Ex Vivo Langendorff perfüzyonlu Kalplerin Optokardiyografi ve Elektrofizyoloji Çalışmaları

Medicine
 

Summary

Bu çalışmanın amacı, kardiyak dinamiği n çevirisel bir hayvan modeli kullanarak araştırmak için bir yöntem oluşturmaktır. Açıklanan deneysel yaklaşım, izole, bozulmamış bir domuz kalp modelindeki elektriksel aktiviteyi değerlendirmek için elektrofizyolojik bir çalışma ile birlikte çift emisyonlu optokardiografi içerir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Swift, L. M., Jaimes III, R., McCullough, D., Burke, M., Reilly, M., Maeda, T., Zhang, H., Ishibashi, N., Rogers, J. M., Posnack, N. G. Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts. J. Vis. Exp. (153), e60472, doi:10.3791/60472 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Küçük hayvan modelleri en yaygın kardiyovasküler araştırmalarda genetik olarak değiştirilmiş türlerin durumu ve daha büyük hayvanlara göre daha düşük maliyet nedeniyle kullanılır. Ancak, büyük memeliler daha iyi normal kardiyak fizyolojisi ile ilgili çeviri araştırma soruları için uygundur, patofizyoloji, ve terapötik ajanların preklinik test. Kardiyak araştırmalarda daha büyük bir hayvan modeli nin kullanılmasıyla ilgili teknik engelleri aşmak için, izole edilmiş, Langendorff'lu domuz yavrusu kalbinde fizyolojik parametreleri ölçmeyaklaşımını tanımlıyoruz. Bu yaklaşım kalbin durumunu değerlendirmek için iki güçlü deneysel aracı bir araya getirmektedir: elektrofizyoloji (EP) çalışması ve parametre duyarlı boyalar (RH237, Rhod2-AM) kullanarak transmembran voltaj ı ve hücre içi kalsiyumun eşzamanlı optik haritalaması. Açıklanan metodolojiler, kardiyak iletim sistemini, etki potansiyeli morfolojisindeki değişiklikler, kalsiyum kullanımı, uyarma-kontraksiyon kaplini ve kardiyak alternanların insidansını araştıran çeviri çalışmaları için uygundur veya Aritmi.

Introduction

Kardiyovasküler hastalık dünya çapında hastalık ve ölüm önde gelen nedenidir. Bu nedenle, birincil bir araştırma odak normal kardiyak fizyolojisi ve insanlarda morbidite ve mortalite katkıda bulunabilir altta yatan mekanizmaları incelemek için kullanılabilecek metodolojileri optimize etmektir. Temel kardiyovasküler araştırma geleneksel kemirgenler ve tavşan1,2,3, genetik olarak değiştirilmiş türlerin durumu nedeniyle4,5dahil olmak üzere küçük hayvan modelleri, dayanıyordu , daha düşük maliyetli, daha küçük deneysel ayak izi ve daha yüksek iş artışı. Ancak, bir domuz modelinin kullanımı daha klinik olarak ilgiliveri6 sağlama potansiyeline sahiptir. Nitekim, önceki çalışmalarda kardiyak elektrofizyoloji benzerlikler belgelenmiştir (EP) insanlar ve domuzlar arasında, benzer iyon akımları da dahil olmak üzere7, eylem potansiyel şekli8 ,ve farmakolojik test yanıtları9. Ayrıca, domuz kalp ya kemirgenler veya tavşan10daha insanlara karşılaştırılabilir kontraktil ve gevşeme kinetik vardır. Bir can modeli ile karşılaştırıldığında, domuz koroner anatomisi daha yakından bir insan kalbi11benzer,12 ve kalp gelişimi, pediatrik kardiyoloji ve / veya konjenital kalp defektleri odaklı çalışmalar için tercih edilen bir modeldir 13. Domuz ve insan kalbi arasında farklılıklar olmasına rağmen8, Bu benzerlikler domuz kalp kardiyovasküler araştırma için değerli bir model yapmak14.

Kalbin retrograd perfüzyon ilk Oskar Langendorff tarafından kurulan bu yana kardiyak dinamikleri ex vivo15 eğitimi için standart bir protokol haline gelmiştir16. Buna göre, Langendorff-perfüzyon otonom etkilerin yokluğunda izole, bozulmamış kalp desteklemek için kullanılabilir. Bu model doğrudan kardiyak elektrofizyoloji ve sağlıklı ve sağlıklı olmayan kalpler arasında kontraktür karşılaştırmak için yararlı bir araçtır. Kardiyak dinamikleri hem zamansal hem de mekansal olarak karmaşık olduğundan, bir bölgedeki hafif bir değişiklik tüm kalbin senkronizasyon17olarak çalışma yeteneğini önemli ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, parametre duyarlı boyaların yüksek spatiotemporal görüntüleme kalp yüzeyinde kardiyak fonksiyon izlemek için yararlı bir araçtır18,19. Nitekim, voltaj ve kalsiyuma duyarlı floresan probların eşzamanlı çift görüntüleme elektriksel aktivite, kalsiyum işleme ve doku düzeyinde uyarma-daralma kaplin değerlendirilmesi için izin verir20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Langendorff-perfüzyon ve/veya optik haritalama teknikleri daha önce yaşlanma veya genetik mutasyonlara bağlı kardiyak performanstaki düşüşü belgelemek ve farmakolojik ajanların veya çevresel maruziyetlerin güvenliğini değerlendirmek için kullanılmıştır29 ,30,31,32,33.

Klinik ortamda, invaziv bir kardiyak elektrofizyoloji çalışması genellikle kardiyak ritim bozukluklarıaraştırmak, patolojileri belirlemek ve olası tedavi seçeneklerini saptamak için kullanılır. Benzer şekilde, sinüs düğümü fonksiyonunu değerlendirmek, atriyoventriküler iletimi ölçmek ve miyokardiyal dokunun kırılmadurumunu belirlemek için kullanılabilecek bir EP protokolü tanımladık. Açıklanan EP çalışması optik haritalama ile birlikte yapılabilir, veya optokardiografi34, tamamen izole kalplerde kardiyak fizyoloji karakterize etmek. Açıklanan protokolde, yüksek spatiotemporal çözünürlük floresan görüntüleme çift emisyonlu bir kurulumda voltaj (RH237) ve kalsiyum (Rhod-2AM) boyalarının birleşimi ile gerçekleştirildi. Ayrıca kardiyak elektrofizyoloji parametreleri hem sinüs ritmi altında hem de programlanmış elektriksel stimülasyona yanıt olarak izlendi.

Protocol

Tüm deneyler, Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi (Sekizinci Baskı) uyarınca yapılmıştır. Bu çalışmalarda kullanılan tüm yöntem ve protokoller, NIH tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak Çocuk Ulusal Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Protokolü Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak insancıl bakım almıştır.

1. Hazırlık

  1. Hazırlayın 6 L modifiye Krebs-Henseleit çözeltisi16 (mM: 118.0 NaCl, 3.3 KCl, 1.2 MgSO4, 24.0 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 10.0 glikoz, 2.0 sodyum piruvat, 2% albumin, 2.0 CaCl2). Deney günü CaCl2 ekleyin, zaman içinde, fosfat varlığında, kalsiyum klorür ölümcül kalsiyum fosfat olarak çözelti dışarı çökelti olacaktır beri.
  2. Steril filtrelemeden sonra pH'ı 7,4'e ayarlayın (gözenek boyutu: 0,22 μm). 275−310 mOsm/kg aralığından emin olmak için çözelti osmolalitesini kontrol edin. Kalp çıkarıldıktan hemen sonra kullanılmak üzere buz üzerinde 1 L soğutun. Karbogen (%95 O2, %5 CO2)ile köpürmeden önce yaklaşık 37 °C'ye kadar bir su banyosunda 3 L Sıcak.
    NOT: Isınma kabarcıklar ve potansiyel emboli en aza indirir, soğuk sıvı çözünmek için gaz artan bir kapasiteye sahip olduğundan; bu nedenle, modifiye Krebs-Henseleit medya perfüzyon sistemi geçer ve ısıtır gibi, gaz kabarcıklar olarak serbest bırakılacaktır.
  3. Hazırlamak 2 L kardiyopleji (modifiye del Nido kardiyopleji solüsyonu, Tablo 1). 500 mL'lik bir kabı doldurmak için bir buz küpü tepsisinde yeterli kardiyopleji dondurun.
  4. 42 °C'ye ayarlanmış dolaşan su banyolarını açın. Kapalı hidronik ısıtma döngüsünde perfusate sirküle etmek için pompaları açın (malzemelerin tam listesi için, Malzeme Tablosu ve Şekil 1'ebakın).
    NOT: Isıtmalı dolaşan su banyosu su ceketli tüpler ve ısı eşanjörleri ısıtmak için kullanılır.
  5. Sistem üzerinden sudaki %1'lik evrensel deterjan çözeltisinin 2 L'sini çalıştırarak boru devrelerini ve odaları temizleyin. Langendorff sisteminin tüm boru devrelerini ve odalarını >4 L saf su ile durulayın. Tüm su sistemden çıkarılana kadar pompaları çalıştırın.
  6. Perfüzyon pompaları (polipropilen filtre, gözenek boyutu >5 μm) doğrultusunda sentetik bir membran filtre ekleyin. Gaz bir mikrofiber oksijenatörü (hemofiltre) ile 95% O2 ve 5% CO2 80 kPa.
    NOT: Albumin kullanırken, genellikle oksijenasyon ve / veya tüp devresi üzerinden pompalama aktivitesi ile ilişkili frothing vardır. Bir anti-köpük bileşik (antifoam Y30 emülsiyon) damla akıllıca periyodik olarak eklenebilir (~ her 30 dk) oluşur gibi söndürmek için.
  7. Aort üzerinde veya kabarcık kapanında bulunan basınç sensörü için iki noktalı kalibrasyonu (0 ve 60 mmHg) kontrol edin; gerektiği gibi kalibre edin.
  8. Kalp eksizyonu hemen önce, Langendorff döngü perfüzyon sistemine medya dökün. Perfusat,oksijenli perfusat ile gazlanan mikrofiber oksijenatörlerden (hemofiltreler) geçtiğinden emin olun, bu da aortta 37 °C'lik bir ortam perfusat sıcaklığını korumak için ısı değiştiricilerinden akar.
  9. Dolaşımdaki su banyosunu, değişim sırasında ve sistem boyunca ısı kaybını hesaba katmak için 42 °C gibi 37 °C'den birkaç dereceye ayarlayın. Termokupllarla sirkülasyon perfusat sıcaklığını izleyin.

2. Kalp Eksizyonu ve Langendorff-perfüzyon

  1. Ketamin (20 mg/kg) ve ksilazin (2 mg/kg) intramüsküler (I.M.) enjeksiyonu ve endotrakeal tüp ile entübon ile domuz yatıştırın. İndüksiyon için, fentanil (50 g/kg) ve rkuronyum (1 mg/kg) intravenöz (I.V.) bolus enjeksiyonu uygulayın. Inhale Isofluran (%0.5−3), fentanil (10−25 μg/kg) ve pankuronyum (1 mg/kg) ile anesteziyi koruyun.
    NOT: Bu prensip kanıtı çalışması için, 2,5−10,5 kg vücut ağırlığı ve 18−137 g kalp ağırlığı(Şekil 2)arasında değişen genç Yorkshire domuzları (14−42 günlük, n = 18) kullanılmıştır. İndüksiyon için ek bir enjeksiyon gerekiyorsa, ketamin (10 mg/kg) I.M. enjekte edilebilir.
  2. Bir kez hayvan tamamen anestezi ve yanıt vermeyen, artan aort ve sağ atriyum ortaya çıkarmak için bir sternotomi gerçekleştirin.
    1. Bir neşter kullanarak, torasik girişte sternumun üstünden ksifoid sürecine kadar orta hat kesisi yapın. Bir kapite ile (veya makas), sternum görünür olana kadar altta yatan yağ ve kas incelemek.
    2. Ksifoid sürecinden, cerrahi kemik makas veya kemik testere ile manubrium yoluyla sternum orta hat kesti. Kalbi ortaya çıkarmak için kesiye retraktör yerleştirin.
  3. Organ eksizyonu sırasında leke pıhtılarını en aza indirmek için 18 G iğne ve şırınga kullanarak sağ atria'ya 300 U/kg heparin (300 U/kg) dozu ile ulaşın. Göğüs boşluğuna emici pedler yerleştirin ve kalbin etrafına buz.
  4. Makas ile, dikkatle perikard ile dilim, çevreleyen bağ dokusundan künt diseksiyon ile aort izole, ve aort kemer üzerinde ilk arteriyel dalı hemen altında aort kelepçe. 18 G iğneli 50 mL'lik bir şırınga kullanarak, artan aortun üst kısmından buz gibi kardiyopleji (20 mL/kg) enjekte edin.
  5. Kalbe giden damarları kesin ve yükselen aort bozulmamış ile kalp kaldırmak ve buz gibi kardiyopleji içine excised kalp dalma.
  6. Bir çift hemostatla aort duvarlarını kavrayın ve kalbin üzerinde asılı olan 1 L buz gibi kardiyopleji ortamına giden boruya bağlı nervürlü bir kanülün üzerine kaydırın (~70 mm Hg sağlamak için~95 cm). Vaskülatüre herhangi bir kabarcık girmesini önlemek için taşana kadar sıvı girmek ve aort doldurmak için izin verin.
    NOT: Mekanik uncoupler kullanımı (2,3-butanedione monoxime [BDM] veya blebbistatin) doku oksijen talebi azaldıkça koroner perfüzyon oranını azaltacaktır.
  7. Göbek bandı kullanarak kanüle aortu sabitleyin ve hemostatları şimdi kanülden sarkan kalbin ağırlığını taşıyacak şekilde bağlayarak daha fazla çapalayın (Şekil 1C). Soğuk ortamın, yerçekimi yoluyla 70 mmHg'lik sabit bir basınçta kalbi geriye doğru itmesine izin verin. Isınmış (37 °C) Langendorff perfüzyon sistemine (<10 dk) transfer edilinceye kadar kalbi soğuk kardiyoplejiye daldırın.
    NOT: Küçük kalpler üzerinde aort (<50 g, kadar 2 haftalık domuz) kalbin ağırlığını taşıyacak ama daha büyük kalpler kanül kapalı kayma riski vardır. İlk kanülasyon sırasında ve ısıtılmış sisteme hareket ederken, havanın koroner emboliye neden olabilecek aorta girmesini önler. Kabarcıkların aorta giren çözeltiden daha hızlı yükselmesini sağlayan büyük delik borusu (>3/8" iç çapı) kullanın.
  8. Kalbi kanüle hava sokmadan Langendorff sistemine (37 °C) aktarın. Normal sinüs ritmi kalan kan ve kardiyopleji vaskülatür floş sağlar.
    NOT: Açıklanan çalışmada izole yavru domuzkalplerinde ortalama başlangıç akış hızı 184 ± 17 mL/dk olarak gözlendi. Akış hızı 70 ± 7.5 mL/dk'ya (ortalama ± SEM) geriledi. Kalp dokusunu batırmayın, çünkü kardiyak görüntülemeye engel olabilir. Doku sıcaklığı kemirgenler ile karşılaştırıldığında, daha büyük hacim ve daha küçük yüzey alanı nedeniyle domuz kalbinde koroner akış tarafından korunur. Tam akış altında, epikardyum ve endokardiyum sıcaklıkları sırasıyla 35 °C ile 37 °C arasında değişmekteydi.
    DİkKAT: Mekanik ayırıcılarla çalışırken göz aşınması da dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanı takın. Kalp hızlı ve beklenmedik bir şekilde medya atabilir.
  9. Şok aritmiler (ventriküler taşikardi, ventriküler fibrilasyon) durumunda kalbin apeks ve tabanında dış kürekler yerleştirerek ve 5 J tek bir şok teslim, 5 J artışlarla artan (veya tarafından seçilebilir olarak) kalp defibrillate defibrilatör) kadar 50 J, kardiyoversiyon, ya da un-shockable ritim. Gerektiğinde 50 J'de şokları tekrarlayın.
    NOT: Sunulan çalışmada, preparatların %89'u defibrilasyon almıştır. Dengeden sonra (~10 dk), yavru domuz kalplerinde ortalama kalp hızı 70 ± 4.5 bpm (ortalama ± SEM) gözlendi (Şekil 2).
  10. Herhangi bir kalıntı kan ve kardiyopleji kaldırmak için, recirculating olmadan modifiye Krebs-Henseleit medya en az 1 L ile kalp flush. Bir kez medya kalp üzerinden açık çalışır, perfusate recirculate sirkülasyon döngü kapatın.

3. Elektrofizyoloji Çalışması

  1. Çalışma boyunca standart bir kurşun II elektrokardiyogram (EKG) kaydetmek için, sağ atriyumda başka bir elektrot ile, apeks yakınındaki ventriküler epikardyuma 29 G iğne elektrot takın. Diferansiyel biyoamplifikatörün pozitif ve negatif girişlerini sırasıyla apeks ve sağ atriyuma bağlayın.
  2. Sağ atria bir bipolar uyarıcı elektrot takın, ve pacing amaçlı lateral sol ventrikül ikinci bir bipolar uyarıcı elektrot.
  3. Pace kalp bir elektrofizyoloji uyarıcı kullanarak, ilk akım iki kez diyastolik eşik (1−2 mA) ve 1 ms darbe genişliği35,36ayarlanmış .
    NOT: Stimülasyon bir yanıt ortaya çıkarmak için başarısız olursa, darbe genişliği kadar artırılabilir 2 ms. Daha fazla akım (~ 10x) büyük koaksiyel elektrotlar ile gerekli (bipolar stimülasyon).
  4. Tutarlı uyarıcı yanıtı sağlamak için tanımlanmış pacing döngüsü uzunluklarında (PCL) bir dizi uyarıcı impuls (1−2 mA, 1 ms darbe genişliği) uygulayarak pacing eşiğini belirleyin.
    NOT: Bir kez içsel hızı belirlenir, ilk dürtü tren biraz daha kısa PCL başlayabilir.
  5. S1−S1 veya S1−S2 pacing treni kullanarak ekstrastimülans pacing gerçekleştirin, ikincisinde 6−8 impuls (S1) treni tek bir impuls (S2) izledi. S2 PCL'yi 10 ms (yani 200 ms, 190 ms, 180 ms, vb.) adım adım küçültün. Sondan bir önceki PCL'ye (yani 190 ms) çıkın ve yakalama kaybından önce en hassas PCL'yi (örn. 184 ms) bulmak için 1 ms aralıklarla azaltın.
    NOT:
    Aynı stimülasyon parametreleri hem S1 hem de S2 için kullanılır (1−2 mA, 1 ms darbe genişliği). Temsili örnekler için Şekil 3'e veya domuz kalp elektrofizyoloji ölçümlerinde daha önce yayınlanmış değerlere bakınız37.
    1. Ventriküler etkili refrakter periyodu (VERP) kurmak için, S2'nin (erken vuruş) ventriküler depolarizasyona başladığı en kısa S1−S2 aralığını belirlemek için lateral sol ventriküldeki uyarıcı elektrodu kullanın.
      NOT: Refrakter dönem, ulaşılabilen en kısa S1−S2 bağlantı aralığıdır.
    2. Wenckebach döngüsü uzunluğunu (WBCL) tanımlamak için sağ atriyumdaki uyarıcı elektrodu kullanarak 1:1 atriyoventriküler iletimin normal iletim yolu üzerinden yayıldığı en kısa S1−S1 aralığını bulun.
      NOT: Aksi takdirde 2derece kalp bloğu temsil eder.
    3. Sinüs düğümü iyileşme süresini (SNRT) tanımlamak için, sağ atriyumdaki uyarıcı elektrodu kullanarak bir tempo treni (S1−S1) uygulayın ve tempotrenindeki son itici güç ile spontan sinoatrial düğüm aracılı aktivitenin geri kazanımı arasındaki zaman gecikmesini ölçün.
    4. Atriyoventriküler düğüm etkili refrakter periyodu (AVNERP) oluşturmak için sağ atriyumdaki uyarıcı elektrodu kullanarak erken atriyal stimülasyonun ardından QRS'yi çıkaran bir Demet potansiyeli ile en kısa S1−S2 kaplin aralığını bulun. ventriküler depolarizasyon anlamına gelen komplekstir.

4. Transmembran Voltaj ı ve Hücre İçi Kalsiyumun Optik Haritalaması

NOT: Mekanik bir uncoupler optik haritalama sırasında hareket yapıları en aza indirmek ve hipoksi önlemek için kullanılmalıdır3,38,39,40. (-/-) Blebbistatin (5 μM sirkülasyon konsantrasyonu) 5 mL perfusat (100x son konsantrasyon)41'de0,5 mM'lik bir bolus dozu olarak yavaş yavaş eklenebilir. Alternatif olarak, BDM başlangıçta 20 mM'lik bir sirkülasyon konsantrasyonunda perfusate ortama dahil edilebilir.

  1. 5 mg RH237'yi susuz DMSO'nun 4 mL'sine eriterek voltaj boyasını hazırlayın. 5 mL'ye kadar ortam ve girdap ile boya aliquot seyreltin. Aort kanülüne yavaşça RH237 (500 mL perfusat başına 62,1 g) proksimal ekleyin.
    NOT: Miyokardiyal doku, deney süresince gerekirse RH237 ile yeniden boyanabilir.
  2. 1 mg Rhod2-AM'i susuz DMSO'nun 1 mL'sine eriterek kalsiyum boyasını hazırlayın. Boyayı 50°L pluronik asitle karıştırın, 37 °C'lik sonicating banyosuna 10 dakikakadar yerleştirin ve ardından 5 mL'ye kadar ortamla seyreltin. Aort kanülüne kalsiyum boyasını (500 mL perfusat başına 50 g) ekleyin.
    NOT: Düzgün boya boyamasağlamak için, boyalar yavaş yavaş eklenmelidir (>30 s). Rhod-2AM'nin en yüksek floresan ulaşmak için 10 dakika kadar sürmesi beklenirken, RH237 kalbi 1−2 dk. Açıklanan boya yüklemesi ile, sinyal-gürültü oranı (SNR) aralıkları ~42−86 ve ~35-69 gerilim ve kalsiyum için sırasıyla beklenebilir. SNR değerleri SNR = (Tepeden Tepeye sayar)/(Diyastolik aralıkta standart sapma)42olarak hesaplanabilir.
  3. Şekil 1'degösterildiği gibi görüntüleme donanımını (kamera, görüntü ayırıcı, lens) uygun bir görüş alanına odaklanmak için yerleştirin.
    NOT: Ayırıcı, RH237'yi geçen ve Rhod2 emisyon spektrumlarını yansıtan bir dikroik ayna (660+ nm) ile yapılandırılır. Yüksek şanzıman emisyon filtreleri RH237 (710 nm uzun geçiş) ve Rhod2 (585 ± 40 nm) yayan ışık için kullanılır (uzun geçişET710, bkz. Malzeme Tablosu). Görüntü ayırıcının ön önüne geniş gözbebeği 50 mm/F0.95l lens takılır. Bu yapılandırma, daha önce doğrulanmış43,44,yeterli emisyon ışığı ayırma ile sonuçlanır.
  4. Kamerayı bir iş istasyonuna bağlayın ve 0,5−2 ms pozlama süresiyle seçilen yazılımı kullanarak görüntü elde edin. İstenilen bölgeleri bölebilen, bindirmeye ve gri ölçekli çıkarma veya sözde renk görüntüleyebilen yazılım yardımıyla görüntü hizalama gerçekleştirin yanlış hizalamayı vurgulamak için eklenmiştir (yazılım seçeneği için Malzeme Tablosu'na bakın).
  5. Ortam aydınlatmasından kaynaklanan floresan girişimini en aza indirmek için oda ışığını kapatın. Led ışıkları (525 nm, 1,4 mW/mm2)sensörün derinliği tarafından belirlendiği şekilde tek tip ve maksimal epikardiyal aydınlatma sağlamak için görüntüleme başlamadan önce test edin.
    NOT: Her ışık bir uyarma filtresi (535 ± 25 nm) ile yönlendirilir. LED ışıkları sinyal doğrusallığını en üst düzeye çıkarmak için filme almadan önce manuel olarak tetiklenebilir. Epikardyumdan yayılan floresan görüntü ayırıcı ve emisyon filtrelerinden geçirilir. Bölünmüş görüntüler yüksek hızlı bir sensöre yansıtılır. Görüş alanı lens seçimi ve kalpten uzaklığa bağlı olarak, her bölünmüş görüntü için yaklaşık 12 cm x 10 cm veya 5,9 cm x 4,7 cm'dir.
  6. Optik haritalama çalışmaları için, sol ventrikülüzerine yerleştirilmiş bir stimülasyon elektrodu ile sinüs ritmi, ventriküler fibrilasyon(Şekil 4)veya dinamik pacing (S1−S1, 1−2 mA, 1 ms pulse genişliği) sırasında miyokardiyum görüntü (Şekil 5). 350 ms'lik bir pacing döngüsü uzunluğu ile başlayın ve geri ödeme eğrileri oluşturmak için 10−50 ms oranında azalış(Şekil 5E)35,36.

5. Temizlik

  1. Kalbi sistemden çıkarın ve tüm perfusate drenaj. Sistem borularını ve odaları arıtılmış suyla durulayın.
  2. Rutin bakım için, gerektiğinde sistemi düzenli olarak deterjan çözeltisi veya seyreltilmiş hidrojen peroksit çözeltisi ile durulayın.

6. Veri İşleme

  1. Bir video dosyası açarak, ilgi çekici bir bölge seçerek ve uygun bir yazılım paketi veya özel algoritma kullanarak zaman içinde ortalama floresan çizerek çalışma boyunca optik sinyal kalitesini doğrulayın.
  2. Daha önce açıklanan görüntüleme verilerini analiz etmek için etki potansiyelini ve kalsiyum geçici zamanparametrelerini ölçmek içinaktivasyonsüresi, voltaj-kalsiyum kaplin süresi (Vm ve Ca aktivasyon süreleri arasındaki fark) ve repolarizasyon süresi ölçümleri.
    1. Floresan epikardiyal pikselleri yalıtmak ve gürültülü arka plan verilerini atmak için eşik uygulayın.
      NOT: Eşik, büyük videolar daki analizi basitleştirir ve hızlandıracaktır.
    2. Şekil 4 ve Şekil 5'tegörüldüğü gibi, 3 mm x 3 mm ile 5 mm x 5 mm arasında değişen çekirdek boyutlarına sahip epikardiyal bir yüzey alanı üzerinde optik sinyalleri mekansal olarak filtreleyin.
      NOT: İkincisi eylem potansiyel özellikleri bozmadan SNR artıracak, kalsiyum geçici morfoloji, ya da wavefronts genel kontur19,47. Büyük pikselli bir sensör kullanıyorsanız veya satın alma sırasında binning kullanıyorsanız, bu gereksiz olabilir.
    3. Önemsiz sinyal içeriğini ortadan kaldırmak için 100 ve 75 Hz arasında bir kesme frekansı ile bir dijital lowpass filtresi (örneğin, 5 sıra Butterworth) ile zamansal filtre sinyalleri45.
      NOT: Temsili işlenmiş izlemeler örneği için Şekil 5C'ye bakın.
    4. Fotobeyaztasyon, hareket veya diğer önemli varyasyon kaynaklarının etkilerini en aza indirmek için Nth-order polinom montajı ile sürüklenme kaldırma ve çıkarma uygulayın.
    5. Optik verilerin tüm video boyunca işlenmesi ve normalleştirilmesinden sonra, etki potansiyelini ve kalsiyum geçici parametrelerini hesaplayın. Depolarizasyon sırasında maksimum türevin zamanı olarak tanımlanan aktivasyon süresini ve repolarizasyon yüzde sürelerini ve dönemlerini (eylem potansiyel süresi [APD] ve [Ca2+]i süresi [CaD] hesaplamak için en yüksek floresan süresini belirleyin, bkz. Şekil 5).
    6. Zamansal parametreler hesaplandıktan sonra, özel algoritmalar23,33kullanarak tüm resimde epikardiyal yüzey boyunca tek bir eylem potansiyeli veya kalsiyum geçici yönlerini göstermek için isokronal haritalar oluşturmak, 43,45,46.
      NOT: Örnek olarak Şekil 5D'ye bakın.

Representative Results

Şekil 1A, boru devresi, pompa, filtre, oksijenatörü, rezervuarları ve ısıtma elemanlarını içeren izole kalp perfüzyon sisteminin diyagramını gösterir. EKG (kurşun II konfigürasyonu) ve pacing elektrotlarının yerleştirilmesi Şekil 1B'degösterilmiştir ve görüntüleme kurulumu Şekil 1C'degösterilmiştir. Optik bileşenlerin ve ışık yollarının şeması Şekil 1D'degösterilmiştir.

2,5−10,5 kg vücut ağırlığı ve 18−137 g kalp ağırlığı(Şekil 2A)arasında değişen, genç Yorkshire domuzlarından izole edilmiş (14−42 gün, n = 18) bozulmamış, bütün kalpler üzerinde deneysel çalışmalar yapılmıştır. İzole kalbi Langendorff sistemine (37 °C) aktardıktan sonra, kalp hızı ~ 10 dk defibrilasyon içinde 70 ± 4.5 bpm 'ye (ortalama ± SEM) sabitlenmiş ve çalışma süresi boyunca sabit kalmıştır(Şekil 2B). Ortalama akış hızı 184 ± 17 mL/dk (ortalama ± SEM) ölçüldü ve mekanik bir ayırıcı içeren ısıtılmış ortamla perfüzyon yapıldıktan sonra 70 ± 7,5 mL/dk'ya kadar yavaşladı (Şekil 2C).

Kurşun II EG'leri çalışma süresi boyunca sinüs ritmi sırasında(Şekil 3A)veya elektrofizyolojik parametreleri ölçmek için dış pacing(Şekil 3B-E)yanıt olarakkaydedildi. EP değerlendirmesi için, wbcl ve SNRT'yi saptamak için sağ atriyuma dinamik pacing (S1−S1) uygulandı (S1−S1 başladıktan sonra iyileşme süresi, Şekil 3C),wbcl ventriküler iletim için atriyal olarak başlatılan en kısa PCL olarak belirtilmiştir. Ventriküler depolarizasyonu başlatan en kısa bağlantı aralığını belirlemek ve verp'yi saptamak için sol ventrikülüzerinde bipolar uyarıcı elektrot kullanılarak S1−S2 pacing protokolü uygulanmıştır (Şekil 3D). Alternatif olarak, Şekil 3E'degösterildiği gibi AVNERP'i (S1−S2) saptamak için Bir S1−S2 atriyal pacing protokolü uygulanır. Domuz kalp elektrofizyoloji parametrelerinin temsili örnekleri daha önce yayınlanmış olanlar ile yakından hizalamak37.

Optik haritalama deneyleri sinüs ritmi sırasında, spontan ventriküler fibrilasyon(Şekil 4),veya sol ventrikül (LV) dinamik pacing (S1−S1) sırasında elektriksel ve kalsiyum geri dönüşüm eğrileri oluşturmak için yapılmıştır Şekil 5. Boya yüklü bir piglet kalbinin temsili görüntüleri Şekil 4'te, epikardiyal yüzeyde ilgi çeken iki bölgeden toplanan ilgili optik aksiyon potansiyelleri (Vm) ve kalsiyum (Ca) geçici olarak gösterilmiştir (sağ ventrikül [RV] = mavi, LV = kırmızı) . İşlenmemiş sinyaller sinüs ritmi sırasında ve ventriküler fibrilasyon sırasında görüntülenir. Daha önce de belirtildiği gibi, dinamik epikardiyal pacing (S1−S1) optik haritalama deneyleri sırasında içsel kalp hızındaki hafif bir farkı normalleştirmek için de kullanılmıştır(Şekil 5A-E). Ham sinyaller (RV = mavi, LV = kırmızı) hareket potansiyelini göstermek için kullanılan - kalsiyum geçici bağlantı süresi(Şekil 5C),aktivasyon ve süre süresi(Şekil 5D),elektrik ve kalsiyum iadesi (Şekil 5E) görüntülenir. Kalın miyokardiyal preparatlar için, çekirdek boyutu ~3 mm x 3 mm ile mekansal filtreleme epikardiyal etki potansiyeli veya kalsiyum geçici analiz19,47için uygundur. Buna göre, yüksek uzamsal çözünürlükteki görüntüler (açıklanan kurulumda 1240 x 1024 toplam veya kanal başına 620 x 512, 6,5 μm piksel boyutu) genellikle edinme sırasında veya satın alma sonrası mekansal olarak bağlanır(Şekil 5C). Görüntü işleme özel algoritmalar23,33,43,45 (Şekil 3D) kullanarak aktivasyon ve repolarizasyon haritaları oluşturmak için yapılabilir kalpteki her piksel, eylem potansiyelinin veya kalsiyum geçici upstroke'un maksimum türevi olarak tanımlanmıştır.

Figure 1
Şekil 1: Deneysel kurulum. (A) İzole kalp perfüzyon sisteminin diyagramı; oklar akış yönünü gösterir. (B) A kanüle kalp elektrot yerleşimi ile gösterilir. RA = sağ atria, RV = sağ ventrikül, LV = sol ventrikül, EKG = kurşun II elektrokardiyogram. (C) Kalp dokusuna yakın görüntüleme platformu. (D) Her tamamlayıcı probun (voltaj, kalsiyum) salınımı, uygun emisyon filtrelerine ve dikroik aynaya sahip bir görüntü bölme cihazı kullanılarak dalga boyu ile ayrılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Kalp ağırlığı, hız ve akış ölçümleri. (A) Çalışmada kullanılan her bir domuz yavrusu için vücut ağırlığı oranı (n = 18). (B) Kalp hızı ölçülen ~10 dk defibrilasyon dan sonra ve yine çalışma sonunda (yaklaşık 1 saat). (C) Azalmış oksijen talebi nedeniyle mekanik bir uncoupler (+BDM) ile perfüzyon sonrası koroner akış hızla düşer. Ölçek çubukları ortalama ± SEM'i temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Sinüs ritmi sırasında veya dış pacing yanıt olarak toplanan kurşun II elektrokardiyogram kayıtları temsili örnekler. (A) Normal sinüs ritmi. (B) Görüntüleme deneyleri için kullanılan 400 ms (S1−S1) döngü uzunluğunda epikardiyal pacing örneği. (C) Top: WBCL tanımlamak için atriyal pacing; S1 = 250 ms'de başarılı yakalama gözlenirken, atriyaldan ventrikül iletimine kadar gözlenir. Atriyal pacing SNRT belirlemek için kullanılabilir unutmayın (sinüs düğümü deşarj zamanı, dış pacing başladıktan sonra). Alt: S1 çevrim uzunluğu 205 ms'e düşürüldükçe ventriküliletimi başarısız olur. (D) Üst: Verp'i tanımlamak için epikardiyal pacing (S1−S2); S1 = 450 ms, S2 = 300 ms. Altta başarılı yakalama gözlenir: S2 çevrim uzunluğu 250 ms'e düşürüldükçe ventriküler doku yakalanmaz. (E) AVNERP'i tanımlamak için atriyal pacing (S1−S2). Üst: S1 = 450 ms, S2 = 200 ms. Altta başarılı yakalama gözlenir: S2 çevrim uzunluğu 199 ms'ye düşürüldükçe ventriküliletimi başarısız olur. Mavi oklar tempolu sivri uçları gösterir, kırmızı oklar yakalama ('C') veya hiçbir yakalama ('NC') gösterir. S1−S1 = dinamik pacing, S1−S2 = ekstrastimulus pacing. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Sinüs ritmi ve ventriküler fibrilasyon sırasında optik veriler. Sol: Boya yüklü domuz kalbinin temsili görüntüleri (Vm = voltaj, RH237; Ca = kalsiyum, Rhod2), ön görünüm. Uzaysal olarak filtrelenmiş transmembran gerilimi ve sinüs ritmi sırasında domuz kalbinden gelen hücre içi kalsiyum floresan sinyalleri (Merkez). Ventriküler fibrilasyon sırasında voltaj ve kalsiyum sinyalleri (Sağ). Sinyal bölge boyutları (15 x 15 piksel = 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 = 4,8 x 4,8 mm2 çekirdek boyutu) kırmızı ve mavi kareler olarak temsil edilir. Birimler = ΔF/F. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Langendorff'un perfüzyonlu domuz kalplerinden alınan optik veriler. İşlenmemiş, uzamsal olarak filtrelenmiş (A) transmembran gerilimi ve (B) apeksteki elektriksel voltaj sırasında sağ ve sol ventriküllerden hücre içi kalsiyum floresan sinyalleri. Filtrelenmemiş, mekansal ortalama sinyaller optik eylem potansiyellerini ve ilgi bölgelerinden gelen kalsiyum geçicilerini göstermektedir (sinyal birimleri ΔF/F'dir). (C) Normalleştirilmiş geçici bir bindirme eylem potansiyelini-kalsiyum geçici bağlantı süresini (75 Hz'de filtrelenmiş düşük geçiş) göstermektedir. (D) Aktivasyon süresi (tact)ve % 80 repolarizasyon süresi de dahil olmak üzere zamansal parametrelerin izokronal haritaları oluşturmak için epikardiyal yüzey boyunca sinyalleri işleme. (E) Daha yavaş tempolu devir uzunluklarında daha uzun repolarizasyon süresini göstermek için istatistiksel analiz (sağda) ile birden fazla frekansta (solda) üretilen elektriksel ve kalsiyum geçici iade eğrileri. Ölçek çubukları = ortalama ± SEM. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kimyasal Formül Molekül ağırlığı g/L
Sodyum klorür Nacl 58.44 5.26
Sodyum glukonat C6H11Nao7 218.14 5.02
Sodyum asetat trihidrat C2H3NaO2•3H2O 136.08 3.68
Potasyum klorür Kartal 74.55 0.63
Magnezyum klorür (susuz) MgCl2 95.21 0.1405
%8.4 Sodyum bikarbonat NaHCO3 84.01 13
Mannitol C6H14O6 182.17 16.3
Magnezyum sülfat MgSO4 120.37 4
Ph 7.4
Ozmolarite (mOsmol/L) 294

Tablo 1: Modifiye del Nido's kardiyopleji tarifi.

Discussion

Kardiyovasküler araştırma modelleri hücresel in vivo preparatları arasında değişse de, klinik alaka ve deneysel yarar arasında doğal bir trade-off vardır. Bu spektrumda, izole Langendorff perfüzyon kalp kardiyakfizyolojisi 48eğitimi için yararlı bir uzlaşma kalır. Tüm kalp modeli tek hücre veya doku monolayers daha fonksiyonel ve yapısal entegrasyon daha yüksek bir düzeyde temsil eder, ama aynı zamanda in vivo modelleri ile ilişkili şaşırtıcı karmaşıklığı önler. Çift optik haritalama deneyleri sırasında önemli bir avantaj izole kalbin epikardiyal yüzeyi gözlemlenebilir ve transmembran potansiyeli ve kalsiyum işleme floresan görüntüleme kardiyakfizyolojisiizlemek için kullanılabilir 34 .

Kemirgen modelleri, kısmen ilgili tüm elementlerin (örn. çözelti hacmi, perfüzyon devresi, boya miktarı ve mekanik uncouplerler) ile ilişkili maliyetnedeniyle, daha büyük hayvanlara karşı izole kalp preparatları için en yaygın olarak kullanılır. büyük hayvanlarda aritmiler için daha fazla istikrarsızlık ve eğilimi ile birlikte10,36,49. Domuz kalpleri kullanmanın bir avantajı da, daralmanın yapısı, büyüklüğü ve hızı açısından insan kalbine yakından benzemeleri, bu nedenle koroner kan akımı ve kardiyak delik gibi hemodinamik parametrelerin daha doğru bir şekilde modelilmesidir. Aynı şekilde, insanlar ve domuzlar benzer kalsiyum işleme var, elektrokardiyogram aralıkları37, ve bu temsil altında yatan kanallar da dahil olmak üzere eylem potansiyel morfolojisi12,50,51, 52. yıl. Bu protokol, miyokardiyal işlevi kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için tekrarlanabilir büyük bir hayvan modeli oluşturma adımlarını ayrıntılı olarak açıklar. Kurulu elektrofizyolojik protokollerle birlikte kullanılan transmembran voltaj (RH237) ve hücre içi kalsiyumun (Rhod2) eşzamanlı görüntülemesi, değişmiş kardiyak mekanizmalardan sorumlu mekanizmaları saptamak için Işlev. Açıklanan metodoloji preklinik güvenlik testi, toksikolojik tarama ve genetik veya diğer hastalık patolojilerinin araştırılması için kullanılabilir. Ayrıca, açıklanan metodoloji değiştirilebilir ve diğer kardiyak modeller ile kullanılmak üzere adapte edilebilir (örneğin, kan, insan) özel araştırma odak bağlı olarak53,54,55.

İzole, tüm kalp hazırlıkları için daha küçük bir kemirgen modeli daha büyük bir domuz modeline geçiş yaparken akılda tutulması gereken birkaç kritik değişiklikler vardır. Hazırlık ve kurulum sırasında, onkotik basıncı korumak ve ödemi azaltmak için perfusate albumin eklemenizi öneririz (artı antiköpük, gerekirse)56,57,58,59. Ayrıca, albumin içeren perfusat da medya yağ asidi takviyesi gerektiren metabolik çalışmalarda yardımcı olabilir60,61. Kemirgen kalpler aksine, büyük domuz kalp hacim oranı ve daha iyi sıcaklığı korur koroner damarlar akan ısıtılmış ortam artan hacmi nedeniyle sıcak ortamda batık olması gerekmez. Daha önce de belirtildiği gibi, sağ ventrikül içine ve sağ ve sol ventriküllerin epikardiyal yüzeyine sıcaklık sondaları yerleştirdik ve çalışma boyunca her üç noktada da 1−2 °C'lik sadece hafif sıcaklık dalgalanmalarını gözlemledik. Daha da önemlisi, bu tür hızlı akış hızları da kabarcıklar ve potansiyel bir emboli olasılığını artırabilir. Bu sorunu aşmak için, aort kanülüne doğru giden büyük delikli borulu bir kabarcık tuzağı kullanmanızı öneririz. Benzer şekilde, biz daha büyük (ve ağır) kalp aort kanültetmek için birlikte çalışan iki kişi için en yararlı bulundu; bir kişi sağlam hemostats ve başka bir göbek bandı kullanarak kanula aort güvenli aort ile aort açık tutmak için. Açıklanan metodolojide, kardiyopleji ve defibrilasyon ile perfüzyonun kardiyak iyileşme için hayati önem taşıdığını ve bunun kemirgen kalp preparatlarına aykırı olduğunu bulduk. Deneyimlerimize göre, sadece birkaç eksire kalpkardiyoversiyon olmadan normal sinüs odaklı aktiviteye devam etti.

Optik görüntüleme uç noktalarını geliştirmek için, asılı bir kalp hazırlığı, batmış bir kalple oluşabilecek parlamanın etkisini sınırlatır. Ayrıca, asılı kalp de dikey görüntüleme için yatay olarak kalp aşağı döşeme oluşabilir kalbin arka yönü üzerinde koroner damarların herhangi bir sıkıştırma veya uzlaşma önler. Biz de kabarcık tuzak (aort kanül yakın) büyük ölçüde doku boyama ve optik sinyaller geliştirilmiş sonra floresan boyalar yükleme bulundu. Son olarak, kardiyak elektrofizyoloji uç noktaları geliştirmek için, daha büyük bir koaksiyel stimülasyon elektrot kullanımı başarılı atriyal pacing kolaylaştırladı. Çeşitli EP parametreleri için yakalama ve yakalama kaybını tanımlamak için elektrokardiyogram kullanımını tanımlasak da, intrakardiyak kateterler veya bipolar kayıt elektrotları da kullanılabilir.

Çalışmamız izole, bozulmamış domuz kalp modelinde çift optik haritalama ve kardiyak elektrofizyolojik değerlendirme için bir metodoloji geliştirmeye odaklanmıştır. Genç insan kalbi ile benzerlikler nedeniyle, domuz kalp pediatrik kardiyoloji veya konjenital kalp defektleri odaklı çalışmalar için popüler bir model olmaya devam etmektedir. Daha da önemlisi, açıklanan yaklaşım daha büyük boyutlu yetişkin kalpleri ve / veya ilgi farklı türler ile kullanmak için adapte edilebilir. Nitekim, diğer laboratuvarlar bu can veya insan kalpleri (ya donör veya hastalıklı) kullanımı kendi özel araştırma odak53,54,55için daha uygulanabilir olduğunu bulabilirsiniz. Bu çalışmanın bir diğer potansiyel sınırlama görüntüleme sırasında hareket artifakı azaltmak için mekanik bir uncoupler kullanımıdır. Blebbistatin EKG parametreleri, aktivasyon ve refrakter dönemleri41,62,63üzerindeki minimal etkileri nedeniyle kardiyak görüntüleme uygulamalarında tercih edilen uncoupler haline gelmiştir. BDM daha az pahalı bir seçimdir, özellikle perfusate ve mekanik uncoupler daha büyük hacimlerde gerektiren büyük hayvan çalışmalarında önemli olabilir, ancak potasyum ve kalsiyum akımları üzerinde daha büyük bir etkiye sahip olduğu bilinmektedir eylem potansiyelini değiştirebilir morfoloji64,65,66,67. BDM kullanılırsa, APD kısaltma şoka bağlı arrythmias68kalplerin savunmasızlığını artırır unutmayın. Tersine, blebbistatin kullanarak ana sınırlama onun fotosensitivite ve fototoksisite, bu etkileri azalttı alternatif formülasyonlar rağmen69,70,71. Son olarak, açıklanan metodoloji çift optik haritalama deneyi için tek bir kamera sistemi kullanır, ancak epikardiyal yüzey de elektrik dalgalarının ventriküler fibrilasyon ve / veya izleme odaklanmış araştırma çalışmaları dikkat etmek önemlidir diğerleri tarafından açıklandığı gibi, üç boyutlu panoramik görüntüleme içerecek şekilde bu yaklaşımı değiştirmek gerekir15,19,72,73,74,75 .

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar minnetle yararlı deneysel rehberlik için Dr Matthew Kay kabul ve Manelle Ramazan ve Muhaymin Chowdhury teknik yardım için. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01HL139472'den NGP'ye, R01 HL139712'den NI'ye), Çocuk Araştırma Enstitüsü, Çocuk Ulusal Kalp Enstitüsü ve Sheikh Zayed Pediatrik Cerrahi İnovasyon Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560-5MG Mechanical Uncoupler
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753-100G Mechanical Uncoupler
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9418
Analog signal interface emka Technologies itf16USB
Antifoam Sigma-Aldrich A5758-250ML
Antifoam Y-30 Emulsion Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A5758
Aortic cannula, 5/16” Cole-Parmer 45509-60
Bubble trap Sigma-Aldrich CLS430641U-100EA
CaCl2 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ C77-500
Camera, sCMOS Andor Technology Zyla 4.2 PLUS
Coaxial stimulation electrode (atria) Harvard Apparatus 73-0219
Defibrillator Zoll M Series
Dichroic mirror Chroma Technology T660lpxrxt-UF2
Differential amplifier Warner Instruments DP-304A
Emission filter, calcium Chroma Technology ET585/40m
Emission filter, voltage Chroma Technology ET710lp
EP stimulator (Bloom) Fisher Medical DTU-215B
Excitation filter Chroma Technology CT510/60bp
Excitation lights Thorlabs SOLIS-525C
Filter McMaster-Carr 8147K52
Filter cartridge, polypropylene Pentair PD-5-934
Filter housing McMaster-Carr 9979T21
Flow transducer Transonic ME6PXN
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 158968
Heating coil Radnoti 158821
Hemofilter Hemocor HPH 400
Hemostatic Forceps World Precision Instruments 501326
Image Splitter Cairn Research OptoSplit II
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P3911
KH2PO4 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ 423-316
Large-bore tubing, I.D. 3/8” Fisher Scientific 14-169-7H
Lens 50 mm, 0.95 f-stop Navitar DO-5095
Metamorph Molecular Devices Image Alignment
MgSO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506
Mucasol detergent Sigma-Aldrich Z637181-2L
Na Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P2256
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S-3014
NaHCO3 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S-233
Needle Electrodes 29 G, 2 mm AD Instruments Inc. MLA1204
Noise eliminator Quest Scientific Humbug
Perfusion pump PolyStan A/S 1481
Pressure transducer World Precision Instruments BLPR2
Reservoir, 2 L Cole-Parmer UX-34541-07
RH237 AAT Bioquest Inc. 21480
Rhod2-AM AAT Bioquest Inc. 21062
Stimulation electrode (ventricle) Harvard Apparatus 73-0160
Surgical Suture McKesson Medical-Surgical 890186
Transducer amplifier World Precision Instruments TBM4M
Tubing flow console Transonic TS410
Umbilical tape Jorvet J0025UA
Water bath/circulator VWR 89400-970
Surgical Tools
Bandage shears Harvard Apparatus 72-8448 Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0 mm blade length, 17.0 cm
Electrocautery Dalwha Corp. Ltd. BA2ALD001 Model: 200 Basic
Hemostat Roboz RS-7476 St Vincent Tube Occluding Forceps
Hemostatic forceps Harvard Apparatus 72-8960 Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm
Hemostats Harvard Apparatus 72-8985 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2 mm tip 14 cm
Mayo scissors WPI 501749 14.5 cm, Straight
Metzenbaum scissors WPI 501747 11.5 cm, Straight
Mosquito forceps Harvard Apparatus 72-8980 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2 mm tip width 12 cm
Needle holder Harvard Apparatus 72-8828 Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length
Pediatric cross clamp Roboz RS-7660 Cooley-Derra Clamp 6.25" 5 mm Calibrations
Right angle forceps WPI 501240 Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14 cm, Right Angle
Scalpel Ted Pella 549-4 Scalpel Handle No. 4, 13.7 cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades
Scissors Harvard Apparatus 72-8380 Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42 mm blade,12 cm
Straight Serrated forceps WPI 500363 Dressing Forceps 15.5 cm
Towel clamp WPI 501700 Backhaus Towel Clamp, 13 cm, Curved, Locking handle, SS
Weitlaner retractor WPI 501314 Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2 cm, 2x 3 Sharp Prongs
Disposables
3-0 prolene suture Various vendors Various vendors
Vessel loop Aspen surgical 011001PBX Sterion® Vessel Loop, 0.8 mm x 406 mm
Cardioplegia (Plegisol) Pfizer 00409-7969-05 Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20 mL/kg
Heparin Various vendors Various vendors 300 U/kg
Syringe and Needle Various vendors Various vendors 60 mL & 18 G respectively
Umbilical tape Ethicon U12T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., De Jesus, N. M., Ripplinger, C. M. Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart. Journal of Visualized Experiments. (103), e53166 (2015).
  2. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2012).
  3. Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. Journal of Visualized Experiments. (65), e4115 (2012).
  4. Capecchi, M. R. The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting. Trends in genetic. 5, (3), 70-76 (1989).
  5. Hall, B., Limaye, A., Kulkarni, A. B. Overview: generation of gene knockout mice. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, Unit 19 1-17 (2009).
  6. Schechter, M. A., et al. An Isolated Working Heart System for Large Animal Models. Journal of Visualized Experiments. (88), e51671 (2014).
  7. Arlock, P., et al. Ion currents of cardiomyocytes in different regions of the Göttingen minipig heart. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 86, 12-18 (2017).
  8. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of anatomy. 193, Pt 1 105-119 (1998).
  9. Markert, M., et al. Validation of the normal, freely moving Göttingen minipig for pharmacological safety testing. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 60, (1), 79-87 (2009).
  10. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141, (3), 235-249 (2014).
  11. Bertho, E., Gagnon, G. A comparative study in three dimension of the blood supply of the normal interventricular septum in human, canine, bovine, porcine, ovine and equine heart. Diseases of the Chest. 46, 251-262 (1964).
  12. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53, (5), 432-438 (2014).
  13. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3, (4), 30 (2016).
  14. Jordan, C. P., et al. Minimally Invasive Resynchronization Pacemaker: A Pediatric Animal Model. The Annals of Thoracic Surgery. 96, (6), 2210-2213 (2013).
  15. Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophysical Journal. 92, (3), 1090-1095 (2007).
  16. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden Saugethierherzen [Investigations on the surviving mammalian heart]. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1895).
  17. Pumir, A., Arutunyan, A., Krinsky, V., Sarvazyan, N. Genesis of ectopic waves: role of coupling, automaticity, and heterogeneity. Biophysical Journal. 89, (4), 2332-2349 (2005).
  18. Kay, M. W., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Rogers, J. M. Lifetimes of epicardial rotors in panoramic optical maps of fibrillating swine ventricles. American journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 291, (4), 1935-1941 (2006).
  19. Lee, P., et al. Low-Cost Optical Mapping Systems for Panoramic Imaging of Complex Arrhythmias and Drug-Action in Translational Heart Models. Scientific Reports. 7, 43217 (2017).
  20. Venkataraman, R., Holcomb, M. R., Harder, R., Knollmann, B. C., Baudenbacher, F. Ratiometric imaging of calcium during ischemia-reperfusion injury in isolated mouse hearts using Fura-2. BioMedical Engineering OnLine. 11, (1), 39 (2012).
  21. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical Imaging of the Heart. Circulation Research. 95, (1), 21-33 (2004).
  22. Zimmermann, W. H., et al. Three-dimensional engineered heart tissue from neonatal rat cardiac myocytes. Biotechnology and Bioengineering. 68, (1), 106-114 (2000).
  23. Jaimes, R., et al. A Technical Review of Optical Mapping of Intracellular Calcium within Myocardial Tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310, (11), 1388-1401 (2016).
  24. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110, (4), 609-623 (2012).
  25. Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. Imaging Calcium Sparks in Cardiac Myocytes. Methods in Molecular Biology. 689, Clifton, N.J. 205 (2011).
  26. Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).
  27. Thomas, K., Goudy, J., Henley, T., Bressan, M. Optical Electrophysiology in the Developing Heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5, (2), 28 (2018).
  28. Nikolski, V., Efimov, I. Fluorescent imaging of a dual-pathway atrioventricular-nodal conduction system. Circulation Research. 88, (3), 23-30 (2001).
  29. Posnack, N. G., et al. Bisphenol A Exposure and Cardiac Electrical Conduction in Excised Rat Hearts. Environmental Health Perspectives. 122, (4), 384-390 (2014).
  30. Garrott, K., et al. KATP channel inhibition blunts electromechanical decline during hypoxia in left ventricular working rabbit hearts. The Journal of Physiology. 595, (12), 3799-3813 (2017).
  31. Wang, Z., et al. Exposure to Secondhand Smoke and Arrhythmogenic Cardiac Alternans in a Mouse Model. Environmental Health Perspectives. 126, (12), 127001 (2018).
  32. Francis Stuart, S. D., et al. Age-related changes in cardiac electrophysiology and calcium handling in response to sympathetic nerve stimulation. The Journal of Physiology. 596, (17), 3977-3991 (2018).
  33. Jaimes, R., et al. Plasticizer Interaction With the Heart: Chemicals Used in Plastic Medical Devices Can Interfere With Cardiac Electrophysiology. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12, (7), (2019).
  34. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE reviews in Biomedical Engineering. 7, 115-125 (2014).
  35. Li, N., Wehrens, X. H. Programmed Electrical Stimulation in Mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730 (2010).
  36. Dor-Haim, H., Berenfeld, O., Horowitz, M., Lotan, C., Swissa, M. Reduced Ventricular Arrhythmogeneity and Increased Electrical Complexity in Normal Exercised Rats. PLoS ONE. 8, (6), 66658 (2013).
  37. Noszczyk-Nowak, A., et al. Normal Values for Heart Electrophysiology Parameters of Healthy Swine Determined on Electrophysiology Study. Advances in Clinical and Experimental. 25, (6), 1249-1254 (2016).
  38. Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Kay, M. W. NADH changes during hypoxia, ischemia, and increased work differ between isolated heart preparations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306, (4), 529-537 (2014).
  39. Schramm, M., Klieber, H. G., Daut, J. The energy expenditure of actomyosin-ATPase, Ca(2+)-ATPase and Na+,K(+)-ATPase in guinea-pig cardiac ventricular muscle. The Journal of Physiology. 481, 647-662 (1994).
  40. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 314, (4), 704-715 (2018).
  41. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4, (5), 619-626 (2007).
  42. Evertson, D. W., et al. High-Resolution High-Speed Panoramic Cardiac Imaging System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55, (3), 1241-1243 (2008).
  43. Jaimes, R., et al. Path Splitter: A New Approach for Truly Simultaneous Dual Optical Mapping of the Heart with a Single Camera. bioRxiv. 651380 (2019).
  44. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  45. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303, (7), 753-765 (2012).
  46. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9, (1), 1389 (2019).
  47. Mironov, S. F., Vetter, F. J., Pertsov, A. M. Fluorescence imaging of cardiac propagation: spectral properties and filtering of optical action potentials. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291, (1), 327-335 (2006).
  48. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55, (2), 113-126 (2007).
  49. Nishida, K., Michael, G., Dobrev, D., Nattel, S. Animal models for atrial fibrillation: clinical insights and scientific opportunities. Europace. 12, (2), 160-172 (2010).
  50. Verdouw, P. D., Van Den Doel, M. A., De Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39, (1), 121-135 (1998).
  51. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3, (4), 30 (2016).
  52. Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as Models in Biomedical Research and Toxicology Testing. Veterinary Pathology. 49, (2), 344-356 (2012).
  53. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical Volume of Human Myocardium Necessary to Maintain Ventricular Fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11, (11), 006692 (2018).
  54. Hill, A. J., et al. In Vitro Studies of Human Hearts. The Annals of Thoracic Surgery. 79, (1), 168-177 (2005).
  55. Fedorov, V. V., et al. Structural and functional evidence for discrete exit pathways that connect the canine sinoatrial node and atria. Circulation Research. 104, (7), 915-923 (2009).
  56. Jacob, M., et al. Albumin Augmentation Improves Condition of Guinea Pig Hearts After 4 hr of Cold Ischemia. Transplantation. 87, (7), 956-965 (2009).
  57. Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 254, (6), 1105-1112 (1988).
  58. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41, (6), 613-627 (2000).
  59. Werner, J. C., Whitman, V., Fripp, R. R., Schuler, H. G., Morgan, H. E. Carbohydrate metabolism in isolated, working newborn pig heart. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 241, (5), 364-371 (1981).
  60. Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303, (2), 156-167 (2012).
  61. Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 13, (1), 168-172 (1989).
  62. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302, (1), 262-269 (2012).
  63. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, (5), 503-512 (2012).
  64. Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89, (2), 163-172 (2004).
  65. Liu, Y., et al. Effects of diacetyl monoxime on the electrical properties of sheep and guinea pig ventricular muscle. Cardiovascular Research. 27, (11), 1991-1997 (1993).
  66. Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25, (45), 419-424 (2010).
  67. Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, (6), 305-313 (1994).
  68. Cheng, Y., Li, L., Nikolski, V., Wallick, D. W., Efimov, I. R. Shock-induced arrhythmogenesis is enhanced by 2,3-butanedione monoxime compared with cytochalasin D. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, (1), 310-318 (2004).
  69. Kolega, J. Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light. Biochemical and Biophysical Research Communications. 320, (3), 1020-1025 (2004).
  70. Sakamoto, T., Limouze, J., Combs, C. A., Straight, A. F., Sellers, J. R. Blebbistatin, a myosin II inhibitor, is photoinactivated by blue light. Biochemistry. 44, (2), 584-588 (2005).
  71. Várkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, (1), 26141 (2016).
  72. Bray, M. A., Lin, S. F., Wikswo, J. P. Three-dimensional surface reconstruction and fluorescent visualization of cardiac activation. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 47, (10), 1382-1391 (2000).
  73. Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. Journal of Biomedical Optics. 12, (4), 44019 (2007).
  74. Gloschat, C., et al. RHYTHM: An Open Source Imaging Toolkit for Cardiac Panoramic Optical Mapping. Scientific Reports. 8, (1), 2921 (2018).
  75. Kay, M. W., Amison, P. M., Rogers, J. M. Three-dimensional surface reconstruction and panoramic optical mapping of large hearts. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 51, (7), 1219-1229 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics