透過性膜支持体との共培養を用いたマクロファージ活性化に及ぼす腫瘍分泌パラクリンリガンドの効果の研究

Cancer Research

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Summary

ここでは、腫瘍細胞が免疫応答を抑制するために使用する非接触パラクリンシグナル伝達の研究を容易にするために透過性膜支持体を用いる方法を提示する。このシステムは、マクロファージ活性化を減衰させる腫瘍分泌因子の役割を研究することに適している。

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Pittman, K., Earp, S., Ubil, E. Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports. J. Vis. Exp. (153), e60453, doi:10.3791/60453 (2019).

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Abstract

腫瘍由来パラクリンシグナル伝達は、局所免疫抑制の見落とされた成分であり、継続的な癌増殖および転移のための寛容な環境につながる可能性があります。パラクリンシグナルは、T細胞の表面上でPD-1と直接相互作用する腫瘍の表面に発現するPD-L1のような異なる細胞型間の細胞間接触、または腫瘍細胞によるリガンドの分泌を含むことができる。ここでは、腫瘍分泌リガンドが免疫細胞(マクロファージ)活性化に及ぼす影響を問う共培養法について説明する。この簡単な手順は市販の0.4μmポリカーボネート膜透過性支持および標準的な組織培養プレートを利用する。記載されたプロセスにおいて、マクロファージは、下房内の上部チャンバーおよび腫瘍細胞で培養される。0.4 μmバリアの存在は、2つの細胞型が同じ培地を共有し、パラクリンリガンドへの暴露を行うので、物理的接触の交絡変数なしで細胞間シグナル伝達の研究を可能にする。このアプローチは、マクロファージの遺伝的変化(例えば、遺伝的ノックアウトマウスからの単離)または腫瘍(例えば、CRISPR媒介性変化)などの他の人と組み合わせて、特定の分泌因子および受容体の役割を研究することができる。このアプローチは、2つの細胞集団を分離するために流れの選別を必要とせずに、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)またはウェスタンブロット分析などの標準的な分子生物学的分析にも適しています。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)も同様に、分泌されたリガンドを測定し、多細胞型文脈における細胞シグナル伝達の動的相互作用をよりよく理解することができる。共培養の期間は、時間的に調節された事象の研究のためにも変化させることができる。この共培養法は、免疫コンテキストにおける腫瘍分泌シグナルの研究を容易にする堅牢なツールである。

Introduction

最近の研究では、免疫細胞による検出を回避し、局所免疫活性化を抑制し、腫瘍微小環境でトレロゲン性腫瘍寛容ミリウーを産生する癌細胞の能力に焦点を当てている。これらの効果を促進する腫瘍および免疫細胞相互作用の2つの広範なクラスが記載されている:接触媒介相互作用または腫瘍分泌リガンド。腫瘍によって利用される接触媒介性免疫阻害の最もよく研究され、臨床的にトラクタブルなメカニズムの1つは、それらの活性化および機能1、2を阻害するためにT細胞上のPD-1と相互作用するPD-L1の発現である。多数の活性化免疫細胞によって発現されるインターフェロン-γ(IFNγ)に応答して、腫瘍細胞はPD-1発現活性化T細胞の枯渇を誘導するPD-L1の発現を増加させることができ、それによって腫瘍細胞3を効果的に根絶することを防止する。PD-L1とPD-1との相互作用を遮断する抗体の使用は、現在、ヒト4における複数の癌タイプを治療するために使用されている。この臨床的成功などに照らして、腫瘍由来免疫抑制機構の同定と標的化が注目を集めている。

適応免疫の抑制を超えて、腫瘍は先天性免疫細胞の炎症性応答を抑制する因子を分泌することも知られている。IL-6、IL-10、VEGF、IL-23、およびコロニー刺激因子(CSF-1)を含む腫瘍由来または腫瘍誘発分泌物は、腫瘍微小環境におけるナチュラルキラー(NK)細胞、顆粒球、および樹状細胞の抗腫瘍応答を阻害することが示されている。腫瘍細胞はまた、腫瘍微小環境における骨髄由来細胞のリクルートおよび分化を歪める因子を分泌し、T細胞活性化の抑制を促進することができる8、9である。

腫瘍進行に大きな影響を与える先天性免疫細胞の一種がマクロファージである。長年にわたり、腫瘍関連マクロファージ(AM)の存在は、患者生存期間10の陰性予後として使用されてきた。免疫抑制性のTAMが腫瘍の免疫細胞媒介クリアランスを減衰させるという概念は、40年以上前に導入されました。さらに最近では、マクロファージ前炎症反応はダウンレギュレートされ、腫瘍微小環境ではプロ腫瘍表現型を誘導できることが示されている。これらの免疫抑制マクロファージは、トレロゲン応答に寄与し、腫瘍の進行および化学および免疫療法12に対する耐性を駆動する。マクロファージは、多くの場合、腫瘍を有する最も豊富な白血球の一つであることを考えると、それらの腫瘍特異的免疫活性の回復は、抗癌治療のための潜在的な標的を表す13。

腫瘍細胞とマクロファージ間の接触媒介性相互作用は直接共培養によってモデル化することができるが、透過性膜支持体の使用は、腫瘍免疫細胞間接触の潜在的に混乱する影響なしに、どの腫瘍分泌因子が免疫調節可能かを解明することができる。幾分類似した方法を用いて、他の人は、ミクログリア/ニューロン相互作用14における分泌因子ならびに中皮細胞15との腫瘍細胞における分泌因子を同定する可能性を実証した。我々はまた、LPSおよびインターフェロン-γ16を用いた腹腹マクロファージの刺激後の炎症性遺伝子発現の抑制剤として、腫瘍分泌タンパク質Pros1の役割を特徴付けるために、この共培養技術を使用することに成功した。ここでは、腫瘍分泌因子がマクロファージ活性化にどのような影響を与えるかを調べたりできる簡単な方法論について説明します。

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Protocol

マウス腹腹マクロファージの収穫と使用に関連するすべての手順は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校(UNC)で行われ、UNC機関動物ケア使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. マクロファージ文化

注: この手順では、一次腹腹マクロファージ(後述)、骨髄由来マクロファージ、またはJ774(ATCC)またはRAW264(ATCC)などのマクロファージ細胞株を利用できます。

  1. 前に説明した16、17およびプレートの0.4μmポリエステル膜インサート共培養6ウェルプレートの上部チャンバーに直接収穫腹膜マクロファージ(図1A)。
    注:各単離からのマクロファージのおおよその収率は合計1 x 106細胞であるため、ウェル当たりの細胞の平均数は6ウェルプレートで〜1.5〜1.6 x 105細胞です。
  2. ドゥルベックの修飾イーグル培地(DMEM)/F12、10%胎児ウシ血清(FBS)、1xペニシリン/ストレプトマイシン、20 ng/mLマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)で収穫されたマクロファージを37°C、5%CO2で3日間培養する。
    注:上部チャンバーには1mLの培養培地が含まれ、下房は1.5mLで満たされています。媒体は各部屋に加えなければならない。

2. マクロファージによる腫瘍細胞の共培養

  1. 使用前に、ATCC推奨組織培養方法に続いてそれぞれの培地で市販の腫瘍細胞を培養する。
  2. リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で付着性腫瘍細胞を1回洗浄し、0.05%トリプシン+エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を加え、細胞が剥離するまで37°Cでインキュベートする。培地を含むFBS内の細胞を再サスペンドし、ヘモサイトメーターまたは細胞カウンターを用いて細胞の総数を定量し、次いで220xgで5分間遠心分離をペレットにする。
  3. 遠心分離の間、マクロファージ含有透過膜支持板の上下のチャンバーから培地を吸引し、新鮮な培地に置換する。
    1. 腫瘍細胞がめっきされる下部チャンバーの場合は、1.5 mLではなく1mLの培地で充填し、細胞添加に十分な体積を可能にします。
  4. ペレット化腫瘍細胞からの吸引媒体およびDMEM/F12の細胞を10%FBS、1xペニシリン/ストレプトマイシン、および3 x 105細胞/mLの濃度で20 ng/mL M-CSFで再サスペンドする。
  5. 3 x 105細胞/mL腫瘍細胞の0.5 mLを所望の井戸の下房に加える(図1B)。
    注: セルはすぐに処理できます。

3. 共培養細胞の治療

  1. マクロファージ前炎症性遺伝子発現を誘導するには、100 ng/mL IFNγおよび50 ng/mL LPSを添加して、無作用または共培養マクロファージを治療する。
    1. 必要に応じて、培養中の治療時間を変更します。マクロファージ活性化は2時間以内に起こり、24時間の共培養によっていくつかの腫瘍媒介抑制が起こり、堅牢で一貫した腫瘍由来の抑制が生じる。
      注:あるいは、マクロファージは、インターロイキン-10(IL10)などの因子の添加を通じて、プロ創傷治癒表現型を採用するように誘導することができ、そして腫瘍分泌リガンドの効果を評価した。
  2. 否定的なコントロールとして、培養マクロファージは、そのままにして放置します。陽性対照として、100 ng/mL IFNγおよび50 ng/mL LPSで、培養マクロファージを治療する。

4. 共培養細胞の下流解析

  1. 所望のインキュベーション時間が経過した後、試験の必要性に応じて、必要に応じて細胞リサートまたはコンディショニング培養培地を単離する。
  2. 定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)分析のために細胞リサートを単離するには、ウェルの両方のチャンバーから媒体を吸引し、2mLのPBSで1回洗浄する。マクロファージを含む上部チャンバーにRNAリシスバッファーを適用します。膜を穏やかに削り取って細胞リサートを放出し、RNA分離キットメーカーのプロトコルに従ってさらなる処理のために回収管に移す。

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Representative Results

腫瘍分泌リガンドがマクロファージ偏光に及ぼす影響を判定するために、記載された手順を利用した。腫瘍細胞の非存在下で培養した腹蓋マクロファージは、陰性(未処理=左端)および陽性(IFNγおよびLPS刺激=左から2番目)対照として用いた(図2A)。あるいは、腹膜マクロファージをB16F10黒色腫腫瘍細胞(ATCC)と共培養した(図1A)。めっき直後、細胞をIFNγおよびLPSで処理するか、未処理のままにした。培養24時間後、マクロファージを採取し、RNAを調製し、qRT-PCRを行い、炎症促進遺伝子の発現を測定した。ここで説明する共培養システムを用いて、B16F10腫瘍細胞の存在下で共培養した腹膜マクロファージが、刺激を活性化することなく(LPS+IFNγ)、炎症性関連遺伝子の発現を増加させないことを示す(図2A、B16F10膜/未処理)。これは、腫瘍分泌リガンドが1)それ自体が炎症前遺伝子発現を誘発するのに十分ではないことを意味し、2)腫瘍分泌による免疫活性化がある場合、パラクリンリガンドはナイーブレベルまで抑制するのに十分である。この共培養法は、IFNγとLPSによって偏光したマクロファージが腫瘍細胞の存在下で培養されると、炎症関連遺伝子発現の抑制が60%も減少したことを示している(図2A、B16F10膜/IFNγ+LPS)。マウスマクロファージ細胞株J774を腹球マクロファージに置換した場合に、同等レベルのマクロファージ炎症前遺伝子抑制が認められた(図2B)。

私たちの以前の研究は、マクロファージ活性化を阻害することができる腫瘍分泌因子としてPros1を同定しました16.透過膜支持共培養モデルをELISAと併せて用い、24時間後にコンディショニング培地中のPros1の濃度をアッセイした。IFNγおよびLPS処理B16F10黒色腫細胞Pros1からの条件付き培地において、475ng/mL±120ng/mLで発現したことを観察した(図3)。同じ条件で処理された腹腹マクロファージは、61 ng/mL ± 5 ng/mLでPros1を発現した(図3)。興味深いことに、共培養した場合、IFNγおよびLPS内のPros1は86ng/mL±15ng/mLであった。これは、1)マクロファージが腫瘍分泌されたPros1または2)B16F10細胞によって分泌されるPros1の量がマクロファージの存在下で実質的に減少することを示唆している。図2と図3両方の結果は、マクロファージが腫瘍細胞と共培養された場合のマクロファージ活性化およびパラクリンシグナル伝達の深い変化を強調した。

Figure 1
図 1.マクロファージを用いた腫瘍細胞の透過膜支持共培養のための概略図。正および陰性の処置制御は、培養マクロファージウェル(A)に適用することができる。マクロファージ活性化に対する腫瘍分泌シグナルの影響を決定するために、マクロファージは、下房(B)で培養された透過膜支持共培養プレートおよび腫瘍細胞の上部チャンバーで培養される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2.腫瘍パラクリンシグナルはマクロファージ前炎症分極を抑制する。炎症関連遺伝子のマクロファージ発現は、腫瘍細胞の有無において未治療またはIFNγおよびLPS刺激マクロファージにおいてqRT-PCRによってアッセイされた。腹膜系マクロファージ(A)またはJ774マクロファージ細胞株(B)において、透過膜支持体によって分離された腫瘍細胞の存在下で培養した場合、炎症促進遺伝子の発現が減少し、パラクリン可溶性リガンドによって効果が伝達されるようにした。*p < 0.05 未処理に対して、 p < 0.05 IFNγ および LPS に対して刺激されます。データは平均 ± SEM です。両側スチューデントのt検定によって計算されたp値。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3.腫瘍細胞およびマクロファージの共培養は、条件付き培地中に見られる腫瘍分泌パラクリンリガンドの量の変化をもたらす。ELISAは、腫瘍単独におけるPros1の濃度を決定するために使用された、マクロファージ単独、または24時間後の共培養後の共培養後の共培養培地は、腫瘍細胞のみのコントロールに対するPros1の量の減少につながる。*p < 0.05 未処理に対して。両側スチューデントのt検定によって計算されたp値。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

ここで提示される共培養アッセイは、免疫細胞活性化に関する腫瘍分泌因子の研究を可能にする、以前に確立されたアッセイの改変である。細胞間接触は免疫活性の変化を誘導することが知られているが、腫瘍分泌リガンドが免疫活性化を調節する能力はあまりよく理解されていない。直接的な共培養とは異なり、腫瘍由来の分泌因子が接触媒介シグナル伝達の混同性なしに免疫細胞活性化にどのような影響を与えるのかを調べたい方法について説明する。免疫抑制における腫瘍分泌リガンドの潜在的な臨床的重要性を考えると、この方法は、直接共培養によって対処されない方法でこれらのメカニズムを研究するための使いやすいツールを提供する。

本質的に、ここで説明する共培養方法は、物理的接触のない腫瘍細胞(細胞株または一次細胞)を有するマクロファージ(一次細胞:常駐、骨髄由来、またはマクロファージ細胞株)の培養を含む。マクロファージを0.4μmの細孔サイズポリエステル膜インサートで培養し、腫瘍分泌リガンドの自由な透過性を可能にしつつ、フィルターを介したマクロファージ細胞の移動を防ぐことが重要です。また、適切な細胞カバレッジを確保するために、上および下部のチャンバーに培養培地の記載量を追加することも重要です。1 つの細胞型のみのコントロールを含めるなどの実験的な計画は、共培養実験を計画する際のもう 1 つの重要な要素です。後で詳しく説明するいくつかの他の要因は、アッセイの結果にも影響を与える可能性があり、研究設計時にそれぞれを念頭に置く必要があります。

考慮すべき概説されたプロトコルに対する2つの有用な修飾は、共培養の持続時間またはマクロファージに対する腫瘍細胞の相対的な比率である。記載の方法では、マクロファージおよび腫瘍細胞は、ほぼ等しい濃度でめっきされる。考慮すべき重要な点は、腫瘍微小環境で自然に発生する腫瘍細胞に対するマクロファージの相対的な割合です。腫瘍の微小環境をよりよく模倣するためには、マクロファージの相対的な割合は、生体内の腫瘍内で見つかったものを反映するように変更することができるが、正しい比率を確立するために予備的な作業が必要な場合がある。

もう一つの重要な点は、システムの可能な制限は、アッセイの一方の細胞型を刺激するために適用される治療が他方の細胞型に予期しないまたは意図しない影響を及ぼす可能性が高いということです。ここで説明するように、LPSおよびIFNγの添加は、マクロファージにおける炎症性遺伝子発現を刺激するものである。しかしながら、Ubilらでは、IFNγも免疫抑制Pros116の発現および分泌を誘導することを示し、他の人は腫瘍細胞18に対するLPSの効果を示している。したがって、実験的な結果を検証するために、他の細胞タイプに対する潜在的なオフターゲットまたは意図しない影響を監視するための適切なコントロールを含める必要があります。これを達成する方法の1つは、個々の細胞型を目的の薬剤で治療し、標準的な分子生物学アッセイを用いて効果をモニタリングすることです。

透過膜支持実験を設計する際には、分泌リガンドの拡散勾配の可能性を考慮することも重要です。リガンド分泌の相対速度、共培養の持続時間、および培養プレートが静止位置に維持されるかどうかは、すべて結果に影響を及ぼす可能性がある。また、いくつかの分泌されたリガンドが培養プレートの表面に付着することが可能である。

示された代表的な結果は、このシステムの特徴であるが、他の腫瘍株を共培養する際に観察される炎症性遺伝子抑制の程度は劇的に変化し得る。Ubilらでは、いくつかのヒト腫瘍株がヒトマクロファージ細胞株16の炎症促進遺伝子発現をほぼ完全に抑制できることを示す。逆に、他の腫瘍細胞型または細胞株は、その免疫抑制能力において実質的に変化し得る。これらの差異の原因は不明ですが、さらなる研究のための領域です。

透過性膜支持共培養は、様々な質問に対処するために容易に変更することができ、qRT-PCR、ウェスタンブロット、およびELISAを含む分子生物学の読み出しの範囲に適応することができる堅牢な方法論です。このシステムは、遺伝子削除マウスやCRISPR編集などの遺伝子改変がマクロファージまたは腫瘍細胞のいずれかに対して行われた場合に、リガンドや受容体などの個々の遺伝子機能を調べるために使用できます。このシステムは、薬理活性剤または阻害剤の研究とパラクリンシグナル伝達に及ぼす影響にも適している。また、ここでは説明しないが、このシステムは、腫瘍細胞遺伝子発現に対する免疫活性化の影響を研究するために用いることができる。

この方法は、免疫抑制、腫瘍分泌リガンドのための新規機能の発見および特徴付けにおいて正常に使用されている。この堅牢なツールは、新しい治療標的を発見することを期待して、非接触腫瘍/免疫相互作用のはるかに広範なサブセットを尋問するために利用することができる。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

エリック・ユービルは、部分的には、アメリカ癌学会博士フェローシップ(128770-PF-15-216-01-LIB)によって資金提供されました。この研究は、NIH(R01-CA205398)と乳がん研究財団賞(BCRF-18-041)からHSEへの助成金によって支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B16-F10 ATCC ATCC CRL-6475
cDNA synthesis kit Promega A3500
DMEM/F12 media ThermoFisher Scientific- Gibco 11320033
Fetal Bovine Serum Millipore TMS-013-B
J774A.1 ATCC ATCC TIB-67
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L5293-2ML
Murine M-CSF Prospec CYT-439
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific- Gibco 15140122
Pros1 ELISA MyBioSource MBS2886720
RAW264.7 ATCC ATCC TIB-71
Recombinant Mouse IFNγ BioLegend 575302
Sensimix SYBR Low-ROX kit Bioline QT625-05
Transwell permeable supports Fisher Scientific 07-200-170
Trypsin-EDTA ThermoFisher Scientific- Gibco 25200056

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References

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