En integrert Raman spektroskopi og Mass massespektrometri Platform å studere single-Cell Drug opptak, metabolisme, og effekter

Biochemistry
 

Summary

Denne protokollen presenterer en integrert Raman spektroskopi-Mass massespektrometri (MS) plattform som er i stand til å oppnå enkelt celle oppløsning. Raman spektroskopi kan brukes til å studere cellulær respons på narkotika, mens MS kan brukes til målrettet og kvantitativ analyse av narkotika opptak og metabolisme.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ali, A., Abouleila, Y., Germond, A. An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects. J. Vis. Exp. (155), e60449, doi:10.3791/60449 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Celler er kjent for å være iboende heterogen i sine svar på narkotika. Derfor er det viktig at single-Cell heterogenitet er beregnet for i narkotika funn studier. Dette kan oppnås ved nøyaktig å måle mengde mobilnettet interaksjoner mellom en celle og narkotika på enkelt cellenivå (dvs. narkotika opptak, metabolisme, og effekt). Dette papiret beskriver en enkelt celle Raman spektroskopi og masse massespektrometri (MS) plattform for å overvåke metabolske endringer av celler som svar på narkotika. Ved hjelp av denne plattformen, metabolske endringer i respons til stoffet kan måles ved Raman spektroskopi, mens stoffet og metabolitten kan kvantifisert ved hjelp av masse massespektrometri i samme celle. Resultatene tyder på at det er mulig å få tilgang til informasjon om narkotika opptak, metabolisme og respons på et enkelt cellenivå.

Introduction

Celler reagerer forskjellig på endringer i deres mikromiljøet på enkelt cellenivå, et fenomen som kalles cellulær heterogenitet1. Til tross for dette er dagens funn studier basert på gjennomsnittlige målinger av celle populasjoner, som obfuscate informasjon om potensielle subpopulasjoner i tillegg til enkelt celle variasjoner2. Denne manglende informasjonen kan forklare hvorfor noen celler er mer utsatt for rusmidler, mens andre er motstandsdyktige. Interessant nok er mangelen på enkelt celleinformasjon om narkotika responsen en mulig årsak til svikt i fase II kliniske studier av narkotika3. Derfor, for å løse dette problemet, cellulære interaksjoner med stoffet (dvs. opptak, metabolisme, og respons) må måles på enkelt cellenivå.

For å oppnå dette, har vi designet et unikt system der levende enkeltceller er vist ved hjelp av etikett-fri Raman spektroskopi deretter videre karakterisert ved hjelp av masse massespektrometri4. Raman spektroskopi gir en molekylær fingeravtrykk av mobilnettet tilstand, et komplekst spektrum som følge av bidrag fra mange molekyler inne i cellen. Til tross for denne kompleksiteten, kan det betraktes som Raman fingeravtrykk reflekterer en hel cellestruktur og metabolisme5,6. Raman spektroskopi utmerker seg med å måle cellulære stater i en ikke-invasiv og relativt høy gjennomstrømmings måte, noe som gjør det nyttig for screening og vurdering av narkotika responsen på enkelt cellenivå.

I kontrast gir MS den nødvendige følsomheten og selektivitet for måling av legemiddel opptak på enkelt cellenivå. Siden MS er ødeleggende (prøven [cellen] er vanligvis forbrukes under analyse), integrere den med ikke-destruktiv, etikett-fri Raman spektroskopi kan gi en høy gjennomstrømning og sensitivt system. Denne kombinerte plattformen er i stand til å gi mer informasjon om narkotika opptak, metabolisme og effekter på enkelt cellenivå.

Dette manuskriptet kaster en protokoll som brukes til å studere mobil interaksjon med rusmidler på enkelt cellenivå ved hjelp av in vitro-kulturer ved hjelp av en integrert Raman-MS-plattform. For å gjøre dette, leverkreft celler (HepG2) og Tamoxifen brukes som en modell. HepG2 celler ble valgt fordi de tar opp Tamoxifen og forbrenne stoffet, og de er samtidig påvirket på grunn av sin hepatotoxic effekter. To delstater er brukt i dette manuskriptet: stoff-behandlede celler kontra ikke-behandlede celler (kontroll).

Protocol

1. cellekultur

  1. Kultur celler av interesse i en passende kultur medier. Penicillin-Streptomycin kan tilsettes for å unngå forurensning. I tilfelle av HepG2 celler, kultur celler i en kultur Media som inneholder Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM) supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) og 0,1% penicillin-Streptomycin. For å faciltate Raman spektroskopi målinger, kan celler dyrkes på en 0,1% gelatin-belagt glass-bunn parabol eller kvarts lysbilder.
  2. Ruge celler for 2 dager ved 37 ° c og 5% CO2 i en fuktet inkubator.
  3. Synkroniser cellekulturer for å nå 70% confluency.
  4. Under kultur celler i en 35 mm glass-bunn Grid parabol eller kvarts lysbilder bruker samme medium på en seeding tetthet på 0,7 x 106, deretter ruge ved 37 ° c for 24 h.
    Merk: kultur retter eller lysbilder kan pre-belagt med kollagen eller gelatin belegg løsning med en kultur overflate ratio på 5 UG/cm2 for å tillate dem å fikse, sikre deres overlevelse under måling.

2. behandling av legemidler

  1. Fjern cellekulturer fra inkubator og vask 2x med prewarmed PBS-buffer (37 ° c).
    Merk: det er optimalt å fjerne celler for behandling med en confluency på 50%-60%.
  2. Del celler inn i stoff-behandlede og ubehandlede undergrupper i 35 mm kultur retter.
  3. Bland stoffet av valget med kulturen Media. For eksempel oppløse Tamoxifen i dimethyl sulfoxide (DMSO) og bland med kultur Media for å oppnå et endelig volum på 2 mL og Tamoxifen konsentrasjon på 10 μM. Dette vil være den stoff-behandlede gruppen.
  4. Bland et tilsvarende volum av løsemiddel (DMSO) i mediet som en kontroll for å studere virkningene av DMSO. Dette vil være kontrollgruppen.
  5. Ruge begge gruppene i 2 mL av piggete medier utarbeidet i trinn 2.3-2.4 for 24 h. Forventet confluency etter inkubasjons skal være 70%-80%.

3. Raman Spectral Imaging og Spectral prosessering

Merk: selv om Raman spektroskopi systemer er kommersielt tilgjengelige, er det Raman spektroskopi systemet som brukes her, et hjemmelaget linjeskanning konfokalmikroskopi mikroskop som tidligere er beskrevet7,8. Kort, dette systemet er utstyrt med en 532 nm diode pumpet Solid-State laser. Laser lyset er formet til et fly ved hjelp av en sylindrisk linse, noe som gjør det mulig å måle 400 Spectra i en enkelt eksponering. Raman Spectra ble spilt inn ved hjelp av et avkjølt CCD-kamera montert på en polychromator som bruker en 1 200 spor/mm rist for å maksimere Spectral oppløsning av fingeravtrykk regionen (fra 500-1800 cm-1). Dette Spectral området inneholder en høy tetthet av frekvenser som er spesifikke for molekyler som genererer Raman spredning. En vann-immersionobjective linse (NA = 0,95) brukes også. Den romlige oppløsningen på dette systemet er ~ 300 NM og Spectral oppløsning er 1 cm-1. For å sikre celle overlevelse under eksperimentet, brukes en gassmikrokammeret som er festet på et motorisert mikroskop-trinn.

  1. Før Spectral målinger, kontroller justeringen av optikk. En 50 μm-pinhole kan brukes til å kontrollere at pinhole og laser posisjonen samsvarer nøyaktig. Angi spektrofotometer slit når smalere så mye som mulig.
  2. Bruk etanol til å kalibrere spektrofotometer før hvert eksperiment. For å gjøre dette, plasser EtOH i et glassbunn parabol, måle spekteret ved en gitt laser intensitet (målt ved prøven) for 1 s, og knytte toppen til kjente bølgelengder7.
  3. Minimer laser intensiteten ved prøven til ~ 2,4 mW/μm2 slik at cellene overlever laser eksponering.
  4. Sett opp gassmikrokammeret ved 5% CO2 og 37 ° c.
  5. Når mikroskop systemet er klart, Fjern celler fra inkubator og skyll umiddelbart celler 2x med varmet PBS (37 ° c) buffer, legg deretter til 2 mL varmet PBS (37 ° c) eller DMEM å resuspend cellene.
    Merknader: både PBS og FluoroBrite DMEM-baserte medier er tilstrekkelige alternativer for Raman spektroskopi målinger fordi de produserer et minimalt bakgrunns signal.
  6. Tilsett 10 μL vann på vann-nedsenking objektiv linse og forsiktig plassere glass-bunn cellen parabolen på mikroskopet scenen.
  7. Mål hver celle ved å fokusere laserlinjen. En 15 s eksponeringstid per celle er tilstrekkelig her for å få et tverrsnitt av en celle med et klart Raman signal. Et galvano speil tillater skanning av en celle eller en gruppe celler i løpet av flere dusin minutter.
    Merknader: høyere oppløsning av full Spectral Imaging av celler krever mer tid og kan føre til photoskade. Her ble celler målt ved hjelp av en enkelt linje eksponering for å få et tverrsnitt av hver celle. Denne tilnærmingen er en god trade-off for å øke gjennomstrømningen og få tilstrekkelig informasjon til å diskriminere celler, samtidig som også sikre celle levedyktighet ved å begrense photoskade.

4. forbehandling av Spectral data og multivariabel analyse

Merk: forbehandling er et nødvendig skritt før ytterligere analyse for å fjerne uønskede tekniske variasjoner innenfor Spectral data. På grunn av mangfoldet av metoder og programvare, kan en uttømmende liste ikke gis, og det er mange nyttige vurderinger funnet i litteraturen7,8. I denne delen beskriver vi kort tilnærmingen som brukes til å analysere og tolke Spectral Raman data innhentet fra levende enkeltceller.

  1. Pakk ut og forhåndsbehandle Raman bilder for å fjerne mulig kosmisk stråling.
    Merk: Spectral akse av Spectra innhentet under forskjellige dager/uker/måneder kan inneholde noen variasjoner på grunn av små tekniske variasjoner under kalibrering ved hjelp av etanol. Dette vil sterkt påvirke påfølgende multivariabel analyse og statistiske sammenligninger. Hvis eksperimenter utføres i løpet av ulike uker/måneder, forventes det små optiske variasjoner. I dette tilfellet må data være interpolert for å korrigere for eventuelle Spectral Skift av data på tvers av eksperimenter. Interpolering ved hjelp av Cubic spline brukes her. Etter dette trinnet, bør alle Spectra aksen være justert. Et utvalg på 500-1800 cm-1 er vurdert for påfølgende analyse.
  2. Pakk Spectral data av celler og bakgrunn (fravær av celler) fra hvert bilde ved hjelp av en hjemmelaget algoritme. Trekk bakgrunns signalet fra cellens signal. Deretter gjennomsnittlig Spectra av de resterende piksler, som skal tilsvare en enkelt celle. Følgende trinn utføres ved hjelp av 2D Spectra av celler.
  3. Utfør en grunnlinje korrigering ved hjelp av ModPoly9 eller en annen algoritme som det anslås å passe tilstrekkelig. Trim Spectral området til 600-1700 cm-1 for å velge fingeravtrykk regionen og sikre at det ikke er uønskede kanteffekter på Spectra grunn av dårlig Polynom montering.
  4. Utfør en normalisering trinn som vektor normalisering (intensitet ved hver wavenumber er delt av den globale L2 normen eller maksimal entall verdi av et spektrum) for å normalisere den Spectral intensitet10, selv om andre normalizations kan vurderes.
  5. Klargjør et datasett med riktig etikett for hver klasse/betingelse.
    Merk: sammenlignende Spectral analyser kan perfored å utforske arten av mulige forskjeller mellom celle klasse/forhold (f. eks, ved å trekke den gjennomsnittlige spekteret av kontrollgruppen til andre grupper for å identifisere regioner av interesse [slik som potensielle biomarkører]). ANOVA og Fisher score beregninger kan også utføres10.
  6. For å identifisere behandlede og ubehandlede celler basert på Spectral funksjoner, kan multivariabel analyse anvendes. En normalisert Spectral data bør brukes som et treningsdata sett, og et ukjent datasett (uten etikett) fra et replikere eksperiment bør brukes som test data, hvis mulig.
    Merk: discriminant analyse utført på noen vektor av en rektor komponent analyse (PCA-DA10), projeksjon på latente score etterfulgt av discriminant analyse (pls-da), og støtte vektor maskiner (SVM)11 er modeller ofte brukt i feltet, og hver presenterer ulike statistiske hensyn. Forbehandling av data bør utføres følgelig.
  7. Bruk maskinlæring som passer til de eksperimentelle målene. Her bygges en projeksjon på latent struktur (PLS)-modell ved hjelp av Spectral fingerprint-området til Raman Spectra (600-1710 cm-1)11,12. Mean-Center dataene etter behov. For kryss validering av modellen, kan ulike teknikker brukes.
    Merk: her brukes en venetiansk blind kryss validering med 10 delinger. Modellen kompleksitet (antall komponenter eller latent variabel) bør testes slik at den beste modellen minimerer roten bety kvadrat feil (RMS) verdi. Det ble funnet at tre latente vektorer (LVs) gitt den beste diskriminering med datasettet vårt.
  8. Identifiser hvilke Raman Spectral topper som bidrar til diskriminering av cellene (f.eks. ved å plotte poengsummen for variabel viktighet i projeksjon [VIP] for hver Raman-wavenumber eller størrelsen på regresjon).
    Merknader: VIP-poengsum for en variabel beregnes som en vektet sum av de kvadrerte sammenhenger mellom PLS-DA komponenter og opprinnelige variabelen. Detaljer om pls og VIP score algoritme kan bli funnet i litteraturen11,12.

5. enkelt celle prøvetaking oppsett og prosedyrer

  1. Fest celleprøve systemet på Raman-mikroskopet som vist i figur 1. Koble 3D-micromanipulator til glass kapillær holde ren som er festet til en tom sprøyte for prøve suging ved å påføre negativt trykk (figur 1).
  2. Sett mikroskopet til et høyt forstørrelses felt (40x) for å observere tuppen av glass kapillær og sørge for at den ikke er ødelagt. Kontroller plasseringen av glass kapillær ved hjelp av micromanipulator (x-, y-, z-akser). Sørg for at kapillær spissen er sentrert i synsfeltet, og flytt deretter kapillær opp på z-aksen for å gi klarering for kultur parabolen senere.
    Merk: Microsampling av cellene utføres av glass kapillær for celler med diameter mellom 10-15 μm. En kapillær med en bore størrelse på ~ 5 μm anbefales. Hvis bore størrelsen er for liten, vil kapillær spissen bli plugget av cellen, og hvis den er for stor, kan følsomheten til senere MS-målinger bli kompromittert.
  3. Plasser prøveplaten/-parabolen på scenen i mikroskopet, Juster forstørrelsen og fokuser, Velg målcellen i rutenett fatet, og Flytt den inn i midten av visningen. Deretter forsiktig senke ned glass kapillær med micromanipulator (z-aksen) til spissen kommer i fokus.
    Merk: Pass på at du ikke flytter kapillær i x-og y-aksene til kapillær er i fokus.
  4. Under mikroskopisk observasjon berører du målet enkelt celle med kapillær spissen, deretter begynner du å bruke negativt trykk ved hjelp av sprøyten for å felle cellen inne i kapillær spissen. Ta opp denne prosedyren ved å ta et bilde eller en video for å sjekke timingen og sugd plasseringen av cellen presist, om nødvendig.
  5. Flytt kapillær opp på z-aksen. Deretter løsner kapillær fra kapillær holderen ved hjelp av tang i forberedelsene til MS analyse.

6. masse massespektrometri målinger

  1. Kalibrer masse nøyaktigheten til MS-instrumentet i henhold til produsentens anbefalinger. Etter kalibrering må du kontrollere at masse feilen ikke er større enn 3 ppm.
  2. Optimaliser MS-instrumentet til parametere som er best egnet for analytt av interesse.
    Merk: når det gjelder Tamoxifen og 4-OHT analyse, er instrumentets parametre satt til følgende: innløps kapillær temperatur: 400 ° c, sprøyte spenning: 1500 V, automatisk forsterknings mål (AGC): 5.00 E + 06, S-objektiv RF-nivå: 90%, SIM-område: 347-397 m/z, SIM maksimal injeksjon tid: 200 MS, SIM oppløsning: 140 000 FWHM, MS/MS Range: 50-400 m/z, MS/MS AGC mål: 2.00 E + 05, MS/MS maksimal injeksjon tid: 100 MS, MS/MS oppløsning: 17 500 FWHM, MS/MS isolasjon vindu: 1 m/z, MS/MS normalisert kollisjon energi (NCE): 35.
  3. Sett opp en automatisk oppkjøps metode med en varighet på 5 min for SIM-modus for å oppnå relative kvantifisering, og en annen MS/MS metode for positiv identifisering av stoffet og dets metabolitten. Parameterne for anskaffelsesmetoden bør settes til de optimaliserte verdiene som er nevnt i trinn 6,2.
  4. Klargjør ionisering løsemiddel under en avtrekksvifte. Løsningsmiddelet sammensetning avhenger av analytt av interesse. Her består den organiske løsemiddel som brukes av 80% MeOH, 10% DMSO, og 0,1% maursyre syre.
  5. Bland en hensiktsmessig intern standard med det organiske oppløsningsmidlet før målinger. I dette eksperimentet brukes 5,31 nM i D5-Tamoxifen som en intern standard.
  6. For å unngå falske positiver, aspirer mediene rundt cellene behandlet med stoffet ved hjelp av en 1 μm bore størrelse kapillær med konstant mikroskopisk observasjon for å unngå prøvetaking noen cellulære deler.
  7. Tilsett 2 μL av ionisering løsemiddel til den brede enden av kapillær som inneholder Media ved hjelp av en pipette festet til loader tips. Deretter analysere samplet Media ved MS, sjekk for tilstedeværelsen av analytt av interesse (normalt, bør det ikke være synlig).
  8. Tilsett 2 μL ionisering løsemiddel til kapillær inneholder cellen, fikse kapillær til en nanoelectrospray adapter (nano-ESI) koblet til en egnet masse spektrometer, og starte den automatiske oppkjøpet metoden.

7. masse massespektrometri databehandling og analyse

Merk: all egnet programvare kan brukes til å utføre dataanalyse. Men hvis forskerne ønsker å utføre dataanalyse ved hjelp av en programvare som ikke er levert av MS leverandøren, og rådata skal konverteres fra proprietære leverandør format til et åpent format eller som en tekstfil først (som ble gjort her).

  1. Normalisere dataene ved å dele topp området for analytt av interesse (er) av den interne standarden fra samme MS-skanning. Deretter logger du transformere topp forholdene for å redusere skjev fordeling.
  2. Plot normalisert intensiteten av stoffet eller dets metabolitten som en boxplot eller tetthet kurve for å visualisere distribusjon over enkeltceller. Her brukes R statistisk programvare, sammen med ggplot2-pakken.
  3. Beregn metaboliseres stoffet til unmetabolized narkotika ratio ved å dele overflod av stoffet metabolitten av at av unmetabolized forelder molekyl i hver celle (dvs. 4-OHT og Tamoxifen, henholdsvis.
    Merk: sammenhengen mellom variasjoner av bestemte Raman topper av interesse og variasjoner i MS topper av stoffet eller dets metabolitter kan bli studert. Dette er et tillegg til den mulige sammenhengen mellom stoffet i seg selv og metabolitten i enkeltceller. Dette kan gjøres ved å beregne korrelasjonskoeffisienten ved hjelp av en tosidig test. Mer avansert integrerende tilnærminger bør også vurderes.

Representative Results

Single-celle analyse av legemiddelinteraksjoner (opptak, metabolisme, og effekter) er avgjørende for å avdekke eventuelle skjulte eller stoff-resistente pasientpopulasjonen samt forstå virkningene av cellulære heterogenitet. I denne protokollen, to komplementære teknikker ble brukt til å måle de nevnte interaksjoner i enkeltceller: Raman spektroskopi og MS. Raman massespektrometri raskt identifiserer celler rammet av narkotika basert på Spectral biomarkører av stoffet respons. MS brukes til å overvåke opptaket og metabolismen av stoffet i en selektiv og semi-kvantitativ måte. Celler ble først vist av Raman spektroskopi deretter individuelt samplet for analyse av MS.

En komparativ analyse av gjennomsnittlig spektrum for hver tilstand (med og uten legemiddelbehandling) er vist i figur 2. Den gjennomsnittlige spekteret av de to forholdene klart forskjellig på ulike topper, som tidligere ble identifisert og tildelt molekylære forbindelser2. Spesielt, toppene på 1000 cm- (tildelt aromatiske forbindelser som fenylalanin og tyrosin) viser sterke forskjeller. Betydningen av den statistiske forskjellen bør vurderes ved ytterligere multivariabel analyse.

Datasettet ble deretter brukt til å trene en PLS-modell (trinn 4.5-4.8) som mål å skille de to celle behandlinger (med narkotika: n = 290, uten rusmiddel: n = 115). Den prediktiv evne til å klassifisere cellene kultivert i nærvær av Tamoxifen nådde 100% følsomhet og 72% spesifisitet i test data (ukjent fra kryss-validert utdannet modell). Følsomhet er et mål på den sanne positive som er riktig identifisert av modellen, mens spesifisitet er et mål på de faktiske negativer som er identifisert av modellen. Alternative modeller som SVMs, LDAs, og nevrale nettverk kan gi lignende eller bedre resultater, selv om en omfattende sammenligning ikke har blitt utført i denne studien.

Basert på PLS-modellen ble VIP-resultatene beregnet, noe som representerer viktigheten av bølgelengder (Raman-Skift) i diskriminerende eksperimentelle forhold (Figur 3). Viktigst, de høyeste toppene av VIP profiler tilsvarte Raman topper som sterke forskjeller ble sett mellom de to behandlingene. Dette bekreftet de konkrete molekylære forskjellene mellom behandlede og ubehandlede celler. Følgelig kan forskerne identifisere mulige Spectral biomarkører som reflekterer responsen til enkeltceller til behandling av legemidler. Disse biomarkører kan testes ytterligere for å verifisere deres biologiske relevans og generalisering på tvers av ulike forhold og cellelinjer.

Et live single-Cell Mass massespektrometri (LSC-MS) systemet var i stand til å oppdage både stoffet og dets metabolitter i enkelt, stoff-behandlet HepG2 celler som tidligere ble målt ved Raman spektroskopi. I tillegg kan tandem MS brukes til å bekrefte strukturen til begge molekylene. Etter positiv identifisering ble den relative overflod av stoffet og dets metabolitter målt i hver celle og sammenlignet med bakgrunn topper i ubehandlede celler. Sterk variasjon ble observert i Tamoxifen overflod, og dette fenomenet var enda mer uttalt i tilfelle av sin metabolitten, 4-OHT (Figur 4). Forholdet mellom Tamoxifen overflod og dets metabolitter ble også studert, der en signifikant positiv korrelasjon ble funnet mellom de to (r = 0,54, p = 0,0001, n = 31).

Figure 1
Figur 1: celle Plukk system montert på et mikroskop stadium. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: gjennomsnitts spekteret av narkotika behandlede celler (med Tamoxifen: n = 295) og ubehandlede celler (uten Tamoxifen: n = 115). Raman topper kan identifiseres fra litteraturen. De fleste av de sterke Spectral forskjellene er statistisk signifikante (ANOVA, p ≤ 0,5) som beskrevet tidligere4. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: VIP-resultater Hentet fra PREDIKTIV pls-modellen. VIP-resultater reflekterer bølgelengdene som bidrar til å skille mellom de to klassene i modellen. De fleste av toppene tilsvarer spesifikke molekyler som er observert som Spectral biomarkører av narkotika effekter på stoff-behandlede celler. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: fordeling av Tamoxifen overflod og metabolitten. Fordeling av Tamoxifen overflod og metabolitten, 4-OHT (målt på single-cellenivå) i forhold til endogene topper i ubehandlet celler (kontroll). Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I dette manuskriptet ble det valgt en enkel sak der HepG2-celler ble eksponert (eller ikke) til Tamoxifen. Muligheten for en Raman spektroskopi og masse massespektrometri systemet er demonstrert for å overvåke virkningene av Tamoxifen på celler. Raman spektroskopi tillot identifisering av potensielle biomarkører som reflekterte en generell respons av enkeltceller til legemiddel eksponering. Noen heterogenitet mellom enkeltceller ble observert, noe som tyder på at noen celler ikke reagerte på narkotika eksponering. På den annen side, LSC-MS var i stand til å utføre en målrettet analyse av stoffet og metabolitten på enkelt cellenivå, der en høy grad av heterogenitet ble observert i stoffet og dets metabolitten overflod. Dette heterogenitet bidrar til å forklare hvorfor noen celler påvirkes av stoffet, mens andre er tilsynelatende ikke, til tross for cellene som stammer fra en angivelig uniform befolkning12.

Blant spesielle aspekter av denne teknikken som krever oppmerksomhet, er det viktig å evaluere kvaliteten på mikroskop oppsettet og signal behandlingen for å sikre reproduserbarhet av dataene. Hvis forbehandling av Spectra gjøres forsiktig, bør signalet variasjoner maksimeres på lokalt maksimum for hver topp. I motsetning bør grunnlinjen og kanten av Spectra overlappe mellom de testede celle forholdene. Et annet viktig aspekt er multivariabel modell som brukes til å undersøke forskjellene mellom behandlingene. Man må nøye evaluere modeller og modell parametre for å sikre en presis og nøyaktig analyse. En fordel med PLS-modellen, i motsetning til nevrale nettverk, er at det gir tilgang til vekter knyttet til hver bølgelengde (Raman Skift) som best skiller forholdene testet av modellen.

Til tross for Raman spektroskopi vellykket diskriminerende stoffet respons, bør det understrekes at denne teknikken er begrenset i bruk for å gi biologisk tolkning. Dette skyldes i hovedsak kompleksiteten til Spectral signalet, som omfatter en blanding av tusenvis av molekyler. Det er derfor nødvendig med ytterligere undersøkelser for å evaluere systematiske variasjoner mellom Raman Spectral intensitet og variasjoner i konsentrasjonen av legemidlet. Også, lignende studier av andre cellelinjer er nødvendig for å evaluere generalisering av Spectral biomarkører forbundet med Tamoxifen.

Videre kan det være av interesse å utføre levende vev målinger for å vurdere farmakodynamikk og studere hvordan narkotika trenge inn og flyte i hver celle. Videre bør det bemerkes at prøvetaking trinnet i LSC-MS er svært avhengig av dyktighet av operatøren. Parametre som romlig oppløsning, celle posisjon inne i kapillær etter prøvetaking, og gjennomstrømning styrke er helt operatøravhengig, som begrenser stor skala adopsjon av LSC-MS. Selv om automatiserte sampling systemer kan lindre dette problemet. Videre, mens LSC-MS utmerker seg på prøvetaking tilhenger eller flytende celler i deres opprinnelige stater, det utfører mer dårlig i prøvetaking celler innebygd i vev seksjoner. Dette skyldes prøvetaking kapillær spissen tendens til å bryte hvis prøven tettheten er høy. Derfor kan en annen tilnærming som single-sonde være mer egnet i slike tilfeller14,15.

Siden cellene som brukes her er samplet i omgivelsesforhold med minimal prøve forberedelser, kan LSC-MS enkelt integreres med andre teknologier, som vist ved sin integrasjon med Raman i denne protokollen. En annen lignende integrasjon med 3D-holography har gjort det mulig å oppnå absolutt kvantifisering av cellulære metabolitter på subcellulære nivå16. I tillegg har integrasjon med Flow flowcytometri tillatt for avdekke metabolske biomarkører i enkelt sirkulerende tumorceller av neuroblastom kreftpasienter17,18.

I fremtiden, på grunn av nylige økende interesse i å kombinere datasett fra Imaging modaliteter19, kan det også være av interesse å studere systematiske variasjoner mellom Raman signaler og masse massespektrometri resultater (så vel som andre omics metoder) ved hjelp av integrerende beregningsorientert tilnærminger. Interessant, har vi allerede funnet flere svake, men betydelige lineære sammenhenger mellom intensiteten av Raman topper identifisert av VIP score og overflod av Tamoxifen eller metabolitten på single-cellenivå som identifiseres av MS4. Disse dataene kan tyde på et metabolsk forhold mellom MS-profiler og Raman Spectra og muligheten til å forutsi disse verdiene.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne takker Toshio Yanagida for hans støtte og RIKEN interne samarbeidende midler tilskrives Dr. Arno Germond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% penicillin-streptomycin Nacalai Tesque 09367-34
35mm glass bottom grid dish Matsunami
4-Hydroxy Tamoxifen standard Sigma-Aldrich 94873
532 nm diode pumped solid-state laser Ventus, Laser Quantum
BIOS-L101T-S motorized microscope stage OptoSigma
CT-2 cellomics coated sampling capillaries HUMANIX
d5-Tamoxifen standard Cambridge Isotope Laboratories
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade Nacalai Tesque D8418
Dulbecco's Modified Eagle's medium Sigma-Aldrich D5796
Eppendorf GELoader tips Eppendorf
fetal bovine serum Hyclone laboratories SH3006603
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher Scientific
Formic acid LC-MS grade Sigma-Aldrich 33015
HepG2 cell line (RCB1886) RIKEN cell bank center RCB1886
MC0-19A1C Incubator Sanyo Electric Co. MC0-19A1C
Methanol LC-MS grade Sigma-Aldrich 1060352500
MMO-203 3-D Micromanipulator Narshige MMO-203
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens Olympus
Nanoflex nano-ESI adaptor Thermo Fisher Scientific ES071
On-stage incubator ibidi
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution Thermo Fisher Scientific 88323
PIXIS BR400 cooled CCD camera Princeton Instruments
Q-Exactive Orbitrap Thermo Fisher Scientific
Rat-tail collagen coating solution Cell Applications Inc.
Tamoxifen standard Sigma-Aldrich 85256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altschuler, S. J., et al. Cellular heterogeneity: do differences make a difference? Cell. 141, (4), 559-563 (2010).
  2. Ali, A., et al. Single-cell metabolomics by mass spectrometry: Advances, challenges, and future applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. (2019).
  3. Bunnage, M., et al. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9, (4), 195-199 (2013).
  4. Ali, A., et al. Single-Cell Screening of Tamoxifen Abundance and Effect Using Mass Spectrometry and Raman-Spectroscopy. Analytical Chemistry. 91, (4), 2710-2718 (2019).
  5. Wu, H., et al. In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (9), 3809-3814 (2011).
  6. Okada, M., et al. Label-free Raman observation of cytochrome c dynamics during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (1), 28-32 (2012).
  7. Palonpon, A. F., et al. Raman and SERS microscopy for molecular imaging of live cells. Nature Protocols. 8, (4), 677-692 (2013).
  8. Butler, H. J., et al. Using Raman spectroscopy to characterize biological materials. Nature Protocols. 11, (4), 664-687 (2016).
  9. Mark, H., Workman, J. Jr Chemomtrics in Spectroscopy. Second Edition, Academic Press. (2018).
  10. Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra. Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).
  11. Germond, A., et al. Raman spectral signature reflects transcriptomic features of antibiotic resistance in Escherichia coli. Communications Biology. 1, 85 (2018).
  12. Wold, S., et al. Partial Least Squares Projections to Latent Structures (PLS) in Chemistry. Encyclopedia of Computational Chemistry. (2002).
  13. Chong, I. G., Jun, C. H. Performance of some variable selection methods when multicollinearity is present. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 78, (2005).
  14. Inde, Z., Dixon, S. J. The impact of non-genetic heterogeneity on cancer cell death. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53, (1), 99-114 (2018).
  15. Pan, N., et al. The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Analytical chemistry. 86, (19), 9376-9380 (2014).
  16. Rao, W., et al. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), e53911 (2016).
  17. Ali, A., et al. Quantitative Live Single-cell Mass Spectrometry with Spatial Evaluation by Three-Dimensional Holographic and Tomographic Laser Microscopy. Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32, (2), 125-127 (2016).
  18. Abouleila, Y., et al. Live single cell mass spectrometry reveals cancer-specific metabolic profiles of circulating tumor cells. Cancer Science. 110, 697-706 (2018).
  19. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 31, (12), 1215-1217 (2015).
  20. Ryabchykov, O., et al. Fusion of MALDI Spectrometric Imaging and Raman Spectroscopic Data for the Analysis of Biological Samples. Frontiers in Chemistry. 6, 257 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics