دراسات الفيزيولوجيا الكهربية والدراسات الكهربائية السابقة لل فيفو لانغرندوف

Medicine
 

Summary

وكان الهدف من هذه الدراسة هو إنشاء طريقه للتحقيق في ديناميات القلب باستخدام نموذج الحيوانية الانتقالية. ويتضمن النهج التجريبي الموصوف التصوير الثنائي الإرسال بالتزامن مع دراسة فيزيولوجية كهربائيه لتقييم النشاط الكهربي في نموذج قلب معزول وسليم.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Swift, L. M., Jaimes III, R., McCullough, D., Burke, M., Reilly, M., Maeda, T., Zhang, H., Ishibashi, N., Rogers, J. M., Posnack, N. G. Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts. J. Vis. Exp. (153), e60472, doi:10.3791/60472 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

النماذج الحيوانية الصغيرة هي الأكثر شيوعا في البحوث القلب والاوعيه الدموية نظرا لتوافر الأنواع المعدلة وراثيا وانخفاض التكلفة مقارنه بالماشية أكبر. ومع ذلك ، فان الثدييات الكبيرة أكثر ملاءمة للاسئله البحثية الانتقالية المتعلقة بفسيولوجيا القلب الطبيعي ، والفيزيولوجيا المرضية ، والاختبار الإكلينيكي للعوامل العلاجية. للتغلب علي الحواجز التقنية المرتبطة باستخدام نموذج الحيوانية أكبر في البحوث القلب ، ونحن وصف نهج لقياس المعلمات الفسيولوجية في القلب المعزول ، لانغيندورف-perfused خنزير الصغير. يجمع هذا النهج بين أداتين تجريبيتين قويتين لتقييم حاله القلب: دراسة الفيزيولوجيا الكهربية (EP) والتخطيط البصري المتزامن للجهد عبر الغشاء والكالسيوم داخل الخلايا باستخدام الاصباغ الحساسة للمعلمات (RH237 ، Rhod2). والمنهجيات الموصوفة مناسبه تماما للدراسات الانتقالية التي تحقق في نظام التوصيل القلبي ، والتعديلات في الشكل المحتمل للعمل ، ومناوله الكالسيوم ، واقتران الاثاره والانكماش ، وحدوث التناوب القلبي أو اضطراب نظم.

Introduction

مرض القلب والاوعيه الدموية هو السبب الرئيسي للمرض والموت في جميع انحاء العالم. وعلي هذا النحو ، فان التركيز علي البحوث الاوليه هو تحسين المنهجيات التي يمكن استخدامها لدراسة فسيولوجيا القلب العادية واليات الكامنة التي يمكن ان تسهم في المراضه والوفاات في البشر. وقد اعتمدت البحوث الاساسيه للقلب والاوعيه الدموية تقليديا علي النماذج الحيوانية الصغيرة ، بما في ذلك القوارض والأرانب1،2،3، نظرا لتوافر الأنواع المعدلة وراثيا4،5، اقل تكلفه ، وبصمه تجريبية أصغر ، وإنتاجيه اعلي. ومع ذلك ، فان استخدام نموذج خنزير لديه القدرة علي توفير المزيد من البيانات ذات الصلة سريريا6. في الواقع ، وقد وثقت الدراسات السابقة أوجه التشابه في الفيزيولوجيا الكهربية القلبية (EP) بين البشر والخنازير ، بما في ذلك تيارات أيون مماثله7، والعمل شكل المحتملة8، والاستجابات للاختبار الدوائية9. وعلاوة علي ذلك ، فان القلب الخنازير لديه حركيه المقلص والاسترخاء التي هي أكثر قابليه للمقارنة مع البشر من القوارض أو الأرانب10. بالمقارنة مع نموذج البوليسية ، وتشريح الشريان التاجي الخنازير يشبه بشكل وثيق قلب الإنسان11،12 وهو نموذج الاختيار للدراسات التي تركز علي تنميه القلب ، وامراض القلب للأطفال و/أو العيوب القلبية الخلقية 13. علي الرغم من ان هناك اختلافات بين الخنازير والقلب البشري8، وهذه التشابات جعل القلب الخنازير نموذجا قيما للبحوث القلب والاوعيه الدموية14.

أصبح الانحراف الارتجاعي للقلب بروتوكولا قياسيا لدراسة ديناميات القلب السابق الجسم الحيوي15 منذ تاسيسها أولا من قبل أوسكار لانغندورف16. وفقا لذلك ، يمكن استخدام لانغندوف-بيرفيوجن لدعم قلب معزول وسليم في غياب التاثيرات لااراديه. هذا النموذج هو أداه مفيده للمقارنة مباشره القلب الكهربي والانقباض بين قلوب صحية وغير صحية. وبما ان ديناميات القلب معقده وقتيا ومكانيا ، فان التغيير الطفيف في منطقه واحده يمكن ان يؤثر بشكل كبير علي قدره القلب بأكمله علي العمل بوصفه مخلي17. ولذلك ، فان التصوير المكاني العالي للاصباغ الحساسة للمعلمات هو أداه مفيده لمراقبه وظيفة القلب عبر سطح القلب18،19. في الواقع ، والتصوير المزدوج في وقت واحد من الجهد والكالسيوم حساسة لتحقيقات الفلورسنت يسمح لتقييم النشاط الكهربائي ، والتعامل مع الكالسيوم والاثاره-انكماش اقتران في مستوي الانسجه20،21، 22،23،24،25،26،27،28. وقد استخدمت في السابق التقنيات البصرية لرسم الخرائط و/أو المسح الضوئي لتوثيق الانخفاض في أداء القلب بسبب الشيخوخة أو الطفرات الجينية ، وتقييم سلامه العوامل الدوائية أو التعرض البيئي29 ،30،31،32،33.

في الوضع السريري ، غالبا ما تستخدم دراسة الفيزيولوجيا الكهربية القلبية الغازية للتحقيق في اضطرابات إيقاع القلب ، وتحديد الامراض ، وحدد خيارات العلاج الممكنة. المثل ، فاننا وصف بروتوكول EP التي يمكن استخدامها لتقييم وظيفة عقده الجيوب الانفيه ، وقياس التوصيل الأذيني البطيني ، وتحديد حران انسجه عضله القلب. ويمكن اجراء دراسة EP الموصوفة بالتزامن مع رسم الخرائط البصرية ، أو optocardiography34، لتوصيف تماما فسيولوجيا القلب في قلوب معزولة. وفي البروتوكول الموصوف ، أجريت الصور المجسمة ذات الاستبانة المكانية العالية بمزيج من الصبغة (RH237) والكالسيوم (الوردي-2 صباحا) في اعداد الانبعاثات المزدوجة. بالاضافه إلى ذلك ، تم رصد المعلمات الكهربية القلبية تحت كل من إيقاع الجيوب الانفيه واستجابه لتحفيز الكهربائية المبرمجة.

Protocol

وأجريت جميع التجارب وفقا للدليل الوطني للمعاهد الصحية لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية (الطبعة الثامنة). وقد تمت الموافقة علي جميع الأساليب والبروتوكولات المستخدمة في هذه الدراسات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانية في المستشفى الوطني للأطفال وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبرات التي تنشرها المعاهد القومية للصحة. وقد تلقت جميع الماشية المستخدمة في هذه الدراسة رعاية انسانيه امتثالا لدليل رعاية واستخدام المختبرات الحيوانية.

1-الاعداد

  1. اعداد 6 لتر من الحل كريبس-Henseleit16 (مم: 118.0 كلوريد الصوديوم ، 3.3 kcl ، 1.2 mgso4، 24.0 ناهكو3، 1.2 KH2PO4، 10.0 الجلوكوز ، 2.0 بيروفات ، 2 ٪ الزلال ، 2.0 cacl2). أضافه CaCl2 في يوم التجربة ، منذ مع مرور الوقت ، في وجود الفوسفات ، كلوريد الكالسيوم سوف عضال يعجل من الحل كما فوسفات الكالسيوم.
  2. ضبط درجه الحموضة إلى 7.4 بعد تصفيه معقمه (حجم المسام: 0.22 μm). تحقق من الحل الخاص بالمحلول لضمان مجموعه من 275-310 mOsm/kg. يبرد 1 لتر علي الثلج للاستخدام مباشره بعد ان يتم استئصال القلب. دافئ 3 لتر في حمام المياه إلى حوالي 37 درجه مئوية قبل محتدما مع كربوجين (95 ٪ O2، 5 ٪ CO2).
    ملاحظه: الاحترار يقلل من فقاعات والانسداد المحتملة ، منذ السائل البارد لديه قدره متزايدة من الغاز إلى حل ؛ لذلك ، كما المعدلة كريبس-henseleit وسائل الاعلام يمر من خلال نظام ترويه ويدفئ ، سيتم الإفراج عن الغاز كما فقاعات.
  3. اعداد 2 لتر من القلب (تعديل ديل نيدو القلب الحل ، الجدول 1). تجميد ما يكفي من القلب في علبه مكعبات الثلج لملء كوب 500 mL.
  4. تشغيل حمامات المياه المتداولة تعيين إلى 42 درجه مئوية. بدوره علي مضخات لتعميم perfusate في حلقه التدفئة إشعاعا hydronic مغلقه (للحصول علي قائمه كامله من المواد ، انظر جدول المواد والشكل 1).
    ملاحظه: يتم استخدام حمام المياه الساخنة التي يتم تداولها لتسخين الأنابيب التي تغلف بالماء والمبادلات الحرارية.
  5. تنظيف دوائر الأنابيب والغرف عن طريق تشغيل 2 لتر من محلول 1 ٪ من المنظفات العالمية في الماء من خلال النظام. شطف جميع الدوائر الأنابيب وغرف نظام لانغرندوف مع > 4 لتر من المياه النقية. تشغيل مضخات حتى يتم أزاله جميع المياه من النظام.
  6. أضافه مرشح غشاء الاصطناعية في خط مع مضخات ترويه (فلتر البولي بروبيلين ، وحجم المسام > 5 μm). الغاز مكساج ستوكات (الاغشيه النصفية) مع 95 ٪ O2 و 5 ٪ CO2 في 80 kPa.
    ملاحظه: عند استخدام ألبومين ، هناك في كثير من الأحيان مزبد المرتبطة الأوكسجين و/أو نشاط الضخ من خلال دائره الأنابيب. ويمكن أضافه مركب مضاد للرغوة (مستحلب انتيفوم Y30) بشكل دوري (~ كل 30 دقيقه) لإرواءه كما يحدث.
  7. تحقق من نقطتين معايره (0 و 60 زئبق) لمستشعر الضغط الموجود فوق الشريان الابهر أو في مصيدة الفقاعات. معايره حسب الحاجة.
  8. مباشره قبل استئصال القلب ، يسكب الاعلام في نظام التجعيد الحلقي لانجندورف. تاكد من ان perfusate يمر من خلال أوكسيجين ستوكات (الاغشيه) بالغاز مع perfusate الأوكسيجين ، الذي يتدفق بعد ذلك من خلال مبادلات حراريه للحفاظ علي وسائل الاعلام perfusate درجه الحرارة من 37 درجه مئوية في الشريان الابهر.
  9. تعيين حمام المياه المتداولة إلى درجات قليله اعلي من 37 درجه مئوية ، مثل 42 درجه مئوية ، لحساب فقدان الحرارة خلال تبادل وطوال النظام. مراقبه درجه الحرارة المتداولة perfusate مع المزدوجات الحرارية.

2. الختان القلب و لانغندوف-perfusion

  1. سيتمور الخنزير مع حقن العضلي (I.M.) من الكيتامين (20 مغ/كغ) و اكسيليازين (2 مغ/كغ) و التنبات مع أنبوب الرغامي. للاستقراء ، وأداره حقن الوريد (وريدي) من الفنتانيل (50 ميكروغرام/كغ) وروتونيوم (1 مغ/كغ). الحفاظ علي التخدير مع ايزوفلواني المستنشق (0.5 − 3 ٪) ، الفنتانيل (10 − 25 ميكروغرام/كغ) ، والبانكورونيوم (1 ملغم/كغ).
    ملاحظه: لهذه الدراسة التي تثبت المبدا ، استخدمت الخنازير يوركشاير الاحداث (14 − 42 يوما من العمر ، ن = 18) التي تراوحت بين 2.5 − 10.5 كجم وزن الجسم و 18 − 137 غرام من وزن القلب (الشكل 2). إذا كان من الضروري حقن اضافيه لحث, الكيتامين (10 مغ/كغ) يمكن حقن I.M.
  2. مره واحده يتم تخدير الحيوانية تماما وغير مستجيبة ، وأداء ستينوتومي لفضح الابهر التصاعدي والأذين الأيمن.
    1. باستخدام مشرط ، اجراء شق منتصف الخط من اعلي القص في مدخل الصدر ، وصولا إلى عمليه الخنجري. مع الحذر (أو مقص) ، تشريح الدهون الاساسيه والعضلات حتى القص مرئية.
    2. من عمليه الخنجري ، قطع خط القص النصفي حتى من خلال القصي مع اما مقص العظام الجراحية أو منشار العظام. ادراج أعاده الجرارات في الشق لفضح القلب.
  3. تقديم جرعه بوليوس من الهيبارين (300 U/kg) إلى الأذين الأيمن ، وذلك باستخدام ابره 18 غرام وحقنه ، للتقليل من الجلطات وصمه عار علي استئصال الأعضاء. وضع منصات ماصه في تجويف الصدر والجليد حول القلب.
  4. مع مقص ، شريحة بعناية من خلال التامور ، وعزل الشريان الابهر عن طريق تشريح حاد من النسيج الضام المحيطة بها ، والمشبك الشريان الابهر أسفل الفرع الشرياني الأول علي قوس الابهر. باستخدام حقنه 50 mL مع ابره 18 ز, حقن الجليد الباردة القلب (20 مل/كغ) من خلال الأعلى من الشريان الابهر التصاعدي.
  5. قطع من خلال السفن المؤدية إلى القلب وأزاله القلب مع الشريان الاورطي التصاعدي سليمه ويغرق القلب المثيرة في الجليد الباردة كاربلوجيا.
  6. فهم جدران الشريان الابهر مع زوج من الأرقاء وزلة علي قني مضلع تعلق علي الأنابيب التي تؤدي إلى 1 لتر من الجليد الباردة القلب وسائل الاعلام المعلقة أعلاه القلوب (~ 95 سم لتوفير ~ 70 مم زئبق). السماح للسوائل بالدخول وملء الشريان الابهر حتى ينساب لمنع اي فقاعه من دخول الاوعيه الدموية.
    ملاحظه: استخدام غير مقرنة الميكانيكية (2, 3-butanedione مونوسيم [bdm] أو blebbistatin) سوف تقلل من معدل ترويه التاجية كما الطلب الأكسجين من الانسجه ينخفض.
  7. تامين الابهر إلى قني باستخدام الشريط السري ومزيد من مرساه من خلال ربط الأرقاء لتحمل وزن القلب ، والذي هو الآن شنقا من قني (الشكل 1c). السماح لوسائل الاعلام الباردة إلى الوراء حقنت القلب في ضغط مستمر من 70 مم زئبق عن طريق الجاذبية. إبقاء القلب المغمورة في كاردوبلجيا الباردة حتى تصبح جاهزه لنقلها إلى درجه حرارة (37 °C) لانجندورف-perfusion النظام (< 10 دقيقه).
    ملاحظه: الشريان الابهر علي القلوب الصغيرة (< 50 غ ، حتى الخنزير الذي يبلغ من العمر أسبوعين) سيتحمل ثقل القلب ولكن القلوب الكبيرة معرضه لخطر الانزلاق من الاكله. اثناء التعليب الاولي وعند الانتقال إلى نظام التسخين ، منع الهواء من دخول الشريان الابهر ، والذي يمكن ان يسبب الشريان التاجي. استخدام أنابيب كبيره تتحمل (> 3/8 "القطر الداخلي) الذي يسمح فقاعات لترتفع أسرع من الحل دخول الشريان الابهر.
  8. نقل القلب إلى نظام لانغريندوف (37 درجه مئوية) دون إدخال الهواء في الكانولا. السماح لإيقاع الجيوب الانفيه العادي لمسح الاوعيه الدموية من اي الدم المتبقية والقلب.
    ملاحظه: في الدراسة الموصوفة معدل تدفق الاوليه المتوسطة من 184 ± 17 مل/دقيقه لوحظ في القلوب الصغيرة الصغيرة الاحداث. انخفض معدل التدفق إلى 70 ± 7.5 mL/min (يعني ± SEM) بعد النبض مع وسائل الاعلام التي تحتوي علي حرارة غير مقرنة الميكانيكية (20 مم bdm). لا تغمر انسجه القلب ، لأنها يمكن ان تؤثر علي التصوير القلبي. يتم الحفاظ علي درجه حرارة الانسجه عن طريق تدفق الشريان التاجي في قلب الخنزير بسبب حجمها الأكبر ومساحتها السطحية الأصغر ، بالمقارنة مع القوارض. وفي ظل التدفق الكامل ، تراوحت درجات الحرارة شغاف من 35 درجه مئوية إلى 37 درجه مئوية ، علي التوالي.
    تحذير: ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك ارتداء العين عند العمل مع المقرنات الميكانيكية. يمكن للقلب إخراج الوسائط بسرعة وبشكل غير متوقع.
  9. نصدم القلب في حاله عدم انتظام ضربات النظم (عدم انتظام دقات القلب البطيني ، والرجفان البطيني) عن طريق وضع المجاذيف الخارجية في قمة وقاعده للقلب وتقديم صدمه واحده في 5 ياء ، وزيادة في 5 زيادات J (أو كما يمكن اختيارها من قبل مزيل الرجفان) حتى 50 J ، تقويم القلب ، أو الإيقاع الأمم المتحدة صدمه. كرر الصدمات في 50 J حسب الضرورة.
    ملاحظه: في الدراسة المقدمة ، 89% من الاستعدادات المطلوبة رجفان. بعد تاخيرمن (~ 10 دقيقه), معدل ضربات القلب المتوسط من 70 ± 4.5 bpm (يعني ± SEM) ولوحظ للاحداث القلوب خنزير صغير (الشكل 2).
  10. مسح القلب مع ما لا يقل عن 1 لتر من الوسائط المعدلة Krebs-Henseleit ، دون أعاده تدوير ، لأزاله اي الدم المتبقية والقلبية. بمجرد تشغيل وسائل الاعلام واضحة من خلال القلب ، وإغلاق حلقه تعميم لتدوير perfusate.

3. دراسة الفيزيولوجيا الكهربية

  1. لتسجيل القيادة القياسية الثانية التخطيط الكهربائي (ECG) طوال فتره الدراسة ، ونعلق 29 ز ابره القطب إلى ابياردريوم البطين بالقرب من قمة ، مع قطب آخر في الأذين الأيمن. قم بتوصيل المدخلات الايجابيه والسلبية لمضخم حيوي تفاضلي إلى الأذين الأعلى والأيمن ، علي التوالي.
  2. ارفق قطب تحفيز ثنائي القطب علي الأذين الأيمن ، وقطب تحفيز ثان ثنائي القطب إلى البطين الأيسر الجانبي لأغراض السرعة.
  3. تيره القلب باستخدام محفز الفيزيولوجيا الكهربية ، مع تعيين الحالي الاوليه إلى ضعف عتبه الانبساطي (1 − 2 مللي أمبير) و 1 ms نبض العرض35،36.
    ملاحظه: إذا فشل التحفيز للحصول علي استجابه ، قد يتم زيادة عرض النبض تصل إلى 2 مللي ثانيه. المزيد من الحالية (~ 10x) وهناك حاجه مع أقطاب محوريه كبيره (التحفيز ثنائي القطب).
  4. حدد عتبه السرعة عن طريق تطبيق سلسله من نبضات التحفيز (1 − 2 مللي أمبير ، وعرض نبض ms 1) في أطوال دوره السرعة المحددة (PCL) لضمان استجابه محفزه متناسقة.
    ملاحظه: وبمجرد تاسيس المعدل الجوهري ، قد يبدا قطار الدفعة الاولي في PCL أقصر قليلا.
  5. تنفيذ سرعه خارج الطريق باستخدام اما S1 − s1 أو S1 − S2 سرعه القطار ، في هذا الأخير كان القطار من 6 − 8 نبضات (S1) متبوعا بدفعه واحده (S2). إنقاص S2 PCL تدريجي بواسطة ms 10 (اي ، 200 ms ، 190 ms ، 180 ms ، الخ) حتى يفشل في التقاط. الخطوة إلى ما قبل الأخير PCL (اي ، 190 ms) وانخفاض في 1 مللي ثانيه فواصل للعثور علي PCL الأكثر دقه قبل فقدان القبض (اي ، 184 ms).
    ملاحظه:
    يتم استخدام نفس معلمات التحفيز لكل من S1 و S2 (1 − 2 مللي أمبير ، وعرض نبض ms 1). انظر الشكل 3 للحصول علي أمثله تمثيليه ، أو القيم المنشورة سابقا علي القياسات الكهربية للقلب الخنازير37.
    1. لإنشاء فتره حراريه فعاله البطين (VERP) ، استخدم القطب التحفيز علي البطين الأيسر الجانبي لتحديد أقصر S1-S2 الفاصل الزمني الذي S2 (فوز سابق لأوانه) يبدا الاستقطاب البطين.
      ملاحظه: الفترة الحرارية هي أقصر الفاصل الزمني لاقتران S1 − S2.
    2. لتحديد طول دوره Wenckebach (وبكل) ، استخدم القطب الكهربائي التحفيزي علي الأذين الأيمن للعثور علي أقصر الفاصل الزمني S1 − S1 حيث ينتشر التوصيل الأذيني البطيني 1:1 عبر مسار التوصيل الطبيعي.
      ملاحظه: عدم القيام بذلك يمثل كتله القلب2 درجه .
    3. لتحديد وقت الاسترداد عقده الجيوب الانفيه (SNRT) ، استخدم القطب التحفيز علي الأذين الأيمن لتطبيق قطار سرعه (S1 − S1) وقياس الوقت التاخير بين الدافع الأخير في سرعه القطار ، والانتعاش من النشاط العفوي العقدة بوساطة.
    4. لإنشاء عقده الاذينيه البطينية فعاله الفترة الحرارية (AVNERP) ، استخدم القطب التحفيز علي الأذين الأيمن للعثور علي أقصر الفاصل الزمني لاقتران S1 − S2 الذي يتبع التحفيز الأذيني المبكر من قبل حزمه له المحتملة التي يثير QRS معقده ، مما يدل علي الاستقطاب البطيني.

4. رسم الخرائط البصرية من الجهد عبر الغشاء والكالسيوم داخل الخلايا

ملاحظه: وينبغي استخدام غير مقرنة الميكانيكية للتقليل من القطع الاثريه الحركة اثناء رسم الخرائط البصرية وتجنب نقص الأكسجين3,38,39,40. (-/-) Blebbistatin (5 ميكرون تعميم التركيز) يمكن ان تضاف ببطء كجرعة البلعه من 0.5 mM في 5 مل من perfusate (100x من التركيز النهائي)41. بدلا من ذلك ، قد يتم تضمين BDM في البداية في وسائل الاعلام perfusate في تركيز تعميم 20 ملم.

  1. اعداد صبغه الجهد عن طريق تذويب 5 ملغ من RH237 إلى 4 مل من DMSO لامائية. تمييع اليكووت صبغ مع ما يصل إلى 5 مل من وسائل الاعلام ودوامه. ببطء أضافه RH237 (62.1 ميكروغرام لكل 500 مل من perfusate) القريبة من cannula الابهر.
    ملاحظه: قد يكون النسيج عضله القلب أعاده ملطخه مع RH237, إذا لزم الأمر, طوال مده التجربة.
  2. اعداد صبغه الكالسيوم عن طريق تذويب 1 ملغ من Rhod2 إلى 1 مل من DMSO لامائية. مزيج الصبغة مع 50 μL من حمض التعددية ، ومكان في 37 درجه مئوية حمام سونينج لمده تصل إلى 10 دقيقه ، ومن ثم تمييع مع ما يصل إلى 5 مل من وسائل الاعلام. ببطء أضافه صبغه الكالسيوم (50 ميكروغرام لكل 500 مل من perfusate) القريبة من cannula الابهر.
    ملاحظه: لضمان صبغه صبغ موحده ، ينبغي أضافه الاصباغ ببطء (> 30 ثانيه). يستغرق الأمر ما يصل إلى 10 دقائق للوصول إلى الذروة ، في حين ان RH237 البقع القلب في غضون 1 − 2 دقيقه. باستخدام وصفت تحميل الصبغة ، واشاره إلى نسبه الضوضاء (الاستخبارات) نطاقات ~ 42 − 86 و ~ 35 − 69 للجهد والكالسيوم ، علي التوالي ، يمكن توقع. ويمكن حساب قيم الاستخبارات التابعة للاستخبارات الخاصة = (العد الذروة إلى الذروة)/(الانحراف المعياري اثناء الفترة الانبساطية)42.
  3. ضع أجهزه التصوير (الكاميرا ، ومقسم الصور ، والعدسة) كما هو موضح في الشكل 1، للتركيز علي مجال الرؤية المناسب.
    ملاحظه: يتم تكوين الخائن مع مراه ثنائيه الRH237 (660 + نانومتر) التي يمر بها ويعكس Rhod2 أطياف الانبعاثات. وتستخدم مرشحات البث عاليه الإرسال لRH237 (710 nm تمريره طويلة) و Rhod2 (585 ± 40 nm) المنبعثة ضوء (تمريره طويلة ET710 ، انظر جدول المواد). يتم إرفاق عدسه واسعه التلميذ 50 mm/F 0.95 l إلى الامام من الخائن الصورة. ينتج عن هذا التكوين فصل ضوء الانبعاث الكافي ، كما تم التحقق منه سابقا43،44.
  4. قم بتوصيل الكاميرا بمحطه العمل والحصول علي الصور باستخدام برنامج محدد ، مع فتره تعرض من 0.5 − 2 مللي ثانيه. تنفيذ محاذاة الصورة مع المعونة من البرامج التي يمكن تقسيم المناطق المطلوبة ، تراكب ، وعرض الطرح علي نطاق رمادي أو اللون الزائف بالاضافه إلى تسليط الضوء علي اختلال (انظر جدول المواد لخيار البرمجيات).
  5. إيقاف ضوء الغرفة للتقليل من التداخل الفلوري من الاضاءه المحيطة. اختبر أضواء LED (525 نانومتر ، 1.4 ميغاواط/مم2) قبل بدء التصوير لضمان الاضاءه الموحدة والقصوى للاضاءه ، كما يحددها المستشعر بعمق جيد.
    ملاحظه: يتم توجيه كل ضوء من خلال فلتر الاثاره (535 ± 25 نانومتر). يمكن تشغيل أضواء LED يدويا قبل التصوير لتعظيم الخطية اشاره. يتم تمرير الفلورية المنبعثة من ابيديارديوم من خلال الخائن الصورة ومرشحات الانبعاثات. يتم إسقاط الصور المنقسمة علي مستشعر عالي السرعة. مجال الرؤية هو ما يقرب من 12 سم × 10 سم ، أو 5.9 سم × 4.7 سم لكل صوره الانقسام ، اعتمادا علي اختيار العدسة والمسافة من القلب.
  6. لدراسات رسم الخرائط البصرية ، صوره عضله القلب اثناء إيقاع الجيوب الانفيه ، الرجفان البطيني (الشكل 4) أو سرعه ديناميكية (S1 − s1 ، 1 − 2 mA ، 1 مللي أمبير عرض) عن طريق القطب التحفيز المتمركزة علي البطين الأيسر (الشكل 5). تبدا مع سرعه دوره طول 350 ms ، وإنقاص بنسبه 10 − 50 مللي ثانيه لتوليد منحنيات الرد (الشكل 5 ه)35،36.

5-التنظيف

  1. أزاله القلب من النظام واستنزاف كل perfusate. شطف أنابيب النظام والغرف مع المياه النقية.
  2. للصيانة الروتينية ، اشطف النظام بشكل دوري بمحلول المنظفات أو محلول بيروكسيد الهيدروجين المخفف ، حسب الحاجة.

6. معالجه البيانات

  1. تاكد من جوده الاشاره الضوئية خلال الدراسة من خلال فتح ملف فيديو ، وتحديد منطقه ذات اهتمام ، والتامر بشكل مضان مع مرور الوقت باستخدام حزمه برامج مناسبه أو خوارزميه مخصصه.
  2. تحليل بيانات التصوير كما سبق وصفها23،33،43،45،46، لقياس إمكانات العمل والمعلمات الزمانيه المؤقتة للكالسيوم ، بما في ذلك وقت التنشيط ، الجهد الكالسيوم اقتران الوقت (الفرق بين الجهاز الظاهري والمرجع المصدق مرات التنشيط) ، وأعاده الاستقطاب قياسات المدة.
    1. تطبيق الدرس لعزل بكسل المصباح الفلورسنت وتجاهل البيانات الخلفية صاخبه.
      ملاحظه: سيقوم الدرس بتبسيط وتسريع التحليل عبر مقاطع الفيديو الكبيرة.
    2. الإشارات البصرية المرشحة مكانيا علي مساحة سطح الأرض التي تحتوي علي احجام نواه تتراوح من 3 مم × 3 مم إلى 5 مم × 5 مم ، كما هو ظاهر في الشكل 4 والشكل 5.
      ملاحظه: وهذا الأخير تحسين الاستخبارات دون تشويه العمل الميزات المحتملة ، المورفولوجية عابره الكالسيوم ، أو كفاف العام لجبهات الموجي19،47. قد يكون هذا غير ضرورية إذا كان استخدام جهاز استشعار مع بكسل كبيره أو إذا كان التسلق اثناء الاستحواذ.
    3. إشارات مرشح وقتيا مع فلتر ام بي الرقمية (علي سبيل المثال ، 5th-النظام بترورث) مع تردد قطع بين 100 و 75 هرتز للقضاء علي المحتوي اشاره ضئيله45.
      ملاحظه: انظر الشكل 5 جيم للحصول علي مثال للآثار المعالجة التمثيلية.
    4. تطبيق أزاله الانجراف والطرح ، عن طريق نث-ترتيب متعدد الحدود المناسب ، للتقليل من اثار الارتشاح الضوئي ، والحركة ، أو غيرها من مصادر هامه من الاختلاف.
    5. بعد معالجه وتطبيع البيانات البصرية عبر الفيديو بأكمله ، وحساب إمكانات العمل والمعلمات عابره الكالسيوم من الفائدة. تحديد وقت التنشيط ، الذي يعرف بأنه وقت الاشتقاق الأقصى اثناء الاستقطاب ، والذروة الفلورية من أجل حساب النسب المئوية لأعاده الاستقطاب والفترات (مده العمل المحتملة [APD] و [Ca2 +] i المدة [CaD] ، راجع الشكل 5).
    6. بعد يتم احتساب المعلمات الزمنيه ، وتوليد خرائط isochronal لتصوير جوانب من امكانيه عمل واحد أو عابره الكالسيوم عبر السطح ايابيدينال بأكمله باستخدام خوارزميات مخصصه23،33، 43،45،46.
      ملاحظه: انظر الشكل 5D للحصول علي مثال.

Representative Results

يظهر الشكل 1a رسما تخطيطيا لنظام القلب المعزول ، والذي يتضمن دائره الأنابيب ، والمضخة ، والفلتر ، والمكساج ، والخزانات ، وعناصر التسخين. يتم عرض وضع ECG (الرصاص الثاني التكوين) وسرعه الأقطاب الكهربائية في الشكل 1B، ويصور اعداد التصوير في الشكل 1b. يتم عرض تخطيطي للمكونات البصرية والمسارات الخفيفة في الشكل 1D.

أجريت دراسات تجريبية علي القلوب الكاملة المعزولة عن خنازير يوركشاير الاحداث (14 − 42 يوما ، ن = 18) التي تراوحت في الحجم من 2.5 − 10.5 كجم وزن الجسم و 18 − 137 غرام من وزن القلب (الشكل 2A). بعد نقل القلب المعزول إلى نظام لانغيندورف (37 درجه مئوية) ، استقر معدل ضربات القلب إلى 70 ± 4.5 bpm (يعني ± SEM) في غضون ~ 10 دقيقه من رجفان وظل ثابتا طوال مده الدراسة (الشكل 2 ب). معدل تدفق متوسط 184 ± 17 مل/دقيقه (يعني ± SEM) تم قياس ، والتي تباطات إلى 70 ± 7.5 ml/min بعد النبض مع وسائل الاعلام تحسنت التي تحتوي علي غير مقرنة الميكانيكية (الشكل 2c).

وسجلت الرصاص الثاني ECGs طوال مده الدراسة خلال إيقاع الجيوب الانفيه (الشكل 3A) أو استجابه لسرعه الخارجية (الشكل 3ب-ه) لقياس المعلمات الفسيولوجية الكهربائية. بالنسبة لتقييم EP ، تم تطبيق سرعه ديناميكية (S1 − S1) علي الأذين الأيمن لتحديد الوقت الذي يبدا فيه التعافي من النبض البطيني و SNRT (الانتعاش بعد S1-S1 ، الشكل 3 ج) ، حيث تم الرمز علي انه الرقم القصير PCL الذي بدا بالتوصيل الأذيني إلى البطين. تم تنفيذ بروتوكول سرعه S1 − S2 باستخدام قطب تحفيز ثنائي القطب علي البطين الأيسر من أجل تحديد أقصر فتره اقتران التي بدات الاستقطاب البطيني ، التالي الاشاره VERP (الشكل 3D). بدلا من ذلك ، يتم تطبيق بروتوكول سرعه الأذيني S1 − S2 لتحديد AVNERP (S1 − S2) ، كما هو موضح في الشكل 3E. الامثله التمثيلية من المعلمات الكهربائية قلب الخنزير محاذاة بشكل وثيق مع تلك التي نشرت سابقا37.

وأجريت تجارب الخرائط البصرية اثناء إيقاع الجيوب الانفيه ، والرجفان البطيني العفوي (الشكل 4) ، أو اثناء السرعة الديناميكية (S1 − s1) في البطين الأيسر (LV) لتوليد منحنيات رد الكهرباء والكالسيوم المبينة في الشكل 5 تظهر الصور التمثيلية لقلب الخنزير الصغير المحمل بالصبغة في الشكل 4 مع إمكانيات العمل البصرية المناظرة (Vm) والكالسيوم (Ca) العابرين التي تم جمعها من منطقتين من الفائدة علي سطح ابيديسارال (البطين الأيمن [RV] = الأزرق ، LV = الأحمر) . يتم عرض الإشارات غير المجهزة اثناء إيقاع الجيوب الانفيه واثناء الرجفان البطيني. كما ذكر سابقا ، استخدمت سرعه الاختبار الحيوي (S1 − S1) أيضا اثناء تجارب الخرائط البصرية لتطبيع اي فرق طفيف في معدل ضربات القلب المتاصله (الشكل 5ا-ه). يتم عرض الإشارات الخام (RV = الأزرق ، LV = الأحمر) ، والتي كانت تستخدم لتصوير العمل المحتملة-وقت اقتران الكالسيوم عابره (الشكل 5 ج) ، والتنشيط ومده الوقت (الشكل 5c) ، ورد الكهربائية والكالسيوم (الشكل 5c). لتحضيرات عضله القلب السميكة ، وتصفيه المكانية مع حجم النواة ~ 3 مم × 3 مم هو المناسبلاحتمال العمل ابيديسارال أو تحليل عابرالكالسيوم 19 ،47. ووفقا لذلك ، فان الصور ذات الاستبانة المكانية العالية (في الاعداد الموصوف 1240 x 1024 الإجمالي ، أو 620 × 512 لكل قناه ، وحجم البكسل البالغ 6.5 μm) غالبا ما تكون ذات قيمه مكانيه اثناء أو بعد الاستحواذ (الشكل 5 ج). يمكن اجراء معالجه الصور لتوليد التنشيط وأعاده الاستقطاب الخرائط باستخدام خوارزميات مخصصه23،33،43،45 (الشكل 3d) ، مع وقت التنشيط من تم تعريف كل بكسل علي القلب بأنه الحد الأقصى لمشتقه العمل المحتملة أو الكالسيوم عابره السكتة الدماغية.

Figure 1
الشكل 1: الاعداد التجريبي. (ا) رسم تخطيطي لنظام عزل القلب المعزول ؛ الأسهم تدل علي اتجاه التدفق. (ب) يظهر قلب التعليب مع وضع القطب الكهربي. RA = الأذين الأيمن ، RV = البطين الأيمن ، LV = البطين الأيسر ، ECG = الرصاص الثاني تخطيط القلب. (ج) منصة التصوير علي مقربه من انسجه القلب. (د) يتم فصل انبعاث كل مسبار تكميلي (الجهد والكالسيوم) بالطول الموجي باستخدام جهاز تقسيم الصورة مع مرشحات الانبعاثات المناسبة والمراه ثنائيه الابعاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: قياسات وزن القلب والمعدل والتدفق. (ا) وزن القلب إلى نسبه وزن الجسم لكل خنزير صغير يستخدم في الدراسة (ن = 18). (B) معدل ضربات القلب يقاس ~ 10 دقيقه بعد رجفان ومره أخرى في نهاية الدراسة (حوالي 1 ساعة). (ج) ينخفض تدفق الشريان التاجي بشكل مفاجئ بعد الانصهار مع الوصلة اليه (+ bdm) بسبب انخفاض الطلب علي الأكسجين. أشرطه المقياس تمثل يعني ± SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: أمثله تمثيليه من الرصاص الثاني الرسم الكهربائي التسجيلات التي تم جمعها خلال إيقاع الجيوب الانفيه أو استجابه لسرعه الخارجية. (ا) إيقاع الجيوب الانفيه العادي. (ب) مثالا علي سرعه الاختبار العصبي عند طول دوره 400 مللي ثانيه (S1 − s1) ، والتي استخدمت في تجارب التصوير. (C) الأعلى: سرعه الأذيني لتحديد الكلور ؛ لوحظ التقاط الناجحة في S1 = 250 ms حيث لوحظ الأذيني إلى التوصيل البطيني. لاحظ انه يمكن استخدام السرعة الاذينيه لتحديد SNRT (الوقت المناسب لتفريغ عقده الجيوب الانفيه ، بعد بدء السرعة الخارجية). أسفل: كما ينخفض طول دوره S1 إلى 205 مللي ثانيه ، يفشل التوصيل إلى البطين. (د) الأعلى: السرعة العالية (S1 − S2) لتحديد verp ؛ لوحظ التقاط الناجحة في S1 = 450 ms ، S2 = 300 ms أسفل: كما انخفض طول دوره S2 إلى 250 ms ، يفشل الانسجه البطينية للتقاط. (ه) السرعة الاذينيه (S1 − S2) لتحديد AVNERP. الأعلى: يتم ملاحظه التقاط الناجح عند S1 = 450 مللي ثانيه ، S2 = 200 مللي ثانيه: بما ان طول دوره S2 ينخفض إلى 199 مللي ثانيه ، يفشل التوصيل إلى البطين. الأسهم الزرقاء تدل علي سرعه المسامير ، والسهام الحمراء تدل علي القبض (' ج ') أو اي التقاط (' NC '). S1-s1 = سرعه ديناميكية ، S1 − S2 = سرعه الخارج. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: البيانات البصرية اثناء إيقاع الجيوب الانفيه والرجفان البطيني. اليسار: صور تمثيليه لقلب خنزير محمل بالصبغة (Vm = جهد كهربي ، RH237 ؛ Ca = الكالسيوم ، Rhod2) ، العرض الامامي. الجهد الكهربي المصفي الذي يتم تصفيته مكانيا وإشارات فلورسنت الكالسيوم داخل الخلايا من قلب الخنزير اثناء إيقاع الجيوب الانفيه (المركز). إشارات الجهد والكالسيوم اثناء الرجفان البطيني (يمين). احجام منطقه الاشاره (15 × 15 بكسل = 2.4 × 2.4 مم2، 30 × 30 = 4.8 × 4.8 مم2 حجم نواه) ممثله كمربعات حمراء وزرقاء. الوحدات = ΔF/f. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: معطيات بصريه من [لنندوروف]-[بردورف] خنزير قلوب. غير المجهزة ، التيتمت تصفيتها مكانيا (ا) الجهد عبر غشاء و (ب) إشارات فلوري الكالسيوم داخل الخلايا من البطينين الأيمن والأيسر اثناء سرعه الكهربائية في قمة. والإشارات غير المصفاة والمتوسطة المكانية تصور إمكانيات العمل البصري وعابري الكالسيوم من مناطق الاهتمام (وحدات الاشاره هي ΔF/F). (ج) تراكب من العابرين تطبيع يوضح العمل المحتملة-وقت اقتران الكالسيوم عابره (تمريره منخفضه تصفيتها في 75 هرتز). (د) معالجه الإشارات عبر السطح العصبي لتوليد خرائط isochronal من المعلمات الزمنيه ، بما في ذلك وقت التنشيط (tact) و 80 ٪ وقت أعاده الاستقطاب. (ه) منحنيات رد الشحنات الكهربائية والكالسيوم العابرة المتولدة علي ترددات متعددة (يسار) مع تحليل إحصائي (يمين) لتوضيح وقت أطول لأعاده الاستقطاب عند أطوال دوره السرعة الابطا. قضبان مقياس = يعني ± SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الكيميائيه الصيغه الوزن الجزيئي g/L
كلوريد الصوديوم كلوريد 58.44 5.26
غلوكونات الصوديوم C6H11الحسابية7 218.14 5.02
خلات الصوديوم ثلاثي الهيدرات C2ح3الحسابية2• 3h2س 136.08 3.68
كلوريد البوتاسيوم بوكل 74.55 0.63
كلوريد المغنيسيوم (لا مائي) MgCl2 95.21 0.1405
8.4% بيكربونات الصوديوم شركه النهدي3 84.01 13
مانيتول C6H14O6 182.17 16.3
كبريتات المغنيسيوم MgSO4 120.37 4
الرقم الهيدروجيني 7.4
اوسمولاريتي (mOsmol/L) 294

الجدول 1: وصفه القلب المعدلة ديل نيدو.

Discussion

علي الرغم من ان نماذج البحوث القلب والاوعيه الدموية تتراوح من الخلوية إلى في الاستعدادات المجرية ، وهناك المقايضة المتاصله بين الاهميه السريرية والمنفعة التجريبية. وعلي هذا الطيف ، يبقي القلب المعزول لانغندورف-بيرفاستخدام حلا توفيقيا مفيدا لدراسة فسيولوجيا القلب48. نموذج القلب كله يمثل مستوي اعلي من التكامل الوظيفي والهيكلي من أحاديه الخلية أو الانسجه أحاديه الطبقات ، ولكن أيضا يتجنب التعقيدات المربكة المرتبطة بالنماذج المجرية. ومن المزايا الرئيسية خلال التجارب المزدوجة لرسم الخرائط البصرية انه يمكن ملاحظه سطح القلب المعزول ، ويمكن استخدام التصوير الفلوري لإمكانات الغشاء الغشائي ومعالجه الكالسيوم لمراقبه فسيولوجيا القلب34.

نماذج القوارض هي الأكثر شيوعا لمستحضرات القلب المعزولة بدلا من الماشية الكبيرة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى التكلفة المرتبطة بها ليصل التحجيم جميع العناصر المعنية (علي سبيل المثال ، حجم الحل ، الدائرة ترويه ، كميه من الاصباغ واليات غير المقرنة) إلى جانب المزيد من عدم الاستقرار والميل لاضطراب نظم القلب في الماشية الأكبر10،36،49. ميزه واحده لاستخدام قلوب الخنازير هو انها تشبه بشكل وثيق القلب البشري في هيكل وحجم ومعدل الانكماش ، التالي أكثر دقه نمذجة المعلمات الديناميكية الدموية مثل تدفق الدم التاجي والناتج القلبي. بالمثل, يتلقى أناس وخنازير مماثله كالسيوم يعالج, تخطيط كهربية فواصل37, وعمل امكانيه مورفولوجية بما في ذلك القناات أساسيه ان هو يمثل12,50,51, 52. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل الخطوات اللازمة لإنشاء نموذج حيواني كبير قابل للتكرار لتوصيف وظيفة عضله القلب بشكل شامل. التصوير في وقت واحد من الجهد عبر الغشاء (RH237) والكالسيوم داخل الخلايا (Rhod2) ، وتستخدم بالاقتران مع البروتوكولات الكهربائية المعمول بها ، ويوفر الفرصة لتحديد أليات التي هي المسؤولة عن تغيير القلب وظيفه. ويمكن استخدام المنهجية الموصوفة لاختبار السلامة قبل السريرية ، والفحص السمية والتحقيق في الامراض الوراثية أو امراض أخرى. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تعديل المنهجية الموصوفة وتكييفها للاستخدام مع نماذج القلب الأخرى (علي سبيل المثال ، البوليسية ، الإنسان) اعتمادا علي تركيز البحث المحدد53،54،55.

هناك بعض التعديلات الهامه لناخذ في الاعتبار عند الانتقال من نموذج القوارض أصغر إلى نموذج خنزير أكبر للعزل, الاستعدادات القلب كله. اثناء الاعداد والاعداد ، نوصي باضافه الزلال إلى perfusate للحفاظ علي الضغط اونكوتيك والحد من الوذمه (بالاضافه إلى انتيفوم ، إذا لزم الأمر)56،57،58،59. وعلاوة علي ذلك ، perfusate التي تحتوي علي الزلال يمكن ان تساعد أيضا في الدراسات الايضيه التي تتطلب أيضا الأحماض الدهنية-مكملات لوسائل الاعلام60،61. وخلافا لقلوب القوارض ، فان قلب الخنزير الأكبر لا يحتاج إلى الغمر في وسائل الاعلام الدافئة نظرا لصغر نسبه سطحه إلى حجمه وزيادة حجم وسائل الاعلام المتدفقة من خلال الاوعيه التاجية التي تحافظ علي درجه الحرارة بشكل أفضل. وكما ذكر سابقا ، وضعنا مجسات درجه الحرارة داخل البطين الأيمن وعلي السطح الرائع للبطينات اليمني واليسرى ، مع ملاحظه تقلبات طفيفه في درجه الحرارة من 1 − 2 درجه مئوية في جميع المواقع الثلاثة خلال الدراسة. والاهم من ذلك ، يمكن لهذه المعدلات تدفق أسرع أيضا زيادة احتمال فقاعات وانسداد المحتملة. للالتفاف علي هذه المشكلة ، نوصي باستخدام فخ فقاعه مع أنابيب كبيره تتحمل المؤدية مباشره إلى cannula الابهر. المثل ، وجدنا انه من المفيد للغاية ان يكون اثنين من الافراد الذين يعملون في ترادف لتعليب الشريان الابهر علي أكبر (وأثقل) القلب. شخص واحد لعقد الشريان الاورطي مفتوحة مع الأرقاء قوي واخر لتامين الشريان الابهر إلى التفت باستخدام الشريط السري. في المنهجية الموصوفة ، وجدنا ان الانصهار مع القلب والرجفان كانت حيوية للانتعاش القلبي ، وهو ما يتناقض مع الاستعدادات للقلب القوارض. في تجربتنا ، فقط عدد قليل من قلوب المثيرة استانفت النشاط العادي يحركها الجيوب الانفيه دون تقويم القلب.

لتحسين نقاط نهاية التصوير البصري ، فان اعداد القلب المعلق يحد من تاثير الوهج الذي يمكن ان يحدث مع القلب المغمور. وعلاوة علي ذلك ، فان القلب المعلق يتجنب أيضا اي ضغط أو حل وسط للاوعيه التاجية علي الجانب الخلفي من القلب الذي يمكن ان يحدث عند وضع القلب لأسفل أفقيا للتصوير الراسي. وجدنا أيضا ان تحميل الاصباغ الفلورية بعد فخ فقاعه (علي مقربه من cannula الابهر) تحسنت كثيرا تلطيخ الانسجه والإشارات البصرية. وأخيرا ، لتحسين نقاط النهاية الكهربية للقلب ، سهل استخدام قطب التحفيز المحوري الأكبر سرعه الأذيني الناجح. علي الرغم من اننا وصف استخدام كهربي لتحديد القبض وفقدان القبض علي مختلف المعلمات EP ، ويمكن أيضا ان تستخدم القسطرة داخل الداخل أو أقطاب التسجيل ثنائي القطب.

وركزت دراستنا علي تطوير منهجيه لرسم الخرائط البصرية المزدوجة والتقييم الكهربي القلبي في نموذج القلب المعزول ، سليمه الخنازير. نظرا لأوجه التشابه مع القلب البشري الحدث ، يبقي قلب الخنازير نموذجا شعبيا للدراسات التي تركز علي طب القلب للأطفال أو عيوب القلب الخلقية. والاهم من ذلك ، يمكن تكييف النهج الموصوف لاستخدامه مع قلوب الكبار الأكبر حجما و/أو أنواع مختلفه من الاهتمام. في الواقع ، قد تجد مختبرات أخرى ان استخدام البوليسية أو القلوب البشرية (اما المتبرع أو المريضة) هي أكثر انطباقا علي التركيز علي البحوث الخاصة بهم53،54،55. ومن القيود المحتملة الأخرى علي هذه الدراسة استخدام الوصلة الميكانيكية لتقليل الحركة الملموسة اثناء التصوير. وقد أصبح blebbistatin المقرنة الاختيار في تطبيقات التصوير القلب نظرا لتاثيراته الحد الأدنى علي المعلمات تخطيط القلب ، والتنشيط والفترات الحرارية41،62،63. BDM هو خيار اقل تكلفه ، والتي يمكن ان تكون مهمة بشكل خاص في الدراسات الحيوانية الكبيرة التي تتطلب كميات أكبر من perfusate وغير مقرنة الميكانيكية ، ولكن من المعروف ان يكون لها تاثير أكبر علي تيارات البوتاسيوم والكالسيوم التي يمكن ان تغير امكانيه العمل المورفولوجية64،65،66،67. إذا تم استخدام BDM ، لاحظ ان تقصير APD يزيد من هشاشة القلوب لأرريثمياس الناجمة عن الصدمات68. وعلي العكس من ذلك ، فان القيد الرئيسي لاستخدام blebbistatin هو حساسية للضوء والضوئية ، علي الرغم من ان الصيغ البديلة التي خفضت هذه الآثار69،70،71. وأخيرا ، تستخدم المنهجية الموصوفة نظام كاميرا واحده لتجريب الخرائط البصرية المزدوجة ، ولكن من المهم ان نلاحظ ان الدراسات البحثية ركزت علي الرجفان البطيني و/أو تتبع الموجات الكهربائية عبر السطح الابيديكال سوف تحتاج إلى تعديل هذا النهج لتشمل التصوير البانورامي ثلاثي الابعاد ، علي النحو الموصوف من قبل الآخرين15،19،72،73،74،75 .

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ويعرب المؤلفون عن امتنانهم للدكتور ماثيو كاي للتوجيه التجريبي المفيد ، والسيد مانيل رمضان والمساعد شودري للحصول علي المساعدة التقنية. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01HL139472 إلى NGP ، R01 HL139712 إلى NI) ، معهد بحوث الأطفال ، معهد القلب الوطني للأطفال ومعهد الشيخ زايد للابتكار الجراحي للأطفال.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560-5MG Mechanical Uncoupler
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753-100G Mechanical Uncoupler
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9418
Analog signal interface emka Technologies itf16USB
Antifoam Sigma-Aldrich A5758-250ML
Antifoam Y-30 Emulsion Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A5758
Aortic cannula, 5/16” Cole-Parmer 45509-60
Bubble trap Sigma-Aldrich CLS430641U-100EA
CaCl2 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ C77-500
Camera, sCMOS Andor Technology Zyla 4.2 PLUS
Coaxial stimulation electrode (atria) Harvard Apparatus 73-0219
Defibrillator Zoll M Series
Dichroic mirror Chroma Technology T660lpxrxt-UF2
Differential amplifier Warner Instruments DP-304A
Emission filter, calcium Chroma Technology ET585/40m
Emission filter, voltage Chroma Technology ET710lp
EP stimulator (Bloom) Fisher Medical DTU-215B
Excitation filter Chroma Technology CT510/60bp
Excitation lights Thorlabs SOLIS-525C
Filter McMaster-Carr 8147K52
Filter cartridge, polypropylene Pentair PD-5-934
Filter housing McMaster-Carr 9979T21
Flow transducer Transonic ME6PXN
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 158968
Heating coil Radnoti 158821
Hemofilter Hemocor HPH 400
Hemostatic Forceps World Precision Instruments 501326
Image Splitter Cairn Research OptoSplit II
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P3911
KH2PO4 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ 423-316
Large-bore tubing, I.D. 3/8” Fisher Scientific 14-169-7H
Lens 50 mm, 0.95 f-stop Navitar DO-5095
Metamorph Molecular Devices Image Alignment
MgSO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506
Mucasol detergent Sigma-Aldrich Z637181-2L
Na Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P2256
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S-3014
NaHCO3 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S-233
Needle Electrodes 29 G, 2 mm AD Instruments Inc. MLA1204
Noise eliminator Quest Scientific Humbug
Perfusion pump PolyStan A/S 1481
Pressure transducer World Precision Instruments BLPR2
Reservoir, 2 L Cole-Parmer UX-34541-07
RH237 AAT Bioquest Inc. 21480
Rhod2-AM AAT Bioquest Inc. 21062
Stimulation electrode (ventricle) Harvard Apparatus 73-0160
Surgical Suture McKesson Medical-Surgical 890186
Transducer amplifier World Precision Instruments TBM4M
Tubing flow console Transonic TS410
Umbilical tape Jorvet J0025UA
Water bath/circulator VWR 89400-970
Surgical Tools
Bandage shears Harvard Apparatus 72-8448 Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0 mm blade length, 17.0 cm
Electrocautery Dalwha Corp. Ltd. BA2ALD001 Model: 200 Basic
Hemostat Roboz RS-7476 St Vincent Tube Occluding Forceps
Hemostatic forceps Harvard Apparatus 72-8960 Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm
Hemostats Harvard Apparatus 72-8985 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2 mm tip 14 cm
Mayo scissors WPI 501749 14.5 cm, Straight
Metzenbaum scissors WPI 501747 11.5 cm, Straight
Mosquito forceps Harvard Apparatus 72-8980 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2 mm tip width 12 cm
Needle holder Harvard Apparatus 72-8828 Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length
Pediatric cross clamp Roboz RS-7660 Cooley-Derra Clamp 6.25" 5 mm Calibrations
Right angle forceps WPI 501240 Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14 cm, Right Angle
Scalpel Ted Pella 549-4 Scalpel Handle No. 4, 13.7 cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades
Scissors Harvard Apparatus 72-8380 Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42 mm blade,12 cm
Straight Serrated forceps WPI 500363 Dressing Forceps 15.5 cm
Towel clamp WPI 501700 Backhaus Towel Clamp, 13 cm, Curved, Locking handle, SS
Weitlaner retractor WPI 501314 Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2 cm, 2x 3 Sharp Prongs
Disposables
3-0 prolene suture Various vendors Various vendors
Vessel loop Aspen surgical 011001PBX Sterion® Vessel Loop, 0.8 mm x 406 mm
Cardioplegia (Plegisol) Pfizer 00409-7969-05 Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20 mL/kg
Heparin Various vendors Various vendors 300 U/kg
Syringe and Needle Various vendors Various vendors 60 mL & 18 G respectively
Umbilical tape Ethicon U12T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., De Jesus, N. M., Ripplinger, C. M. Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart. Journal of Visualized Experiments. (103), e53166 (2015).
  2. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2012).
  3. Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. Journal of Visualized Experiments. (65), e4115 (2012).
  4. Capecchi, M. R. The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting. Trends in genetic. 5, (3), 70-76 (1989).
  5. Hall, B., Limaye, A., Kulkarni, A. B. Overview: generation of gene knockout mice. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, Unit 19 1-17 (2009).
  6. Schechter, M. A., et al. An Isolated Working Heart System for Large Animal Models. Journal of Visualized Experiments. (88), e51671 (2014).
  7. Arlock, P., et al. Ion currents of cardiomyocytes in different regions of the Göttingen minipig heart. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 86, 12-18 (2017).
  8. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of anatomy. 193, Pt 1 105-119 (1998).
  9. Markert, M., et al. Validation of the normal, freely moving Göttingen minipig for pharmacological safety testing. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 60, (1), 79-87 (2009).
  10. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141, (3), 235-249 (2014).
  11. Bertho, E., Gagnon, G. A comparative study in three dimension of the blood supply of the normal interventricular septum in human, canine, bovine, porcine, ovine and equine heart. Diseases of the Chest. 46, 251-262 (1964).
  12. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53, (5), 432-438 (2014).
  13. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3, (4), 30 (2016).
  14. Jordan, C. P., et al. Minimally Invasive Resynchronization Pacemaker: A Pediatric Animal Model. The Annals of Thoracic Surgery. 96, (6), 2210-2213 (2013).
  15. Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophysical Journal. 92, (3), 1090-1095 (2007).
  16. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden Saugethierherzen [Investigations on the surviving mammalian heart]. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1895).
  17. Pumir, A., Arutunyan, A., Krinsky, V., Sarvazyan, N. Genesis of ectopic waves: role of coupling, automaticity, and heterogeneity. Biophysical Journal. 89, (4), 2332-2349 (2005).
  18. Kay, M. W., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Rogers, J. M. Lifetimes of epicardial rotors in panoramic optical maps of fibrillating swine ventricles. American journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 291, (4), 1935-1941 (2006).
  19. Lee, P., et al. Low-Cost Optical Mapping Systems for Panoramic Imaging of Complex Arrhythmias and Drug-Action in Translational Heart Models. Scientific Reports. 7, 43217 (2017).
  20. Venkataraman, R., Holcomb, M. R., Harder, R., Knollmann, B. C., Baudenbacher, F. Ratiometric imaging of calcium during ischemia-reperfusion injury in isolated mouse hearts using Fura-2. BioMedical Engineering OnLine. 11, (1), 39 (2012).
  21. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical Imaging of the Heart. Circulation Research. 95, (1), 21-33 (2004).
  22. Zimmermann, W. H., et al. Three-dimensional engineered heart tissue from neonatal rat cardiac myocytes. Biotechnology and Bioengineering. 68, (1), 106-114 (2000).
  23. Jaimes, R., et al. A Technical Review of Optical Mapping of Intracellular Calcium within Myocardial Tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310, (11), 1388-1401 (2016).
  24. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110, (4), 609-623 (2012).
  25. Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. Imaging Calcium Sparks in Cardiac Myocytes. Methods in Molecular Biology. 689, Clifton, N.J. 205 (2011).
  26. Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).
  27. Thomas, K., Goudy, J., Henley, T., Bressan, M. Optical Electrophysiology in the Developing Heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5, (2), 28 (2018).
  28. Nikolski, V., Efimov, I. Fluorescent imaging of a dual-pathway atrioventricular-nodal conduction system. Circulation Research. 88, (3), 23-30 (2001).
  29. Posnack, N. G., et al. Bisphenol A Exposure and Cardiac Electrical Conduction in Excised Rat Hearts. Environmental Health Perspectives. 122, (4), 384-390 (2014).
  30. Garrott, K., et al. KATP channel inhibition blunts electromechanical decline during hypoxia in left ventricular working rabbit hearts. The Journal of Physiology. 595, (12), 3799-3813 (2017).
  31. Wang, Z., et al. Exposure to Secondhand Smoke and Arrhythmogenic Cardiac Alternans in a Mouse Model. Environmental Health Perspectives. 126, (12), 127001 (2018).
  32. Francis Stuart, S. D., et al. Age-related changes in cardiac electrophysiology and calcium handling in response to sympathetic nerve stimulation. The Journal of Physiology. 596, (17), 3977-3991 (2018).
  33. Jaimes, R., et al. Plasticizer Interaction With the Heart: Chemicals Used in Plastic Medical Devices Can Interfere With Cardiac Electrophysiology. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12, (7), (2019).
  34. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE reviews in Biomedical Engineering. 7, 115-125 (2014).
  35. Li, N., Wehrens, X. H. Programmed Electrical Stimulation in Mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730 (2010).
  36. Dor-Haim, H., Berenfeld, O., Horowitz, M., Lotan, C., Swissa, M. Reduced Ventricular Arrhythmogeneity and Increased Electrical Complexity in Normal Exercised Rats. PLoS ONE. 8, (6), 66658 (2013).
  37. Noszczyk-Nowak, A., et al. Normal Values for Heart Electrophysiology Parameters of Healthy Swine Determined on Electrophysiology Study. Advances in Clinical and Experimental. 25, (6), 1249-1254 (2016).
  38. Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Kay, M. W. NADH changes during hypoxia, ischemia, and increased work differ between isolated heart preparations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306, (4), 529-537 (2014).
  39. Schramm, M., Klieber, H. G., Daut, J. The energy expenditure of actomyosin-ATPase, Ca(2+)-ATPase and Na+,K(+)-ATPase in guinea-pig cardiac ventricular muscle. The Journal of Physiology. 481, 647-662 (1994).
  40. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 314, (4), 704-715 (2018).
  41. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4, (5), 619-626 (2007).
  42. Evertson, D. W., et al. High-Resolution High-Speed Panoramic Cardiac Imaging System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55, (3), 1241-1243 (2008).
  43. Jaimes, R., et al. Path Splitter: A New Approach for Truly Simultaneous Dual Optical Mapping of the Heart with a Single Camera. bioRxiv. 651380 (2019).
  44. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  45. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303, (7), 753-765 (2012).
  46. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9, (1), 1389 (2019).
  47. Mironov, S. F., Vetter, F. J., Pertsov, A. M. Fluorescence imaging of cardiac propagation: spectral properties and filtering of optical action potentials. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291, (1), 327-335 (2006).
  48. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55, (2), 113-126 (2007).
  49. Nishida, K., Michael, G., Dobrev, D., Nattel, S. Animal models for atrial fibrillation: clinical insights and scientific opportunities. Europace. 12, (2), 160-172 (2010).
  50. Verdouw, P. D., Van Den Doel, M. A., De Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39, (1), 121-135 (1998).
  51. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3, (4), 30 (2016).
  52. Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as Models in Biomedical Research and Toxicology Testing. Veterinary Pathology. 49, (2), 344-356 (2012).
  53. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical Volume of Human Myocardium Necessary to Maintain Ventricular Fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11, (11), 006692 (2018).
  54. Hill, A. J., et al. In Vitro Studies of Human Hearts. The Annals of Thoracic Surgery. 79, (1), 168-177 (2005).
  55. Fedorov, V. V., et al. Structural and functional evidence for discrete exit pathways that connect the canine sinoatrial node and atria. Circulation Research. 104, (7), 915-923 (2009).
  56. Jacob, M., et al. Albumin Augmentation Improves Condition of Guinea Pig Hearts After 4 hr of Cold Ischemia. Transplantation. 87, (7), 956-965 (2009).
  57. Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 254, (6), 1105-1112 (1988).
  58. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41, (6), 613-627 (2000).
  59. Werner, J. C., Whitman, V., Fripp, R. R., Schuler, H. G., Morgan, H. E. Carbohydrate metabolism in isolated, working newborn pig heart. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 241, (5), 364-371 (1981).
  60. Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303, (2), 156-167 (2012).
  61. Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 13, (1), 168-172 (1989).
  62. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302, (1), 262-269 (2012).
  63. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, (5), 503-512 (2012).
  64. Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89, (2), 163-172 (2004).
  65. Liu, Y., et al. Effects of diacetyl monoxime on the electrical properties of sheep and guinea pig ventricular muscle. Cardiovascular Research. 27, (11), 1991-1997 (1993).
  66. Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25, (45), 419-424 (2010).
  67. Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, (6), 305-313 (1994).
  68. Cheng, Y., Li, L., Nikolski, V., Wallick, D. W., Efimov, I. R. Shock-induced arrhythmogenesis is enhanced by 2,3-butanedione monoxime compared with cytochalasin D. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, (1), 310-318 (2004).
  69. Kolega, J. Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light. Biochemical and Biophysical Research Communications. 320, (3), 1020-1025 (2004).
  70. Sakamoto, T., Limouze, J., Combs, C. A., Straight, A. F., Sellers, J. R. Blebbistatin, a myosin II inhibitor, is photoinactivated by blue light. Biochemistry. 44, (2), 584-588 (2005).
  71. Várkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, (1), 26141 (2016).
  72. Bray, M. A., Lin, S. F., Wikswo, J. P. Three-dimensional surface reconstruction and fluorescent visualization of cardiac activation. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 47, (10), 1382-1391 (2000).
  73. Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. Journal of Biomedical Optics. 12, (4), 44019 (2007).
  74. Gloschat, C., et al. RHYTHM: An Open Source Imaging Toolkit for Cardiac Panoramic Optical Mapping. Scientific Reports. 8, (1), 2921 (2018).
  75. Kay, M. W., Amison, P. M., Rogers, J. M. Three-dimensional surface reconstruction and panoramic optical mapping of large hearts. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 51, (7), 1219-1229 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics