حساب المخدرات استقلاب لعدم استقلاب نسبه المخدرات عن طريق تقسيم وفره من المستقلب المخدرات التي من جزيء الأصل غير القابل لاستقلاب في كل خليه (اي, 4-OHT و تاموكسيفين, علي التوالي.
    ملاحظه: يمكن دراسة العلاقة بين الاختلافات من قمم رامان محدده من الفائدة والاختلافات في قمم MS من المخدرات أو الأيض لها. هذا هو أضافه إلى الارتباط المحتمل بين المخدرات نفسها والمستقلب في خلايا واحده. ويمكن القيام بذلك عن طريق حساب معامل الارتباط بيرسون باستخدام اختبار ثنائي الذيل. وينبغي أيضا النظر في اتباع نهج تكامليه أكثر تقدما.

Representative Results

تحليل خليه واحده من التفاعلات المخدرات (امتصاص, الأيض, والآثار) أمر ضروري في الكشف عن اي السكان الفرعية الخفية أو مقاومه للادويه ، فضلا عن فهم اثار التغاير الخلوي. في هذا البروتوكول ، تم استخدام اثنين من التقنيات التكميلية لقياس التفاعلات المذكورة أعلاه في خلايا واحده: الطيفي رامان والتصلب البيولوجي MS راما يحدد بسرعة الخلايا المتضررة من المخدرات استنادا إلى المؤشرات الحيوية الطيفية للاستجابة للمخدرات. تستخدم MS لمراقبه امتصاص المخدرات واستقلابها بطريقه انتقائية وشبه كميه. تم فحص الخلايا أولا بواسطة التحليل الطيفي رامان ثم عينات فرديه للتحليل من قبل MS.

ويرد في الشكل 2تحليل مقارن لمتوسط طيف كل حاله (مع المعالجة بالعقاقير وبدونها). الطيف المتوسط للظروف اثنين تختلف بوضوح في قمم مختلفه ، والتي تم تحديدها سابقا وتعيينها إلى المركبات الجزيئية2. علي وجه الخصوص ، وقمم في 1000 سم-(المخصصة للمركبات العطرية مثل فينيلالانين والتيروزين) تظهر اختلافات قويه. وينبغي تقييم اهميه الفرق الإحصائي باجراء المزيد من التحليلات المتعددة المتغيرات.

ثم استخدمت مجموعه البيانات لتدريب نموذج الثابتة والمتنقلة (الخطوات 4.5-4.8) تهدف إلى التمييز بين العلاجات الخلية اثنين (مع المخدرات: ن = 290 ، دون المخدرات: ن = 115). بلغت القدرة التنبؤيه لتصنيف الخلايا المستزرعة في وجود تاموكسيفين 100 ٪ حساسية و 72 ٪ خصوصية في بيانات الاختبار (غير معروف من النموذج المدرب عبر التحقق من صحة). الحساسية هي مقياس لإيجابيات حقيقية التي يتم تحديدها بشكل صحيح من قبل النموذج ، في حين ان الخصوصية هي مقياس لسلبيات الفعلية التي يتم تحديدها من قبل النموذج. النماذج البديلة مثل SVMs ، LDAs ، والشبكات العصبية قد توفر نتائج مماثله أو أفضل ، علي الرغم من انه لم يتم اجراء مقارنه شامله في هذه الدراسة.

استنادا إلى نموذج الثابتة والمتنقلة ، تم حساب عشرات كبار الشخصيات ، والتي تمثل اهميه الأطوال الموجية (التحولات رامان) في التمييز بين الظروف التجريبية (الشكل 3). والاهم من ذلك ، كانت اعلي قمم الملفات الشخصية للشخصيات الهامه تناظر قمم رامان التي شهدت اختلافات قويه بين العلاجين. وهذا يؤكد الاختلافات الجزيئية المحددة بين الخلايا المعالجة وغير المعالجة. التالي ، يمكن للباحثين تحديد المؤشرات البيولوجية الطيفية المحتملة التي تعكس استجابه الخلايا المفردة لعلاج المخدرات. ويمكن اختبار هذه المؤشرات الحيوية بشكل أكبر للتحقق من أهميتها البيولوجية وتعميمها عبر مختلف الظروف وخطوط الخلايا.

وكان نظام قياس الطيف الكتلي (LSC-MS) الحي وحيد الخلية قادرا علي الكشف عن كل من المخدرات ونواتجها في خلايا HepG2 الوحيدة المعالجة بالمخدرات التي كانت تقاس سابقا بواسطة الطيفي رامان. الاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام MS ترادفي لتاكيد بنيه كل من الجزيئات. بعد التحديد الإيجابي ، تم قياس الوفرة النسبية للدواء ونواتجه في كل خليه ومقارنه بالقمم الخلفية في الخلايا غير المعالجة. لوحظ اختلاف قوي في وفره تاموكسيفين ، وكانت هذه الظاهرة أكثر وضوحا في حاله المستقلب ، 4-OHT (الشكل 4). ودرست أيضا العلاقة بين وفره تاموكسيفين ونواتجه ، والتي تم العثور علي ارتباط إيجابي كبير بين الاثنين (r = 0.54 ، p = 0.0001 ، n = 31).

Figure 1
الشكل 1: نظام انتقاء الخلايا المثبت علي مرحله المجهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: متوسط طيف الخلايا المعالجة بالمخدرات (مع تاموكسيفين: n = 295) والخلايا غير المعالجة (بدون تاموكسيفين: n = 115). ويمكن تحديد قمم رامان من الأدب. معظم الاختلافات الطيفية القوية ذات دلاله احصائيه (ANOVA ، p ≤ 0.5) كما هو موضح سابقا4. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق4. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: علامات كبار الشخصيات المستخرجة من نموذج الثابتة والمتنقلة التنبؤيه. علامات كبار الشخصيات تعكس الأطوال الموجية التي تسهم في التمييز بين فئتين في النموذج. وتتوافق معظم القمم مع الجزيئات المحددة التي تلاحظ كمؤشرات بيولوجية طيفيه لأثار المخدرات علي الخلايا المعالجة بالمخدرات. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق4. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: توزيع وفره تاموكسيفين والمستقلب. توزيع الوفرة تاموكسيفين والمستقلب ، 4-OHT (تقاس علي مستوي خليه واحده) بالمقارنة مع القمم الذاتية في الخلايا غير المعالجة (السيطرة). وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق4. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في هذه المخطوطة ، تم اختيار حاله بسيطه تعرضت فيها خلايا HepG2 (أو لا) لعقار تاموكسيفين. ومن الواضح ان قدره الطيفية رامان ونظام الطيف الكتلي لرصد اثار تاموكسيفين علي الخلايا. سمح الطيفي رامان تحديد المؤشرات الحيوية المحتملة التي تعكس استجابه عامه من خلايا واحده للتعرض للمخدرات. ولوحظ وجود بعض التباين بين الخلايا المفردة ، مما يوحي بان بعض الخلايا لا تستجيب للتعرض للمخدرات. ومن ناحية أخرى ، كانت اللجنة قادره علي اجراء تحليل مستهدف للدواء والمستقلب الخاص به علي مستوي الخلية الواحدة ، حيث لوحظت درجه عاليه من التغاير في المخدرات ووفره المستقلب. هذا التباين يساعد علي تفسير لماذا تتاثر بعض الخلايا من المخدرات في حين ان البعض الآخر علي ما يبدو لا, علي الرغم من الخلايا الناشئة من السكان موحده يفترض12.

ومن بين جوانب معينه من هذه التقنية التي تتطلب الاهتمام ، من المهم تقييم نوعيه المجهر الاعداد ومعالجه الإشارات لضمان استنساخ البيانات. إذا تم المعالجة المسبقة لأطياف بعناية ، وينبغي تعظيم الاختلافات اشاره في اقصي المحلية لكل ذروه. وعلي النقيض من ذلك ، ينبغي ان يتداخل خط الأساس وحافه الأطياف بين ظروف الخلايا المختبرة. وثمة جانب هام آخر هو النموذج المتعدد المتغيرات المستخدم للتحقيق في الاختلافات بين العلاجات. ويجب علي المرء ان يقيم بعناية النماذج والمعايير النموذجية لضمان تحليل دقيق ودقيق. ميزه واحده من نموذج الثابتة والمتنقلة ، علي عكس الشبكات العصبية ، هو انه يسمح بالوصول إلى الأوزان المرتبطة بكل الطول الموجي (النوبات رامان) التي تميز أفضل الظروف اختبارها من قبل النموذج.

علي الرغم من الطيف الطيفي رامان التمييز بنجاح الاستجابة للمخدرات, وينبغي التاكيد علي ان هذه التقنية محدوده في استخدامها لتوفير التفسير البيولوجي. ويرجع ذلك أساسا إلى تعقيد الاشاره الطيفية ، التي تشمل خليطا من آلاف الجزيئات. ولذلك ، يلزم اجراء مزيد من التحقيقات لتقييم الاختلافات المنهجية بين الكثافة الطيفية لرامان والاختلافات في تركيزات المخدرات. أيضا ، هناك حاجه إلى دراسات مماثله لخطوط الخلايا الأخرى لتقييم تعميم المؤشرات الحيوية الطيفية المرتبطة تاموكسيفين.

وعلاوة علي ذلك ، قد يكون من المهم اجراء قياسات الانسجه الحية لتقييم الدوائي ودراسة كيفيه تغلغل المخدرات وتدفقها داخل كل خليه. وعلاوة علي ذلك ، تجدر الاشاره إلى ان خطوه أخذ العينات في المركز المذكور تعتمد إلى حد كبير علي مهارة المشغل. المعلمات مثل الدقة المكانية ، ووضع الخلية داخل الشعرية بعد أخذ العينات ، وقوه الانتاجيه هي بالبالكامل المشغل التابعة ، والتي تحد من اعتماد واسعه النطاق من LSC-MS. وعلي الرغم من ان نظم أخذ العينات المؤتمتة قد تخفف من هذه المسالة. وعلاوة علي ذلك ، في حين تتفوق LSC-MS في أخذ العينات الملتصقة أو الخلايا العائمة في الدول الاصليه ، فانه يؤدي أكثر سوءا في الخلايا أخذ العينات جزءا لا يتجزا من أقسام الانسجه. ويرجع ذلك إلى ميل الشعيرات الشعرية العينة لكسر إذا كانت كثافة العينة عاليه. ولذلك ، فان نهجا آخر مثل التحقيق الوحيد قد يكون أكثر ملاءمة في مثل هذه الحالات14،15.

منذ يتم أخذ عينات من الخلايا المستخدمة هنا في الظروف المحيطة مع الحد الأدنى من اعداد العينة ، يمكن دمج LSC-MS بسهوله مع التكنولوجيات الأخرى ، كما هو مبين من خلال دمجها مع رامان في هذا البروتوكول. وقد سمح تكامل مماثل آخر مع التصوير الثلاثي الابعاد لتحقيق الكمية المطلقة من نواتج الأيض الخلوية علي مستوي الخلايا الفرعية16. بالاضافه إلى ذلك, التكامل مع تدفق الخلوي سمح للكشف عن المؤشرات الحيوية الايضيه في واحده الخلايا السرطانية المنتشرة من مرضي السرطان الورم الارومي العصبي17,18.

وفي المستقبل ، وبسبب الاهتمام المتزايد مؤخرا بالجمع بين مجموعات البيانات من طرائق التصوير19، قد يكون من المهم أيضا دراسة الاختلافات المنهجية بين إشارات رامان ونتائج قياس الطيف الكتلي (بالاضافه إلى أساليب القياس الأخرى) باستخدام النهج الحسابية التكاملية. ومن المثير للاهتمام ، لقد وجدنا بالفعل العديد من الارتباطات الخطية الضعيفة ولكن الهامه بين كثافة القمم رامان التي حددتها درجات كبار الشخصيات ووفره من تاموكسيفين أو المستقلب في مستوي خليه واحده كما حددت MS4. قد تشير هذه البيانات إلى وجود علاقة ايضيه بين ملفات تعريف MS وأطياف رامان وامكانيه التنبؤ بهذه القيم.

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويشكر المؤلفون توشيو ياناغيدا علي دعمه والصناديق التعاونية الداخلية المنسوبة إلى الدكتور أرنو جيرموند.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% penicillin-streptomycin Nacalai Tesque 09367-34
35mm glass bottom grid dish Matsunami
4-Hydroxy Tamoxifen standard Sigma-Aldrich 94873
532 nm diode pumped solid-state laser Ventus, Laser Quantum
BIOS-L101T-S motorized microscope stage OptoSigma
CT-2 cellomics coated sampling capillaries HUMANIX
d5-Tamoxifen standard Cambridge Isotope Laboratories
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade Nacalai Tesque D8418
Dulbecco's Modified Eagle's medium Sigma-Aldrich D5796
Eppendorf GELoader tips Eppendorf
fetal bovine serum Hyclone laboratories SH3006603
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher Scientific
Formic acid LC-MS grade Sigma-Aldrich 33015
HepG2 cell line (RCB1886) RIKEN cell bank center RCB1886
MC0-19A1C Incubator Sanyo Electric Co. MC0-19A1C
Methanol LC-MS grade Sigma-Aldrich 1060352500
MMO-203 3-D Micromanipulator Narshige MMO-203
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens Olympus
Nanoflex nano-ESI adaptor Thermo Fisher Scientific ES071
On-stage incubator ibidi
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution Thermo Fisher Scientific 88323
PIXIS BR400 cooled CCD camera Princeton Instruments
Q-Exactive Orbitrap Thermo Fisher Scientific
Rat-tail collagen coating solution Cell Applications Inc.
Tamoxifen standard Sigma-Aldrich 85256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altschuler, S. J., et al. Cellular heterogeneity: do differences make a difference? Cell. 141, (4), 559-563 (2010).
  2. Ali, A., et al. Single-cell metabolomics by mass spectrometry: Advances, challenges, and future applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. (2019).
  3. Bunnage, M., et al. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9, (4), 195-199 (2013).
  4. Ali, A., et al. Single-Cell Screening of Tamoxifen Abundance and Effect Using Mass Spectrometry and Raman-Spectroscopy. Analytical Chemistry. 91, (4), 2710-2718 (2019).
  5. Wu, H., et al. In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (9), 3809-3814 (2011).
  6. Okada, M., et al. Label-free Raman observation of cytochrome c dynamics during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (1), 28-32 (2012).
  7. Palonpon, A. F., et al. Raman and SERS microscopy for molecular imaging of live cells. Nature Protocols. 8, (4), 677-692 (2013).
  8. Butler, H. J., et al. Using Raman spectroscopy to characterize biological materials. Nature Protocols. 11, (4), 664-687 (2016).
  9. Mark, H., Workman, J. Jr Chemomtrics in Spectroscopy. Second Edition, Academic Press. (2018).
  10. Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra. Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).
  11. Germond, A., et al. Raman spectral signature reflects transcriptomic features of antibiotic resistance in Escherichia coli. Communications Biology. 1, 85 (2018).
  12. Wold, S., et al. Partial Least Squares Projections to Latent Structures (PLS) in Chemistry. Encyclopedia of Computational Chemistry. (2002).
  13. Chong, I. G., Jun, C. H. Performance of some variable selection methods when multicollinearity is present. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 78, (2005).
  14. Inde, Z., Dixon, S. J. The impact of non-genetic heterogeneity on cancer cell death. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53, (1), 99-114 (2018).
  15. Pan, N., et al. The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Analytical chemistry. 86, (19), 9376-9380 (2014).
  16. Rao, W., et al. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), e53911 (2016).
  17. Ali, A., et al. Quantitative Live Single-cell Mass Spectrometry with Spatial Evaluation by Three-Dimensional Holographic and Tomographic Laser Microscopy. Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32, (2), 125-127 (2016).
  18. Abouleila, Y., et al. Live single cell mass spectrometry reveals cancer-specific metabolic profiles of circulating tumor cells. Cancer Science. 110, 697-706 (2018).
  19. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 31, (12), 1215-1217 (2015).
  20. Ryabchykov, O., et al. Fusion of MALDI Spectrometric Imaging and Raman Spectroscopic Data for the Analysis of Biological Samples. Frontiers in Chemistry. 6, 257 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics