पारगम्य झिल्ली समर्थन के साथ सह संस्कृति का उपयोग कर मैक्रोफेज सक्रियण पर ट्यूमर स्रावित पैराक्रिन लिगांड्स के प्रभाव का अध्ययन

Cancer Research

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Summary

यहां, हम प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दबाने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा उपयोग किए जाने वाले गैर-संपर्क पैराक्रिन सिग्नलिंग के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए पारगम्य झिल्ली का उपयोग करके एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह प्रणाली मैक्रोफेज सक्रियण को गीला करने में ट्यूमर-स्रावित कारकों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी है।

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Pittman, K., Earp, S., Ubil, E. Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports. J. Vis. Exp. (153), e60453, doi:10.3791/60453 (2019).

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Abstract

ट्यूमर-व्युत्पन्न पैराक्रिन सिग्नलिंग स्थानीय इम्यूनोसप्रेसिंग का एक अनदेखा घटक है और निरंतर कैंसर के विकास और मेटाटैसिस के लिए एक स्वतंत्र वातावरण का कारण बन सकता है। पैराक्रिन संकेतों में विभिन्न सेल प्रकारों के बीच सेल-सेल संपर्क शामिल हो सकता है, जैसे कि टी कोशिकाओं की सतह पर पीडी-1 के साथ सीधे बातचीत करने वाले ट्यूमर की सतह पर व्यक्त किए गए ट्यूमर की सतह पर व्यक्त किया जाता है, या प्रतिरक्षा कोशिका को प्रभावित करने के लिए ट्यूमर सेल द्वारा लिगांड का स्राव होता है। यहां हम प्रतिरक्षा कोशिका (मैक्रोफेज) सक्रियण पर ट्यूमर-स्रावित लिगांड के प्रभावों से पूछताछ करने के लिए एक सह-संस्कृति विधि का वर्णन करते हैं। यह सीधी प्रक्रिया व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 0.4 माइक्रोन पॉलीकार्बोनेट झिल्ली परगम्य समर्थन और मानक ऊतक संस्कृति प्लेटों का उपयोग करती है। वर्णित प्रक्रिया में, मैक्रोफेज ऊपरी कक्ष और निचले कक्ष में ट्यूमर कोशिकाओं में सुसंस्कृत हैं। 0.4 माइक्रोन बाधा की उपस्थिति शारीरिक संपर्क के जटिल चर के बिना इंटरकोशियलर सिग्नलिंग के अध्ययन के लिए अनुमति देती है, क्योंकि दो सेल प्रकार एक ही माध्यम और पैराक्रिन लिगांड के संपर्क को साझा करते हैं। इस दृष्टिकोण को दूसरों के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे मैक्रोफेज के आनुवंशिक परिवर्तन (उदाहरण के लिए, आनुवंशिक नॉक-आउट चूहों से अलगाव) या ट्यूमर (जैसे, CRISPR-मध्यस्थता परिवर्तन) विशिष्ट स्रावित कारकों और रिसेप्टर्स की भूमिका का अध्ययन करने के लिए। यह दृष्टिकोण दो सेल आबादी को अलग करने के लिए प्रवाह छंटाई की आवश्यकता के बिना, मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) या पश्चिमी दाग विश्लेषण जैसे मानक आणविक जैविक विश्लेषणों को भी उधार देता है। एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (ELISAs) इसी तरह कई सेल प्रकार के संदर्भ में सेल सिग्नलिंग की गतिशील बातचीत को बेहतर ढंग से समझने के लिए स्रावित लिगांड को मापने के लिए उपयोग किया जा सकता है। सह-संस्कृति की अवधि को अस्थायी विनियमित घटनाओं के अध्ययन के लिए भी विविध किया जा सकता है। यह सह-संस्कृति विधि एक मजबूत उपकरण है जो प्रतिरक्षा संदर्भ में ट्यूमर-स्रावित संकेतों के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है।

Introduction

हाल के अध्ययनों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा पता लगाने से बचने के लिए कैंसर कोशिकाओं की क्षमता पर ध्यान केंद्रित किया है, स्थानीय प्रतिरक्षा सक्रियण को दबाने, या ट्यूमर माइक्रोवातावरण में एक सहरोगी ट्यूमर-स्वतंत्र परिवेश का उत्पादन करने के लिए । ट्यूमर और प्रतिरक्षा कोशिका बातचीत के दो व्यापक वर्गों का वर्णन किया गया है कि इन प्रभावों की सुविधा: संपर्क मध्यस्थता बातचीत या ट्यूमर स्रावित ligands । ट्यूमर द्वारा उपयोग किए जाने वाले संपर्क-मध्यस्थता प्रतिरक्षा अवरोध के सबसे अच्छी तरह से अध्ययन और चिकित्सकीय पथन्तर तंत्रमें से एक पीडी-एल 1 की अभिव्यक्ति है, जो टी कोशिकाओं पर पीडी-1 के साथ उनकी सक्रियता और कार्य1,2को बाधित करने के लिए बातचीत करता है। इंटरफेरॉन-गामा (IFNο) के जवाब में, जो कई सक्रिय प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किया जाता है, ट्यूमर कोशिकाएं पीडी-एल1 की अभिव्यक्ति को बढ़ा सकती हैं ताकि पीडी-1 की थकावट को प्रेरित किया जा सके-सक्रिय टी कोशिकाओं को व्यक्त करना, जिससे उन्हें ट्यूमर कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से समाप्त करने से रोका जा सके3। पीडी-एल1 और पीडी-1 के बीच बातचीत को अवरुद्ध करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग वर्तमान में मनुष्यों में कई कैंसर प्रकारों के इलाज के लिए किया जाता है4। इस नैदानिक सफलता और दूसरों के प्रकाश में, ट्यूमर-व्युत्पन्न इम्यूनोसप्रेसिव तंत्र की पहचान और लक्ष्यीकरण पर ध्यान दिया गया है।

अनुकूली प्रतिरक्षा के दमन से परे, ट्यूमर भी कारकों है कि सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को दबाने स्राव करने के लिए जाना जाता है । ट्यूमर-6, आईएल-10, VEGF, आईएल-23, और कॉलोनी उत्तेजक कारक (सीएसएफ-1) सहित ट्यूमर-व्युत्पन्न या ट्यूमर प्रेरित स्राव, प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं, ग्रैन्युलोसाइट्स, और ट्यूमर माइक्रोएनवातावरण5,6,7में डेंग्ड्रिटिक कोशिकाओं के एंटीट्यूमर प्रतिक्रियाओं को बाधित करने के लिए दिखाया गया है । ट्यूमर कोशिकाएं उन कारकों को भी स्रावित कर सकती हैं जो टी सेल सक्रियण8,9के दमन को बढ़ावा देने के लिए ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में माइलॉयड-व्युत्पन्न कोशिकाओं की भर्ती और भेदभाव को तिरछा करते हैं।

जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका का एक प्रकार है कि ट्यूमर प्रगति पर गहरा प्रभाव पड़ता है मैक्रोफेज है । कई वर्षों के लिए, ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs) की उपस्थिति रोगी अस्तित्व10के एक नकारात्मक शकुन के रूप में इस्तेमाल किया गया है । यह अवधारणा जो इम्यूनोसप्रेसिव टीएएमएस ट्यूमर की प्रतिरक्षा कोशिका-मध्यस्थता निकासी को गीला करती है, उसे 40 साल पहले11से अधिक समय पहले पेश किया गया था। हाल ही में, यह दिखाया गया है कि मैक्रोफेज समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया को डाउनरेकेश किया जा सकता है जबकि ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में ट्यूमर फेनोटाइप समर्थक को प्रेरित किया जा सकता है। ये इम्यूनोप्रेसिव मैक्रोफेज एक सहरोग्य प्रतिक्रिया में योगदान कर सकते हैं, ट्यूमर प्रगति और कीमो के प्रतिरोध ड्राइविंग-और इम्यूनोथेरेपी12। यह देखते हुए कि मैक्रोफेज अक्सर ट्यूमर के साथ सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स में से एक होते हैं, उनके ट्यूमर-विशिष्ट प्रतिरक्षा गतिविधि की बहाली कैंसर विरोधी चिकित्साविज्ञान 13के लिए संभावित लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करती है।

जबकि ट्यूमर कोशिकाओं और मैक्रोफेज के बीच संपर्क-मध्यस्थता बातचीत प्रत्यक्ष सहसंस्कृति के माध्यम से मॉडलिंग की जा सकती है, permeable झिल्ली का उपयोग करता है स्पष्ट कर सकते है जो ट्यूमर स्रावित कारक ट्यूमर के संभावित भ्रामक प्रभाव के बिना इम्यूनोमोडुलेटरी-प्रतिरक्षा सेल सेल संपर्क कर रहे हैं । कुछ इसी तरह के तरीकों का उपयोग करना, दूसरों माइक्रोग्लिया में स्रावित कारकों की पहचान करने की क्षमताका प्रदर्शन किया है/ हमने एलपीएस और इंटरफेरॉन-गामा16के साथ पेरिटोनियल मैक्रोफेज की उत्तेजना के बाद एक ट्यूमर-स्रावित प्रोटीन, प्रो1 की भूमिका को चित्रित करने के लिए इस सह-संस्कृति तकनीक का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। यहां हम एक सीधी पद्धति का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग यह पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है कि ट्यूमर-स्रावित कारक मैक्रोफेज सक्रियण को कैसे प्रभावित कर सकते हैं।

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Protocol

फसल और मूत्र पेरिटोनियल मैक्रोफेज के उपयोग से संबंधित सभी प्रक्रियाओं चैपल हिल (यूएनसी) में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में आयोजित किया गया था और यूएनसी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. मैक्रोफेज संस्कृति

नोट: यह प्रक्रिया प्राथमिक पेरिटोनियल मैक्रोफेज (नीचे विस्तार से वर्णित), बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज, या मैक्रोफेज सेल लाइनजैसे J774 (ATCC) या RAW264 (ATCC) का उपयोग कर सकती है।

  1. फसल पेरिटोनियल मैक्रोफेज जैसा कि पहलेवर्णित 16,17 और प्लेट सीधे 0.4 माइक्रोन पॉलिएस्टर झिल्ली के ऊपरी कक्ष (एस) में सह-संस्कृति 6 अच्छी प्लेट(चित्रा 1A)डालें।
    नोट: प्रत्येक अलगाव से मैक्रोफेज की अनुमानित उपज कुल 1 x 106 कोशिकाएं हैं, इसलिए प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की औसत संख्या ~ 1.5-1.6 x 105 कोशिकाएं 6 अच्छी प्लेट में हैं।
  2. संस्कृति डल्बेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) /एफ12, 10% फेटल बोवाइन सीरम (एफबीएस), 1x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, 20 एनजी/एमएल मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) में 3 दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2में काटा मैक्रोफेज ।
    नोट: ऊपरी कक्ष में संस्कृति माध्यम का 1 मिलील होता है जबकि निचले कक्ष 1.5 मिलील से भरा होता है। माध्यम प्रत्येक कक्ष में जोड़ा जाना चाहिए।

2. मैक्रोफेज के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की सहसंस्कृति

  1. उपयोग करने से पहले, एटीसीसी-अनुशंसित ऊतक संस्कृति विधियों के बाद अपने संबंधित माध्यम में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्यूमर कोशिकाओं की संस्कृति।
  2. फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) के साथ एक बार अनुयायी ट्यूमर कोशिकाओं को धोएं, 0.05% ट्राइप्सिन + एथिलीनडायमाइनेटेट्राएटिक एसिड (EDTA) जोड़ें, और कोशिकाओं को अलग होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। मध्यम युक्त एफबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, हीमोसाइटोमीटर या सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करें, और फिर 220 x ग्राम से पैलेट पर 5 मिन के लिए अपकेंद्री।
  3. केंद्रीकरण के दौरान, मैक्रोफेज युक्त प्रतिकार झिल्ली समर्थन प्लेटों के ऊपरी और निचले कक्षों से माध्यम को एस्पिरेट करें और ताजा माध्यम से प्रतिस्थापित करें।
    1. निचले कक्षों के लिए जहां ट्यूमर कोशिकाओं चढ़ाया जाएगा, 1.5 मिलील के बजाय मध्यम के 1 mL के साथ भरने के लिए सेल के अलावा के लिए पर्याप्त मात्रा के लिए अनुमति देते हैं ।
  4. पैलेट ट्यूमर कोशिकाओं से एस्पिरेट माध्यम और 10% एफबीएस, 1x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डीएमईएम/F12 में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करना, और 3 x 105 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता पर 20 एनजी/एमएम-सीएसएफ ।
  5. वांछित कुओं के निचले कक्ष में 3 x 105 कोशिकाओं/mL ट्यूमर कोशिकाओं के 0.5 mL जोड़ें(चित्रा 1B)।
    नोट: कोशिकाओं को तुरंत इलाज किया जा सकता है।

3. सह-संस्कारित कोशिकाओं का उपचार

  1. मैक्रोफेज प्रो-भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, १०० एनजी/एमएल IFNο और ५० एनजी/mL एलपीएस जोड़कर singly या सह-संस्कारी मैक्रोफेज का इलाज करें ।
    1. जरूरत के अनुसार संस्कृति में उपचार के समय की अवधि भिन्न करें। मैक्रोफेज सक्रियण 2 घंटे के भीतर होता है और कुछ ट्यूमर-मध्यस्थता दमन 24 घंटे के लिए 8 घंटे सह संस्कृति द्वारा होता है मजबूत और लगातार ट्यूमर व्युत्पन्न दमन पैदावार ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, मैक्रोफेज को इंटरल्यूकिन-10 (आईएल10) जैसे कारकों के अलावा, और ट्यूमर-स्रावित लिगांड मूल्यांकन के प्रभाव के माध्यम से एक समर्थक घाव भरने वाले फेनोटाइप को अपनाने के लिए प्रेरित किया जा सकता है।
  2. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, संस्कृति मैक्रोफेज को अकेला और अनुपचारित छोड़ देते हैं। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, १०० एनजी/mL IFNο और ५० एनजी/mL एलपीएस के साथ singly सुसंस्कृत मैक्रोफेज का इलाज ।

4. सह-संस्कारी कोशिकाओं का डाउनस्ट्रीम विश्लेषण

  1. वांछित ऊष्मायन समय बीत जाने के बाद, परीक्षण की जरूरतों के आधार पर, वांछित के रूप में सेल लाइसेट या वातानुकूलित संस्कृति माध्यम को अलग करें।
  2. मात्रात्मक बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (क्यूपीसीआर) विश्लेषण के लिए सेल लाइसेट को अलग करने के लिए, मीडिया को कुएं के दोनों कक्षों से निकालें और पीबीएस के 2 मिलील के साथ एक बार धोएं। मैक्रोफेज वाले शीर्ष कक्ष में आरएनए लाइसेस बफर लागू करें। धीरे-धीरे कोशिका को छोड़ने के लिए झिल्ली को कुरेदना, और आरएनए आइसोलेशन किट निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आगे की प्रसंस्करण के लिए एक संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें।

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Representative Results

मैक्रोफेज ध्रुवीकरण पर ट्यूमर-स्रावित लिगांड के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, वर्णित प्रक्रिया का उपयोग किया गया था। ट्यूमर कोशिकाओं की अनुपस्थिति में सुसंस्कृत पेरिटोनियल मैक्रोफेज का उपयोग नकारात्मक (अनुपचारित = अब तक बाएं) और सकारात्मक (IFNο और एलपीएस उत्तेजित = 2nd बाएं) नियंत्रण(चित्रा 2A)के रूप में किया जाता था। वैकल्पिक रूप से, पेरिटोनियल मैक्रोफेज को B16F10 मेलानोमा ट्यूमर कोशिकाओं (एटीसीसी)(चित्रा 1A)के साथ सह-संस्कारी किया गया था। चढ़ाना के तुरंत बाद, कोशिकाओं को या तो IFNο और एलपीएस के साथ इलाज किया गया या अनुपचारित छोड़ दिया गया । संस्कृति के 24 घंटे के बाद, मैक्रोफेज काटा गया, आरएनए तैयार किया गया, और क्यूआरटी-पीसीआर ने समर्थक भड़काऊ जीन की अभिव्यक्ति को मापने के लिए प्रदर्शन किया। यहां वर्णित सह-संस्कृति प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम बताते हैं कि B16F10 ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति में पेरिटोनियल मैक्रोफेज सह-संस्कारी है, लेकिन उत्तेजनाओं (एलपीएस + IFNο) को सक्रिय किए बिना, समर्थक भड़काऊ-संबद्ध जीन(चित्रा 2ए,B16F10 झिल्ली/अनुपचारित) की अभिव्यक्ति में वृद्धि नहीं हुई। इसका मतलब यह है कि ट्यूमर स्रावित लिगांड 1) प्रो-भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति या 2 को प्रेरित करने के लिए खुद से पर्याप्त नहीं हैं) यदि ट्यूमर स्राव द्वारा प्रतिरक्षा सक्रियण है, तो पैराक्रिन लिगांड इसे भोले के स्तर तक दबाने के लिए पर्याप्त हैं। यह सह-संस्कृति विधि दिखाता है कि जब आईएफएन और एलपीएस द्वारा ध्रुवीकृत मैक्रोफेज ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति में सुसंस्कृत होते हैं, तो सूजन से जुड़ी जीन अभिव्यक्ति का दमन 60% तक कम हो गया था(चित्रा 2ए,B16F10 झिल्ली/IFNο+LPS)। मैक्रोफेज प्रो-भड़काऊ जीन दमन का एक तुलनीय स्तर देखा गया जब मूत्र मैक्रोफेज सेल लाइन J774 को पेरिटोनियल मैक्रोफेज(चित्रा 2 B)के लिए प्रतिस्थापित किया गया था।

हमारे पिछले काम ने Pros1 को ट्यूमर-स्रावित कारक के रूप में पहचाना जो मैक्रोफेज सक्रियण16को बाधित कर सकता है। एलिसा के साथ मिलकर परगम्य झिल्ली समर्थन सह-संस्कृति मॉडल का उपयोग करते हुए, हमने 24 घंटे के बाद वातानुकूलित माध्यम में Pros1 की एकाग्रता को परख दिया। हमने देखा कि IFNο और एलपीएस से वातानुकूलित माध्यम में B16F10 मेलानोमा कोशिकाओं Pros1 का इलाज ४७५ एनजी/mL ± १२० एनजी/mL(चित्रा 3)पर व्यक्त किया गया था । पेरिटोनियल मैक्रोफेज एक ही शर्तों में इलाज ६१ एनजी/mL ± 5 एनजी/mL(चित्रा 3)पर Pros1 व्यक्त किया । दिलचस्प बात यह है कि जब सह-संस्कारी, IFNο और एलपीएस के भीतर Pros1 अच्छी तरह से इलाज ८६ एनजी/mL ± 15 एनजी/mL था । इससे पता चलता है कि 1) मैक्रोफेज ट्यूमर-स्रावित Pros1 या 2 का उपभोग करते हैं) मैक्रोफेज की उपस्थिति में B16F10 कोशिकाओं द्वारा स्रावित प्रो1 की मात्रा में काफी कमी आई है। चित्रा 2 और चित्रा 3 दोनों के परिणाम मैक्रोफेज सक्रियण और पैराक्रिन सिग्नलिंग के गहन परिवर्तनों को उजागर करते हैं जब मैक्रोफेज ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सह-संस्कारी होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1. प्रतिगामी झिल्ली के लिए योजनाबद्ध मैक्रोफेज के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की सह-संस्कृति का समर्थन करते हैं। सकारात्मक और नकारात्मक उपचार नियंत्रण को गायनी सुसंस्कृत मैक्रोफेज वेल्स (ए)पर लागू किया जा सकता है। मैक्रोफेज सक्रियण पर ट्यूमर-स्रावित संकेतों के प्रभाव ों को निर्धारित करने के लिए, मैक्रोफेज को निचले कक्ष (बी)में सुसंस्कृत चालू झिल्ली समर्थन सह-संस्कृति प्लेटों और ट्यूमर कोशिकाओं के ऊपरी कक्ष में सुसंस्कृत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2. ट्यूमर पैराक्रिन मैक्रोफेज समर्थक भड़काऊ ध्रुवीकरण को दबाने का संकेत देता है। सूजन से जुड़े जीन की मैक्रोफेज अभिव्यक्ति क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा अनुपचारित या आईएफएन में परख लाई गई थी और एलपीएस ने ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति या अनुपस्थिति में मैक्रोफेज को उत्तेजित किया था। पेरिटोनियल मैक्रोफेज (ए) या जे774 मैक्रोफेज सेल लाइन (बी) में प्रो-भड़काऊ जीन की अभिव्यक्ति में कमी आई थी, जब एक पारगम्य झिल्ली समर्थन द्वारा अलग ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति में सुसंस्कृत किया गया था ताकि प्रभाव पैराक्रिन घुलनशील लिगांड द्वारा प्रेषित किया गया था। *पी एंड एलटी; 0.05 अनुपचारित, पी एंड एलटी; 0.05 के सापेक्ष IFNο और एलपीएस के सापेक्ष प्रेरित किया। डेटा का मतलब ± एसईएम है; पी मान दो पूंछ छात्र टी परीक्षण द्वारा गणना की । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3. ट्यूमर कोशिकाओं और मैक्रोफेज के सहसंस्कृति से वातानुकूलित माध्यम में पाए जाने वाले ट्यूमर-स्रावित पैराक्रिन लिगांड की मात्रा में परिवर्तन होता है। एलिसा का उपयोग अकेले ट्यूमर में Pros1 की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए किया गया था, अकेले मैक्रोफेज, या सह-संस्कारित वातानुकूलित माध्यम 24 घंटे के बाद सह-संस्कृति केवल ट्यूमर सेल के सापेक्ष Pros1 की मात्रा में कमी की ओर ले जाती है। *पी एंड एलटी; 0.05 अनुपचारित के सापेक्ष। पी मान दो पूंछ छात्र टी परीक्षण द्वारा गणना की । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सह संस्कृति यहां प्रस्तुत परख पहले से स्थापित परख का एक संशोधन है कि ट्यूमर के अध्ययन के लिए अनुमति देता है प्रतिरक्षा सेल सक्रियण पर गुप्त कारकों । जबकि सेल सेल संपर्क प्रतिरक्षा गतिविधि में परिवर्तन को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, प्रतिरक्षा सक्रियण को मिलाने के लिए ट्यूमर-स्रावित लिगांड की क्षमता कम अच्छी तरह से समझ में आती है। हम एक विधि का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग प्रत्यक्ष सह-संस्कृति के विपरीत, यह पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है कि संपर्क-मध्यस्थता सिग्नलिंग की जटिल प्रकृति के बिना ट्यूमर-व्युत्पन्न गुप्त कारक प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण को कैसे प्रभावित करते हैं। इम्यूनोसप्रेसिंग में ट्यूमर-स्रावित लिगांडके संभावित नैदानिक महत्व को देखते हुए, यह विधि प्रत्यक्ष सह-संस्कृति द्वारा संबोधित नहीं किए गए तरीकों से इन तंत्रों का अध्ययन करने के लिए उपकरण का उपयोग करने के लिए एक आसान प्रदान करती है।

मूलतः, यहां वर्णित सह-संस्कृति विधि में शारीरिक संपर्क के बिना ट्यूमर कोशिकाओं (सेल लाइन या प्राथमिक कोशिकाओं) के साथ मैक्रोफेज (प्राथमिक कोशिकाएं: निवासी, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न, या एक मैक्रोफेज सेल लाइन) की संस्कृति शामिल है। यह महत्वपूर्ण है कि मैक्रोफेज को 0.4 माइक्रोन पोर आकार पॉलिएस्टर झिल्ली डालने पर सुसंस्कृत किया जाए ताकि फिल्टर के माध्यम से संभावित मैक्रोफेज सेल माइग्रेशन को रोकते हुए ट्यूमर-स्रावित लिगांड की मुफ्त परगम्यता की अनुमति दी जा सके। उचित सेल कवरेज सुनिश्चित करने के लिए ऊपरी और निचले कक्षों में संस्कृति माध्यम की वर्णित राशि को जोड़ना भी महत्वपूर्ण है। प्रयोगात्मक डिजाइन, जैसे एक सेल प्रकार को शामिल करना केवल नियंत्रण, सह-संस्कृति प्रयोगों की योजना बनाते समय एक और महत्वपूर्ण कारक है। कई अन्य कारकों, बाद में अधिक विस्तार में वर्णित है, परख के परिणामों पर भी प्रभाव पड़ सकता है और अध्ययन डिजाइन के दौरान प्रत्येक को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है।

सह-संस्कृति की अवधि या मैक्रोफेज के लिए ट्यूमर कोशिकाओं के सापेक्ष अनुपात पर विचार करने के लिए उल्लिखित प्रोटोकॉल में दो उपयोगी संशोधन हैं। वर्णित विधि में, मैक्रोफेज और ट्यूमर कोशिकाओं को लगभग समान सांद्रता पर चढ़ाया जाता है। विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु ट्यूमर कोशिकाओं के लिए मैक्रोफेज का सापेक्ष अनुपात है जो स्वाभाविक रूप से ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में होता है। ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट की बेहतर नकल करने के लिए, मैक्रोफेज के सापेक्ष अनुपात को आईने में बदला जा सकता है जो वीवो में ट्यूमर के भीतर पाया जाता है, हालांकि सही अनुपात स्थापित करने के लिए प्रारंभिक काम आवश्यक हो सकता है।

एक और महत्वपूर्ण बिंदु, और प्रणाली की संभावित सीमा, यह है कि परख में एक सेल प्रकार को प्रोत्साहित करने के लिए लागू उपचार अन्य सेल प्रकार पर अप्रत्याशित या अनपेक्षित प्रभाव हो सकता है। जैसा कि यहां वर्णित है, एलपीएस और IFNο के अलावा मैक्रोफेज में समर्थक भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति को प्रोत्साहित करने का इरादा है । हालांकि, यूबिल एट अल में हमने दिखाया कि IFNο भी अभिव्यक्ति और इम्यूनोसप्रेसिव Pros116के स्राव लाती है, और दूसरों को ट्यूमर कोशिकाओं18पर एलपीएस के प्रभाव को दिखाया गया है । इसलिए प्रयोगात्मक परिणामों को सत्यापित करने के लिए अन्य सेल प्रकार पर संभावित ऑफ-टारगेट या अनपेक्षित प्रभावों की निगरानी के लिए उचित नियंत्रण शामिल करना आवश्यक है। एक विधि जिसके द्वारा यह प्राप्त किया जा सकता है मानक आणविक जीव विज्ञान परख का उपयोग कर ब्याज और निगरानी प्रभाव के एजेंटों के साथ व्यक्तिगत सेल प्रकार का इलाज करके है ।

जब परगम्य झिल्ली समर्थन प्रयोगों को डिजाइन किया जाता है, तो स्रावित लिगांड के संभावित प्रसार ढाल पर विचार करना भी महत्वपूर्ण है। लिगामेंट स्राव की सापेक्ष दर, सह-संस्कृति की अवधि और क्या संस्कृति प्लेट को स्थिर स्थिति में बनाए रखा जाता है, सभी परिणामों पर प्रभाव डाल सकते हैं। इसके अलावा, कुछ स्रावित लिगामेंट के लिए संस्कृति प्लेटों की सतह का पालन करना संभव है।

जबकि दिखाए गए प्रतिनिधि परिणाम इस प्रणाली की विशेषता हैं, समर्थक भड़काऊ जीन दमन की डिग्री देखी गई जब सह-खेती अन्य ट्यूमर लाइनें नाटकीय रूप से भिन्न हो सकती हैं। यूबिल एट अल में, हम बताते हैं कि कुछ मानव ट्यूमर लाइनें मानव मैक्रोफेज सेल लाइन16के समर्थक भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति को लगभग पूरी तरह से दबा सकती हैं। इसके विपरीत, अन्य ट्यूमर सेल प्रकार या सेल लाइनें उनकी इम्यूनोसप्रेसिव क्षमताओं में काफी भिन्न हो सकती हैं। इन विचरण के लिए कारण अस्पष्ट है, लेकिन आगे के अध्ययन के लिए एक क्षेत्र है ।

पारगम्य झिल्ली समर्थन सह संस्कृति एक मजबूत पद्धति है जिसे विभिन्न प्रश्नों को संबोधित करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है और क्यूआरटी-पीसीआर, पश्चिमी दाग और एलिसा सहित आणविक जीव विज्ञान रीडआउट की एक श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रणाली का उपयोग व्यक्तिगत जीन कार्यों, जैसे लिगांड या रिसेप्टर्स से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है, जब जीन-हटाए गए चूहों या CRISPR संपादन ों जैसे आनुवंशिक परिवर्तन या तो मैक्रोफेज या ट्यूमर कोशिकाओं के लिए किए जाते हैं। यह प्रणाली औषधीय सक्रियकों या अवरोधकों के अध्ययन और पैराक्रिन सिग्नलिंग पर उनके प्रभावों के लिए भी उत्तरदायी है। इसके अलावा, जबकि यहां चर्चा नहीं की, प्रणाली ट्यूमर सेल जीन अभिव्यक्ति पर प्रतिरक्षा सक्रियण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस विधि का सफलतापूर्वक उपयोग इम्यूनोसप्रेसिव, ट्यूमर-स्रावित लिगांड के लिए एक उपन्यास समारोह की खोज और लक्षण वर्णन में किया गया है। इस मजबूत उपकरण का उपयोग नए चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज की उम्मीद में गैर-संपर्क ट्यूमर/प्रतिरक्षा बातचीत के बहुत व्यापक सबसेट से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एरिक उबिल को अमेरिकन कैंसर सोसायटी पोस्टडॉक्टोरल फेलोशिप (128770-पीएफ-15-216-01-LIB) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। इस काम को एचएसई को एनआईएच (R01-CA205398) और ब्रेस्ट कैंसर रिसर्च फाउंडेशन अवार्ड (बीसीआरएफ-18-041) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B16-F10 ATCC ATCC CRL-6475
cDNA synthesis kit Promega A3500
DMEM/F12 media ThermoFisher Scientific- Gibco 11320033
Fetal Bovine Serum Millipore TMS-013-B
J774A.1 ATCC ATCC TIB-67
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L5293-2ML
Murine M-CSF Prospec CYT-439
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific- Gibco 15140122
Pros1 ELISA MyBioSource MBS2886720
RAW264.7 ATCC ATCC TIB-71
Recombinant Mouse IFNγ BioLegend 575302
Sensimix SYBR Low-ROX kit Bioline QT625-05
Transwell permeable supports Fisher Scientific 07-200-170
Trypsin-EDTA ThermoFisher Scientific- Gibco 25200056

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References

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