Estudando os efeitos dos ligantes paracrinos tumorais na ativação do macrófago usando a co-cultura com suportes permeáveis da membrana

Cancer Research

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Summary

Aqui, apresentamos um método usando suportes de membrana permeáveis para facilitar o estudo da sinalização paracrina sem contato usada pelas células tumorais para suprimir a resposta imune. O sistema é passível de estudar o papel dos fatores tumorados no amortecimento da ativação do macrófago.

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Pittman, K., Earp, S., Ubil, E. Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports. J. Vis. Exp. (153), e60453, doi:10.3791/60453 (2019).

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Abstract

A sinalização paracrina derivada do tumor é um componente negligenciado da imunossupressão local e pode levar a um ambiente permissivo para o crescimento contínuo do câncer e metástase. Sinais paracrinos podem envolver contato célula-célula entre diferentes tipos de células, como PD-L1 expressa na superfície de tumores interagindo diretamente com PD-1 na superfície das células T, ou a secreção de ligantes por uma célula tumoral para afetar uma célula imune. Aqui descrevemos um método de co-cultura para interrogar os efeitos dos ligantes tumorais na ativação de células imunes (macrófago). Este procedimento direto utiliza suportes permeáveis de membrana de policarbonato de 0,4 μm disponíveis comercialmente e placas padrão de cultura de tecido. No processo descrito, os macrófagos são cultivados na câmara superior e as células tumorais na câmara inferior. A presença da barreira de 0,4 μm permite o estudo da sinalização intercelular sem a variável de confusão do contato físico, pois os dois tipos de células compartilham o mesmo meio e exposição a ligantes paracrinos. Essa abordagem pode ser combinada com outras, como alterações genéticas do macrófago (por exemplo, isolamento de camundongos knock-out genéticos) ou tumor (por exemplo, alterações mediadas pela CRISPR) para estudar o papel de fatores e receptores secretos específicos. A abordagem também se presta a análises biológicas moleculares padrão, como a reação em cadeia de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) ou a análise de borrões ocidentais, sem a necessidade de triagem de fluxo para separar as duas populações celulares. Os ensaios imunosorventes ligados a enzimas (ELISAs) podem ser utilizados da mesma forma para medir ligantes secretados para entender melhor a interação dinâmica da sinalização celular no contexto do tipo de célula múltipla. A duração da cocultura também pode ser variada para o estudo de eventos temporalmente regulamentados. Este método de co-cultura é uma ferramenta robusta que facilita o estudo de sinais tumorais no contexto imunológico.

Introduction

Estudos recentes têm se concentrado na capacidade das células cancerosas para evitar a detecção por células imunes, suprimir a ativação imunológica local, ou para produzir um ambiente tolerogênico tumor-permissivo no microambiente tumoral. Duas classes largas de interações do tumor e da pilha imune foram descritas que facilitam estes efeitos: interações contato-mediadas ou ligands tumor-secretados. Um dos mecanismos mais bem estudados e clinicamente tratável de inibição imunológica mediada por contato utilizada por tumores é a expressão de PD-L1, que interage com PD-1 em células T para inibir sua ativação e função1,2. Em resposta ao interferon-gama (IFNγ), que é expressa por um número de células imunes ativadas, as células tumorais podem aumentar a expressão de PD-L1 para induzir a exaustão de células T ativadas por PD-1, impedindo-as de erradicar efetivamente as células tumorais3. O uso de anticorpos para bloquear a interação entre PD-L1 e PD-1 é usado atualmente para tratar vários tipos de câncer em seres humanos4. À luz desse sucesso clínico e de outros, a identificação e a segmentação de mecanismos imunossupressores derivados do tumor tem recebido cada vez mais atenção.

Além da supressão da imunidade adaptativa, os tumores também são conhecidos por secretar fatores que suprimem as respostas pró-inflamatórias das células imunes inatas. Secreções induzidas por tumores ou induzidas por tumor, incluindo IL-6, IL-10, VEGF, IL-23 e fator estimulante da colônia (CSF-1), têm sido mostrados para inibir as respostas antitumorais de células assassinas naturais (NK), gringócitos e células dendríticas no microambiente tumoral5,6,7. As células tumorais também podem secretar fatores que distorcem o recrutamento e diferenciação de células derivadas de mieloide no microambiente tumoral para promover a supressão da ativação de células T8,9.

Um tipo de célula imune inata que tem um efeito profundo sobre a progressão do tumor é o macrófago. Por muitos anos, a presença de macrófagos associados ao tumor (TAMs) tem sido usada como prognóstico negativo da sobrevida do paciente10. O conceito de que os TAMs imunossupressores amortecem a liberação de tumores mediada por células imunes foi introduzido há mais de 40 anos há11. Mais recentemente, tem sido demonstrado que o macrófago resposta pró-inflamatória pode ser desregulada, enquanto um fenótipo pró-tumor pode ser induzido no microambiente tumoral. Estes macrófagos imunossupressores podem contribuir para uma resposta tolerogênica, impulsionando a progressão do tumor e resistência à quimioterapia e imunoterapia12. Dado que os macrófagos são muitas vezes um dos leukócitos mais abundantes com o tumor, a restauração de sua atividade imunológica específica do tumor representa um alvo potencial para a terapêutica anticâncer13.

Embora as interações mediadas pelo contato entre células tumorais e macrófagos possam ser modeladas por meio da cocultura direta, o uso de suportes permeáveis da membrana pode elucidar quais fatores secretados por tumor são imunomodulatórios sem a influência potencialmente confusa do contato celular-imune ao tumor. Usando métodos um pouco semelhantes, outros demonstraram o potencial de identificar fatores secretos em interações microglia / neuronal14, bem como células tumorais com células mesoteliais15. Também usamos com sucesso essa técnica de cocultura para caracterizar o papel de uma proteína secretada por tumor, Pros1, como supressora da expressão gênica pró-inflamatória após a estimulação dos macrófagos peritoneal com LPS e interferon-gama16. Aqui descrevemos uma metodologia direta que pode ser usada para interrogar como fatores secretados por tumor podem afetar a ativação do macrófago.

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Protocol

Todos os procedimentos relacionados à colheita e uso de macrófagos peritoneal murine foram realizados na Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill (UNC) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UNC (IACUC).

1. Cultura do macrófago

NOTA: Este procedimento pode utilizar macrófagos peritoneal primários (descritos em detalhes abaixo), macrófagos derivados de medula óssea ou linhas celulares de macrófagos, como J774 (ATCC) ou RAW264 (ATCC).

  1. Macrófagos peritoneal da colheita como descrito previamente16,17 e placa diretamente na câmara superior (s) de uma membrana do poliéster de 0.4 μm inserem a co-cultura 6 placa de poço(figura 1A).
    NOTA: O rendimento aproximado dos macrófagos de cada isolamento é de 1 x 106 células no total, de modo que o número médio de células por poço é de ~1,5-1,6 x 105 células em uma placa de 6 poços.
  2. Cultura os macrófagos colhidos no Modificado Méxio águia de Dulbecco (DMEM)/F12, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1x penicilina/estreptomicina, 20 ng/mL macrophage colony stimulating factor (M-CSF) por 3 dias a 37 °C, 5% CO2.
    NOTA: A câmara superior contém 1 mL de meio de cultura, enquanto a câmara inferior é preenchido com 1,5 mL. O meio deve ser adicionado a cada câmara.

2. Cocultura de células tumorais com macrófagos

  1. Antes do uso, as pilhas comercialmente disponíveis do tumor da cultura em seus métodos médios respectivos da cultura do tecido DO ATCC-recomendado.
  2. Lave células tumorais aderentes uma vez com soro soro lógico amortecida de fosfato (PBS), adicione 0,05% de trippsina + ácido etilediatriáptico (EDTA) e incubada a 37 °C até que as células se seseparem. Resuspenda as células em FBS contendo médio, quantidade o número total de células usando um hemocytometer ou contador de células, e depois centrífuga por 5 min em 220 x g para pelota.
  3. Durante a centrífugação, aspirar o meio das câmaras superior e inferior das placas de suporte permeáveis contendo macrófagos de membrana e substituir por meio fresco.
    1. Para câmaras inferiores, onde as células tumorais serão banhadas, preencha com 1 mL de médio em vez de 1,5 mL para permitir o volume suficiente para adição celular.
  4. Aspiruais médios de células tumorais pelleted e células resuspendem no DMEM/F12 com 10% FBS, 1x penicilina/estreptomicina e 20 ng/mL M-CSF a uma concentração de 3 x 105 células/mL.
  5. Adicione 0,5 mL de 3 x 105 células/mL células tumorais para a câmara inferior dos poços desejados (Figura 1B).
    NOTA: As células podem ser tratadas imediatamente.

3. Tratamento de células co-cultivadas

  1. Para induzir a expressão genética pró-inflamatória do macrófago, trate macrófagos com singly ou co-cultivadas adicionando 100 ng/mL IFNγ e 50 NG/mL LPS.
    1. Variar a duração dos tempos de tratamento na cultura, conforme necessário. A ativação do macrófago ocorre dentro de 2 h e alguma supressão tumor-mediada ocorre por 8 h. Co-culture para 24 h rende a supressão tumor-derivada robusta e consistente.
      NOTA: Alternativamente, macrófagos podem ser induzidos a adotar um fenótipo de cura pró-ferida através da adição de fatores como interleucina-10 (IL10), e o efeito do ligand tumoralmente-secretado avaliado.
  2. Como um controle negativo, macrófagos cultura singly e deixar sem tratamento. Como um controle positivo, trate macrófagos singly cultivados com 100 ng/mL IFNγ e 50 ng/mL LPS.

4. Análise a jusante de células co-cultivadas

  1. Após o tempo de incubação desejado ter decorrido, isolar o lysate celular ou o meio de cultura condicionada, conforme desejado, dependendo das necessidades de teste.
  2. Para isolar o lysate celular para análise quantitativa de reação em cadeia de polimerase (qPCR), assaa a mídia de ambas as câmaras do poço e lave uma vez com 2 mL de PBS. Aplique o amortecedor da lyse do RNA à câmara superior que contem os macrófagos. Raspe delicadamente a membrana para liberar a lysate da pilha, e transfira a um tubo da coleção para processar mais de acordo com o protocolo do fabricante do fabricante do jogo da isolação do RNA.

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Representative Results

Para determinar o efeito dos ligands tumor-secretados na polarização do macrófago, o procedimento descrito foi utilizado. Macrófagos peritoneal cultivados na ausência de células tumorais foram utilizados como negativos (não tratados = extrema esquerda) e positivo (IFNγ e LPS estimulados = 2nd da esquerda) controles (Figura 2A). Alternativamente, os macrófagos peritoneal foram co-cultivados com células tumorais de melanoma B16F10 (ATCC) (Figura 1A). Imediatamente após o revestimento, as pilhas foram tratadas com IFNγ e LPS ou não tratadas. Após 24 h de cultura, macrófagos foram colhidos, RNA preparado e qRT-PCR realizado para medir a expressão de genes pró-inflamatórios. Utilizando o sistema de cocultura descrito aqui, mostramos que os macrófagos peritoneal co-cultivados na presença de células tumorais B16F10, mas sem ativar estímulos (LPS + IFNγ), não aumentaram a expressão de genes associados pró-inflamatórios (Figura 2A,membrana B16F10/não tratada). Isto implica que as ligands tumor-secretadas são 1) não suficientes por se para induzir a expressão pro-inflammatory do gene ou 2) se há uma ativação imune por secreções do tumor, os ligands do paracrine são suficientes suprimi-lo aos níveis ingénuos. Este método de co-cultura ilustra que quando macrófagos polarizados por IFNγ e LPS são cultivados na presença de células tumorais, a supressão da expressão gênica associada à inflamação foi reduzida em até 60% (Figura 2A,Membrana B16F10/IFNγ+LPS). Observou-se um nível comparável de supressão de genes pró-inflamatórios de macrófagos quando a linha de células de macrófago murine J774 foi substituída por macrófagos peritoneal (Figura 2B).

Nosso trabalho anterior identificou o Pros1 como um fator secretado pelo tumor que pode inibir a ativação do macrófago16. Usando o modelo permeável da co-cultura da sustentação da membrana conjuntamente com ELISA, nós ensaiou a concentração de Pros1 no meio condicionado após 24 h. Observamos que, em meio condicionado de IFNγ e LPS tratados células de melanoma B16F10 Pros1 foi expressa em 475 ng/mL ± 120 ng/mL (Figura 3). Macrófagos peritoneal tratados nas mesmas condições expressas Pros1 em 61 ng/mL ± 5 ng/mL (Figura 3). Curiosamente, quando co-cultivada, o Pros1 dentro do IFNγ e LPS tratados bem foi 86 ng/mL ± 15 ng/mL. Isso sugere que 1) macrófagos consomem Pros1 ou 2 secretados por tumor) a quantidade de Pros1 secretada pelas células B16F10 é substancialmente diminuída quando na presença de macrófagos. Os resultados da Figura 2 e da Figura 3 destacam mudanças profundas de ativação de macrófagos e sinalização paracrina quando os macrófagos são co-cultivados com células tumorais.

Figure 1
Figura 1. Esquemático para membrana permeável suportam a co-cultura das células tumorais com macrófagos. Controles de tratamento positivos e negativos podem ser aplicados a poços de macrófagos chamuscanos (A). Para determinar os efeitos dos sinais tumorados na ativação do macrófago, os macrófagos são cultivados na câmara superior de placas permeáveis da cocultura da sustentação da membrana e das pilhas do tumor cultivadas na câmara mais baixa (B). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2. Sinais paracrinos tumorais suprimem a polarização pró-inflamatória do macrófago. A expressão de macrófagos de genes associados à inflamação foi amenizado pelo qRT-PCR em macrófagos não tratados ou IFNγ e LPS estimulados na presença ou ausência de células tumorais. A expressão de genes pró-inflamatórios foi diminuída nos macrófagos peritoneal (A) ou na linha celular de macrófagos J774 (B) quando cultivada na presença de células tumorais separadas por suporte de membrana permeável para que o efeito fosse transmitido por um ligand solúvel paracrina. *p < 0,05 em relação ao não tratado, p < 0,05 em relação ao IFNγ e LPS estimulado. Os dados são significam ± SEM; p valores calculados pelo teste t do estudante de duas caudas. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3. A cocultura de células tumorais e macrófagos leva a mudanças na quantidade de ligantes paracrinos secretados por tumor encontrados em meio condicionado. ELISA foi usado para determinar a concentração de Pros1 no tumor sozinho, macrófago sozinho, ou co-culto condicionado médio após 24 h. Co-cultura leva a uma diminuição na quantidade de Pros1 em relação à célula tumoral só controla. *p < 0,05 em relação ao não tratado. p valores calculados pelo teste t do estudante de duas caudas. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Discussion

O ensaio co-cultural apresentado aqui é uma modificação de ensaios previamente estabelecidos que permite o estudo de fatores tumorados na ativação de células imunes. Enquanto o contato célula-célula é conhecido por induzir alterações na atividade imunológica, a capacidade de ligantes tumorais para modular a ativação imunológica é menos bem compreendida. Descrevemos um método que, ao contrário da cocultura direta, pode ser usado para interrogar como fatores secretos derivados do tumor afetam a ativação de células imunes sem a natureza confusa da sinalização mediada pelo contato. Dada a importância clínica potencial dos ligantes tumorados na imunossupressão, este método oferece uma ferramenta fácil de usar para estudar esses mecanismos de maneiras não abordadas pela cocultura direta.

Essencialmente, o método de co-cultura descrito aqui envolve a cultura dos macrófagos (células primárias: residentes, derivados da medula óssea, ou uma linha celular de macrófago) com células tumorais (linha celular ou células primárias) sem contato físico. É fundamental que os macrófagos sejam cultivados em uma inserção de membrana de poliéster de tamanho de poros de 0,4 μm para permitir a permeabilidade livre de ligantes secretados pelo tumor, evitando a possível migração de células de macrófagos através do filtro. Também é importante adicionar a quantidade descrita de meio de cultura para as câmaras superior e inferior para garantir a cobertura celular adequada. O projeto experimental, como a inclusão de um tipo de célula, só controla, é outro fator chave no planejamento de experimentos de cocultura. Vários outros fatores, descritos com mais detalhes mais tarde, também podem ter efeitos sobre os resultados do ensaio e é importante manter cada um em mente durante o projeto do estudo.

Duas modificações úteis ao protocolo esboçado a considerar são a duração da co-cultura ou a relação relativa de pilhas do tumor aos macrófagos. No método descrito, macrófagos e células tumorais são banhados em concentrações aproximadamente iguais. Um ponto importante a considerar é a proporção relativa de macrófagos para células tumorais que ocorre naturalmente no microambiente tumoral. Para imitar melhor o microambiente tumoral, a proporção relativa de macrófagos pode ser alterada para espelhar o que é encontrado dentro do tumor in vivo, embora o trabalho preliminar possa ser necessário para estabelecer a razão correta.

Outro ponto crítico, e possível limitação do sistema, é que os tratamentos aplicados para estimular um tipo de célula no ensaio podem ter efeitos inesperados ou não intencionais sobre o outro tipo de célula. Como descrito aqui, a adição de LPS e IFNγ destina-se a estimular a expressão gênica pró-inflamatória em macrófagos. No entanto, em Ubil et al. mostramos que ifnγ também induz a expressão e secreção de imunossupressora Pros116, e outros têm mostrado os efeitos da SLP sobre as célulastumorais 18. Por conseguinte, é essencial incluir os controlos adequados para monitorizar potenciais efeitos fora do alvo ou não intencionais no outro tipo de célula para verificar os resultados experimentais. Um método pelo qual isso pode ser alcançado é o tratamento de tipos de células individuais com os agentes de interesse e monitoramento de efeitos usando ensaios de biologia molecular padrão.

Ao projetar experimentos permeáveis de suporte de membrana, também é importante considerar possíveis gradientes de difusão de ligantes secretados. A taxa relativa de secreção de ligand, a duração da co-cultura e se a placa de cultura é mantida em uma posição estacionária podem ter efeitos sobre os resultados. Além disso, é possível que alguns ligantes secretados aderissem à superfície das placas de cultura.

Quando os resultados representativos mostrados forem característicos deste sistema, o grau de supressão pro-inflammatory do gene observado ao co-culturing outras linhas do tumor pode variar dramàtica. Em Ubil et al., mostramos que algumas linhas tumorais humanas podem quase suprimir completamente a expressão gênica pró-inflamatória de uma linha de células de macrófago humano16. Por outro lado, outros tipos de células tumorais ou linhas celulares podem variar substancialmente em suas capacidades imunossupressoras. A causa para estas variações é obscura mas é uma área para um estudo mais adicional.

A cocultura permeável da sustentação da membrana é uma metodologia robusta que possa facilmente ser modificada para endereçar uma variedade de perguntas e possa ser adaptada a uma escala de leituras da biologia molecular que incluem o qRT-PCR, o borrão ocidental, e o ELISA. O sistema pode ser usado para interrogar funções genéticas individuais, como ligantes ou receptores, quando alterações genéticas como as de camundongos excluídos por genes ou edições CRISPR são feitas para macrófagos ou células tumorais. O sistema também é passível de estudo de ativadores ou inibidores farmacológicos e seus efeitos na sinalização paracrina. Além disso, embora não seja discutido aqui, o sistema pode ser usado para estudar os efeitos da ativação imunológica na expressão do gene da célula tumoral.

Este método tem sido usado com sucesso na descoberta e caracterização de uma nova função para um ligand imunossupressor, tumor-secretado. Esta ferramenta robusta pode ser utilizada para interrogar o subconjunto muito mais amplo de interações tumor/imunes sem contato na esperança de descobrir novos alvos terapêuticos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Eric Ubil foi financiado, em parte, pela American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). O trabalho foi apoiado por uma doação do NIH (R01-CA205398) e de um prêmio da Breast Cancer Research Foundation (BCRF-18-041) ao HSE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B16-F10 ATCC ATCC CRL-6475
cDNA synthesis kit Promega A3500
DMEM/F12 media ThermoFisher Scientific- Gibco 11320033
Fetal Bovine Serum Millipore TMS-013-B
J774A.1 ATCC ATCC TIB-67
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L5293-2ML
Murine M-CSF Prospec CYT-439
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific- Gibco 15140122
Pros1 ELISA MyBioSource MBS2886720
RAW264.7 ATCC ATCC TIB-71
Recombinant Mouse IFNγ BioLegend 575302
Sensimix SYBR Low-ROX kit Bioline QT625-05
Transwell permeable supports Fisher Scientific 07-200-170
Trypsin-EDTA ThermoFisher Scientific- Gibco 25200056

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References

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