Farelerde İntrathecally Sentezlenmiş Proteinlerin Kantitatif Ölçümü

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Yüksek spinal sıvı protein düzeyleri ya değiştirilmiş bir kan-beyin bariyeri veya intratekal sentez arasında plazma proteininin difüzyon sonucu olabilir. Bu makalede, her iki vakanın da ayrımına yardımcı olan ve intrathecally sentezlenmiş proteinlerin nicel ölçümlerini sağlayan optimize edilmiş bir test protokolü sunulmuştur.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gilli, F., Welsh, N. C., Linzey, M. R., Royce, D. B., DiSano, K. D., Pachner, A. R. Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice. J. Vis. Exp. (153), e60495, doi:10.3791/60495 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Beyin ve omurilikte bulunan bir sıvı olan beyin omurilik sıvısı (BOS), hem temel hem de klinik bilim için büyük önem taşımaktadır. BOS protein bileşiminin analizi, nörolojik hastalıkların yanı sıra temel nörolojik araştırmalarda da önemli bilgiler sağlar. Bir uyarı, BOS cinsinden ölçülen proteinlerin hem intratekal sentezden hem de serumdan transudasyondan kaynaklanabilir ve BOS'un protein analizi sadece bu iki bileşenin toplamını belirleyebilir. Protein transudasyonu ile hayvan modellerinde ve insanlarda intrathecally üretilen proteinler arasında ayrım yapmak için, geleneksel protein analiz araçlarını kullanan BOS protein profilleme ölçümleri, kan-beyin arabiriminin bütünlüğünün bir göstergesi olan albumin BOS/serum quotient (Qalbumin)ve intrakalprotein sentezinin bir tahmini olan protein indeksini (Qprotein/Qalbumin)içermelidir. Bu protokol, bos ve kan toplamadan, intratekal protein sentezinin kantitatif ölçümü ve nörolojik bozuklukların fare modellerinde BBI bozukluğunun kantitatif ölçümü için tüm prosedürü göstermektedir.

Introduction

Beyin ve omuriliği çevreleyen berrak ve renksiz bir sıvı olan beyin omurilik sıvısı (BOS), büyük klinik ve temel bilimsel öneme sahiptir. BOS merkezi sinir sisteminin elektrolitik ortamını korur (CNS), sistemik asit-baz durumunu dengeler, nöronal ve glial hücrelere besin kaynakları, CNS için lenfatik bir sistem olarak fonksiyonları, ve hormonlar taşır, nörotransmitter, sitokinler ve CNS boyunca diğer nöropeptidler1. Böylece, BOS bileşimi CNS aktivitesini yansıttığından, bu sıvı CNS'nin fizyolojik ve patolojik durumunu karakterize etmek için değerli, dolaylı da olsa erişim sağlar.

BOS, yüz yılı aşkın bir süredir CNS'yi etkileyen koşulları teşhis etmek için kullanılmıştır ve bu süre içinde öncelikle klinisyenler tarafından bir tanı aracı olarak incelenmiştir. Ancak, son yıllarda nörobiyologlar CNS patofizyolojisi çalışma için BOS potansiyelini tanıdı. Özellikle, bu analizin dinamik değişimlere ışık tutabileceği beklentisiyle, BOS'un protein bileşiminin ayrıntılı bir şekilde incelenmesine olanak sağlayan nörolojik alanda çeşitli yüksek işlem protein analiz araçları kullanılmaya başlanmıştır. CNS içinde meydana gelen.

Luminex ve Simoa teknolojileri 2 gibi multipleksimmünoassay teknikleri teknolojik gelişmeler,3, çok düşük konsantrasyonlarda proteinlerin yüzlerce tespit yeteneği ile bugün araştırmacılar sağlar. Ayrıca, bu aynı teknolojiler küçük örnek hacimlerin kullanımına izin vermekte, böylece küçük hayvanlarda, fareler de dahil olmak üzere, sınırlı sayıda BOS numune hacminin yakın zamana kadar sıvının ayrıntılı karakterizasyonlarını engellediği çalışmaları teşvik etmektedir.

Bununla birlikte, bir uyarı BOS cinsinden ölçülen proteinlerin hasarlı bir kan-beyin arayüzü (BBI) nedeniyle intratekal sentez ve / veya serum transudation elde edilebilmiştir. Ne yazık ki, BOS protein analizi tek başına sadece bu iki bileşenin toplamını belirleyebilirsiniz. Transudate ve intrathecally üretilen proteinler arasında ayrım yapmak için, mevcut protein analiz aracını kullanan BOS protein ölçümleri serum konsantrasyonlarında bireysel değişkenlik ve bariyer bütünlüğü için ayarlanmalıdır. Ancak, bu ayarlama yaygın klinik uygulamada kullanılan rağmen, örneğin, BOS IgG indeksi, intratekal IgG sentezi tespit etmek için yüksek duyarlılığa sahip4,5,6, Bugüne kadar çok az araştırma çalışmaları serum konsantrasyonu ve bariyer bütünlüğü için BOS protein konsantrasyonları düzeltilmiş var7,8.

Günümüzde Reibergram yaklaşımı, proteinlerin bariyer fonksiyonunu ve intratekal sentezini belirlemenin en iyi yoludur. Bu analizleri BOS / serum bölüm diyagramları grafiksel bir değerlendirme, entegre bir şekilde, hem bariyer (dys) fonksiyonu ve intratekal protein sentezi, sadece kan kaynaklı protein atıfta9,10. Çok bol protein albumin genellikle referans protein olarak seçilir çünkü sadece karaciğerde üretilir ve büyüklüğü, yaklaşık 70 kDa, küçük ve büyük proteinler arasında ara protein11. Analiz diyagramı ilk olarak 1987 yılında Reiber ve Felgenhauer tarafından immünglobulinlerin (Igs)11'inana sınıfları için tanımlanmıştır, ampirik olarak binlerce insan örneğinin analizinden elde edilen sonuçlara dayanmaktadır9. Yaklaşım daha sonra moleküler difüzyon / akış hızı12teorisinde difüzyon iki Fick yasalarının uygulanması ile doğrulandı . Böyle bir teori bariyer yoluyla bir proteindifüzyon uhiperbolik bir dağılıma sahiptir ve nicel CNSproteinlerindinamiklerini açıklayabilir gösterir 9,13. Genel olarak, intratekal protein sentezini göstermek için Reibergram kullanmanın avantajı, aynı anda serumdan BOS giren protein fraksiyonunu ve yerel üretim nedeniyle BOS'ta bulunan protein miktarını aynı anda tanımlamasTır.

Bu makale ve ilgili protokol, BOS ve kan toplamadan BOS protein düzeylerini düzelten son hesaplamalara kadar tüm prosedürü, nörolojik fare modellerinde intratekal protein sentezinin nicel ölçümü için tanımlar. Bozukluk -ları. Bu prosedür, (1) herhangi bir BOS proteininin patofizyolojik kökenini ve (2) bariyer bütünlüğünün stabilitesini ve işlevsel önemini değerlendirmek için bir temel sağlar. Bu prosedür ve protokol sadece fare BOS örneklerinin değerlendirilmesinde yararlı olmakla kalmıyor, aynı zamanda nörolojik hastalıklar ve insan hastalarının çok sayıdaki hayvan modellerinde BOS'un analizinde de yararlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları, Dartmouth'taki Geisel Tıp Fakültesi'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan protokolleri kullanır.

1. Sıvıların toplanması

NOT: Hem serum hem de BOS gereklidir. Her sıvı toplama için iki protokol ler hayatta kalma ve nekropsi için gereklidir.

  1. Sağkalım prosedürleri kullanılarak serum ve BOS toplama
    NOT: Sağkalım sıvısı toplama için serum toplama daha az invaziv bir işlem olduğu için BOS koleksiyonundan önce yapılmalıdır. BOS serum çekilişinden sonraki bir hafta içinde alınmalıdır.
    1. Serum toplama için retro-orbital kanama prosedürü.
      NOT: Bu işlem farelerin sağkalım kanaması içindir14. Açıklanan prosedür farelerin herhangi bir yaş, cinsiyet ve suşu için geçerlidir. IACUC kuralları, vücut ağırlığının %1'inin maksimum kan hacminin tek bir kan çekimi olarak çıkarılabileni gerektirdiğinden, işlemin sadece 15 g'dan ağır farelerde yapılması önerilir.
      1. Fare içeren kafesleri raftan uygun bir çalışma alanına taşıyın. Oksijen akış ölçeri 1 L/dk'ya açarak anestezi gaz makinesini hazırlayın.
      2. Hayvanı indüksiyon odasına yerleştirin ve kapağı sıkıca kapatın. Izofluran buharlaştırıcıyı %3,5'e açın ve hayvanı bükünmeye kadar izleyin.
      3. Odadan hayvan çıkarın ve pedal refleks, yani, sıkı ayak takımı çimdik anestezi düzeyini değerlendirmek. İşlemi gerçekleştirmeden önce yeterli anestezi derinliğini sağlayın: sıkı bir kıskaç yanıt eksikliği yeterli anestezi gösterir.
      4. Baskın olmayan elin başparmak ve işaret parmağı ile kulakların arkasındaki gevşek deriyi kavrayarak anestezili fareyi dizginle. Göz üstündeki deriyi ve başparmağı geri çekmek için göz altı derisini geri çekmek için işaret parmağını kullanarak gözleri şişkinlik.
      5. Pasteur pipetinin ucunu göz küresinin altındaki göz çukuruna yerleştirin(Şekil 1, sol panel), ucu yaklaşık 45° olarak göz çukurunun ortasına doğru yönlendirin(Şekil 1, sağ panel). Pipeti ileri geçiş sırasında parmakların arasında döndürün. Hafif basınç uygulayın ve kan pipet girene kadar bırakın.
        NOT: Bu konumdan bir anda çekilebilecek maksimum kan miktarı vücut ağırlığının yaklaşık %1'idir, örneğin 20 g fareden 0.2 mL.
      6. Kapilleri yavaşça çıkararak göz yaralanmasını önleyin ve toplanan kanı 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Göz kapağını kapatın ve daha fazla kanamayı önlemek için gazlı bez ile hafif basınç uygulayın. Bir kez tam uyarı ve mobil (genellikle 3−5 dk), onun tutma kafesi için fare dönün.
      7. Oda sıcaklığında 30−60 dakika (RT) için kanın pıhtılaşmasına izin verin, ardından 4 °C'lik soğutuculu santrifüjde 2.000 x g'da 10 dakika santrifüj kan verin. Temiz bir pipet tekniği kullanarak serumu 0,5 mL etiketli yeni bir şişeye toplayın. Serum şişesini hemen -80 °C'de dondurun.
    2. Hayatta kalma prosedürü ile BOS toplama
      NOT: Bu işlem sağkalım cerrahisi içindir ve Liu ve Duff tarafından 2008 yılında yayınlanan protokole dayanmaktadır.15. Fareler intraperitoneal olarak uygulanan Ketamin (20 mg/mL), ksilazin (0.5 mg/mL) ve asetpromazin (0.5 mg/mL) kokteylile anestezi edilir.
      1. Fare içeren kafesleri raftan belirlenmiş bir ameliyat çalışma alanına taşıyın. Steril bir ortamda ameliyat alanı hazırlayın. Kullanılan tüm alet ve malzemelerin ameliyattan önce sterilize edilmesini sağlayın.
      2. Fareyi tartın ve gerekli anestezi hacmini hesaplayın (20 g fare için 0,1 mL anestezi kokteyli). Anestezi intraperitoneal16enjekte edin. Birkaç dakika sonra, yeterli anestezi sağlamak için ayak takımı çimdikleyerek fareyi test edin. Daha fazla anestezi gerekiyorsa, anestezik kokteylin 0.01−0.03 mL daha fazla enjekte edin.
      3. BOS koleksiyonu için yeterince büyük çalışma alanını ortaya çıkarmak için, kafanın küçük bir alanını, kafatasıüzerinde medial üzerinde, küçük bir alanı tıraş etmek için makas veya tıraş layıcı kullanın. Fareyi stereotaksik aletin üzerinde eğilimli pozisyonda konumlandırın ve kulak çubuklarını kullanarak başı sabitler(Şekil 2A).
        NOT: Fare, kafanın gövdeyle yaklaşık 135° açı kurabilmesi için yere serilir (Şekil 2A). Hayvan konumlandırıldıktan sonra, cerrahi alanda steril bir alan korumak için cerrahi bir örtü kullanılır. Farelerde BOS koleksiyonu için net yapışkan perdeler tercih edilir, çünkü hayvanın doğrudan ve daha odaklı görselleştirilmesine olanak sağlar.
      4. % 30 klorheksidin diasetat ile cerrahi site swab. Steril bir neşter kullanarak, sarsıcı bir kesi yapmak ocisterna magna örten kasları ortaya çıkarmak için occiput aşağı deri.
      5. Forceps ile künt diseksiyon ile, sarnıç magna ortaya çıkarmak için deri altı doku ve kasları ayırmak (Şekil 2B). Kasları ayrı tutmak için mikroretraktörler kullanın(Şekil 2B)ve sarnıç magna üzerinde dura mater meningeal tabakası ortaya çıkarmak.
      6. Olası kan kontaminasyonunu gidermek için steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile hafifçe yıkayın. Leke steril pamuklu bir bez ile dura mater kuru ve hafifçe 30 G iğne ile sarnıç magna kapsayan membran delin. BOS'u toplamak için hızlı ve hafifçe küçük bir cam kılcal tüp takın (Şekil 2C).
        NOT: İntrakraniyal basınç BOS'un kılcal damara kendiliğinden akmasını sağlar (Şekil 2C). Farenin yaşına ve boyutuna bağlı olarak her fareden yaklaşık 5−12 μL BOS elde edilir.
      7. Kılcal tüpü membrandan dikkatlice çıkarın. Tüpü polietilen bir tüp(Malzeme Tablosu)aracılığıyla 3 mL şırıngaya bağlayın ve toplanan BOS'u 0,5 mL etiketli bir tüpe enjekte edin(Şekil 2D). Şişeleri buzda tut.
      8. Tek kullanımlık iğne ile polidioxanone sütür (PDS) kullanarak ve gömülü dikişler kullanılarak kesikapatın 17. Herhangi bir kurutulmuş kan veya doku alanı temizleyin.
      9. Analjezik tedavi olarak 0.05−0.1 mg/kg buprenorfin hidroklorür içeren farelere deri altı veya intraperitoneal16enjekte edin. Ayrıca, dehidratasyon önlemek için steril salin subkutan 1 mL enjekte.
      10. Kurtarma için temiz ve sıcak bir kafese fare geri yerleştirin. Fare hareket halinde ve yiyecek ve suya ulaşabildikten sonra kafesi rafa geri yerleştirin.
      11. 4 °C'lik soğutulmuş santrifüjde 10 dk x g 4 °C'lik bir santrifüjde santrifüj BOS. Ksanthochromia'nın belirlenmesi ve tüpün alt kısmında kırmızı bir pelet bulunması için görsel inceleme ile kan kontaminasyonu derecesini kontrol edin. Kanla kirlenmiş örnekleri atın.
        NOT: Kanla kontamine olmuş numunelerde BOS protein miktarlarının düzeltilmesiiçin kullanılan formül, BOS ve serumda protein içeriği, hematokrit (HCT) ve BOS'ta kırmızı kan hücreleri (RBC) sayımı ve kan18'iiçeren denklem parametrelerine dayanmaktadır. Ancak, bu tür bir düzeltme stratejisi fare BOS örneklerine küçük hacim nedeniyle kolayca uygulanamadığından, düzeltme stratejisini görsel bir denetimle sınırlandırmaktadır.
      12. Temiz bir pipet tekniği kullanarak BOS'u yeni bir 0,2 mL tüp halinde toplayın ve peleti hücrelerle birlikte geride bırakın. Aerosol nedeniyle hacim kaybını azaltmak için PBS ile Bos 1:3 seyreltin. BOS şişesini hemen -80 °C'de dondurun.
  2. Sağkalım dışı prosedürler kullanılarak serum ve BOS toplama
    NOT: Hayatta kalmayan sıvı toplama için, farenin nabzının olması gerektiğinden BOS toplama serum toplamadan önce gelir.
    1. Nekropsi de BOS koleksiyonu
      NOT: Bu işlem sağkalım dışı cerrahi içindir ve her fareden yaklaşık 10−20 μL BOS elde edilir. Steril cerrahi alan önerilir, ancak sağkalım dışı cerrahi için gerekli değildir.
      1. Fare içeren kafesleri raftan rahat bir çalışma alanına taşıyın. BOS koleksiyonu için 1.1.2.2−1.1.2.7 ve 1.1.2.11−1.1.2.12 adımlarını izleyin. Serum toplama için bölüm 1.2.2'ye devam edin.
    2. İntrakardiyak delinme yoluyla kan toplanması (açık yaklaşım)
      NOT: Beklenen kan hacimleri vücut ağırlığının yaklaşık %3'üdür, örneğin 20 g fareden 0.6 mL.
      1. BOS koleksiyonunu takiben, farenin ayak bileliğini sıkıştırarak hala yeterince anestezi sağladığından emin olun. Herhangi bir reaksiyon gözlenirse, anestezik ikinci bir doz uygulayın. Reaksiyon gözlenmezse, devam edin.
      2. % 70 alkol ile arka ve karın deri bezi hayvan yerleştirin. Cerrahi makas ile göğüs boşluğunu açın ve kalbi ortaya çıkarın. Sol ventriküle 25 G iğne (3 mL şırınga bağlı) yerleştirin ve şırınga pistonuna hafifçe negatif basınç uygulayın. Kan toplandıktan sonra iğneyi geri çekin.
      3. Hayvanın ölmüş olduğundan emin olmak için kafa kesme veya servikal çıkık gibi ötanazi ikinci bir yöntem gerçekleştirin.
      4. Şırınganın pistini aşağı itin ve toplanan kanı 1,5 mL'lik bir şişeye enjekte edin. RT'de 30-60 dakika kanın pıhtılaşmasına izin verin ve 4 °C'lik soğutuculu santrifüjde 2.000 x g'de 10 dakika santrifüj edin.
      5. Temiz pipet tekniğini kullanarak serumu 0,5 mL etiketli yeni bir şişeye toplayın. Serum şişesini -80 °C'lik bir dondurucuda hemen dondurun.

2. Protein analizi

  1. Uyumlu serum ve BOS örneklerinde hedef protein(ler) ve albuminlerin ölçülmesi için Luminex teknolojisi gibi tercih edilen bir yöntem kullanın.
    NOT: Burada Luminex manyetik teknolojisi ile bir örnek verilir, ancak enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA) dahil olmak üzere protein miktarlarını ölçen hemen hemen her teknik mevcut protokole uygulanabilir. İdeal olarak, BOS ve serum örnekleri aynı platformda hem albumin hem de hedef proteinler için çalıştırılır. Test koşulları, antijen-boncuk bağlantı konsantrasyonu, serum ve BOS numune seyreltmeleri, her bir analiz için en uygun standart eğriler ve spesifik olmayan reaktiviteyi azaltmak için tampon bileşimi gibi protokoldeki önemli adımlar için optimize edilmelidir. Protein ölçümü için ticari bir kit kullanılıyorsa, örneğin, immünglobulin isotipleme kiti (Malzeme Tablosu) içinde sunulan verileri elde etmek için kullanılanŞekil 3, üreticilerin talimatlarına uyulmalıdır.
    1. Çözülme üzerine ve analizden önce, BOS ve serum numuneleri (10 dk için 2.000 x g) santrifüj ve filtre plakaları ve /veya probun tıkanmasını önlemek için supernatant kullanın. Uygun numune seyreltmeleri için kit ile sağlanan test prosedürünü uygulayın. Aksi takdirde, her analit ve sıvı için uygun seyreltme belirleyin. PBS'deki numuneleri buna göre seyreltin.
      NOT: Belirli bir kılavuz veya talimat yoksa, her bir analit ve sıvı için seyreltmeler çalışma testinden önce, en fazla içine giren konsantrasyon tahminlerini elde etmek için gerekli seyreltme aralıkları belirlenerek kurulmalıdır. standart bir eğrinin güvenilir aralığı. Analiz edilecek biyolojik numunenin özelliklerini bilmek, örneğin sıvıdaki fizyolojik ve patolojik konsantrasyonlar, düşük, orta ve yüksek analit içeriği örnekleri ile farklı seyreltmelerin yapılmasına olanak sağlar. Numunelerde beklenen konsantrasyon aralığının a priori olarak biliniyorsa, seçilen standart eğri aralığında olmak için numunenin kaç kez seyreltilmesi gerektiği hesaplandıktan sonra seyreltmeler seçilebilir.
      DİkKAT: Seyreltme faktörleri hesaplanarak, BOS'un 1:3 seyreltildiğini unutmayın.
    2. Referans standart proteinleri seri olarak seyrelterek Şekil 3'teveri oluşturmak için kullanılan albumin ve IgG gibi ilgi çeken her protein için standart bir eğri hazırlayın. Standart eğrilerin hazırlanması sırasında, bir sonraki seyreltme yapmadan önce iyice her yüksek konsantrasyon karıştırın.
      NOT: Seçilen nicelik yöntemine bakılmaksızın, numunelerde protein konsantrasyonunu tahmin etmek için her test yapıldığında standart bir eğri nin dahil edilmesi esastır. Bir referans standart için en iyi seçim ilgi protein saflaştırılmış, bilinen konsantrasyonudur. Standart eğriyi tanımlamak için kullanılan veri noktalarının ve çoğaltmaların sayısının yanı sıra belirli seyreltmelere karar vermek, standart eğrideki doğrusal olmayanlık derecesine bağlıdır.
    3. Uygun antikor-çiftli manyetik boncuk setleri seçin(Malzeme Tablosu). Boncuk bireysel şişeler için, 30 s ve girdap için her şişe sonicate 1 dakika. Boncuk stokları her set / μL her set / μL son konsantrasyonu için seyrelterek bir "çalışan boncuk karışımı" hazırlamak tahlil / yıkama tampon (PBS, 1% sığır serum albumin [BSA]). Her kuyuya düz tabanlı 96 kuyulu bir plaka(Malzeme Tablosu)50 μL karışık boncuk ekleyin.
      DİkKAT: Floresan boncuklar ışığa duyarlıdır. Bu nedenle, prosedür boyunca ışığa uzun süre maruz kalmaktan korunmalıdır.
    4. Geçmişlerin, standartların ve örneklerin iyi bir harita çalışma sayfasına yerleştirilmesi diyagramı.
    5. Her arka plan için 50 μL'lik test/yıkama arabelleği ve standart eğri için kuyulara her standarttan 50°L ekleyin. Seyreltilmiş her numunenin 50 mL'ini uygun kuyulara son olarak yükleyin. Rt 30 dakika boyunca bir tabak çalkalayıcı üzerinde ajitasyon (~ 800 rpm) ile folyo ve kuluçka ile plaka sarın.
    6. Plakayı el mıknatısına(Malzeme Tablosu)yerleştirin ve manyetik boncukların tam olarak ayarlanmasına izin vermek için plakayı ~60 s için mıknatısın üzerine koyun. Plakayı yavaşça dekantasyon yaparak iyi içeriği çıkarın ve artık sıvıyı çıkarmak için emici pedlere dokunun.
    7. Plakayı mıknatıstan çıkararak, ~30 s için sallayarak ve son olarak mıknatısa yeniden takarak 200 μL'lik bir yıkama tamponu ekleyerek yıkayın. 3x yıkamatekrarlayın.
    8. Biyotinylated algılama antikor seyreltmek, yani, biyotin etiketli antikor protein konak türlerine karşı yükseltilmiş, için 4 μg/mL için ispat / yıkama tampon. Her kuyuya seyreltilmiş algılama antikorunun 50 000'ini ekleyin. Plakayı kapatın ve ~800 rpm'de plaka çalkalayıcıda RT'de 30 dk kuluçkaya yatın. Plakayı mıknatısın üzerine yerleştirin ve 2.1.6 ve 2.1.7 adımlarını tekrarlayın.
    9. Seyreltik phycoerythrin (PE)-konjuge streptavidin (SAPE) için 4 μg/mL ispat / yıkama tampon. Her kuyuya 50°L seyreltilmiş SAPE ekleyin. Plakayı kapatın ve ~800 rpm'de plaka çalkalayıcıda RT'de 30 dk kuluçkaya yatın. Plakayı mıknatısın üzerine yerleştirin ve 2.1.6 ve 2.1.7 adımlarını tekrarlayın.
    10. Plakayı mıknatıstan çıkarın ve boncukları 100 μL'lik bir aratla/yıkama tamponunda yeniden askıya alın. PE floresan yoğunluğunun (FI) büyüklüğünün algılanmasını sağlayan çift lazer akış tabanlı algılama cihazı ile kuyuları okuyun.
      NOT: Üretilen sinyal, örneğin FI, boncukyüzeyine bağlı hedef antijen miktarı ile orantılıdır.
    11. Ham verileri dışa aktarın ve algılama sinyali FI'yi standart protein konsantrasyonlarına karşı grafikleştirerek standart eğriler oluşturun. Örneklerdeki analit konsantrasyonunun hesaplanması için standart eğri(ler)i kullanın.
      NOT: Albumin tercihen g/dL ile, ilgi proteinleri ise tercihen mg/dL ile ifade edilir.

3. İntekal indeks hesaplamaları

  1. Protein konsantrasyonu değerlerini bir elektronik tabloda düzenleyin ve aşağıdaki formülleri uygulayarak sonuçları analiz edin.
  2. Qalbuminhesapla:
    Equation 1
    bosalbumin ve Serumalbuminin ineşe serum ve BOS örneklerinde albumin konsantrasyonları olduğu durumlarda, sırasıyla.
  3. Qproteininihesapla :
    Equation 2
    BOSproteini ve Serumproteininin sırasıyla serum ve BOS örneklerinde hedef protein(ler) konsantrasyonları olduğu durumlarda.
  4. Protein indeksini hesaplayın:
    Equation 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu temsili deney multipl skleroz (MS) iki klinik olarak ilgili kemirgen modelleri IgG intratekal sentezini karşılaştırmayı amaçladı: PLP139-151-deneysel otoimmün ensefalomiyelit (R-EAE) ve kronik progresif nüks, Theiler's murine ensefalomiyelit virüsü kaynaklı demiyelinating hastalık (TMEV IDD). R-EAE relaps-remitting MS anlamak için yararlı bir model, TMEV-IDD modeli kronik progresif MS özellikleri ise19.

Bu çalışmada R-EAE (n = 12) ve TMEV-IDD (n = 28) intratekal IgG sentezinin nicel analizi yapılmıştır. Her iki grup da hastalıklarının doruğunda incelendi. 10 fareden oluşan ek bir grup sham-tedavi edildi ve yaşa uygun kontrol grupları olarak görev yaptı (cR-EAE n = 4, cTMEV-IDD sham n = 6).

Eşleşen serum ve BOS örneklerinde toplam IgG'yi ölçmek için ticari olarak kullanılabilen kit(Malzeme Tablosu)ile manyetik boncuk bazlı bir yaklaşım kullanılmıştır. Toplam IgG değeri, IgG1, IgG2a, IgG2b ve IgG3 değerlerinin alt sınıfının toplamından türetilmiştir. Albumin, elisa kitinde ticari bir fare albümü(Tablo)ile ölçüldü çünkü o sırada albümin için luminex tayini mevcut değildi. Tüm ölçümler üreticilerin talimatları doğrultusunda dikkatle yapılmıştır. Albumin katsayısı (Qalbumin)ve IgG indeksi (QIgG/Qalbumin)daha sonra BOS'ta CNS kaynaklı IgG'ye karşı kanı ayırt etmek için kullanıldı.

Şekil 3A'dagösterildiği gibi, ms'in her iki kemirgen modelinin BOS'unda, ilgili yaşla eşleşen şam kontrollerine göre toplam IgG'nin gerçek düzeyleri önemli ölçüde artmaktadır(p ≤ 0.026). Ancak, R-EAE fareler önemli ölçüde gelişmiş Qalbumin değerleri göstermek(p ≤ 0.019), bu farelerde bariyer in permeability artan gösteren(Şekil 3B). Tersine, TMEV-IDD ve sahte fareler(p = 0.49) arasında Qalbumin hiçbir fark var, böylece TMEV-IDD fareler 7 bozulmamış bir bariyer bizim önceki bulgu doğrulayan7,8. R-EAE ve TMEV-IDD'de transudate ve intrathecally üretilen IgG arasında daha fazla ayrım yapmak için, IgG İndeksi ölçüldü, TMEV-IDD farelerde anlamlı olarak daha yüksek değerler gösteren(p ≤ 0.0006), ve bu nedenle bu modelde intratekal IgG üretimi(Şekil 3C).

Yüksek IgG indeksi ile birlikte TMEV-IDD farelerde sağlam bir bariyer, bu modelde antikor CNS içinde üretildiğini göstermektedir. Tersine, R-EAE, önemli bir bariyer arızası ve düşük IgG indeksi BOS IgG çoğunlukla intratekal B hücreleri yerine periferik tarafından üretilen kanıt sağlamak, ayrıca MS bu akut modelde, BOS IgG çoğunlukla serum türetilmiştir düşündürmektedir.

Figure 1
Şekil 1: Farelerin retro-orbital kanaması. Sol: İğnenin retro-orbital sinüse, göz küresine ve yörüngenin arkasına göre doğru yerleştirilmesi. Sağ: Pipet konumu gözün medial kanthus başlar ve yörüngenin dorsal yönü için süzülür. Kılcal damar 45° açıyla yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Farelerde BOS toplama. (A) Kulak çubukları farenin başını destekler ve fare yere yatırılır, böylece baş gövdeyle 135° açı oluşturur. Ok, açığa çıkan sarnıç magnasını işaret etti. (B) Forceps ile künt diseksiyon ile, kaslar sarnıç magna (ok tarafından işaret) ortaya çıkarmak için ayrılır. Mikroretraktörler kasları ayrı tutmak için kullanılır. (C) Cisterna magna'dan BOS toplamak için küçük bir cam kılcal tüp kullanılır. BOS, intrakraniyal basınç nedeniyle kendiliğinden kılcal damariçine akar. Ok, kılcal damarda toplanan BOS'u işaret eder. (D) BOS modifiye edilmiş 3 mL şırınga ile 0,5 mL'lik bir tüpe aktarılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: R-EAE ve TMEV-IDD'de kan-beyin bariyerfonksiyonu ve IgG intratekal sentezi. (A) Luminex teknolojisi ile ölçülen toplam IgG (mg/dL) BOS düzeylerini temsil eden nokta lekesi, (B) albumin BOS/serum quotients (Qalbumin),ve (C) IgG indeksleri (QIg/Qalbumin)R-EAE ve TMEV-IDD farelerde ve yaşa uygun kontrol (cR-EAE ve cTEVM-ID) ile. Yatay çizgiler, o grubun ortanca değerini temsil ediyor. p < 0.0001; p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Artmış BOS protein konsantrasyonlarının değerlendirilmesi için kullanılan kantitatif yöntemler, CNS'nin fizyolojik ve patolojik durumunun karakterizasyonunda yararlı araçlardır. Ancak, BOS protein düzeylerinin güvenilir bir şekilde ölçülmesinin ötesinde, BOS proteinlerinin saptanması, BOS'ta kan ve CNS kaynaklı fraksiyonlar arasında ayrım yapan sonuçların bir ifadesi nin ifade sini gerektirir. Ancak, bugüne kadar, yaygın olarak kullanılan protein niceleme tahlilleri iki protein bileşeni arasında ayrımcılığa izin vermez, yüksek iş letimatel araçlar yardımıyla bile. Bu nedenle, CNS bölmesi içinde sentezlenen proteinler ile kandan elde edilen proteinleri ayırt etmek için protein ölçümlerinde özel düzeltmeler önerilmiştir. Bu tür düzeltmeler hem serum konsantrasyonlarında hem de bariyer bütünlüğünde bireysel değişkenliği dengeler. Genel olarak, bu düzeltmeler serum proteininin bireysel konsantrasyonundaki farklılıklara bağlı olarak değişkenliği azaltan bir BOS/serum katsayısının (Qproteini)hesaplamalarına dayanmaktadır. Bariyer fonksiyonundaki bireysel farklılıklara bağlı Qproteininin varyasyonu, Qproteininin BOS/serum albumin katisenine (Qalbumin)bağlanmasıyla daha da azaltılabilir. Her iki düzeltmenin kombinasyonu genellikle protein indeksi olarak bilinir ve Qprotein/Qalbumin oranı4,6olarak hesaplanır.

Albumin, sentezlenen ve karaciğer tarafından salgılanan, kan dolaşımında dolaşan önemli plazma proteinidir. Albumin sadece CNS dışında üretildiği ve BOS'taki düzeyleri düşük olduğundan (~0.15 g/dL), artmış BOS albumin düzeyleri ya BBI'de hasar alabildiği veya intratekal kanama ya da travmatik BOS toplanması nedeniyle kan kontaminasyonu olduğunu gösterir. Bu durumların herhangi birinde albumin serum konsantrasyonu ile orantılı olarak serumdan BOS'a dönüşür. Bu nedenle, kan kontaminasyonu yokluğunda, Qalbumin bariyer fonksiyonu20bir göstergesi olarak kullanılabilir. Tersine, Qalbumin bozulmamış BBI21ile insanlar ve hayvanlarda normal aralıkları içinde sabit kalır. İntertekal protein sentezi hesaplamasında bu katkient4,6'yı kullanmak için temel bir varsayım, sızıntılı bir bariyer in varlığında artan BOS protein miktarının BOS albumin konsantrasyonundaki artışla orantılı olmasıdır. Bu varsayım deneysel olarak 19774bir çalışmada teyit edilmiştir , hangi yazarlar MS hastalarında radyoetiketli IgG ve albumin sağlıklı insan sera elde kan-BOS pasajı izlendi.

Albumin'e benzer şekilde, kandaki herhangi bir protein BBI'yi geçebilir. Bariyer sağlam olduğunda, Qproteini nispeten sabittir. Albumin aksine, ancak, birçok protein de CNS içinde sentezlenebilir. Sonuç olarak, değişmiş bir Qproteini hasarlı bariyer ve/veya artmış intratekal protein üretiminden kaynaklanabilir. Bununla birlikte, yüksek BOS protein konsantrasyonu sadece bir tehlikeye BBI nedeniyle olduğunda, hem Qprotein ve Qalbumin değerleri artar, bozulmamış bir bariyer ile hayvanlarda bu aynı bölüm değerleri ile karşılaştırıldığında. Buna karşılık, bariyer sağlam olduğunda, artmış BOS protein konsantrasyonları büyük olasılıkla artmış intratekal sentez nedeniyle, ve sadece Qprotein sonuçta artar.

Protein indeksi kullanımı kısmen beş faktör ile sınırlı olabilir: 1) sağlıklı hayvanlarda BOS albümin konsantrasyonunun büyük değişkenliği, 2) proteinlerin farklı hidrodinamik yarıçapı, 3) proteinlerin endojen CNS ekspresyonu, 4) farklı örnekleme teknikleri ve 5) BBI morfolojik farklılıkları. Sağlıklı hayvanlarda BOS albümin konsantrasyonunun büyük değişkenliği, son protein indeksi değerlerinde önemli ölçüde değişkenlik sağlar. İnsanlarda, örneğin, Qalbumin yaşa bağlı çünküyaş 22ile artar. Bir önceki raporda da sağlıklı bir popülasyonda Qalbumin bir cinsiyet tabanlı fark bahsetti23. Aynı şekilde, fare albumin konsantrasyonları yaş ve fare zorlanma bağlıdır24, örneğin, genç için Qalbumin, erkek, C57Bl/6 fareler eski, kadın, DBA/1J fareler için Qalbumin farklı olabilir. Bu nedenle, bariyer bütünlüğü için standartlaştırılmış referans aralıkları türler arasında ve türler içinde oluşturulamaz ve uygun eşikler belirli deneysel koşullara göre hesaplanmalıdır.

Proteinler arasında normal indekslerde değişkenliğe neden olan bir diğer faktör de moleküler boyutlarıdır. Serum proteinlerinin BBI'den geçişi moleküler boyutlarına bağlıdır ve temizleme hızı ile molekül ağırlığı (MW) arasındaki korelasyon BBI'nin geçirgenliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Genel protein yapıları boyutu ondan birkaç bin amino asit e kadar değişir. Bazı proteinler nispeten küçük moleküler boyuttadır, kemokinler gibi, molekül ağırlığı 8 ile 20 kDa arasında değişmektedir. Böyle düşük bir MW BBI geçiş lehine, sonuçta daha yüksek normal protein indeksleri ile sonuçlanan. Farklı olarak, IgM gibi diğer proteinler, çok büyük (900−950 kDa), bu nedenle normal koşullarda çok düşük indeksler gösteren6. Ancak, bu her zaman böyle değildir, çünkü, benzer bir MW rağmen, bazı proteinler bariyer çok daha iyi diğer proteinlere göre nüfuz, muhtemelen farklı bir şekil nedeniyle. Böylece, bir proteinin difüzyon katsayısı, ve dolayısıyla ondan hesaplanan hidrodinamik yarıçap, moleküllerin hem boyutuna hem de şekline bağlıdır25. Bir proteinin geometrik ve hidrodinamik hacmi arasındaki temel fark, 150 kDa'nın üzerindeki büyük proteinlerle en belirgin hale gelir. Örneğin, seruloplazmin (132 kDa), IgG (150 kDa) ve IgA (150 kDa) azalan açıklık oranları benzer MW25olan bu üç proteinin hidrodinamik heterojenliğini yansıtır. Normal şartlar altında proteinlerin intratekal üretimi de mümkündür. Bazı kemokinler, örneğin, CXCL10, genellikle intrathecally üretilir, diğerleri ise, örneğin, CXCL13, değildir26,27. Bu, protein indekslerinin çoğu deneysel koşullar altında yorumlanması genellikle yaş,cinsiyet ve zorlanma ile eşleşen tedavi edilmemiş kontrollerin analizini gerektirdiği anlamına gelir.

Sıvılarda protein düzeyleri de farklı örnekleme tekniklerinden etkilenebilir. Burada açıklandığı gibi BOS toplama için bir sorun olmasa da -açıklanan sağkalım ve hayatta kalmama prosedürleri arasında BOS örneklemesinde herhangi bir fark yoktur-farklı kan toplama yöntemleri toplam serum protein miktarı üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Kan toplama bazı yöntemler arteriyel kan verim, diğerleri venöz kan verim, hala diğerleri her ikisi de bir karışımı verimise 14. Sağkalım retro-orbital kanama elde edilen örnek venöz kan ve doku sıvısı karışımı, kardiyak ponksiyon terminal kan toplama venöz veya arteriyel kan veya her ikisi de bir karışımı verim ise14. Sağlıklı hayvanlarda arteriyel kan serumunun toplam protein ve albumin içeriği venöz kan serumunun aynı fraksiyonlarından biraz daha yüksek olabilir28. Hayatta kalma ve sağkalım dışı örnekler karşılaştırıldığında bu göz önünde bulundurulmalıdır.

Son olarak, göz önünde bulundurulması gereken önemli bir özellik BBI heterojen morfolojik yapısı, en az iki farklı bariyerler oluşur, kan-beyin bariyeri (BBB) beyin mikrodamarların endotel bulunan ve kan-BOS bariyeri (BCSF) koroid pleksus epitel bulunan29. Her iki bariyer de molekül ve hücrelerin periferik ve beyin-omurilik bölmesi arasındaki geçişini kısıtlar ve düzenler, ancak bunu farklı mekanizmalar tarafından yaparlar. BBB gerçek bir fiziksel bariyer olsa da, hücreler arasında karmaşık bir etkileşim ile karakterize, BCSF çoğunlukla BOS akışına bağlıdır fizyolojik bir bariyer, daha fazla. Bos üretimi, serbest bırakma ve akış hızı nörolojik koşullar ve / veya travma nedeniyle azalmalar BCSF fonksiyonu bozabilir, böylece Qalbumin9 artan9 ,30,31,32. Bu nedenle, Qalbumin BBB veya genellikle BBI geçirgenliği yerine BCSF geçirgenlik daha iyi bir belirteç olarak hizmet vermektedir.

Özetle, bir protein indeksi hesaplama transudate ve intrathecally üretilen proteinler arasında ayrımcılık için nispeten basit ve iyi karakterize bir yöntemdir. BOS örneklerindeki proteinlerin genel ölçümlerini düzeltmek için bu formülü uygulamanın avantajı, proteinlerin intratekal sentezini ölçmek ve BBI'yi, özellikle BCSF(dys) işlevini ölçmek için nesnel bir değişken oluşturmasıdır. Bu yaklaşımın sağlamlığı göz önüne alındığında, Qalbumin ve protein indeksi ile BOS protein miktarlarının düzeltilmesi (1) herhangi bir BOS proteininin patofizyolojik kökenini ve (2) bariyer bütünlüğünün stabilitesini ve işlevsel önemini değerlendirmek için bir temel sağlar. Burada BOS ve kan toplama dan nörolojik hastalıklar için fare modelleri için geçerli dir. Toplam BOS protein miktarı düzeltilmesi ne son hesaplamalar için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Ancak, aynı protokol kolayca BOS çalışmasına adapte edilebilir ve insanlar da dahil olmak üzere herhangi bir hayvan, proteinlerin intratekal sentezi. Qalbumin ve IgG indeksi zaten yaygın inflamatuar nörolojik hastalıkların tanısı için klinik uygulamada kullanılmaktadır6. Bu aynı parametreler de başarıyla inflamatuar demiyelinating hastalıkları olan hastalarda sitokinler ve kemokinler geniş bir yelpazede değerlendirmek için kullanılmıştır26,33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar Karşılaştırmalı Tıp ve Araştırma Merkezi (CCMR) Dartmouth de fareler bu çalışmalar için kullanılan kendi uzman bakımı için personel teşekkür ederiz. Bu araştırmayı Bornstein Araştırma Fonu finanse etti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL insulin syringe BD 329650
1 mL syringe BD 329622
25 gauge needle BD 305122
3 mL syringe BD 309582
30 gauge insulin needle BD 305106
Absorbent pads Any suitable brand
Acepromazine Patterson Vet Supply Inc
BioPlex Handheld Magnetic Washer BioRad 171020100 Magnet
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader BioRad 171015001
BioPlex Pro Flat Bottom Plates BioRad 171025001
Biotinilated detection antibody Any suitable source The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503
Buprenorphine hydrochloride PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05
Capillary Tubes Sutter Instrument B100-75-10 OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.
Centrifuge tube, 0.2 mL VWR 20170-012
Centrifuge tube, 0.5 mL VWR 87003-290
Centrifuge tube, 1.5 mL VWR 87003-294
Chlorhexidine diacetate Nolvasan E004272
Disposable pipettes tips Any suitable brand
Ear bars KOPF Instruments 1921 or 1922
Ethanol Kopter V1001
Freezer VWR VWR32086A
Gauze Medline NON25212
Heating pad Sunbeam XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch
Induction Chamber VETEQUIP
Isoflurane Patterson Vet Supply Inc NDC 14043-704-06
Ketamine (KetaVed) Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) BioRad Antibody-coupled magnetic bead
Microplate Shaker Southwest Scientific SBT1500
Microretractors Carfill Quality ACD-010 Blunt - 1 mm
Microsoft Office (Excel) Microsoft
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel EMD Millipore MGAMMAG-300K Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.
Mouse Albumin capture ELISA kit Novus Biological NBP2-60484 Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.
Multichannel pipette Eppendorf 3125000060
Non-Sterile swabs MediChoice WOD1002 Need to be autoclaved for sterility
Oxygen AIRGAS OX USPEA
Pasteur Pippettes Fisher 13-678-20A 5 & 3/4"
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen Patterson Vet 8695G P-3 Reverse Cutting, 18"
PE-Streptavidin BD Biosciences 554061
Pipetters Eppendorf Research seriers
Polyethylene tubing
Refrigerated Centrifuge Beckman Coulter ALLEGRA X-12R
Scale Uline H2716
Scalpel Feather EF7281
Shaver Harvard Apparatus 52-5204
Standard proteins Any suitable source The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.
Stereotaxic instrument KOPF Instruments Model 900LS Standard Accessories
Sterile 1 x PBS Corning Cellgro 21-040-CV
Sterile saline Baxter 0338-0048-02 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP
Surgical Forceps Curved, 7 (2) Fine Science Tools 11271-30 Dumont
Surgical Scissors Fine Science Tools 14094-11 Stainless 25x
Vaporizer + Flow meter Moduflex Anhestesia Instruments
Vortex Fisher 02-215-414
Warming pad Kent Scientific Corporation RT-JR-20
Water Sonicator Cole Parmer EW-08895-01
Xylazine Patterson Vet Supply Inc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15, (3), 54-60 (2009).
  2. Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56, (4), 484-493 (2012).
  3. Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23, (12), 1600-1613 (2017).
  4. Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30, (3), 240-244 (1980).
  5. Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184 (2015).
  6. Reiber, H. Cerebrospinal fluid--physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4, (3), 99-107 (1998).
  7. DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16, (1), 109 (2019).
  8. Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232, (1-2), 35-40 (2011).
  9. Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)--a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122, (2), 189-203 (1994).
  10. Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid - The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
  11. Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163, (3), 319-328 (1987).
  12. Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28, (10), 996-998 (1999).
  13. Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241 (2017).
  14. Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  15. Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960 (2008).
  16. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  17. Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult - E-Book. Elsevier Health Sciences. (2017).
  18. Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159, (1), 158-159 (2011).
  19. McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
  20. Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37, (5), 391-396 (1977).
  21. Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37, (5), 385-390 (1977).
  22. Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13, (9), 913-922 (2006).
  23. Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
  24. Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, (4), 387-390 (2009).
  25. Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14, (2), 100-104 (1977).
  26. Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6, (1), 520 (2019).
  27. Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76, (2), 577-580 (2015).
  28. Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31, (1), 49-61 (1951).
  29. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  30. Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21, (3-4), 79-96 (2003).
  31. Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74, (6), 501-512 (2016).
  32. Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47, (10), 1417-1422 (2013).
  33. Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).
  34. Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15, (1), 305 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics