पूर्व वीवो लैंगेंडोर्फ-पर्फ्यूज ्डहार्ट्स के ऑप्टोकार्डियोग्राफी और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी स्टडीज

Medicine
 

Summary

इस अध्ययन का उद्देश्य एक अनुवादपशु मॉडल का उपयोग कर हृदय गतिशीलता की जांच के लिए एक विधि स्थापित करना था । वर्णित प्रायोगिक दृष्टिकोण में एक अलग, अक्षुण्ण पोर्सिन हार्ट मॉडल में विद्युत गतिविधि का आकलन करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के साथ दोहरी उत्सर्जन ऑप्टोकार्डियोग्राफी को शामिल किया गया है।

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Swift, L. M., Jaimes III, R., McCullough, D., Burke, M., Reilly, M., Maeda, T., Zhang, H., Ishibashi, N., Rogers, J. M., Posnack, N. G. Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts. J. Vis. Exp. (153), e60472, doi:10.3791/60472 (2019).

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Abstract

छोटे पशु मॉडल सबसे अधिक बड़े जानवरों की तुलना में आनुवंशिक रूप से संशोधित प्रजातियों और कम लागत की उपलब्धता के कारण हृदय अनुसंधान में उपयोग किया जाता है। फिर भी, बड़े स्तनधारी सामान्य हृदय शरीर विज्ञान, रोगविज्ञान, और चिकित्सीय एजेंटों के प्रीक्लिनिकल परीक्षण से संबंधित अनुवादअनुसंधान प्रश्नों के लिए बेहतर अनुकूल हैं। हृदय अनुसंधान में एक बड़े पशु मॉडल को नियोजित करने से जुड़ी तकनीकी बाधाओं को दूर करने के लिए, हम एक अलग, लैंगेंडोर्फ-परफेक्ट पिलेट हार्ट में शारीरिक मापदंडों को मापने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। यह दृष्टिकोण दिल की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए दो शक्तिशाली प्रयोगात्मक उपकरणों को जोड़ती है: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (ईपी) अध्ययन और पैरामीटर संवेदनशील रंगों (RH237, Rhod2-AM) का उपयोग करके ट्रांसमेम्ब्रेन वोल्टेज और इंट्रासेलर कैल्शियम का एक साथ ऑप्टिकल मैपिंग। वर्णित पद्धतियां हृदय चालन प्रणाली की जांच करने वाले अनुवादात्मक अध्ययनों, कार्रवाई संभावित आकृति विज्ञान में परिवर्तन, कैल्शियम हैंडलिंग, उत्तेजना-संकुचन युग्मन और हृदय परिवर्तन की घटनाओं या हृदय परिवर्तन की घटनाओं के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं अतालता।

Introduction

हृदय रोग दुनिया भर में बीमारी और मौत का एक प्रमुख कारण है। इस प्रकार, एक प्राथमिक शोध फोकस उन पद्धतियों को अनुकूलित करना है जिनका उपयोग सामान्य हृदय शरीर विज्ञान और अंतर्निहित तंत्रों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो मनुष्यों में रुग्णता और मृत्यु दर में योगदान दे सकते हैं। बुनियादी हृदय अनुसंधान पारंपरिक रूप से छोटे पशु मॉडल पर भरोसा किया है, कृंतक औरखरगोशसहित 1,2,3,आनुवंशिक रूप से संशोधित प्रजातियों की उपलब्धता के कारण4, कम लागत, छोटे प्रयोगात्मक पदचिह्न, और उच्च थ्रूपुट। हालांकि, सुअर मॉडल के उपयोग में अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक डेटा 6 प्रदान करनेकीक्षमता है। दरअसल, पिछले अध्ययनों में मनुष्यों और सूअरों के बीच कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (EP) में समानताएं प्रलेखित की गई हैं, जिनमें समान आयन धाराएं7,एक्शन संभावित आकार8और औषधीय परीक्षण9के जवाब शामिल हैं। इसके अलावा, पोर्सिन दिल में संकुचन और विश्राम काइनेटिक्स होते हैं जो मनुष्यों के लिए कृंतक या खरगोश10की तुलना में अधिक तुलनीय होते हैं। एक कैनाइन मॉडल की तुलना में, पोर्सिन कोरोनरी एनाटॉमी अधिक बारीकी से एक मानव दिल11,12 जैसा दिखता है और दिल के विकास, बाल चिकित्सा कार्डियोलॉजी और/या जन्मजात हृदय दोषों पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए पसंद का मॉडल है 13. हालांकि सुअर और मानव हृदय8के बीच मतभेद हैं , लेकिन ये समानताएं पोर्सिन दिल को हृदय अनुसंधान14के लिए एक मूल्यवान मॉडल बनाती हैं ।

दिल का प्रतिगामी परफ्यूजन हृदय की गतिशीलता पूर्व वीवो15 का अध्ययन करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल बन गया है क्योंकि पहली बार ओस्कर लैंगेंडोर्फ16द्वारा स्थापित किया गया था । तदनुसार, लैंगेंडोर्फ-पेरिफ्यूजन का उपयोग स्वायत्त प्रभावों के अभाव में एक अलग, अक्षुण्ण दिल का समर्थन करने के लिए किया जा सकता है। यह मॉडल सीधे हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और स्वस्थ और गैर-स्वस्थ दिलों के बीच संकुचन की तुलना करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। चूंकि हृदय की गतिशीलता अस्थायी और स्थानिक रूप से जटिल दोनों हैं, इसलिए एक क्षेत्र में मामूली परिवर्तन नाटकीय रूप से पूरे दिल की सिंक्टियम17के रूप में काम करने की क्षमता को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, पैरामीटर संवेदनशील रंगों की उच्च स्थानिक इमेजिंग हृदय की सतह पर हृदय समारोह की निगरानी के लिए एक उपयोगी उपकरण है18,19। दरअसल, वोल्टेज और कैल्शियम के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच की एक साथ दोहरी इमेजिंग ऊतक स्तर20,21पर विद्युत गतिविधि, कैल्शियम हैंडलिंग और उत्तेजना-संकुचन युग्मन के आकलन के लिए अनुमति देताहै, 22,23,24,25,26,27,28. लैंगेंडोर्फ-perfusion और/या ऑप्टिकल मैपिंग तकनीकों पहले उंर बढ़ने या आनुवंशिक उत्परिवर्तन के कारण हृदय प्रदर्शन में गिरावट दस्तावेज़ के लिए इस्तेमाल किया गया है, और औषधीय एजेंटों या पर्यावरण जोखिम29 की सुरक्षा का आकलन करने के लिए ,30, 31,32,33.

नैदानिक सेटिंग में, एक आक्रामक हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन का उपयोग अक्सर हृदय लय में गड़बड़ी की जांच करने, विकृतियों की पहचान करने और संभावित उपचार विकल्पों को इंगित करने के लिए किया जाता है। इसी तरह, हम एक ईपी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग सिनस नोड फ़ंक्शन का आकलन करने, एट्रिओवेनेट्रिकुलर चालन को मापने और मायोकार्डियल ऊतक के अपवर्तकता की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। वर्णित ईपी अध्ययन ऑप्टिकल मैपिंग, या ऑप्टोकार्डियोग्राफी34के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है, पूरी तरह से अलग दिलों में हृदय शरीर विज्ञान की विशेषता है। वर्णित प्रोटोकॉल में, उच्च स्थानिक संकल्प फ्लोरेसेंस इमेजिंग को दोहरे उत्सर्जन सेटअप में वोल्टेज (RH237) और कैल्शियम (रोड-2AM) रंगों के संयोजन के साथ किया गया था। इसके अतिरिक्त, कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मापदंडों दोनों सिनास लय के तहत और प्रोग्राम विद्युत उत्तेजना के जवाब में निगरानी की गई।

Protocol

सभी प्रयोग प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग (आठवें संस्करण) के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित किए गए थे । इन अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले सभी तरीकों और प्रोटोकॉलों को एनआईएच द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के दिशा-निर्देशों के बाद बच्चों के राष्ट्रीय अस्पताल में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग प्रोटोकॉल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है । इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सभी जानवरों को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुपालन में मानवीय देखभाल प्राप्त हुई।

1. तैयारी

  1. संशोधित क्रेब्स-हेंसेलिट समाधान16 (एमएम: 118.0 एनसीएल, 3.3 केसीएल, 1.2 एमजीएसओ4,24.0 नाहको3,1.2 KH2पीओ4,10.0 ग्लूकोज, 2.0 सोडियम पायरुवेट, 2% एल्बुमिन, 2.0 सीएसीएल2)के 6 एल तैयार करें। प्रयोग के दिन सीएसीएल2 जोड़ें, क्योंकि समय के साथ, फॉस्फेट की उपस्थिति में, कैल्शियम क्लोराइड कैल्शियम फॉस्फेट के रूप में समाधान से बाहर निकल जाएगा।
  2. बाँझ छानने के बाद पीएच को 7.4 पर समायोजित करें (पोर आकार: 0.22 माइक्रोन)। 275−310 एमओएसएम/किलोग्राम की रेंज सुनिश्चित करने के लिए समाधान ओस्मोलेटी की जांच करें। दिल को एक्साइज करने के तुरंत बाद उपयोग के लिए बर्फ पर 1 एल ठंडा करें। कार्बोजन (95% ओ2,5% सीओ2)के साथ बुदबुदाने से पहले लगभग 37 डिग्री सेल्सियस तक पानी के स्नान में गर्म 3 एल।
    नोट: वार्मिंग बुलबुले और संभावित एम्बोलिज्म को कम करता है, क्योंकि ठंडे तरल में गैस की क्षमता में वृद्धि हुई है; इसलिए, जैसे-जैसे संशोधित क्रेब्स-हेंसेलिट मीडिया परफ्यूजन सिस्टम और वार्म्स से गुजरता है, गैस को बुलबुले के रूप में जारी किया जाएगा।
  3. कार्डियोप्लेजिया के 2 एल तैयार करें (संशोधित डेल नीडो कार्डियोप्लेजिया समाधान, तालिका 1)। एक आइस क्यूब ट्रे में पर्याप्त कार्डियोप्लेजिया फ्रीज एक ५०० mL बीकर भरने के लिए ।
  4. परिसंचारी जल स्नान को 42 डिग्री सेल्सियस तक घुमाएं। एक बंद हाइड्रोनिक हीटिंग लूप में परफ्यूसेट प्रसारित करने के लिए पंपों को चालू करें (सामग्री की पूरी सूची के लिए, सामग्री की तालिका देखें और चित्रा 1)।
    नोट: पानी के जैकेट वाली ट्यूबों और हीट एक्सचेंजर्स को गर्म करने के लिए गर्म परिसंचारी पानी के स्नान का उपयोग किया जाता है।
  5. सिस्टम के माध्यम से पानी में सार्वभौमिक डिटर्जेंट के 1% समाधान के 2 एल चलाकर स्वच्छ ट्यूबिंग सर्किट और कक्ष। शुद्ध पानी के >4 L के साथ लैंगेंडोर्फ सिस्टम के सभी ट्यूबिंग सर्किट और कक्षों को कुल्ला। जब तक सिस्टम से सारा पानी नहीं निकल जाता तब तक पंप चलाएं।
  6. परफ्यूजन पंपों (पॉलीप्रोपाइलीन फिल्टर, पोर आकार और gt;5 μm) के साथ लाइन में एक सिंथेटिक झिल्ली फिल्टर जोड़ें। गैस एक माइक्रोफाइबर ऑक्सीजनेटर (हीमोफिल्टर) के साथ 95% O2 और 5% सीओ2 80 केपीए पर।
    नोट: एल्बुमिन का उपयोग करते समय, अक्सर ऑक्सीजन और/या ट्यूबिंग सर्किट के माध्यम से पंपिंग गतिविधि से जुड़ा होता है। एक एंटी-फोम यौगिक (एंटीफोम Y30 पायस) को समय-समय पर (~ हर 30 min) के रूप में इसे बुझाने के लिए जोड़ा जा सकता है।
  7. महाधमनी के ऊपर या बुलबुले के जाल में स्थित दबाव सेंसर के लिए दो-बिंदु अंशांकन (0 और 60 एमएमएचजी) की जांच करें; आवश्यकतानुसार अंशांकन करें।
  8. दिल के एक्सिजन से तुरंत पहले, मीडिया को लैंगेंडोर्फ लूप परफ्यूजन सिस्टम में डालें। सुनिश्चित करें कि परफ्यूसेट माइक्रोफाइबर ऑक्सीजनेटर (हीमोफिल्टर) के माध्यम से गुजरता है जो ऑक्सीजनयुक्त परफ्यूसेट के साथ गैस ाएँ, जो तब महाधमनी पर 37 डिग्री सेल्सियस के मीडिया परफ्यूस तापमान बनाए रखने के लिए हीट एक्सचेंजर्स के माध्यम से बहता है।
  9. परिसंचारी जल स्नान को 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक कुछ डिग्री तक सेट करें, जैसे कि 42 डिग्री सेल्सियस, एक्सचेंज के दौरान और पूरे सिस्टम के दौरान गर्मी के नुकसान के लिए खाते में। थर्मोजोड़ों के साथ परिसंचारी परफ्यूश तापमान की निगरानी करें।

2. हार्ट एक्सीशन और लैंगेंडोर्फ-पेरिफ्यूजन

  1. केटामाइन (20 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (2 मिलीग्राम/किलो) के इंट्रामस्कुलर (आईएम) इंजेक्शन के साथ सुअर को बेहोश करें और एंडोट्रेचल ट्यूब के साथ इंट्यूब करें । इंडक्शन के लिए, फेन्टनाइल (50 μg/kg) और रोक्यूरोनियम (1 मिलीग्राम/किलो) के नसों में (I.V.) बोलस इंजेक्शन का प्रशासन करें। साँस लेने वाले आइसोफ्लोरीन (0.5−3%), फेन्टनाइल (10−25 μg/kg), और पैंक्यूरोनियम (1 मिलीग्राम/किलो) के साथ एनेस्थीसिया बनाए रखें।
    नोट: इस सबूत के सिद्धांत अध्ययन के लिए, किशोर यॉर्कशायर सूअरों (14−42 दिन पुराने, एन = 18) का उपयोग किया गया था जो 2.5−10.5 किलोग्राम शरीर के वजन और 18−137 ग्राम हृदय वजन(चित्रा 2)से लेकर थे। यदि इंडक्शन के लिए एक अतिरिक्त इंजेक्शन आवश्यक है, तो केटामाइन (10 मिलीग्राम/किलो) इंजेक्शन लगाया जा सकता है I.M.
  2. एक बार जब जानवर पूरी तरह से संवेदनाकारित और गैर-उत्तरदायी हो जाता है, तो आरोही महाधमनी और सही एट्रियम का पर्दाफाश करने के लिए एक स्टरनॉटॉमी करें।
    1. स्केलपेल का उपयोग करके, छाती के प्रवेश पर उरोस्थि के शीर्ष से एक मिडलाइन चीरा बनाएं, जो xiphoid प्रक्रिया तक नीचे है। एक कॉटरी (या कैंची) के साथ, अंतर्निहित वसा और मांसपेशियों को तब तक विच्छेदन दें जब तक कि स्टर्नम दिखाई न दे।
    2. xiphoid प्रक्रिया से, या तो सर्जिकल हड्डी कैंची या एक हड्डी देखा के साथ manubrium के माध्यम से उरोस्थि मिडलाइन काट । दिल को बेनकाब करने के लिए चीरा में रिट्रैक्टर डालें।
  3. अंग एक्सिजन पर दाग के थक्के को कम करने के लिए, 18 जी सुई और सिरिंज का उपयोग करके, सही अटरिया को हेपरिन (300 यू/किलो) की बोलस खुराक वितरित करें। छाती गुहा और दिल के चारों ओर बर्फ में शोषक पैड रखें।
  4. कैंची के साथ, पेरिकार्डियम के माध्यम से सावधानीपूर्वक टुकड़ा करें, आसपास के संयोजी ऊतक से कुंद विच्छेदन द्वारा महाधमनी को अलग करें, और महाधमनी आर्क पर पहली धमनी शाखा के ठीक नीचे महाधमनी को दबाएं। 18 जी सुई के साथ 50 मिलीग्राम सिरिंज का उपयोग करके आरोही महाधमनी के शीर्ष के माध्यम से बर्फ-ठंडा कार्डियोप्लेजिया (20 मिलीग्राम/किलो) इंजेक्ट करें।
  5. दिल की ओर जाने वाले जहाजों के माध्यम से कट करें और आरोही महाधमनी के साथ दिल को हटा दें और आरोही दिल को बर्फ-ठंडे कार्डियोप्लेजिया में डुबकी दें।
  6. हेमोस्टट्स की एक जोड़ी के साथ महाधमनी की दीवारों को समझें और इसे ट्यूबिंग से जुड़े रिब्ड कैनुला पर फिसलें, जिससे दिल के ऊपर निलंबित बर्फ ठंड कार्डियोप्लेजिया मीडिया के 1 एल हो गए (~ 95 सेमी ~ 70 मिमी एचजी प्रदान करने के लिए)। तरल पदार्थ को प्रवेश करने और महाधमनी भरने की अनुमति दें जब तक कि यह किसी भी बुलबुले को वास्कुल्चर में प्रवेश करने से रोकने के लिए ओवरफ्लो न हो जाए।
    नोट: एक यांत्रिक अनकपलर (2,3-ब्यूटानेडिओन मोनोक्सिम [बीडीएम] या ब्लेबिस्टटिन) का उपयोग कोरोनरी परफ्यूजन दर में कमी आएगी क्योंकि ऊतक की ऑक्सीजन की मांग में गिरावट आती है।
  7. गर्भनाल टेप का उपयोग कर के कैनुला के लिए महाधमनी सुरक्षित और आगे यह दिल है, जो अब cannula(चित्रा 1 C)से लटक रहा है के वजन सहन करने के लिए hemostats बांधने से लंगर । गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से 70 एमएमएचजी के निरंतर दबाव में हृदय को प्रतिगामी करने के लिए ठंडे मीडिया की अनुमति दें। दिल को ठंडे कार्डियोप्लेजिया में तब तक डूबे रखें जब तक कि गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) लैंगेंडोर्फ-परफ्यूजन सिस्टम (<10 min) में स्थानांतरित होने के लिए तैयार न हो जाए।
    नोट: छोटे दिलों पर महाधमनी (<50 ग्राम, 2 सप्ताह तक पुराने सुअर) दिल का वजन सहन करेंगे, लेकिन बड़े दिलों को कैनुला से फिसल ने का खतरा है । प्रारंभिक कैनुलेशन के दौरान और गर्म प्रणाली में जाने पर, हवा को महाधमनी एम्बोली में प्रवेश करने से रोकें, जो कोरोनरी एम्बोली का कारण बन सकता है। बड़े बोर ट्यूबिंग (>3/8" आंतरिक व्यास) का उपयोग करें जो बुलबुले महाधमनी में प्रवेश करने वाले समाधान की तुलना में तेजी से बढ़ने की अनुमति देता है।
  8. कैनुला में हवा शुरू किए बिना दिल को लैंगेंडोर्फ सिस्टम (37 डिग्री सेल्सियस) में स्थानांतरित करें। किसी भी शेष रक्त और कार्डियोप्लेजिया के वास्कुलचर को फ्लश करने के लिए सामान्य सीनस ताल की अनुमति दें।
    नोट: वर्णित अध्ययन में १८४ ± 17 mL/min की एक औसत प्रारंभिक प्रवाह दर अलग किशोर पिलेट दिलों में मनाया गया था । एक यांत्रिक अनकपलर (20 एमएम बीडीएम) युक्त गर्म मीडिया के साथ छिद्रण के बाद प्रवाह दर 70 ± 7.5 मिली/मिन (मतलब ± एसईएम) तक आ गई। दिल के ऊतकों को जलमग्न न करें, क्योंकि यह कार्डियक इमेजिंग पर अतिक्रमण कर सकता है। कृंतक की तुलना में, इसकी बड़ी मात्रा और छोटे सतह क्षेत्र के कारण सुअर दिल में कोरोनरी प्रवाह द्वारा ऊतक का तापमान बनाए रखा जाता है। पूर्ण प्रवाह के तहत, एपिकार्डियम और एंडोकार्डियम तापमान क्रमशः 35 डिग्री सेल्सियस से लेकर 37 डिग्री सेल्सियस तक था।
    सावधानी: यांत्रिक अकपलर्स के साथ काम करते समय आंख पहनने सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। दिल मीडिया को तेजी से और अप्रत्याशित रूप से बाहर निकाल सकता है।
  9. दिल के शीर्ष और आधार पर बाहरी पैडल रखकर और 5 जे में एक झटका देकर, 5 जे वेतन वृद्धि (या द्वारा चयनित के रूप में) की स्थिति में दिल को निराशाजनक अतालता (वेंट्रिकुलर टैचिकार्डिया, वेंट्रिकुलर फिब्रिलेशन) की स्थिति में निराश करें डिफिब्रिलेटर) जब तक 50 जे, कार्डियोवर्जन, या अन-हैरान करने वाली लय। आवश्यक के रूप में 50 J पर झटके दोहराएं।
    नोट: प्रस्तुत अध्ययन में 89 प्रतिशत तैयारियों में डिफिब्रिलेशन की जरूरत थी। समतुल्यता (~ 10 मिन) के बाद, किशोर पिलेट दिलों(चित्रा 2)के लिए 70 ± 4.5 बीपीएम (मतलब ± एसईएम) की औसत हृदय गति देखी गई।
  10. किसी भी अवशिष्ट रक्त और कार्डियोप्लेजिया को हटाने के लिए, बिना किसी अवशिष्ट रक्त और कार्डियोप्लेजिया को हटाने के लिए, संशोधित क्रेब्स-हेंसेलिट मीडिया के कम से कम 1 एल के साथ दिल को फ्लश करें। एक बार जब मीडिया दिल के माध्यम से स्पष्ट चलाता है, परिसंचारी पाश बंद करने के लिए perfusate फिर से प्रसारित ।

3. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन

  1. अध्ययन के दौरान एक मानक लीड II इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईसीजी) रिकॉर्ड करने के लिए, सही एट्रियम में एक और इलेक्ट्रोड के साथ, शीर्ष के पास वेंट्रिकुलर एपिकार्डियम में 29 जी सुई इलेक्ट्रोड संलग्न करें। एक अंतर बायोएम्पलीफायर के सकारात्मक और नकारात्मक इनपुट को क्रमशः शीर्ष और सही एट्रियम से कनेक्ट करें।
  2. दाईं अटरिया पर एक द्विध्रुवी उत्तेजना इलेक्ट्रोड संलग्न करें, और पेसिंग उद्देश्यों के लिए पार्श्व बाएं वेंट्रिकल के लिए एक दूसरा द्विध्रुवी उत्तेजना इलेक्ट्रोड करें।
  3. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उत्तेजक का उपयोग करके दिल को गति दें, प्रारंभिक वर्तमान सेट के साथ डायस्टोलिक दहलीज (1−2 एमए) और 1 एमएस पल्स चौड़ाई35,36।
    नोट: यदि उत्तेजना प्रतिक्रिया प्राप्त करने में विफल रहती है, तो पल्स चौड़ाई 2 एमएस तक बढ़ सकती है। अधिक वर्तमान (~ 10x) बड़े coaxial इलेक्ट्रोड (द्विध्रुवी उत्तेजना) के साथ की जरूरत है।
  4. लगातार प्रोत्साहन प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए परिभाषित पेसिंग चक्र लंबाई (पीसीएल) पर प्रोत्साहन आवेगों (1−2 एमए, 1 एमएस पल्स चौड़ाई) की एक श्रृंखला लागू करके पेसिंग सीमा की पहचान करें।
    नोट: एक बार आंतरिक दर स्थापित हो जाने के बाद, प्रारंभिक आवेग ट्रेन थोड़ा कम पीसीएल पर शुरू हो सकती है।
  5. एक S1−S1 या S1−S2 पेसिंग ट्रेन का उपयोग करके एक्स्ट्राउत्तेजना पेसिंग करें, बाद में 6−8 आवेगों (S1) की एक ट्रेन के बाद एक ही आवेग (S2) था। S2 पीसीएल स्टेपवाइज को 10 एमएस (यानी 200 एमएस, 190 एमएस, 180 एमएस आदि) से कम करें, जब तक कि वह कब्जा करने में विफल न हो जाए। अंतिम पीसीएल (यानी, 190 एमएस) तक कदम रखें और कब्जा के नुकसान से पहले सबसे सटीक पीसीएल को खोजने के लिए 1 एमएस अंतराल में कमी (यानी, 184 एमएस)।
    नोट:
    एक ही उत्तेजना मापदंडों दोनों S1 और S2 (1−2 एमए, 1 एमएस पल्स चौड़ाई) के लिए उपयोग किया जाता है । प्रतिनिधि उदाहरणों के लिए चित्रा 3 देखें, या पोर्सिन हार्ट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माप37पर पहले प्रकाशित मूल्य।
    1. वेंट्रिकुलर प्रभावी रिफ्रैक्टरी अवधि (VERP) स्थापित करने के लिए, सबसे कम S1−S2 अंतराल की पहचान करने के लिए पार्श्व बाएं वेंट्रिकल पर उत्तेजना इलेक्ट्रोड का उपयोग करें, जिस पर S2 (समय से पहले हरा) वेंट्रिकुलर डिपोलराइजेशन शुरू करता है।
      नोट: रिफ्रैक्टरी अवधि सबसे कम प्राप्त S1−S2 युग्मन अंतराल है।
    2. Wenckebach चक्र लंबाई (WBCL) को परिभाषित करने के लिए, सबसे कम S1−S1 अंतराल खोजने के लिए सही एट्रियम पर उत्तेजना इलेक्ट्रोड का उपयोग करें जिस पर 1:1 एट्रिओवेनेट्रिकुलर चालन सामान्य चालन मार्ग के माध्यम से प्रचार करता है।
      नोट: ऐसा न करने पर 2डिग्री हार्ट ब्लॉक का प्रतिनिधित्व होता है।
    3. सीनस नोड रिकवरी टाइम (एसएनआरटी) को परिभाषित करने के लिए, पेसिंग ट्रेन (S1−S1) लागू करने और पेसिंग ट्रेन में अंतिम आवेग के बीच समय की देरी को मापने और सहज सिनोरियल नोड-मध्यस्थता गतिविधि की वसूली के लिए सही एट्रियम पर उत्तेजना इलेक्ट्रोड का उपयोग करें।
    4. एट्रिओवेंट्रिकुलर नोड प्रभावी रिफ्रैक्टरी अवधि (एवीनेआरपी) स्थापित करने के लिए, सबसे कम S1−S2 युग्मन अंतराल खोजने के लिए सही एट्रियम पर उत्तेजना इलेक्ट्रोड का उपयोग करें, जिस पर समय से पहले एरियल उत्तेजना उसके बंडल क्षमता के बाद होती है जो क्यूआरएस को प्राप्त करती है जटिल, जो वेंट्रिकुलर डिपोलराइजेशन का प्रतीक है।

4. ट्रांसमेम्ब्रेन वोल्टेज और इंट्रासेल्युलर कैल्शियम की ऑप्टिकल मैपिंग

नोट: ऑप्टिकल मैपिंग के दौरान मोशन कलाकृतियों को कम करने और हाइपोक्सिया3,38,39,40से बचने के लिए एक यांत्रिक अदंपतर का उपयोग किया जाना चाहिए . (-/-) ब्लेबिस्टेटिन (5 माइक्रोन परिसंचारी एकाग्रता) को धीरे-धीरे परफ्यूसेट (अंतिम एकाग्रता के 100x)41के 5 एमएल में 0.5 मीटर की बोलस खुराक के रूप में जोड़ा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, बीडीएम को शुरू में 20 एमएम की परिसंचारी एकाग्रता पर परफ्यूश मीडिया में शामिल किया जा सकता है।

  1. 5 मिलीग्राम आरएच237 को निर्जल डीएमएसओ के 4 मिलीग्राम में घोलकर वोल्टेज डाबी तैयार करें। मीडिया और भंवर के 5 लाख तक के साथ रंग ी एलिकोट को पतला करें। धीरे-धीरे महाधमनी कैनुला में आरएच237 (प्रति 500 मीटर प्रति परफ्यूशकेट) समीपस्थ जोड़ें।
    नोट: मायोकार्डियल ऊतक को प्रयोग की अवधि के दौरान RH237 के साथ फिर से दाग दिया जा सकता है, यदि आवश्यक हो।
  2. 1 मिलीग्राम रोड2-एएम को निर्जल डीएमएसओ के 1 मिलीग्राम में घोलकर कैल्शियम डाया तैयार करें। प्लुरोनिक एसिड के 50 माइक्रोन के साथ रंगे को मिलाएं, 10 00 तक के लिए 37 डिग्री सेल्सियस सोनिकाटिंग बाथ में रखें, और फिर मीडिया के 5 मिलीलीटर तक पतला करें। धीरे-धीरे कैल्शियम डाये (50 μg प्रति 500 mL perfusate) महाधमनी कैनुला में प्रॉक्सील जोड़ें।
    नोट: वर्दी रंग धुंधला सुनिश्चित करने के लिए, रंगों को धीरे-धीरे जोड़ा जाना चाहिए (>30 s)। रोड-2AM को पीक फ्लोरेसेंस तक पहुंचने में 10 मिनट तक का समय लगता है, जबकि RH237 1−2 मिनट के भीतर दिल को दाग देता है। वर्णित डाये लोडिंग, सिग्नल टू शोर अनुपात (एसएनआर) की श्रेणियों का उपयोग करना ~ 42−86 और वोल्टेज और कैल्शियम के लिए ~ 35−69 क्रमशः, उम्मीद की जा सकती है। SNR मानों SNR = (पीक-टू-पीक मायने रखता है) /(डायस्टोलिक अंतराल के दौरान मानक विचलन)४२के रूप में गणना की जा सकती है ।
  3. इमेजिंग हार्डवेयर (कैमरा, छवि स्प्लिटर, लेंस) की स्थिति के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है, देखने के एक उपयुक्त क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ।
    नोट: स्प्लिटर को डिक्रोइक मिरर (660+ एनएम) के साथ कॉन्फ़िगर किया गया है जो RH237 से गुजरता है और रोड2 उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को दर्शाता है। उच्च संचरण उत्सर्जन फिल्टर RH237 (710 एनएम लंबे पास) और Rhod2 (585 ± 40 एनएम) उत्सर्जित प्रकाश (लांग पास ET710, सामग्री की तालिकादेखें) के लिए उपयोग किया जाता है। एक व्यापक छात्र ५० मिमी/F0.95l लेंस छवि विभाजनकारी के सामने से जुड़ा हुआ है । इस विन्यास के परिणामस्वरूप पर्याप्त उत्सर्जन प्रकाश अलगाव होता है, जैसा कि पहले43,44मान्य था।
  4. कैमरे को वर्कस्टेशन से कनेक्ट करें और चयनित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवियां प्राप्त करें, 0.5−2 के एक्सपोजर समय के साथ, सुश्री सॉफ्टवेयर की सहायता से छवि संरेखण करें जो वांछित क्षेत्रों को विभाजित कर सकता है, ओवरले कर सकता है, और ग्रे-स्केल घटाव या छद्म रंग प्रदर्शित कर सकता है गलत संरेखण को हाइलाइट करने के अलावा (सॉफ्टवेयर विकल्प के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
  5. परिवेश प्रकाश व्यवस्था से फ्लोरेसेंस हस्तक्षेप को कम करने के लिए कमरे की रोशनी बंद कर दें। सेंसर द्वारा अच्छी तरह से गहराई द्वारा निर्धारित वर्दी और अधिकतम एपिकार्डियल रोशनी सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग की शुरुआत से पहले एलईडी लाइट्स (525 एनएम, 1.4 mW/mm2)का परीक्षण करें।
    नोट: प्रत्येक प्रकाश एक उत्तेजना फिल्टर (535 ± 25 एनएम) के माध्यम से निर्देशित किया जाता है। सिग्नल लाइनारिटी को अधिकतम करने के लिए फिल्मांकन से पहले एलईडी लाइट्स को मैन्युअल रूप से ट्रिगर किया जा सकता है। एपिकार्डियम से उत्सर्जित फ्लोरेसेंस छवि विभाजनकर्ता और उत्सर्जन फिल्टर के माध्यम से पारित किया जाता है। स्प्लिट छवियों को एक उच्च गति सेंसर पर पेश किया जाता है। देखने का क्षेत्र लेंस पसंद और दिल से दूरी के आधार पर प्रत्येक विभाजन छवि के लिए लगभग 12 सेमी x 10 सेमी, या 5.9 सेमी x 4.7 सेमी है।
  6. ऑप्टिकल मैपिंग अध्ययन के लिए, सीनस रिदम के दौरान मायोकार्डियम की छवि, वेंट्रिकुलर फिब्रिलेशन(चित्रा 4)या गतिशील पेसिंग (S1−S1, 1−2 mA, 1 एमएस पल्स चौड़ाई) बाएं वेंट्रिकल(चित्रा 5)पर तैनात उत्तेजना इलेक्ट्रोड के माध्यम से। 350 एमएस की पेसिंग साइकिल लंबाई से शुरू करें, और क्षतिपूर्ति घटता उत्पन्न करने के लिए 10−50 एमएस द्वारा डिजायर(चित्रा 5E)35,36।

5. सफाई

  1. सिस्टम से दिल निकालें और सभी परफ्यूसेट नाली। शुद्ध पानी के साथ सिस्टम ट्यूबिंग और कक्षों कुल्ला।
  2. नियमित रखरखाव के लिए, समय-समय पर आवश्यकतानुसार डिटर्जेंट समाधान या पतला हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान के साथ सिस्टम को कुल्ला करें।

6. डेटा प्रोसेसिंग

  1. एक वीडियो फ़ाइल खोलने, ब्याज के एक क्षेत्र का चयन, और एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर पैकेज या कस्टम एल्गोरिथ्म का उपयोग कर समय के साथ मतलब फ्लोरेसेंस की साजिश रचने के द्वारा अध्ययन भर में ऑप्टिकल सिग्नल गुणवत्ता की पुष्टि करें ।
  2. इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करें जैसा कि पहले23,33,43,45,46वर्णित है, सक्रियण समय सहित कार्रवाई क्षमता और कैल्शियम क्षणिक अस्थायी मापदंडों की मात्रा निर्धारित करने के लिए, वोल्टेज-कैल्शियम युग्मन समय (वीएम और सीए सक्रियण समय के बीच अंतर), और पुनर्ध्रुवीकरण अवधि माप।
    1. फ्लोरोसेंट एपिकार्डियल पिक्सल को अलग करने और शोर पृष्ठभूमि डेटा को त्यागने के लिए थ्रेसहोल्डिंग लागू करें।
      नोट: थ्रेसहोल्डिंग बड़े वीडियो में विश्लेषण को सरल और गति देगा।
    2. स्थानिक रूप से 3 मिमी x 3 मिमी से 5 मिमी x 5 मिमी तक गिरी आकारके साथ एक एपिकार्डियल सतह क्षेत्र पर ऑप्टिकल सिग्नल फ़िल्टर करें, जैसा कि चित्रा 4 और चित्रा 5में देखा गया है।
      नोट: बाद में कार्रवाई की क्षमता सुविधाओं, कैल्शियम क्षणिक आकृति विज्ञान, या तरंग19,47के समग्र समोच्च को विकृत किए बिना एसएनआर में सुधार होगा। यदि बड़े पिक्सल वाले सेंसर का उपयोग करना या अधिग्रहण के दौरान बिनिंग करना अनावश्यक हो सकता है।
    3. तुच्छ सिग्नल सामग्री45को खत्म करने के लिए 100 और 75 हर्ट्ज के बीच कटऑफ फ्रीक्वेंसी के साथ डिजिटल लोपास फिल्टर (जैसे, 5वें ऑर्डर बटरवर्थ) के साथ टेम्पेरैली फ़िल्टर सिग्नल।
      नोट: प्रतिनिधि प्रसंस्कृत निशान के उदाहरण के लिए चित्रा 5C देखें।
    4. फोटोब्लीचिंग, गति, या भिन्नता के अन्य महत्वपूर्ण स्रोतों के प्रभावको कम करने के लिए, नाथ-ऑर्डर पॉलीनोमियल फिटिंग के माध्यम से बहाव हटाने और घटाव लागू करें।
    5. पूरे वीडियो में ऑप्टिकल डेटा के प्रसंस्करण और सामान्यीकरण के बाद, कार्रवाई क्षमता और ब्याज के कैल्शियम क्षणिक मापदंडों की गणना करें। पुनर्ध्रुवीकरण प्रतिशत समय और अवधि (कार्रवाई संभावित अवधि [एपीडी] और [सीए2 +] की अवधि [सीएडी] की गणना करने के लिए सक्रियण समय निर्धारित करें, जो ध्रुवीकरण के दौरान अधिकतम व्युत्पन्न के समय के रूप में परिभाषित किया गया है, देखें चित्रा 5)
    6. लौकिक मापदंडों की गणना किए जाने के बाद, कस्टम एल्गोरिदम23,33का उपयोग करके पूरे इमेजड एपिकार्डियल सतह पर एक ही कार्रवाई क्षमता या कैल्शियम क्षणिक के पहलुओं को चित्रित करने के लिए आइसोक्रोनल मानचित्र उत्पन्नकरें, 43,45,46.
      नोट: उदाहरण के लिए चित्र5D देखें।

Representative Results

चित्रा 1A अलग दिल perfusion प्रणाली है, जो ट्यूबिंग सर्किट, पंप, फिल्टर, ऑक्सीजनेटर, जलाशयों और हीटिंग तत्वों में शामिल है की एक आरेख से पता चलता है । ईसीजी (लीड II कॉन्फ़िगरेशन) और पेसिंग इलेक्ट्रोड का प्लेसमेंट फिगर 1 बीमें दिखाया गया है, और इमेजिंग सेटअप को फिगर 1 Cमें चित्रित किया गया है। ऑप्टिकल घटकों और प्रकाश पथों की एक योजनाबद्ध चित्रा 1 Dमें दिखाया गया है ।

प्रायोगिक अध्ययन बरकरार पर किए गए, पूरे दिल किशोर यॉर्कशायर सूअरों (14−42 दिन, एन = 18) से अलग है कि आकार में 2.5−10.5 किलो शरीर के वजन और 18−137 ग्राम दिल वजन(चित्रा 2A)से लेकर । अलग दिल को लैंगेंडोर्फ सिस्टम (37 डिग्री सेल्सियस) में स्थानांतरित करने के बाद, हृदय गति 70 ± 4.5 बीपीएम (मतलब ± एसईएम) को डिफिब्रिलेशन के ~ 10 मिनट के भीतर स्थिर कर दिया गया और अध्ययन की अवधि में स्थिर रहा(चित्रा 2B)। १८४ ± 17 mL/min (मतलब ± एसईएम) की एक औसत प्रवाह दर मापा गया था, जो एक यांत्रिक uncoupler(चित्रा 2C)युक्त गर्म मीडिया के साथ perfusing के बाद ७० ± ७.५ mL/मिनट के लिए धीमा ।

लीड II ईसीजी को अध्ययन की अवधि के दौरान सिनस लय(चित्रा 3 ए)के दौरान या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापदंडों की मात्रा निर्धारित करने के लिए बाहरी पेसिंग(चित्रा 3बी-ई)के जवाब में दर्ज किया गया था ईपी मूल्यांकन के लिए, डब्ल्यूबीसीएल और एसएनआरटी (एस1−एस1 शुरू होने के बाद रिकवरी टाइम, फिगर 3सी)को इंगित करने के लिए राइट एट्रियम पर डायनेमिक पेसिंग (S1−S1) लागू किया गया था, जिसमें डब्ल्यूबीसीएल को सबसे कम पीसीएल के रूप में चिह्नित किया गया था जिसने वेंट्रिकुलर चालन के लिए एट्रियल शुरू किया था। एक S1−S2 पेसिंग प्रोटोकॉल को बाएं वेंट्रिकल पर एक द्विध्रुवी उत्तेजना इलेक्ट्रोड का उपयोग करके लागू किया गया था ताकि वेंट्रिकुलर डिपोलराइजेशन शुरू करने वाले सबसे कम युग्मन अंतराल की पहचान की जा सके, जिससे VERP(चित्रा 3D)को इंगित किया जा सके। वैकल्पिक रूप से, एक S1−S2 अपरीक्षण पेसिंग प्रोटोकॉल एवीनेआरपी (S1−S2) को इंगित करने के लिए लागू किया जाता है, जैसा कि चित्रा 3Eमें दिखाया गया है। सुअर दिल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मापदंडों के प्रतिनिधि उदाहरण पहले प्रकाशित37लोगों के साथ मिलकर संरेखित करते हैं ।

ऑप्टिकल मैपिंग प्रयोगसीन लय, सहज वेंट्रिकुलर फिब्रिलेशन(चित्रा 4),या बाएं वेंट्रिकल (एलवी) के गतिशील पेसिंग (S1−S1) के दौरान विद्युत और कैल्शियम क्षतिपूर्ति घटता उत्पन्न करने के दौरान किए गए थे। चित्रा 5। एक रंग से भरी हुई पिलेट दिल की प्रतिनिधि छवियों को चित्रा 4 में इसी ऑप्टिकल कार्रवाई क्षमता (वीएम) और कैल्शियम (सीए) क्षणिक सतह पर ब्याज के दो क्षेत्रों से एकत्र किए गए क्षणिक (सही वेंट्रिकल [आरवी] = नीला, एलवी = लाल) के साथ दिखाया गया है . असंसाधित संकेतों को पापलय के दौरान और वेंट्रिकुलर फिब्रिलेशन के दौरान प्रदर्शित किया जाता है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया था, आंतरिक हृदय गति(चित्रा 5ए-ई)में किसी भी मामूली अंतर को सामान्य बनाने के लिए ऑप्टिकल मैपिंग प्रयोगों के दौरान गतिशील एपिकार्डियल पेसिंग (S1−S1) का भी उपयोग किया गया था। कच्चे संकेतों को प्रदर्शित किया जाता है (आरवी = नीला, एलवी = लाल), जिसका उपयोग कार्रवाई क्षमता को चित्रित करने के लिए किया जाता था - कैल्शियम क्षणिक युग्मन समय(चित्रा 5 C),सक्रियण और अवधि समय(चित्रा 5D),विद्युत और कैल्शियम क्षतिपूर्ति(चित्रा 5E)। मोटी मायोकार्डियल तैयारी के लिए, गिरी आकार के साथ स्थानिक फ़िल्टरिंग ~ 3 मिमी x 3 मिमी एपिकार्डियल एक्शन क्षमता या कैल्शियम क्षणिक विश्लेषण19,47के लिए उपयुक्त है। तदनुसार, उच्च स्थानिक संकल्प छवियां (वर्णित सेटअप में 1240 x 1024 कुल, या 620 x 512 प्रति चैनल, 6.5 माइक्रोन पिक्सेल आकार) अक्सर अधिग्रहण के दौरान या अधिग्रहण के बाद स्थानिक रूप से बिन्द होते हैं(चित्रा 5 C)। इमेज प्रोसेसिंग कस्टम एल्गोरिदम23,33,43,45 (चित्रा 3डी)का उपयोग करके सक्रियण और पुनर्ध्रुवीकरण मानचित्र उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, जिसके सक्रियण समय के साथ दिल पर प्रत्येक पिक्सेल को कार्रवाई क्षमता या कैल्शियम क्षणिक अपस्ट्रोक के अधिकतम व्युत्पन्न के रूप में परिभाषित किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: प्रायोगिक सेटअप। (A)अलग दिल परफ्यूजन प्रणाली का आरेख; तीर प्रवाह की दिशा को निरूपित करते हैं। (ख)इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट के साथ एक cannulated दिल दिखाया गया है । RA = दाएं अटरिया, आरवी = दाएं वेंट्रिकल, एलवी = बाएं वेंट्रिकल, ईसीजी = लीड II इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम। (ग)दिल के ऊतकों के निकट इमेजिंग मंच। (D)प्रत्येक पूरक जांच (वोल्टेज, कैल्शियम) का उत्सर्जन उचित उत्सर्जन फिल्टर और डिक्रोइक दर्पण के साथ छवि बंटवारे वाले उपकरण का उपयोग करके तरंगदैर्ध्य से अलग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: दिल का वजन, दर और प्रवाह माप। (A)अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक पिलेट (एन = 18) के लिए शरीर के वजन अनुपात में दिल का वजन। (ख)हृदय गति डिफिब्रिलेशन के बाद ~10 मिन और फिर अध्ययन के अंत में (लगभग 1 घंटे) मापा गया। (ग)कोरोनरी प्रवाह ऑक्सीजन की मांग कम होने के कारण यांत्रिक अदंपती (+ बीडीएम) के साथ परफ्यूजन के बाद तेजी से गिरता है । स्केल बार मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सीनस रिदम के दौरान या बाहरी पेसिंग के जवाब में एकत्र लीड II इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि उदाहरण। (A)सामान्य पापों की लय। (ख)400 एमएस (S1−S1) की चक्र लंबाई में एपिकार्डियल पेसिंग का उदाहरण, जिसका उपयोग इमेजिंग प्रयोगों के लिए किया गया था। (ग)शीर्ष: अपरीक्षण पेसिंग WBCL की पहचान करने के लिए; सफल कैप्चर S1 = 250 एमएस पर मनाया जाता है जिसमें वेंट्रिकुलर चालन के लिए एट्रियल मनाया जाता है। ध्यान दें कि अट्रियल पेसिंग का उपयोग एसएनआरटी (बाहरी पेसिंग शुरू करने के बाद सिएनस नोड डिस्चार्ज करने का समय) निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। नीचे: के रूप में S1 चक्र लंबाई २०५ एमएस को कम कर दिया है, वेंट्रिकल के लिए चालन विफल रहता है । (घ)शीर्ष: VERP की पहचान करने के लिए एपिकार्डियल पेसिंग (S1−S2); सफल कैप्चर S1 = 450 एमएस, S2 = 300 एमएस बॉटम में मनाया जाता है: चूंकि एस 2 चक्र लंबाई 250 एमएस तक कम हो जाती है, वैसे ही वेंट्रिकुलर ऊतक कब्जा करने में विफल रहता है। (ई)एवीनेआरपी की पहचान करने के लिए अट्यट्रियल पेसिंग (S1−S2) । शीर्ष: सफल कब्जा S1 = 450 एमएस, S2 = 200 एमएस नीचे पर मनाया जाता है: के रूप में S2 चक्र लंबाई 199 एमएस को कम कर दिया है, वेंट्रिकल के लिए चालन विफल रहता है. नीले तीर पेसिंग स्पाइक्स को निरूपित करते हैं, लाल तीर कैप्चर ('सी') या कोई कैप्चर ('एनसी') को निरूपित करते हैं। S1−S1 = गतिशील पेसिंग, S1−S2 = एक्स्ट्राउत्तेजना पेसिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सिनस रिदम और वेंट्रिकुलर फिब्रिलेशन के दौरान ऑप्टिकल डेटा। बाएं: एक रंग भरी हुई सुअर दिल की प्रतिनिधि छवियां (वीएम = वोल्टेज, RH237; Ca = कैल्शियम, Rhod2), पूर्वकाल दृश्य। स्पेटियल फ़िल्टर ट्रांसमेब्रेन वोल्टेज और सीनस रिदम (केंद्र) के दौरान सुअर दिल से इंट्रासेलर कैल्शियम फ्लोरोसेंट संकेत। वेंट्रिकुलर फिब्रिलेशन (दाएं) के दौरान वोल्टेज और कैल्शियम सिग्नल। सिग्नल क्षेत्र आकार (15 x 15 पिक्सल = 2.4 x 2.4 मिमी2,30 x 30 = 4.8 x 4.8 मिमी2 गिरी आकार) लाल और नीले वर्गों के रूप में प्रतिनिधित्व किया। इकाइयां = इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: लैंगेंडोर्फ-परफेक्ड सुअर दिलों से ऑप्टिकल डेटा। शीर्ष पर विद्युत पेसिंग के दौरान दाएं और बाएं वेंट्रिकल्स से असंसाधित, स्थानिक रूप से फ़िल्टर(ए)ट्रांसमेम्ब्रेन वोल्टेज और(बी)इंट्रासेलुलर कैल्शियम फ्लोरेसेंस सिग्नल। अनफ़िल्टर्ड, स्थानिक रूप से औसत संकेतों में ब्याज के क्षेत्रों से ऑप्टिकल एक्शन क्षमता और कैल्शियम ट्रांसिएंट्स को दर्शाया गया है (सिग्नल इकाइयां एफएफ/एफ हैं)। (ग)सामान्यीकृत क्षणिकों का एक ओवरले कार्रवाई संभावित-कैल्शियम क्षणिक युग्मन समय (75 हर्ट्ज पर फ़िल्टर कम पास) दिखाता है। (घ)एपिकार्डियल सतह के पार प्रसंस्करण संकेत ों को सक्रियण समय (टीअधिनियम)और 80% पुनर्ध्रुवीकरण समय सहित अस्थायी मापदंडों के आइसोक्रोनल नक्शे उत्पन्न करने के लिए। (ई)धीमी पेसिंग चक्र लंबाई में लंबे समय तक पुनर्ध्रुवीकरण समय को समझाने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण (दाएं) के साथ कई आवृत्तियों (बाएं) पर उत्पन्न विद्युत और कैल्शियम क्षणिक क्षतिपूर्ति घटता है। स्केल बार = मतलब ± एसईएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

रासायनिक सूत्र आणविक वजन जी/एल
सोडियम क्लोराइड Nacl 58.44 5.26
सोडियम ग्लूकोनेट सी6एच11नाओ7 218.14 5.02
सोडियम एसीटेट ट्राइहाइड्रेट सी2एच3नाओ2• 3H2O 136.08 3.68
पोटेशियम क्लोराइड केसीएल 74.55 0.63
मैग्नीशियम क्लोराइड (निर्जल) एमजीसीएल2 95.21 0.1405
8.4% सोडियम बाइकार्बोनेट नाहको3 84.01 13
मैनिटॉल सी6एच146 182.17 16.3
मैग्नीशियम सल्फेट एमजीएसओ4 120.37 4
पीएच 7.4
ओस्मोलैरिटी (मोस्मोल/एल) 294

तालिका 1: संशोधित डेल नीडो का कार्डियोप्लेजिया नुस्खा।

Discussion

हालांकि हृदय अनुसंधान मॉडल सेलुलर से लेकर वीवो की तैयारी में हैं, लेकिन नैदानिक प्रासंगिकता और प्रायोगिक उपयोगिता के बीच एक अंतर्निहित व्यापार-बंद है। इस स्पेक्ट्रम पर, अलग लैंगेंडोर्फ-perfused दिल हृदय शरीर विज्ञान४८का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी समझौता रहता है । पूरे दिल मॉडल एकल कोशिका या ऊतक मोनोलेयर की तुलना में कार्यात्मक और संरचनात्मक एकीकरण के उच्च स्तर का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन वीवो मॉडल में जुड़े जटिल जटिलताओं से भी बचा जाता है। दोहरे ऑप्टिकल मैपिंग प्रयोगों के दौरान एक बड़ा लाभ यह है कि अलग दिल की एपिडियल सतह को देखा जा सकता है, और हृदय शरीर विज्ञान34की निगरानी के लिए ट्रांसमेम्ट्रिक क्षमता और कैल्शियम हैंडलिंग की फ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग किया जा सकता है।

कृंतक मॉडल का उपयोग आमतौर पर बड़े जानवरों के विपरीत अलग-थलग दिल की तैयारियों के लिए किया जाता है, जो शामिल सभी तत्वों (जैसे, समाधान मात्रा, परफ्यूजन सर्किट, रंगों और यांत्रिक uncouplers) की संबद्ध लागत के कारण होता है। बड़े जानवरों में अतालता के लिए अधिक अस्थिरता और प्रवृत्ति के साथ10,36,49. सुअर दिलों का उपयोग करने के लिए एक लाभ यह है कि वे बारीकी से संरचना, आकार और संकुचन की दर में मानव दिल के समान है, इसलिए अधिक सही कोरोनरी रक्त प्रवाह और हृदय उत्पादन की तरह हीमोडायनामिक मापदंडों मॉडलिंग । इसी तरह, मनुष्यों और सूअरों में समान कैल्शियम हैंडलिंग, इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम अंतराल37और अंतर्निहित चैनलों सहित कार्रवाई संभावित आकृति विज्ञान होता है जो यह12,50,51का प्रतिनिधित्व करताहै, 52. यह प्रोटोकॉल मायोकार्डियल फ़ंक्शन को व्यापक रूप से चित्रित करने के लिए एक प्रजनन योग्य बड़े पशु मॉडल बनाने के लिए चरणों का विस्तार से वर्णन करता है। ट्रांसमेम्ब्रेन वोल्टेज (RH237) और इंट्रासेल्युलर कैल्शियम (रोड2) की एक साथ इमेजिंग, स्थापित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रोटोकॉल के साथ संयोजन के रूप में उपयोग की जाती है, उन तंत्रों को इंगित करने का अवसर प्रदान करती है जो परिवर्तित हृदय के लिए जिम्मेदार हैं समारोह. वर्णित कार्यप्रणाली का उपयोग प्रीक्लिनिकल सुरक्षा परीक्षण, विष जांच और आनुवंशिक या अन्य रोग विकृतियों की जांच के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, वर्णित पद्धति को विशिष्ट शोध फोकस53,54,55के आधार पर अन्य हृदय मॉडल (जैसे, कैनाइन, मानव) के साथ उपयोग के लिए संशोधित और अनुकूलित किया जा सकता है।

अलग, पूरे दिल की तैयारी के लिए एक बड़े सुअर मॉडल के लिए एक छोटे कृंतक मॉडल से संक्रमण जब ध्यान में रखने के लिए कुछ महत्वपूर्ण संशोधन कर रहे हैं । तैयारी और सेटअप के दौरान, हम ऑन्कोटिक दबाव बनाए रखने और एडीमा (प्लस एंटीफोम, यदि आवश्यक हो)56,57,58,59को कम करने के लिए परफ्यूसेट में एल्बुमिन जोड़ने की सलाह देते हैं। इसके अलावा, एल्बुमिन युक्त परफ्यूसेट मेटाबोलिक अध्ययनों में भी सहायता कर सकता है जिसके लिए मीडिया को फैटी एसिड-पूरकता की आवश्यकता होती है60,61। कृंतक दिलों के विपरीत, बड़े सुअर दिल को अपनी छोटी सतह से मात्रा अनुपात और कोरोनरी जहाजों के माध्यम से बहने वाले गर्म मीडिया की बढ़ी हुई मात्रा के कारण गर्म मीडिया में जलमग्न होने की आवश्यकता नहीं है जो तापमान को बेहतर बनाए रखता है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, हमने सही वेंट्रिकल के अंदर और दाएं और बाएं वेंट्रिकल्स दोनों की एपिकार्डियल सतह पर तापमान जांच रखी, पूरे अध्ययन के दौरान तीनों स्थानों में 1−2 डिग्री सेल्सियस के केवल मामूली तापमान में उतार-चढ़ाव को देख ते हैं। महत्वपूर्ण बात, इस तरह के तेज प्रवाह दरभी बुलबुले और एक संभावित एम्बोलिज्म की संभावना बढ़ सकती है । इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, हम बड़े बोर ट्यूबिंग के साथ एक बुलबुला जाल का उपयोग करने की सलाह देते हैं जो सीधे महाधमनी कैनुला तक जाता है। इसी तरह, हमने पाया कि दो व्यक्तियों को एक बड़े (और भारी) दिल पर महाधमनी के लिए मिलकर काम करना सबसे उपयोगी है; एक व्यक्ति को मजबूत hemostats के साथ महाधमनी खुला पकड़ और एक और नाल के लिए महाधमनी सुरक्षित करने के लिए नाल का उपयोग कर । वर्णित कार्यप्रणाली में, हमने पाया कि कार्डियोप्लेजिया और डिफिब्रिलेशन के साथ परफ्यूजन हृदय वसूली के लिए महत्वपूर्ण थे, जो कृंतक दिल की तैयारी के विपरीत है। हमारे अनुभव में, केवल कुछ उत्पादित दिलों ने कार्डियोवर्जन के बिना सामान्य पाप-संचालित गतिविधि फिर से शुरू की।

ऑप्टिकल इमेजिंग एंडपॉइंट्स में सुधार करने के लिए, एक फांसी दिल की तैयारी चकाचौंध के प्रभाव को सीमित करती है जो जलमग्न दिल के साथ हो सकती है। इसके अलावा, फांसी दिल भी दिल के पीछे के पहलू पर कोरोनरी जहाजों के किसी भी संपीड़न या समझौता से बचा जाता है जो ऊर्ध्वाधर इमेजिंग के लिए क्षैतिज रूप से दिल बिछाने पर हो सकता है। हमने यह भी पाया कि बुलबुला जाल (महाधमनी कैनुला के करीब) के बाद फ्लोरोसेंट रंगों को लोड करना ऊतक धुंधला और ऑप्टिकल संकेतों में काफी सुधार हुआ है। अंत में, कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एंडपॉइंट्स में सुधार करने के लिए, एक बड़े कोक्सियल उत्तेजना इलेक्ट्रोड के उपयोग ने सफल अलिंद पेसिंग की सुविधा प्रदान की। यद्यपि हम विभिन्न ईपी मापदंडों के लिए कैप्चर और कैप्चर के नुकसान की पहचान करने के लिए इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम के उपयोग का वर्णन करते हैं, इंट्राकार्डियक कैथेटर या बाइपोलर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का भी उपयोग किया जा सकता है।

हमारा अध्ययन एक अलग, बरकरार पोर्सिन हार्ट मॉडल में दोहरी ऑप्टिकल मानचित्रण और हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए एक पद्धति विकसित करने पर केंद्रित था । किशोर मानव हृदय के साथ समानताओं के कारण, पोर्सिन दिल बाल चिकित्सा कार्डियोलॉजी या जन्मजात हृदय दोषों पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल बना हुआ है । महत्वपूर्ण बात, वर्णित दृष्टिकोण बड़े आकार वयस्क दिलों और/या ब्याज की विभिन्न प्रजातियों के साथ उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । दरअसल, अन्य प्रयोगशालाओं को लग सकता है कि कैनाइन या मानव हृदय (या तो दाता या रोगग्रस्त) का उपयोग उनके विशिष्ट शोध फोकस53,54,55के लिए अधिक लागू होता है। इस अध्ययन के लिए एक और संभावित सीमा इमेजिंग के दौरान गति विरूपण साक्ष्य को कम करने के लिए एक यांत्रिक अदंपती का उपयोग है। ब्लेबिस्टिन ईसीजी मापदंडों, सक्रियण और रिफ्रैक्टरी अवधि41,62,63पर इसके न्यूनतम प्रभावों के कारण कार्डियक इमेजिंग अनुप्रयोगों में पसंद का अदंपतर बन गया है। बीडीएम एक कम खर्चीला विकल्प है, जो बड़े पशु अध्ययन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है जिसके लिए परफ्यूज़ और यांत्रिक अनकपलर की अधिक मात्रा की आवश्यकता होती है, लेकिन यह पोटेशियम और कैल्शियम धाराओं पर अधिक प्रभाव डालता है जो कार्रवाई क्षमता को बदल सकता है आकृति विज्ञान64,65,66,67. यदि बीडीएम का उपयोग किया जाता है, तो ध्यान दें कि एपीडी छोटा करने से दिलों को सदमे से प्रेरित arrythmias68तक जोखिम बढ़ जाता है। इसके विपरीत, ब्लेबिस्टिन का उपयोग करने की मुख्य सीमा इसकी फोटोसेंसिटिविटी और फोटोटॉक्सक्सिसिटी है, हालांकि वैकल्पिक योगों ने इन प्रभावों को69,70,71कम कर दिया है। अंत में, वर्णित पद्धति दोहरी ऑप्टिकल मानचित्रण प्रयोग के लिए एक एकल कैमरा प्रणाली का उपयोग करती है, लेकिन यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि अनुसंधान अध्ययन वेंट्रिकुलर फिब्रिलेशन पर केंद्रित है और/ 15,19,72,73,74,75 अन्य लोगों द्वारा वर्णित त्रि-आयामी मनोरम इमेजिंग को शामिल करने के लिए इस दृष्टिकोण को संशोधित करने की आवश्यकता होगी .

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक कृतज्ञता से सहायक प्रयोगात्मक मार्गदर्शन के लिए डॉ मैथ्यू Kay स्वीकार करते हैं, और Manelle रमजान और Muhaymin चौधरी तकनीकी सहायता के लिए । इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01HL139472 से NGP, R01 HL139712 से एनआई), बाल अनुसंधान संस्थान, बाल राष्ट्रीय हृदय संस्थान और बाल चिकित्सा सर्जिकल नवाचार के लिए शेख जायेद संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560-5MG Mechanical Uncoupler
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753-100G Mechanical Uncoupler
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9418
Analog signal interface emka Technologies itf16USB
Antifoam Sigma-Aldrich A5758-250ML
Antifoam Y-30 Emulsion Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A5758
Aortic cannula, 5/16” Cole-Parmer 45509-60
Bubble trap Sigma-Aldrich CLS430641U-100EA
CaCl2 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ C77-500
Camera, sCMOS Andor Technology Zyla 4.2 PLUS
Coaxial stimulation electrode (atria) Harvard Apparatus 73-0219
Defibrillator Zoll M Series
Dichroic mirror Chroma Technology T660lpxrxt-UF2
Differential amplifier Warner Instruments DP-304A
Emission filter, calcium Chroma Technology ET585/40m
Emission filter, voltage Chroma Technology ET710lp
EP stimulator (Bloom) Fisher Medical DTU-215B
Excitation filter Chroma Technology CT510/60bp
Excitation lights Thorlabs SOLIS-525C
Filter McMaster-Carr 8147K52
Filter cartridge, polypropylene Pentair PD-5-934
Filter housing McMaster-Carr 9979T21
Flow transducer Transonic ME6PXN
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 158968
Heating coil Radnoti 158821
Hemofilter Hemocor HPH 400
Hemostatic Forceps World Precision Instruments 501326
Image Splitter Cairn Research OptoSplit II
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P3911
KH2PO4 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ 423-316
Large-bore tubing, I.D. 3/8” Fisher Scientific 14-169-7H
Lens 50 mm, 0.95 f-stop Navitar DO-5095
Metamorph Molecular Devices Image Alignment
MgSO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506
Mucasol detergent Sigma-Aldrich Z637181-2L
Na Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P2256
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S-3014
NaHCO3 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S-233
Needle Electrodes 29 G, 2 mm AD Instruments Inc. MLA1204
Noise eliminator Quest Scientific Humbug
Perfusion pump PolyStan A/S 1481
Pressure transducer World Precision Instruments BLPR2
Reservoir, 2 L Cole-Parmer UX-34541-07
RH237 AAT Bioquest Inc. 21480
Rhod2-AM AAT Bioquest Inc. 21062
Stimulation electrode (ventricle) Harvard Apparatus 73-0160
Surgical Suture McKesson Medical-Surgical 890186
Transducer amplifier World Precision Instruments TBM4M
Tubing flow console Transonic TS410
Umbilical tape Jorvet J0025UA
Water bath/circulator VWR 89400-970
Surgical Tools
Bandage shears Harvard Apparatus 72-8448 Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0 mm blade length, 17.0 cm
Electrocautery Dalwha Corp. Ltd. BA2ALD001 Model: 200 Basic
Hemostat Roboz RS-7476 St Vincent Tube Occluding Forceps
Hemostatic forceps Harvard Apparatus 72-8960 Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm
Hemostats Harvard Apparatus 72-8985 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2 mm tip 14 cm
Mayo scissors WPI 501749 14.5 cm, Straight
Metzenbaum scissors WPI 501747 11.5 cm, Straight
Mosquito forceps Harvard Apparatus 72-8980 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2 mm tip width 12 cm
Needle holder Harvard Apparatus 72-8828 Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length
Pediatric cross clamp Roboz RS-7660 Cooley-Derra Clamp 6.25" 5 mm Calibrations
Right angle forceps WPI 501240 Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14 cm, Right Angle
Scalpel Ted Pella 549-4 Scalpel Handle No. 4, 13.7 cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades
Scissors Harvard Apparatus 72-8380 Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42 mm blade,12 cm
Straight Serrated forceps WPI 500363 Dressing Forceps 15.5 cm
Towel clamp WPI 501700 Backhaus Towel Clamp, 13 cm, Curved, Locking handle, SS
Weitlaner retractor WPI 501314 Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2 cm, 2x 3 Sharp Prongs
Disposables
3-0 prolene suture Various vendors Various vendors
Vessel loop Aspen surgical 011001PBX Sterion® Vessel Loop, 0.8 mm x 406 mm
Cardioplegia (Plegisol) Pfizer 00409-7969-05 Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20 mL/kg
Heparin Various vendors Various vendors 300 U/kg
Syringe and Needle Various vendors Various vendors 60 mL & 18 G respectively
Umbilical tape Ethicon U12T

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