Medición cuantitativa de proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones

Neuroscience

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Summary

Los niveles elevados de proteína de líquido cefalorraquídeo pueden ser el resultado de la difusión de proteína plasmática a través de una barrera hematoencefálica alterada o de la síntesis intratecal. En este artículo se presenta un protocolo de prueba optimizado que ayuda a discriminar ambos casos y proporciona mediciones cuantitativas de proteínas sintetizadas intratecalmente.

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Gilli, F., Welsh, N. C., Linzey, M. R., Royce, D. B., DiSano, K. D., Pachner, A. R. Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice. J. Vis. Exp. (153), e60495, doi:10.3791/60495 (2019).

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Abstract

El líquido cefalorraquídeo (LCR), un líquido que se encuentra en el cerebro y la médula espinal, es de gran importancia para la ciencia básica y clínica. El análisis de la composición de proteínas del LIF proporciona información crucial en la investigación básica de neurociencia, así como en enfermedades neurológicas. Una advertencia es que las proteínas medidas en el LSC pueden derivar tanto de la síntesis intratecal como de la transudación del suero, y el análisis proteico del LSC sólo puede determinar la suma de estos dos componentes. Para discriminar entre la transudación de proteínas de la sangre y las proteínas producidas intratecalmente en modelos animales, así como en humanos, las mediciones de perfilado de proteínas CSF utilizando herramientas convencionales de análisis de proteínas deben incluir el cálculo del cociente cSF/suero de albúmina (Qalbúmina),un marcador de la integridad de la interfaz hematoencefálico (BBI) y el índice de proteínas(proteínaQ /Qalbumin),una estimación de la síntesis de proteínas intralacales. Este protocolo ilustra todo el procedimiento, desde el LCM y la recolección de sangre hasta los cálculos de cocientes e índices, para la medición cuantitativa de la síntesis de proteínas intratecales y el deterioro de la BBI en modelos de ratón de trastornos neurológicos.

Introduction

El líquido cefalorraquídeo (LCR), un líquido transparente e incoloro que rodea el cerebro y la médula espinal, tiene una gran importancia clínica y científica básica. El LSN preserva el entorno electrolítico del sistema nervioso central (SNC), equilibra el estado sistémico de la base de ácidos, suministra nutrientes a las células neuronales y gliales, funciona como un sistema linfático para el SNC, y transporta hormonas, neurotransmisores, citoquinas y otros neuropéptidos a lo largo del SNC1. Así, como la composición del LSNC refleja la actividad del SNC, este fluido ofrece un valioso, aunque indirecto, acceso para caracterizar el estado fisiológico y patológico del SNC.

El LSN se ha utilizado para diagnosticar afecciones que afectan al SNC durante más de cien años, y durante la mayor parte de este tiempo, fue estudiado principalmente por los médicos como una herramienta de diagnóstico. Sin embargo, en los últimos años los neurobiólogos han reconocido el potencial del LIF para estudiar la fisiopatología del SNC. En particular, se han introducido varias herramientas de análisis de proteínas de alto rendimiento en el ámbito de la neurociencia, lo que permite un estudio detallado de la composición proteica del LSCA, con la expectativa de que este análisis puede ayudar a proporcionar información sobre los cambios dinámicos que ocurre dentro del SNC.

Los desarrollos tecnológicos en técnicas de inmunoensayo multiplex como Luminex y Simoa technologies2,3, proporcionan a los investigadores hoy en día la capacidad de detectar cientos de proteínas a concentraciones muy bajas. Además, estas mismas tecnologías permiten el uso de pequeños volúmenes de muestra, promoviendo así estudios en animales pequeños, incluidos ratones, en los que volúmenes de muestras limitados de LIF han impedido caracterizaciones detalladas del fluido hasta hace poco.

Sin embargo, una advertencia es que las proteínas medidas en el LCC pueden derivar de la síntesis intratecal y/o la transudación del suero debido a una interfaz hematoencefálica (BBI) dañada. Desafortunadamente, el análisis proteico del LIF por sí solo sólo puede determinar la suma de estos dos componentes. Para discriminar entre las proteínas transsufechadas y producidas intratecalmente, las mediciones de proteínas CSF que utilicen cualquier herramienta de análisis de proteínas disponible deben ajustarse para la variabilidad individual en las concentraciones séricas, así como para la integridad de la barrera. Sin embargo, aunque este ajuste se utiliza comúnmente en la práctica clínica, por ejemplo, el índice IgG de La CSF, que tiene alta sensibilidad para detectar la síntesis intratecal de IgG4,5,6, hasta la fecha muy pocos estudios de investigación han corregido las concentraciones de proteína CSF para la concentración sérica y la integridad de la barrera7,8.

Actualmente, el enfoque Reibergram es la mejor manera de determinar la función de barrera y la síntesis intratecal de proteínas. Se trata de una evaluación gráfica en diagramas de cocientes CSF/suero que analiza, de forma integrada, tanto la función de barrera (dys) como la síntesis de proteínas intratecales, refiriéndose a una proteína exclusivamente derivada de la sangre9,10. La albúmina proteica muy abundante suele ser elegida como proteína de referencia porque se produce sólo en el hígado y porque su tamaño, de aproximadamente 70 kDa, es intermedio entre proteínas pequeñas y grandes11. El diagrama de análisis fue definido por primera vez por Reiber y Felgenhauer en 1987 para las principales clases de inmunoglobulinas (Igs)11,siendo empíricamente basado en los resultados obtenidos del análisis de miles de muestras humanas9. El enfoque fue confirmado posteriormente por la aplicación de las dos leyes de difusión de Fick en la teoría de la difusión molecular/velocidad de flujo12. Tal teoría demuestra la difusión de una proteína a través de la barrera tiene una distribución hiperbólica y puede explicar cuantitativamente la dinámica de las proteínas en el SNC9,13. En general, la ventaja de utilizar el Reibergram para demostrar la síntesis de proteínas intratecales es que identifica simultáneamente la fracción proteica que entra en el LRESULT desde el suero, así como la cantidad de proteína que se encuentra en el LIF debido a la producción local.

El presente artículo y el protocolo relacionado describen todo el procedimiento, desde el LC y la recolección de sangre hasta los cálculos finales que corrigen los niveles de proteína CSF, para la medición cuantitativa de la síntesis de proteínas intratecales en modelos de ratón de Trastornos. Este procedimiento proporciona una línea de base para evaluar (1) el origen fisiopatológico de cualquier proteína del LCP y (2) la estabilidad y la importancia funcional de la integridad de la barrera. Este procedimiento y protocolo no sólo son útiles para evaluar muestras de CSF de ratón, sino que también son útiles en el análisis de la CSF en una multitud de modelos animales de enfermedades neurológicas y pacientes humanos.

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Protocol

Todo el trabajo animal utiliza protocolos revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Escuela de Medicina Geisel en Dartmouth.

1. Recolección de líquidos

NOTA: Se requieren tanto suero como LSC. Se necesitan dos protocolos para cada recolección de fluidos para la supervivencia y la necropsia.

  1. Recolección de suero y CSF mediante procedimientos de supervivencia
    NOTA: Para la recolección de fluidos de supervivencia, la recolección de suero debe preceder a la recolección de Líquido Cefalreino, ya que es un procedimiento menos invasivo. El cSF debe obtenerse dentro de una semana de la extracción de suero.
    1. Procedimiento de sangrado retroorbital para la recolección de suero.
      NOTA: Este procedimiento es para la hemorragia de supervivencia de ratones14. El procedimiento descrito se aplica a cualquier edad, sexo y cepa de ratones. Dado que las normas de la IACUC dictan que un volumen sanguíneo máximo del 1% del peso corporal se puede eliminar como una sola extracción de sangre, se recomienda que el procedimiento se realice solo en ratones que pesen más de 15 g.
      1. Mueva las jaulas que contienen ratones del bastidor a un área de trabajo adecuada. Prepare la máquina de gas de anestesia encendiendo el medidor de flujo de oxígeno a 1 L/min.
      2. Coloque el animal en la cámara de inducción y cierre bien la tapa. Encienda el vaporizador de isoflurano al 3,5% y vigile al animal hasta que lo recumben.
      3. Retire el animal de la cámara y evalúe el nivel de anestesia por reflejo de pedal, es decir, pellizco firme de la almohadilla. Asegurar la profundidad adecuada de la anestesia antes de realizar el procedimiento: la falta de respuesta a un pellizco firme indica anestesia adecuada.
      4. Sujete el ratón anestesiado agarrando la piel suelta detrás de las orejas con el pulgar y el dedo índice de la mano no dominante. Abultar los ojos mediante el uso del dedo índice para recuperar la piel por encima del ojo y el pulgar para extraer la piel por debajo de los ojos.
      5. Coloque la punta de una pipeta Pasteur en la cavidad ocular debajo del globo ocular(Figura 1, panel izquierdo), dirigiendo la punta a aproximadamente 45o hacia el centro de la cavidad ocular(Figura 1, panel derecho). Gire la pipeta entre los dedos durante el paso hacia adelante. Aplique una presión suave y luego suelte hasta que la sangre entre en la pipeta.
        NOTA: La cantidad máxima de sangre que se puede retirar a la vez de esta ubicación es de aproximadamente el 1% del peso corporal, por ejemplo, 0,2 ml de un ratón de 20 g.
      6. Retire suavemente el capilar para evitar lesiones en el ojo y coloque la sangre recogida en un tubo centrífugo de 1,5 ml. Cierre el párpado y aplique una presión leve con gasa para evitar sangrados adicionales. Una vez completamente alerta y móvil (generalmente de 3 a 5 minutos), devuelva el ratón a su jaula de retención.
      7. Deje que la sangre coagule durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente (RT), luego centrifugar sangre durante 10 min a 2.000 x g en una centrífuga refrigerada de 4oC. Con una técnica de pipeta limpia, recoja el suero en un vial nuevo con la etiqueta de 0,5 ml. Congele inmediatamente el vial de suero a -80 oC.
    2. Recogida de CSF con procedimiento de supervivencia
      NOTA: Este procedimiento es para cirugía de supervivencia, y se basa en el protocolo publicado por Liu y Duff en 200815. Los ratones son anestesiados por un cóctel de ketamina (20 mg/ml), xilazina (0,5 mg/ml) y acepromaz (0,5 mg/ml) administrado por vía intraperitoneal.
      1. Mueva las jaulas que contienen ratones del estante a un área de trabajo de cirugía designada. Prepare el espacio de la cirugía en un ambiente estéril. Asegúrese de que todos los instrumentos y materiales utilizados estén esterilizados antes de la cirugía.
      2. Pesar el ratón y calcular el volumen de anestesia necesario (0,1 ml de cóctel de anestesia para un ratón de 20 g). Inyectar anestesia por vía intraperitoneal16. Después de unos minutos, pruebe el ratón pellizcando el reposapiés para asegurar una anestesia adecuada. Si se requiere más anestesia, inyectar más 0,01 x 0,03 ml del cóctel anestésico.
      3. Utilice tijeras o una afeitadoa para afeitar un área pequeña de la cabeza, en el extremo caudal, medial en el cráneo, para exponer un área de trabajo lo suficientemente grande como para la colección de LSN. Coloque el ratón en la posición propensa en el instrumento estereotaxico y firme la cabeza usando barras de oído(Figura 2A).
        NOTA: El ratón se coloca de modo que la cabeza forme un ángulo de casi 135o con el cuerpo(Figura 2A). Una vez que el animal está posicionado, se utiliza una cortina quirúrgica para mantener un campo estéril en el sitio quirúrgico. Las cortinas adhesivas claras son preferidas para la recolección de LSF en ratones, ya que permiten una visualización directa y más enfocada del animal.
      4. Swab el sitio quirúrgico con 30% de diacetato de clorhexidina. Usando un bisturí estéril, haz una incisión sagital de la piel inferior al occiput para exponer los músculos que revuelcan la cisterna magna.
      5. Por disección contundente con fórceps, separe el tejido subcutáneo y los músculos para exponer la cisterna magna(Figura 2B). Utilice microretractores para mantener los músculos separados(Figura 2B)y exponer la capa meningeal dura mater sobre la cisterna magna.
      6. Lavar suavemente con solución salina estéril con fosfato (PBS) para eliminar cualquier posible contaminación de la sangre. Seque el dura mater con un hisopo de algodón estéril y perfore suavemente la membrana que cubre la cisterna magna con una aguja de 30 G. Inserte rápida y suavemente un pequeño tubo capilar de vidrio para recoger el LCC(Figura 2C).
        NOTA: La presión intracraneal permite que el lcmo fluya espontáneamente hacia el capilar(Figura 2C). Dependiendo de la edad y el tamaño del ratón, se obtienen aproximadamente 5 a 12 l de L. de L. de CSF de cada ratón.
      7. Retire cuidadosamente el tubo capilar de la membrana. Conecte el tubo a una jeringa de 3 ml a través de un tubo de polietileno(Tabla de materiales)e inyecte el LSN recogido en un tubo etiquetado de 0,5 ml(Figura 2D). Mantenga los viales en hielo.
      8. Cierre la incisión utilizando sutura de polidioxanona (PDS) con aguja desechable y utilizando suturas enterradas17. Limpie el área de cualquier sangre o tejido seco.
      9. Inyectar ratones, por vía subcutánea o intraperitoneal16,con 0,05 x 0,1 mg/kg de clorhidrato de buprenorfina como tratamiento analgésico. Además, inyectar por vía subcutánea 1 ml de solución salina estéril para prevenir la deshidratación.
      10. Vuelva a colocar el ratón en una jaula limpia y cálida para su recuperación. Una vez que el ratón esté móvil y sea capaz de llegar a la comida y el agua, vuelva a colocar la jaula en el estante.
      11. Centrífuga CSF durante 10 min a 1.000 x g en una centrífuga refrigerada de 4oC. Compruebe el grado de contaminación de la sangre mediante inspección visual para la identificación de la xanthochromia y la presencia de un pellet rojo en la parte inferior del tubo. Deseche las muestras contaminadas con sangre.
        NOTA: La fórmula utilizada para la corrección de cantidades de proteína softa en muestras contaminadas con sangre se basa en parámetros de ecuación que incluyen el contenido de proteínas en el LCR y el suero, el hematocrito (HCT) y el recuento de glóbulos rojos (RBC) en el lCR y la sangre18. Sin embargo, esta estrategia de corrección no se puede aplicar fácilmente a las muestras de PSF de ratón debido al pequeño volumen, limitando así la estrategia de corrección a una inspección visual.
      12. Usando una técnica de pipeta limpia, recoja el LSC en un nuevo tubo de 0,2 ml, dejando atrás el pellet con células. Diluir el CSF 1:3 con PBS para reducir la pérdida de volumen debido al aerosol. Inmediatamente congelar el vial de CSF a -80 oC.
  2. Recolección de suero y CSF mediante procedimientos de no supervivencia
    NOTA: Para la recolección de fluidos sin supervivencia, la recolección de líquidos cSF precede a la recolección de suero, ya que el ratón necesita tener un pulso.
    1. Recolección del CSF en la necropsia
      NOTA: Este procedimiento es para cirugía sin supervivencia, y aproximadamente 10-20 l de L. CSF se obtiene de cada ratón. Se recomienda un campo quirúrgico estéril, pero no es necesario para la cirugía que no es de supervivencia.
      1. Mueva las jaulas que contienen ratones del bastidor a un espacio de trabajo cómodo. Siga los pasos 1.1.2.2-1.1.2.7 y 1.1.2.11-1.1.2.12 para la colección de CSF. Proceda a la sección 1.2.2 para la recolección de suero.
    2. Recolección de sangre mediante punción intracardiaca (enfoque abierto)
      NOTA: Los volúmenes sanguíneos esperados son aproximadamente el 3% del peso corporal, por ejemplo, 0,6 ml de un ratón de 20 g.
      1. Después de la colección de CSF asegúrese de que el ratón todavía está suficientemente anestesiado por pellizcar el pie. Si se observa alguna reacción, administre una segunda dosis de anestésico. Si no se observa ninguna reacción, proceda.
      2. Coloque el animal en la espalda y frote la piel en el abdomen con 70% de alcohol. Con tijeras quirúrgicas, abra la cavidad torácica y exponga el corazón. Inserte una aguja de 25 G (adjunta a una jeringa de 3 ml) en el ventrículo izquierdo y aplique suavemente presión negativa sobre el émbolo de la jeringa. Retirar la aguja después de que se haya recogido sangre.
      3. Realizar un método secundario de eutanasia como la decapitación o la dislocación cervical para asegurarse de que el animal ha fallecido.
      4. Empuje el émbolo de la jeringa hacia abajo e inyecte la sangre recogida en un vial de 1,5 ml. Deje que la sangre coagule durante 30-60 minutos a RT y luego centrifugar la durante 10 min a 2.000 x g en una centrífuga refrigerada de 4oC.
      5. Con la técnica de pipeta limpia, recoja el suero en un vial nuevo con la etiqueta de 0,5 ml. Congele inmediatamente el vial de suero a un congelador de -80 oC.

2. Análisis de proteínas

  1. Utilice un método preferido, por ejemplo, la tecnología Luminex, para cuantificar las proteínas diana y la albúmina en muestras de suero y LSN coincidentes.
    NOTA: Aquí se da un ejemplo con la tecnología magnética Luminex, pero prácticamente cualquier técnica que mide las cantidades de proteínas, incluidos los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), se puede aplicar al protocolo actual. Idealmente, las muestras de CSF y suero se ejecutan tanto para la albúmina como para las proteínas diana en la misma plataforma. Las condiciones del ensayo deben optimizarse para pasos cruciales en el protocolo, como la concentración de acoplamiento de antígenos y perlas, diluciones de muestras de suero y LSF, curvas estándar de mejor ajuste para cada analito y composición de búfer para reducir la reactividad no específica. Si se utiliza un kit comercial para la medición de proteínas, por ejemplo, el kit de isotipado de inmunoglobulina (Tabla de materiales) utilizados para obtener los datos presentados enFigura 3, deben seguirse las instrucciones de los fabricantes.
    1. Al descongelar y antes del análisis, centrifugar el LSC y las muestras de suero (2.000 x g durante 10 min) y utilizar el sobrenadante para evitar la obstrucción de las placas de filtro y/o sonda. Siga el procedimiento de ensayo proporcionado con el kit para las diluciones de muestra adecuadas. De lo contrario, determine la dilución adecuada para cada analito y líquido. Diluir las muestras en PBS en consecuencia.
      NOTA: Si no hay instrucciones o orientación específicas, las diluciones para cada analito y fluido deben establecerse antes de la prueba de estudio, determinando los rangos de dilución adecuados necesarios para obtener estimaciones de concentración que gama fiable de una curva estándar. Conocer las características de la muestra biológica a analizar, por ejemplo, concentraciones fisiológicas y patológicas en el fluido, permite probar diferentes diluciones con muestras de bajo, medio y alto contenido de analito. Si el rango esperado de concentraciones en las muestras se conoce a priori, las diluciones se pueden seleccionar después de calcular cuántas veces la muestra tiene que diluirse para estar dentro del rango de curva estándar elegido.
      ADVERTENCIA: Al calcular los factores de dilución, recuerde que el PSM ya se ha diluido 1:3.
    2. Preparar una curva estándar para cada proteína de interés, por ejemplo, albúmina e IgG como se utiliza para generar datos en la Figura 3,mediante proteínas estándar de referencia de dilución en serie. Durante la preparación de curvas estándar, mezcle a fondo cada concentración más alta antes de realizar la siguiente dilución.
      NOTA: Independientemente del método de cuantificación elegido, es esencial incluir una curva estándar cada vez que se realiza el ensayo para estimar la concentración de proteínas en las muestras. La mejor opción para un estándar de referencia es una concentración purificada y conocida de la proteína de interés. La decisión sobre las diluciones específicas, así como el número de puntos de datos y réplicas utilizadas para definir la curva estándar, depende del grado de no linealidad en la curva estándar.
    3. Seleccione los conjuntos de perlas magnéticas acoplados a anticuerpos apropiados(Tabla de materiales). Para viales individuales de perlas, sonicar cada vial durante 30 s y vórtice durante 1 min. Preparar una "mezcla de perlas de trabajo" diluyendo las existencias de cuentas a una concentración final de 50 perlas de cada conjunto / L en el tamón de ensayo/lavado (PBS, albúmina sérica bovina albúmina 1% bovina [BSA]). Añadir 50 l de las cuentas mixtas a cada pocal en una placa de fondo plano de 96 pocillos(Tabla de Materiales).
      ADVERTENCIA: Las perlas fluorescentes son sensibles a la luz. Por lo tanto, deben protegerse de la exposición prolongada a la luz durante todo el procedimiento.
    4. Diagrame la ubicación de los fondos, estándares y muestras en una hoja de cálculo de mapa de pozos.
    5. Añadir 50 l de tamón de ensayo/lavado a cada pozo de fondo, y 50 l de cada estándar a los pozos para la curva estándar. Cargue 50 ml de cada muestra diluida en los pozos apropiados. Envuelva la placa con papel de aluminio e incubar con agitación (800 rpm) en una coctelera durante 30 minutos a RT.
    6. Coloque la placa en un imán de mano(Tabla de materiales)y descanse la placa en el imán durante 60 s para permitir el ajuste completo de las perlas magnéticas. Retire el contenido del pozo decanando suavemente la placa y toque la placa en las almohadillas absorbentes para eliminar el líquido residual.
    7. Lave la placa quitándola del imán, añadiendo 200 s l de ensayo/tampón de lavado, agitando durante 30 s y, finalmente, volviéndola a conectar al imán. Repita el lavado 3x.
    8. Diluir el anticuerpo de detección biotinylated, es decir, anticuerpo etiquetado biotina levantado contra las especies huésped de proteínas, a 4 g/ml en el tamón de ensayo/lavado. Añadir 50 l de anticuerpo de detección diluido a cada poca. Cubra la placa e incubadurante durante 30 minutos a RT en la coctelera de la placa a 800 rpm. Coloque la placa en el imán y repita los pasos 2.1.6 y 2.1.7.
    9. Diluir la estreptavidina conjugada con ficoeritrina (PE) (SAPE) a 4 g/ml en el búfer de ensayo/lavado. Añadir 50 s de SAPE diluido a cada pocto. Cubra la placa e incubadurante durante 30 minutos a RT en la coctelera de la placa a 800 rpm. Coloque la placa en el imán y repita los pasos 2.1.6 y 2.1.7.
    10. Retire la placa del imán y vuelva a suspender las perlas en 100 ml de tampón de ensayo/lavado. Leer pozos con un instrumento de detección basado en flujo láser doble que permite la detección de la magnitud de la intensidad de fluorescencia PE (FI).
      NOTA: La señal, por ejemplo, FI, generada es proporcional a la cantidad de antígeno objetivo conectado a la superficie de las perlas.
    11. Exporte datos sin procesar y cree curvas estándar graficando la señal de detección FI frente a las concentraciones de proteínas estándar. Utilice las curvas estándar para calcular la concentración de los analitos en las muestras.
      NOTA: La albúmina se expresa preferentemente en g/dL, mientras que las proteínas de interés se expresan preferentemente en mg/dL.

3. Cálculos del índice intratecal

  1. Organice los valores de concentración de proteínas en una hoja de cálculo y analice los resultados aplicando las siguientes fórmulas.
  2. CalcularalbúminaQ :
    Equation 1
    donde laalbúmina cSF y laalbúmina sérica son concentraciones de albúmina en muestras de suero y CSF coincidentes, respectivamente.
  3. Calcularla proteínaQ :
    Equation 2
    donde laproteína LSM y laproteína sérica son concentraciones de proteína(s) diana en muestras de suero y LSN coincidentes, respectivamente.
  4. Calcular el índice de proteínas:
    Equation 3

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Representative Results

Este experimento representativo tenía como objetivo comparar la síntesis intratecal de IgG en dos modelos de esclerosis múltiple (EM) clínicamente relevantes: la enfermedad desmielinizante inducida por el virus de la encefalomielitis de la encefalomielitis murinitis PLP139-151-inducida por la relaperante experimental (R-EAE) y la enfermedad desmielinizante inducida por el virus de la encefalomielitis murine de Theiler(PT-IDD). R-EAE es un modelo útil para entender la EM recurrente-remitente, mientras que el modelo TMEV-IDD cuenta con MS progresivo crónico19.

Para el presente estudio, se ha realizado un análisis cuantitativo de la síntesis de IgG intratecal en R-EAE (n a 12) y TMEV-IDD (n.o 28). Ambos grupos fueron analizados en el pico de su enfermedad. Un grupo adicional de 10 ratones fue tratado con farsa y sirvió como grupos de control coincidentes con la edad (cR-EAE n .4, cTMEV-IDD falso n .6).

Se utilizó un enfoque magnético basado en perlas con el kit disponible comercialmente(Tabla de Materiales)para medir el IgG total en muestras de suero y LSN coincidentes. El valor total de IgG se derivó de la suma de los valores de la subclase IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3. La albúmina se midió con un kit elISA de albúmina de ratón comercial(Tabla de materiales)porque un ensayo de Luminex para albúmina no estaba disponible en ese momento. Todas las mediciones se realizaron cuidadosamente siguiendo las instrucciones del fabricante. El cociente de albúmina (Qalbumin)y el índice IgG (QIgG/Qalbumin)se utilizaron entonces para diferenciar el IgG derivado de sangre contra el CNS en el CSF.

Como se muestra en la Figura 3A,los niveles reales de IgG total se incrementan significativamente en el LGR de ambos modelos de roedores de EM en comparación con los controles de farsa correspondientes con la edad(p - 0,026). Sin embargo, los ratones R-EAE muestran valores dealbúmina Q significativamente mejorados(p - 0,019), lo que indica una mayor permeabilidad de la barrera en estos ratones(Figura 3B). Por el contrario, no existen diferencias en laalbúmina Q entre tMEV-IDD y ratones falsos(p . 0,49), corroborando así nuestro hallazgo previo de una barrera intacta en ratones TMEV-IDD7,8. Para discriminar aún más entre el carálque y el IgG producido intratecalmente en R-EAE y TMEV-IDD, se midió el índice IgG, mostrando valores significativamente más altos en ratones TMEV-IDD(p - 0.0006), y por lo tanto la producción intratecal de IgG en este modelo(Figura 3C).

Una barrera intacta en ratones TMEV-IDD junto con un alto índice de IgG sugiere que en este modelo, se producen anticuerpos dentro del SNC. Por el contrario, en R-EAE, una avería significativa de la barrera y un bajo índice de IgG proporcionan evidencia de que el IgG del LF se produce principalmente por células B periféricas en lugar de intratecales, lo que también sugiere que en este modelo agudo de EM, CSF IgG se deriva principalmente del suero.

Figure 1
Figura 1: Sangrado retroorbital de ratones. Izquierda: Colocación correcta de la aguja en relación con el seno retro-orbital, el globo ocular y la parte posterior de la órbita. Derecha: La ubicación de la pipeta comienza en el canthus medial del ojo y se desliza hacia el aspecto dorsal de la órbita. El capilar se inserta en un ángulo de 45o. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Colección de CSF en ratones. (A) Las barras de los oídos sostienen la cabeza del ratón, y el ratón se coloca de modo que la cabeza forma un ángulo de 135o con el cuerpo. La flecha apunta a la cisterna magna expuesta. (B) Por disección contundente con fórceps, los músculos se separan para exponer la cisterna magna (apuntado por la flecha). Los microretractores se utilizan para mantener los músculos separados. (C) Se utiliza un pequeño tubo capilar de vidrio para recoger el LCC de la cisterna magna. El leso cefalorraquídeo fluye espontáneamente hacia el capilar, debido a la presión intracraneal. La flecha apunta al LSN recogido en el capilar. (D) El LCC se transfiere a un tubo de 0,5 ml a través de una jeringa modificada de 3 ml. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Función de barrera hematoencefálica y síntesis intratecal de IgG en R-EAE y TMEV-IDD. La mancha de puntos que representa (A) los niveles de CSF del IgG total (mg/dL) medido según la tecnología Luminex, (B) cocientes CSF/serum de albúmina (Qalbumin),y (C) IgG indices (QIg/Qalbumin)en ratones R-EAE y TMEV-IDD, así como ratones de control coincidentes con la edad (cR-EAE y cTMEV-IDD). Las líneas horizontales representan el valor mediano de ese grupo. p < 0.0001; p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los métodos cuantitativos para la evaluación del aumento de las concentraciones de proteínas del LSC son herramientas útiles en la caracterización del estado fisiológico y patológico del SNC. Sin embargo, más allá de la cuantificación fiable de los niveles de proteína sofo, la detección de proteínas del LIF requiere una expresión de resultados que discriminen entre las fracciones derivadas de la sangre y del SNC en el LRESULT. Sin embargo, hasta la fecha, los ensayos de cuantificación de proteínas comúnmente utilizados no permiten la discriminación entre los dos componentes proteicos, incluso con la ayuda de herramientas de alto rendimiento. Así, se han propuesto correcciones específicas a las mediciones de proteínas con el fin de distinguir entre las proteínas sintetizadas dentro del compartimento del SNC y las proteínas derivadas de la sangre. Estas correcciones compensan la variabilidad individual tanto en las concentraciones séricas como en la integridad de la barrera. En general, estas correcciones se basan en cálculos de un cociente CSF/suero(proteínaQ), lo que reduce la variabilidad debido a las diferencias en la concentración individual de proteína sérica. La variación de laproteína Q relacionada con las diferencias individuales en la función de barrera se puede reducir aún más relacionando laproteína Q con un cociente de albúmina CSF/suero(albúminaQ). La combinación de ambas correcciones se conoce generalmente como índice de proteína y se calcula como proteínaQ/Q relaciónde albúmina 4,6.

La albúmina, sintetizada y secretada por el hígado, es la principal proteína plasmática que circula en el torrente sanguíneo. Debido a que la albúmina se produce exclusivamente fuera del SNC y sus niveles en el LSCA son bajos (0,15 g/dL), el aumento de los niveles de albúmina de Lsna indica daño a la BBI o contaminación de la sangre debido a hemorragia intratecal o recolección traumática de LSF. En cualquiera de estas condiciones, la albúmina transcadea del suero en el FSC en proporción a su concentración sérica. Por lo tanto, en ausencia de contaminación de la sangre, laalbúmina Q se puede utilizar como un indicador de la función de barrera20. Por el contrario, laalbúmina Q permanece constante dentro de los rangos normales en humanos y animales con un BBI21intacto. Una suposición fundamental para el uso de este cociente4,6 en el cálculo de la síntesis de proteínas intratecales es que el aumento de la cantidad de proteína CSF en presencia de una barrera con fugas es proporcional al aumento de la concentración de albúmina del Líquido fSe. Esta suposición ha sido confirmada experimentalmente en un estudio de 19774, en el que los autores monitorizaron en pacientes con EP el paso sanguíneo-CSF de IgG radiomarcado y albúmina obtenida de sueros humanos sanos.

Al igual que la albúmina, cualquier proteína en la sangre puede cruzar la BBI. Cuando la barrera está intacta, laproteína Q es relativamente constante. A diferencia de la albúmina, sin embargo, muchas proteínas también se pueden sintetizar dentro del SNC. Como consecuencia, unaproteína Q alterada puede ser el resultado de una barrera dañada y/o un aumento de la producción de proteínas intratecales. Sin embargo, cuando una concentración elevada de proteína DeC se debe sólo a una BBI comprometida, los valores tanto de laproteína Q como de laalbúmina Q se incrementan, en comparación con los valores de estos mismos cocientes en animales con una barrera intacta. Por el contrario, cuando la barrera está intacta, el aumento de las concentraciones de proteína cSF es más probable debido al aumento de la síntesis intratecal, y sólo laproteína Q se incrementa en última instancia.

El uso del índice de proteínas puede estar parcialmente limitado por cinco factores: 1) la gran variabilidad de la concentración de albúmina del LIF en animales sanos, 2) el diferente radio hidrodinámico de proteínas, 3) la expresión endógena del SNC de proteínas, 4) diferentes técnicas de muestreo y 5) las diferencias morfológicas de la BBI. La gran variabilidad de la concentración de albúmina de LIF en animales sanos da como resultado una variabilidad considerable en los valores del índice final de proteínas. En los seres humanos, por ejemplo, laalbúmina Q depende de la edad, ya que aumenta con la edadde 22años. Un informe anterior también mencionaba una diferencia basada en el sexo en laalbúmina Q en una población sana23. Del mismo modo, en ratones las concentraciones de albúmina dependen de la edad y la cepa del ratón24,por ejemplo, laalbúmina Q para ratones jóvenes, machos, C57Bl/6 puede ser diferente de laalbúmina Q para ratones viejos, hembras, DBA/1J. Por lo tanto, no se pueden establecer intervalos de referencia estandarizados para la integridad de la barrera en todas las especies y dentro de ellas, y los umbrales adecuados deben calcularse en función de las condiciones experimentales específicas.

Otro factor que causa variabilidad en los índices normales entre las proteínas es su tamaño molecular. El paso de proteínas séricas a través de la BBI depende de su tamaño molecular, y la correlación entre la tasa de aclaramiento y el peso molecular (MW) se utiliza ampliamente para evaluar la permeabilidad de la BBI. Las estructuras proteicas generales varían en tamaño de decenas a varios miles de aminoácidos. Algunas proteínas son de tamaño molecular relativamente pequeño, como las quimiolinas, con un peso molecular que oscila entre 8 y 20 kDa. Un MW tan bajo favorece el cruce de la BBI, lo que en última instancia resulta en índices de proteínas normales más altos. De manera diferente, otras proteínas, como IgM, son muy grandes (900-950 kDa), por lo tanto, muestran índices muy bajos en condiciones normales6. Sin embargo, esto no siempre es así, ya que, a pesar de un MW similar, algunas proteínas impregnan la barrera mucho mejor que otras proteínas, posiblemente debido a una forma diferente. Por lo tanto, el coeficiente de difusión de una proteína, y por lo tanto los radios hidrodinámicos calculados a partir de ella, depende tanto del tamaño como de la forma de las moléculas25. La diferencia fundamental entre el volumen geométrico y el hidrodinámico de una proteína se hace más evidente con proteínas grandes por encima de 150 kDa. Las tasas de aclaramiento desfase sin efecto, por ejemplo, de ceruloplasmina (132 kDa), IgG (150 kDa) e IgA (150 kDa) reflejan la heterogeneidad hidrodinámica de estas tres proteínas, que tienen25MW similares. También es posible que haya producción intratecal de proteínas en circunstancias normales. Algunas quimiocinas, por ejemplo, CXCL10, se producen típicamente intratecalmente, mientras que otras, por ejemplo, CXCL13, no son26,27. Esto significa que la interpretación de los índices de proteínas en la mayoría de las condiciones experimentales generalmente requiere el análisis de los controles no tratados de edad, sexo y cepa.

Los niveles de proteínas en los líquidos también pueden verse afectados por diferentes técnicas de muestreo. Si bien esto puede no ser un problema para la recolección de LSF como se describe aquí -no hay diferencias en el muestreo de LIF entre los procedimientos de supervivencia y no supervivencia descritos-, diferentes métodos de recolección de sangre pueden tener un impacto en la cantidad total de proteína sérica. Algunos métodos de recolección de sangre producen sangre arterial, otros producen sangre venosa, mientras que otros producen una mezcla deambos 14. La muestra obtenida a partir de la supervivencia del sangrado retro-orbital es una mezcla de sangre venosa y líquido tisular, mientras que la acumulación de sangre terminal de la punción cardíaca puede producir sangre venosa o arterial o una mezcla deambos 14. En animales sanos, el contenido total de proteínas y albúminas del suero sanguíneo arterial puede ser ligeramente superior a las mismas fracciones del suero sanguíneo venoso28. Esto debe tenerse en cuenta cuando se comparan las muestras de supervivencia y no supervivencia.

Por último, una característica importante a tener en cuenta es la estructura morfológica heterogénea de la BBI, que comprende al menos dos barreras distintas, la barrera hematoencefálica (BBB) ubicada en el endotelio de los microvasos cerebrales y la barrera sangre-CSF (BCSF) ubicada en el epitelio de los plexos coroides29. Ambas barreras restringen y regulan el paso de moléculas y células entre los compartimentos periférico y cefalorraquídeo, aunque lo hacen por diferentes mecanismos. Mientras que el BBB es una barrera física real, caracterizada por una interacción compleja entre las células, el BCSF es más bien una barrera fisiológica, que depende principalmente del flujo del Fiel. Las reducciones en la producción, liberación y caudal del FisF debidas a afecciones neurológicas y/o traumatismos afectan a la función BCSF, aumentando así laalbúminaQ9,30,31,32. Por lo tanto, Qalbúmina sirve como un mejor marcador de la permeabilidad BCSF en lugar de la BBB o generalmente permeabilidad BBI.

En resumen, el cálculo de un índice de proteínas es un método relativamente simple y bien caracterizado para la discriminación entre las proteínas transsudados y producidas intratecalmente. La ventaja de aplicar esta fórmula para corregir la medición general de proteínas en muestras de LCR es que genera una variable objetiva para cuantificar la síntesis intratecal de proteínas y para medir la BBI, específicamente BCSF, (dys)función. Dada la robustez de este enfoque, la corrección de las cantidades de proteína CSF a través del índice dealbúmina y proteína Q proporciona una línea de base para evaluar (1) el origen fisiopatológico de cualquier proteína Del LIF y (2) la estabilidad y la importancia funcional de la integridad de la barrera. Aquí se presenta un protocolo detallado, desde el LSN y la recolección de sangre hasta los cálculos finales que corrigen la cantidad total de proteína del LIF, que se aplica a los modelos de ratón para enfermedades neurológicas. Sin embargo, el mismo protocolo se puede adaptar fácilmente al estudio del LCM y la síntesis intratecal de proteínas en cualquier animal, incluidos los seres humanos. Qalbúmina e índice IgG ya se utilizan comúnmente en la práctica clínica para el diagnóstico de enfermedades neurológicas inflamatorias6. Estos mismos parámetros también se han utilizado con éxito para evaluar una amplia gama de citoquinas y quimioquinas en pacientes con enfermedades desmielinizantes inflamatorias26,33,34.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen al personal del Centro de Medicina Comparada e Investigación (CCMR) de Dartmouth por su cuidado experto de los ratones utilizados para estos estudios. El Fondo de Investigación Bornstein financió esta investigación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL insulin syringe BD 329650
1 mL syringe BD 329622
25 gauge needle BD 305122
3 mL syringe BD 309582
30 gauge insulin needle BD 305106
Absorbent pads Any suitable brand
Acepromazine Patterson Vet Supply Inc
BioPlex Handheld Magnetic Washer BioRad 171020100 Magnet
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader BioRad 171015001
BioPlex Pro Flat Bottom Plates BioRad 171025001
Biotinilated detection antibody Any suitable source The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503
Buprenorphine hydrochloride PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05
Capillary Tubes Sutter Instrument B100-75-10 OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.
Centrifuge tube, 0.2 mL VWR 20170-012
Centrifuge tube, 0.5 mL VWR 87003-290
Centrifuge tube, 1.5 mL VWR 87003-294
Chlorhexidine diacetate Nolvasan E004272
Disposable pipettes tips Any suitable brand
Ear bars KOPF Instruments 1921 or 1922
Ethanol Kopter V1001
Freezer VWR VWR32086A
Gauze Medline NON25212
Heating pad Sunbeam XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch
Induction Chamber VETEQUIP
Isoflurane Patterson Vet Supply Inc NDC 14043-704-06
Ketamine (KetaVed) Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) BioRad Antibody-coupled magnetic bead
Microplate Shaker Southwest Scientific SBT1500
Microretractors Carfill Quality ACD-010 Blunt - 1 mm
Microsoft Office (Excel) Microsoft
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel EMD Millipore MGAMMAG-300K Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.
Mouse Albumin capture ELISA kit Novus Biological NBP2-60484 Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.
Multichannel pipette Eppendorf 3125000060
Non-Sterile swabs MediChoice WOD1002 Need to be autoclaved for sterility
Oxygen AIRGAS OX USPEA
Pasteur Pippettes Fisher 13-678-20A 5 & 3/4"
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen Patterson Vet 8695G P-3 Reverse Cutting, 18"
PE-Streptavidin BD Biosciences 554061
Pipetters Eppendorf Research seriers
Polyethylene tubing
Refrigerated Centrifuge Beckman Coulter ALLEGRA X-12R
Scale Uline H2716
Scalpel Feather EF7281
Shaver Harvard Apparatus 52-5204
Standard proteins Any suitable source The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.
Stereotaxic instrument KOPF Instruments Model 900LS Standard Accessories
Sterile 1 x PBS Corning Cellgro 21-040-CV
Sterile saline Baxter 0338-0048-02 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP
Surgical Forceps Curved, 7 (2) Fine Science Tools 11271-30 Dumont
Surgical Scissors Fine Science Tools 14094-11 Stainless 25x
Vaporizer + Flow meter Moduflex Anhestesia Instruments
Vortex Fisher 02-215-414
Warming pad Kent Scientific Corporation RT-JR-20
Water Sonicator Cole Parmer EW-08895-01
Xylazine Patterson Vet Supply Inc

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