난소암에서 노치 신호의 역할을 이해하기 위한 생물정보학 접근법 및 실험 검증의 통합

Cancer Research

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Summary

생물정보학은 대규모 데이터 세트를 처리하는 유용한 방법입니다. 생물 정보학 접근법의 구현을 통해 연구원은 통찰력 있는 응용 분야및 과학적 발견을 신속하고 안정적으로 효율적으로 얻을 수 있습니다. 이 문서는 난소암 연구에서 생물 정보학의 활용을 보여줍니다. 또한 실험을 통해 생물 정보학 연구 결과를 성공적으로 검증합니다.

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Defreitas, S., Rowe, M., Paculis, L., Jia, D. Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer. J. Vis. Exp. (155), e60502, doi:10.3791/60502 (2020).

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Abstract

노치 시그널링은 많은 세포 공정에 관여하는 고도로 보존된 규제 경로입니다. 이 신호 통로의 dysregulation는 수시로 적당한 발달을 가진 방해로 이끌어 내고 특정 경우에 암의 개시 또는 진행귀착될 수 있습니다. 이 통로는 복잡하고 다양한 기능을 제공하기 때문에 다양한 접근법을 통해 광범위하게 연구 할 수 있습니다. 이 중 생물 정보학은 명백히 비용 효율적이고 친근하며 사용자 친화적 인 연구 방법을 제공합니다. 생물 정보학은 대규모 데이터 집합에서 더 작은 정보를 추출하는 유용한 방법입니다. 다양한 생물정보학 접근법의 구현을 통해 연구원은 이러한 대규모 데이터 세트를 신속하고 안정적으로 효율적으로 해석하여 통찰력 있는 응용 분야와 과학적 발견을 얻을 수 있습니다. 여기서, 난소암에서 노치 신호의 역할을 조사하기 위한 생물정보학 접근법의 통합을 위한 프로토콜이 제시된다. 또한, 생물 정보학 사실 인정은 실험을 통해 검증됩니다.

Introduction

노치 신호 통로는 생물학적 유기체 내의 많은 발달 과정에 중요한 고도로 보존된 통로입니다. 노치 시그널링은 세포 증식 및 자가 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났으며, 노치 신호경로의 결함은 많은 유형의암으로이어질 수 있으며1,2,3,4,5,6. 일부 상황에서, 노치 신호 통로는 조직 성장 및 암뿐만 아니라 세포 사멸 및 종양 억제에 연결되었다7. 다양한 기능을 갖춘 다중 노치 수용체(NOTCH 1−4) 및 co\u2012activator 마스터마인드(MAML 1−3)는 추가적인 복잡성을 더합니다. 노치 신호 통로는 기능 면에서 정교하지만 핵심 경로는 분자 기준으로간단합니다 8. 노치 수용체는 세포외 및 세포내 영역으로 구성된 막 간 단백질로서작용한다 9. 노치 수용체의 세포외 영역에 결합하는 리간드는 단백질 용해 분열을 용이하게하며, 이는 노치 세포 내 도메인 (NICD)이 핵으로 방출 될 수 있게합니다. NICD는 다음 co\u2012activator Mastermind에 결합하여 다운스트림 유전자발현(10)을활성화합니다.

최근 몇 년 동안, 노치 시그널링은 상이한 종6,11에걸쳐 여러 종류의 암의 개시 및 진행에 다양한 역할을 하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 노치 신호는 인간 NOTCH1 유전자12를수반하는 종양 발생에 연결되었다. 최근, 노치2, NOTCH3, 델타유사 3(DLL3), 마스터마인드\u2012like 단백질 1(MAML1)디신테그린 및 메탈로프로테나제 도메인\u2012함유 단백질 17(ADAM17) 유전자는 난소암과 강하게 연관된 것으로 나타났으며, 특히 환자의 전반적인 생존율이13명이낮은 것으로 나타났다.

실험 및 환자 관련 데이터의 양이 지속적으로 증가함에 따라 사용 가능한 데이터의 분석에 대한 수요도 증가하고 있습니다. 사용 가능한 데이터는 출판물 에 흩어져 있으며 일관성이 없거나 모순된 결과를 제공할 수 있습니다. 최근 수십 년 동안 차세대 염기서열 분석과 같은 새로운 기술이 개발되면서 사용 가능한 데이터의 양이 기하급수적으로 증가했습니다. 이것은 과학에 있는 급속한 발전을 나타내고 지속적인 생물학 연구를 위한 기회, 연구 질문을 해결하기 위하여 공개적으로 유효한 데이터의 의미를 평가하는 것은 중대한도전입니다 14. 우리는 생물 정보학이 대규모 데이터 세트에서 더 작은 정보를 추출하는 유용한 방법이라고 믿습니다. 다양한 생물정보학 접근법의 구현을 통해 연구원은 이러한 대규모 데이터 세트를 신속하고 안정적으로 효율적으로 해석하여 통찰력 있는 발견을 얻을 수 있습니다. 이러한 발견은 잠재적인 신약 치료 표적 또는 질병 바이오마커의 식별으로부터, 개인화된 환자 치료15,16에이르기까지 다양할 수 있다.

생물정보학 자체는 빠르게 진화하고 있으며, 기술 발전이 의학 및 생물과학을 휩쓸면서 접근 방식은 끊임없이 변화하고 있습니다. 현재, 일반적인 생물정보학 접근법은 DNA 또는 단백질 서열을 분석하고, 특정 관련성 또는 중요성의 유전자를 식별하고, 기능적유전체학16을통해 유전자 및 유전자 생성물의 관련성을 결정하기 위해 공개적으로 접근할 수 있는 데이터베이스 및 소프트웨어 프로그램의 활용을 포함한다. 생물 정보학의 필드는 확실히 이 접근에 한정되지 않더라도, 이들은 임상의와 연구원이 전체적으로 환자의 이익을 위해 생물학 데이터를 처리하는 것을 돕는에서 중요합니다.

이 연구는 몇 가지 중요한 데이터베이스와 노치 신호 경로에 대한 연구에 대한 사용을 강조하는 것을 목표로하고있다. NOTCH2, NOTCH3및 이들의 공동\u2012activivator MAML1은 데이터베이스 연구의 예로 사용되었다. 이 유전자는 난소암에 있는 노치 신호 통로의 중요성이 검증되었기 때문에 이용되었습니다. 검색된 데이터의 체계적인 분석은 난소암에서 노치 신호의 중요성을 확인했습니다. 또한, 노치 시그널링은 종에 걸쳐 잘 보존되기 때문에, 드로소필라 멜라노가스터 NICD와 마스터마인드의 과발현이 함께 초파리성 난소에서 종양을 유도할 수 있음을 확인하였고, 이는 난소암에서 노치 신호의 중요하고 보존된 역할을 뒷받침한다.

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Protocol

1. 유전체 프로파일에서 임상 결과의 예측 (PRECOG)

참고: PRECOG 포털(precog.stanford.edu)은 유전자 발현 수준 및 환자 임상 결과17을포함하여 165개의 암 발현 데이터 세트에서 공개적으로 이용 가능한 데이터에 액세스합니다. 특히 39개의 암 유형에서 다른 유전자의 Z\u2012scores를 제공하기 위해 큰 데이터 세트를 통합하여 환자 전체 생존을 나타내는 Meta\u2012Z 분석을 제공합니다. 불량 및 양호한 생존율은 각각 양수 및 음수 Z\u2012score 값으로 표시됩니다.

  1. 이 데이터베이스에 액세스하려면 학술 제휴 이메일로 계정을 만듭니다. 계정과 연결된 이메일 주소와 암호를 입력합니다.
  2. 메타-Z 분석 제목 아래에 있는 세부 정보 보기 버튼을 클릭합니다.
  3. 관심 유전자를 검색 모음에 입력합니다.
  4. 화면 하단에 있는 스크롤 막대를 사용하여 관심 있는 특정 암 유형에 대한 생존 Z 점수를 얻습니다.

2. CSIOVDB

참고: CSIOVDB(csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html)는난소암18을연구하기 위해 싱가포르 암 과학 연구소에서 개발한 마이크로어레이 데이터베이스입니다. 이 데이터베이스는 다른 종양 사이트뿐만 아니라 정상적인 난소 조직 데이터에서 암종의 데이터를 포함. 또한, CSIOVDB는 차동 유전자 발현 수준으로 환자의 생존을 평가하기 위해 Kaplan\u2012Meier 생존 플롯을 제공합니다. CSIOVDB는 유전자 발현 수준과 난소암 단계/등급 사이의 연관성을 조사하기 위해 적용될 수 있다.

  1. 관심 유전자를 입력한 다음 검색 버튼을 클릭합니다.
  2. 질병 상태 탭을 클릭합니다.
    참고: 이 탭은 난소암 질환 상태에 관심 있는 표적 유전자의 유전자 발현에 대한 요약 통계를 제공합니다.
  3. 역학 탭을 클릭합니다.
    참고: 이 탭은 주요 난소암 학력에 관심 있는 표적 유전자의 유전자 발현에 대한 요약 통계를 제공합니다.
  4. 클리닉 병리학 매개 변수 탭을 클릭합니다.
    참고: 이 탭은 Mann-Whitney 시험을 가진 다른 난소암 단계, 급료 및 임상 반응 중 유전자 발현 수준의 비교를 제공합니다.
  5. 서바이벌 탭을 클릭합니다.
    참고: 이 탭은 전체 생존 및 질병 없는 생존과 관련된 카플란-마이어 플롯을제공합니다. 이 데이터베이스의 경우, 질병 없는 생존은 진행성 및 재발없는 생존으로 간주된다18. 전반적인 생존및 질병 없는 생존을 위한 다변량 분석은 또한 이 탭의 밑에 있습니다. 다변량 분석은 난소암 예후 (단계, 등급, 외과 debulking, 학회, 나이)와 관심있는 유전자와 관련된 특징을 비교합니다.
  6. 하위 유형 탭을 클릭합니다.
    참고: 이 탭은 난소암의 분자 아류형에 관심 있는 유전자의 발현 수준에 대한 요약 통계 및 Mann-Whitney 테스트를 제공합니다. 이 탭은 또한 난소암의 분자 특수형에 관심 있는 유전자의 전반적인 생존질병 없는 생존과 관련되었던 Kaplan-Meier 플롯을 제공합니다.

3. 정상 및 종양 조직에 걸쳐 유전자 발현 (GENT)

참고: GENT 포털(medical\u2012genome.kribb.re.kr/GENT)은 한국생명공학연구원(KRIBB)이 개발하고 관리하고 있습니다19. 16,400개(U133A; 241데이터 세트)와 24,300개(U133plus2; 306데이터 세트)를 공개적으로 사용할 수 있는 샘플을 수집합니다. 표준화 후, GENT는 종양과 정상 조직으로 더 나뉘어진 다양한 조직에 걸쳐 유전자 발현 데이터를 제공합니다.

  1. 화면 상단의 검색 탭을 클릭합니다.
  2. 섹션에서 레이블이 지정된 1입니다. 키워드는드롭다운 메뉴에서 용어에 대한 유전자 기호를 선택하고 키워드 섹션의 빈 영역에 관심 있는 유전자의 유전자 기호를 입력하고 유형 옵션에 대한 조직을 선택합니다.
  3. 1의 하단에 있는 검색 단추를 클릭합니다. 키워드 섹션입니다. U133A 및 U122Plus2 플랫폼에 기초하여 상이한 암 유형의 정상 및 종양 조직에서 유전자 발현의 요약 그래프를 나타낸다.
    참고: 요약 그래프 맨 위에 있는 데이터 필터링 옵션을 선택하여 연구할 특정 데이터베이스를 선택합니다.
  4. 결과 데이터 다운로드 옆의 링크를 클릭하여 유전자 발현 값, 조직 유형 및 데이터 원본에 대한 자세한 정보에 액세스합니다.

4. 브로드 연구소 암 세포주 백과 사전 (CCLE)

참고: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle)는 브로드 연구소에 의해 만들어졌으며 947 인간의 암 세포주20의게놈 프로파일 및 돌연변이를 제공한다.

  1. 원하는 유전자를 검색 창에 입력한 다음 검색 단추를 클릭합니다.
  2. 데이터 집합 선택이라는섹션에서 드롭다운 메뉴에서 mRNA 식(RNAeq) 옵션을 클릭합니다.
    참고 : 다른 옵션은 mRNA 발현 (Affy) 아킬레스 shRNA 녹다운복사 번호를포함한다 .
  3. 모든 추적 전환 버튼을 클릭합니다. 오른쪽의 회색 상자에서 관심 있는 조직 유형을 선택합니다. 화면 아래쪽으로 스크롤하여 mRNA 식 다운로드 단추를 클릭합니다.
  4. 다운로드한 텍스트 문서를 엽니다. 모든 텍스트를 복사하여 시트 1에붙여 넣습니다. 시트 1의모든 텍스트를 복사합니다.
  5. 스프레드시트 하단의 스프레드시트 소프트웨어 시트 2 탭에서 시트를 클릭합니다. A 열을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 특수 붙여넣기를 선택한 다음 시트 2에서 전치 옵션을 선택합니다.
  6. 텍스트가 시트 2의두 열로 변환되면 정렬 및 필터 옵션 제목의 드롭다운 화살표를 클릭한 다음 필터 옵션을 선택합니다. 화살표는 유전자로표시된 제목 영역에 나타납니다. 화살표를 클릭하고 관심의 조직 유형에 입력합니다.
    참고: 이 단계는 모든 데이터를 필터링하고 관심 있는 조직 유형에 대한 유전자 발현 수준만 표시합니다.

5. c바이오포털

참고: cBioPortal(www.cioportal.org)은 메모리얼 슬론 케터링 암 센터(MSK)에서 개발되었으며, 대규모 암 게놈 데이터21,22에액세스, 분석 및 시각화합니다. 특히, 이 포털은 연구원이 유전 변경 및 신호 네트워크를 검색 할 수 있습니다.

  1. 방문 페이지의 쿼리를 사용하여 연구 선택섹션 아래에 관심 있는 기관/조직을 클릭합니다. 관심 있는 특정 연구를 선택한 다음 유전자별 쿼리 단추를 누린 다음
  2. 유전체 프로파일 선택섹션에서 GISTIC의 돌연변이,부피 수 변경 또는 mRNA 발현의세 가지 옵션 중에서 선택합니다. 또한 환자/사례 집합 선택에대한 드롭다운 메뉴에서 해당 데이터를 선택합니다.
  3. 유전자 입력의쿼리 상자에 대상 유전자 기호를 입력합니다. 쿼리 제출 단추를 클릭합니다.
  4. 페이지 상단의 네트워크 탭을 클릭하여 원하는 유전자 네트워크를 검색합니다.
    참고: 시그널링 네트워크는 색상으로 구분됩니다. 입력된 유전자는 두꺼운 테두리를 가진 종자 노드에 의해 표시됩니다. 각 유전자는 적색 원으로 표시되고, 적색 원의 색깔 강렬은 그것의 돌연변이 주파수를 반영합니다. 유전자는 다르게 색깔된 선에 의해 연결됩니다. 갈색 선은 동일한 생물학적 성분에 관여하는 것을 나타내는 "동일한 성분"을 의미한다. 파란색 선은 유전자 반응을 나타내는 "반응"을 의미합니다. 녹색 선은 1개의 유전자가 다른 유전자의 상태 변경을 일으키는 원인이 될 수 있다는 것을 건의하는 "상태 변경"을 의미합니다.
  5. 이미지 상단의 파일 탭을 클릭하여 이미지 로 저장(PNG)을 선택하여 네트워크 이미지 다운로드를 선택합니다.

6. 원하는 유전자형과 DAPI 염색을 가진 초파리 해부

참고 : 원하는 유전자형으로 여성 초파리를 수집 한 다음 비행 난소를 해부하여 이미징을위한 DAPI 염색 절차를 거칩니다.

  1. 플라이 주식 tj-Gal4, Gal80ts/CyO 준비; UAS-NICD-GFP/TM6B, w*; UAS-맘.A;w[1118] NICD-overexpression(tj-Gal4, Gal80ts/+; UAS-NICD-GFP/+NICD 및 맘-과발현 (tj-Gal4, Gal80ts/UAS-mam.A; UAS-NICD-GFP/+기능.
  2. 시공간성 유전자발현을조절하기 위해 시간적 및 국소 적 유전자 발현(TARGET) 기법을 적용한다. 성인이 될 때까지 18 °C에서 파리를 올린 다음 해부 전에 효모로 48 시간 동안 29 °C로 이동합니다.
    참고 : tj-Gal4는 Gal80ts에 의한 억제가 완화 될 때 더 높은 온도에서만 UAS 발현을 구동 할 수 있습니다. 해부 전에 효모를 첨가하여 수확을위한 난소를 확대합니다.
  3. 배아 수집 접시에 1x 인산완충식염수(PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mMNa2HPO4,1.8 mMKH2PO4)를3 mL. CO2 패드를 사용하여 파리를 마취하십시오.
  4. 암컷 플라이를 선택한 다음 해부 집게 한 쌍을 사용하여 플라이의 하부 흉부를 조심스럽게 잡고 배아 수집 접시에 1x PBS 용액에 담급하십시오. 두 번째 집게를 사용하여 하복부를 꼬집고 부드럽게 당겨 내부 장기를 풀어보냅니다.
  5. 플라이 바디에서 난소 쌍을 확인하고 분리하십시오. 난소의 후방 끝에있는 근육 외포를 부수고 난소를 분리하십시오.
    참고: 난소분리와 근육외칼 깨기는 더 높은 품질의 염색 결과를 얻기 위해 필요합니다.
  6. 난소를 1x PBS의 500 μL을 포함하는 1.5 mL 원심 분리관에 놓습니다. 튜브는 모든 난소가 수집 될 때까지 얼음에 남아 있어야합니다.
  7. 1x PBS를 제거하고 0.5 mL의 수정 용액 (4 % 포름알데히드)을 튜브에 넣습니다. 튜브를 영양분 위에 10분 동안 놓습니다.
  8. 튜브에서 고정 용액을 제거하고 적절한 폐기물 용기에 폐기하십시오. 1x PBT 1 mL(0.4% 트리톤™ X-100으로 보충된 1x PBS)를 사용하여 난소를 3x 15분 동안 세척합니다.
  9. 최종 PBT 세척을 버리고 비특이적 결합을 방지하기 위해 PBTG 1 mL(0.2% 소 혈청 알부민, 1x PBT에 5% 정상 염소 세럼)를 첨가합니다.
    참고: 이 단계는 DAPI 염색을 위해 건너뛸 수 있지만 항체 염색에는 필수적입니다. 상세한 면역 조직 화학 염색은 Jia 등에서 찾을 수있습니다. 24.
  10. 10-15분 동안 튜브에 DAPI 150 μL(10 μg/mL)을 놓습니다. DAPI를 버리고 1x PBT 의 1 mL를 사용하여 10 분 동안 난소를 1x로 씻습니다. PBT를 제거하고 1x PBS를 사용하여 10 분 동안 2 x를 씻으하십시오.
  11. 약 300 μL의 PBS가 난소와 튜브에 남아있을 때까지 과잉 PBS를 제거합니다. 난소를 200 μL 파이펫을 사용하여 난소를 위아래로 여러 번 피펫하여 난자 챔버를 풀어보도록 합니다.
  12. 튜브를 부드럽게 회전시키고 난소를 제거하지 않고 가능한 한 많은 1x PBS 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 120 μL의 마운팅 용액 (n-propyl gallate 1g, 10X PBS 5 ml, 글리세롤 40 ml 및 dH2O 5 ml)을 튜브에 넣습니다.
    참고: 마운팅 솔루션은 끈적이므로 정확히 120 μL의 마운팅 용액을 튜브로 전달하기가 어렵습니다. 이 문제를 완화하기 위해 1,000 μL 파이펫 팁을 사용하여 튜브에 3방울의 장착 용액을 추가할 수 있습니다.
  13. 200 μL 파이펫 팁에서 약 0.33mm를 제거하고 새로 절단된 파이펫 팁을 사용하여 장착 용액을 현미경 유리 슬라이드에 놓습니다.
  14. 커버슬립 글래스를 마운팅 용액에 부드럽게 놓고 커버 슬립의 가장자리를 투명 매니큐어로 밀봉합니다.
    참고: 공초점 이미지를 촬영할 때 계란 챔버가 장착 용액 내부로 흐르는 것을 방지하기 위해 커버 유리의 가장자리를 밀봉해야 합니다.
  15. 다음 설정을 사용하여 공초점 현미경으로 이미지를 수집합니다: 대물 렌즈 = 10배 배율; 숫자 조리개 = 0.8; DAPI 방출 파장 = 410-513 nm.

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Representative Results

PRECOG 포털을 사용하여 1단계에서 언급한 절차를 사용하여, 난소암에서 노치2, NOTCH3MAML1의 Z-스코어를 각각 수득하였다(각각 1.3, 2.32, 1.62). 음의 Z\u2012score 값은 3개의 유전자의 발현 수준이 높은 환자의 전반적인 생존율이 좋지 없음을 나타낸다. 스프레드시트 소프트웨어의 조건부 서식을 사용하면 Z\u2012score 값이 그림 1의색상 막대 그래프에 표시됩니다.

CSIOVDB 데이터베이스는 결과를 확인하는 데 사용되었다. 2단계의 지시를 사용하여, NOTCH2, NOTCH3MAML1은 CSIOVDB 데이터베이스 검색 영역에 순차적으로 입력되었고, 생존 탭 아래에 있는 환자 생존 데이터를 검색했다. CSIOVDB는 전체 생존 데이터 외에도 질병 없는 생존을제공합니다. CSIOVDB는 유전자 발현 수준의 Q1 대 Q4(하부 사분위수 대 상부 사분위수)에 기초하여 생존 데이터를 제시하기 위해 환자를 더욱 분리합니다. 이전 사실 인정과 일치하여, 노치2, NOTCH3MAML1의 높은 발현은 전반적인 생존및 질병 없는 생존과 상관관계가 있다(그림2A,B). 한편, CSIOVDB의 클리닉 병리학 적 매개 변수 탭은 또한 Mann-Whitney 시험을 가진 다른 난소 암 단계, 급료 및 임상 반응 중 유전자 발현 수준의 비교를 제공합니다. 결과는 노치2, NOTCH3MAML1의 더 높은 발현 수준이 진행성 난소암 단계와 연관된다는 것을 보여준다(도2C).

NOTCH2, NOTCH3MAML1이 전반적인 환자 생존에 중요하기 때문에 난소 종양 및 암 세포주에서의 유전자 발현 수준을 더 조사하였다. 정상 및 종양 난소 조직에서 의 NOTCH2, NOTCH3MAML1의 발현 데이터는 GENT에 대한 3단계 지시를 사용하여 U133A 플랫폼에서 다운로드되었다. 과학자들은 자신의 특정 연구 목적에 따라 다운로드 한 데이터를 처리 할 수 있습니다. 여기서는 데이터를 활용하여 GraphPad 프리즘(버전 8)을 사용하여 상자와 수염 플롯을 생성했습니다. 추가 순열 시험은 NOTCH2, NOTCH3MAML1이 종양 조직에서 높게 발현된다는 것을 건의하였다(그림 3A). 다음으로, 난소암 세포주에서 노치2, NOTCH3MAML1의 발현 데이터를 CCLE를 사용하여 프로토콜 단계 4에 따라 다운로드하였습니다. 암 세포주에서의 유전자 발현 수준은 상자 및 수염 플롯에 의해 도시된다(도3B). 노치2, NOTCH3 MAML1의 발현 수준이 암 세포주에서 높더라도 CCLE 데이터베이스에서 정상적인 세포주 조절이 부족하여 결론을 도출할 수 없습니다. 그러나 과학자들은 암 세포주의 기원을 식별하고 다른 등급, 단계 및 기타 임상 병리학 적 매개 변수를 기반으로 발현 수준을 비교할 수 있습니다.

난소암에서 노치2, NOTCH3MAML1의 중요성이 확인되면, cBioPortal은 관련 신호 네트워크를 연구하기 위해 활용되었다. 프로토콜 단계 5를 사용하여, 난소/나팔관을 선택 연구에대해 선택된 다음, 난소 장액 낭색종(TCGA, Nature 2011) 데이터 세트를 분석을 위해 선택하였다. 선택 게놈 프로파일로표지된 섹션의 경우, mRNA 발현을 선택하였고, 마지막으로 그의 프로파일 mRNA 발현 Z-scores(all genes)를선택하였다. 환자/사례 세트 선택섹션의 경우, mRNA 데이터(Agilent 마이크로어레이)(489) 옵션이 있는 샘플을 드롭다운 메뉴에서 선택하였다. 결국, 유전자 NOTCH2, NOTCH3MAML1은 질의를 제출하기 위해 선택되었다. 3개의 핵심 유전자에 기초하여, 신호 네트워크는 가장 높은 돌연변이 비율을 가진 동일 통로에 있는 50의 가장 빈번하게 변경된 이웃 유전자를 제공하기 위하여 만들어졌습니다(그림 4).

노치 신호는 종에 걸쳐 잘 보존되기 때문에, 그것은 Drosophila 난소 암에서 조사되었다. 노치 시그널링은 이전에 모낭 세포증식(25,분화26,27,및 세포 주기 조절28,29)을조절하는 것으로 보고되었다. NICD 단독의 과발현은 Drosophila에서 종양을 유도하지 않았다(그림 5A), 초파리 난자 챔버의 상피는 하나의 단일 층으로 그대로 남아로. 그러나, NICD와 맘의 과발현은 다중 상피 층 및 축적된 세포에 의해 입증되는 Drosophila (그림 5B)에서종양을 유도했다.

Figure 1
도 1: 난소암에서노치2, 노치3MAML1의 발현은 전체 생존이 불량한 것과 관련이 있다. 난소암 환자에서 노치2, 노치3MAML1의 생존 Z-스코어가 제시된다. 불쌍한 생존은 음수 Z\u2012score 값으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 난소암에서 노치2, NOTCH3MAML1의 상부는 가난한 전반적인 생존, 가난한 질병 없는 생존 및 향상된 암 단계와 연관됩니다. 마이크로어레이 데이터베이스 CSIOVDB는 난소암 환자에서 노치2, NOTCH3MAML1의 전체 생존 및 질병 없는 생존 플롯을 제공하며, 상이한 암 단계에서 유전자 발현 수준을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 노치2, 노치3,MAML1은 난소 종양 및 암 세포주에서 고도로 발현된다. P 값은 정상 난소 및 상응하는 난소 종양에서 유전자 발현을 비교하기 위해 지시된다. (약어: 난소-N = 정상 난소 조직; 난소-C = 난소암 조직). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: NOTCH2/NOTCH3/MAML1 유전자 및 50개의 가장 빈번히 변경된 이웃 유전자와 관련된 신호 네트워크. 시그널링 네트워크는 색상으로 구분됩니다. 입력된 유전자는 두꺼운 테두리를 가진 종자 노드에 의해 표시됩니다. 각 유전자는 적색 원으로 표시되고, 적색 원의 색깔 강렬은 그것의 돌연변이 주파수를 반영합니다. 유전자는 다르게 색깔된 선에 의해 연결됩니다. 갈색 선은 동일한 생물학적 성분에 관여하는 것을 나타내는 "동일한 성분"을 의미한다. 파란색 선은 유전자 반응을 나타내는 "반응"을 의미합니다. 녹색 선은 1개의 유전자가 다른 유전자의 상태 변경을 일으키는 원인이 될 수 있다는 것을 건의하는 "상태 변경"을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: DROSOPHILA에 있는 NICD 그리고 맘은 또한 난소 종양을 유도합니다. A. NICD 단독의 과발현은 초파리에서종양 형성을 유도하지 않습니다. B. NICD와 맘의 과발현은 함께 초파리에서종양을 유도. 배율 표시줄 = 50 μm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

생물 정보학의 활용을 위한 수많은 접근 및 방법이 있기 때문에, 일반 대중이 온라인으로 사용할 수 있는 수많은 데이터베이스가 있습니다. 이러한 각 데이터베이스에서 풍부한 정보를 추출할 수 있지만 일부는 특정 입력을 기반으로 환자의 생존을 평가하는 것과 같은 특정 목적에 가장 적합합니다. 서로 다른 개별 데이터베이스에서 검색된 데이터를 체계적으로 분석하면 중요한 과학적 발견을 설득력 있게 얻을 수 있습니다.

현재 분석은 생물 정보학 접근의 이용을 통해 난소암에 있는 노치 신호의 역할에 집중합니다. 예를 들어, PRECOG 포털 데이터베이스에 대한 메타-Z 분석은 임상 암 연구에서 환자 생존 결과를 나타내는 Z 점수를 얻기 위해 사용되었습니다. CSIOVDB는 난소암 환자의 생존 결과를 연구하는 데 사용된 또 다른 메타 분석 데이터베이스입니다. CSIOVDB 데이터는 PRECOG 포털에서 NOTCH2, NOTCH3 MAML1이 전반적인 환자 생존에 중요하다는 결과를 성공적으로 검증했습니다. 나중에, GENT 및 CCLE 데이터베이스의 적용은 노치2, NOTCH3MAML1이 난소 종양 및 암 세포주에서 고도로 발현된다는 것을 더욱 입증했다. 이 데이터베이스의 조합은 체계적으로 난소암에 있는 NOTCH2, NOTCH3MAML1의 중요한 역할을 밝혔습니다. 생물 정보학 방법의 이 사용은 암 연구를 비용 효율적으로 할 수 있는 효율적인 방법을 제공하고 미래 실험 및 임상 응용을 위한 중요한 사실 인정을 산출할 수 있는 방법을 보여줍니다.

생물정보학은 대중에게 수천 개의 실험결과에 한 번에 접근할 수 있는 기능을 제공합니다. 공용 데이터베이스에서 파생된 정보는 실험을 수행하기 전에 실험 설계를 설정하는 비용 효율적이고 효율적인 방법을 제공합니다. 또한 공개적으로 이용 가능한 데이터가 출판물 에 흩어질 수 있으며 생물 정보학 접근법을 통해 메타 분석을 수행해야 하는 일관되지 않거나 모순된 결과를 제공할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 과학자들은 대형 생물정보학 데이터베이스를 통해 발견된 데이터를 기반으로 실험을 설계하고 수행하여 특정 과학적 가설을 검증할 수 있습니다. Drosophila 실험에서 결과는 생물 정보학 데이터베이스에서 사실 인정을 확인하고 더 노치 통로 분대가 잠재적인 치료 약 표적으로 조사되는 것을 계속해야 한다는 아이디어를 지원했습니다. 실험을 통한 생물정보학 연구 결과의 성공적인 검증은 또한 과학적 발견을 위한 생물정보학 접근법의 중요성을 시사합니다.

생물 정보학의 몇 가지 제한이있을 수 있습니다. 첫째, 일부 웹 사이트 /도구는 유지 보수와 관련된 시간 노력이나 비용으로 인해 결과를 업데이트하지 않을 수 있습니다. 둘째, 일부 웹 사이트/도구는 지속적으로 업데이트되지만 추가 입력이 있는 업데이트는 이전에 얻은 결과를 변경할 수 있습니다. 셋째, 일부 웹 사이트 / 도구의 개발자는 저작권을 보유하고 콘텐츠의 사용을 제한합니다. 넷째, 특정 웹 사이트 / 도구의 분석 또는 알고리즘이 항상 정확하지 않을 수 있습니다.

이러한 제한 사항을 극복하기 위해 향후 더 나은 응용 프로그램을 위한 몇 가지 단계 또는 수정 및 문제 해결이 제안됩니다. 첫째, 일부 웹 사이트 / 도구는 연구원이 분석을 위해 수동으로 새 데이터를로드 할 수 있습니다. 그렇지 않은 경우 연구원은 가장 최근의 데이터를 자체적으로 다운로드하고 분석할 수 있습니다. 둘째, 연구원은 반복적으로 분석을 실행하고 날짜를 기록해야합니다. 결과가 크게 변경되면 연구원은 데이터를 추가로 입력하여 이유를 파악해야 할 수 있습니다. 셋째, 연구원은 잠재적인 저작권 문제를 피하기 위해 분석을 실행할 수 있는 대체 웹 사이트/도구를 찾을 수 있습니다. 넷째, 연구원은 그들의 중요 한 결과 확인 하는 추가 웹사이트/도구를 얻을 수 있습니다. 분석 또는 알고리즘에 문제가 있는 경우 연구원은 데이터를 다운로드하여 다시 분석하여 실수를 수정하거나 적절한 설정으로 다른 웹 사이트/도구를 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 시작 자금 에 의해 지원되었다, 과학 및 수학 연구 보조금 대학, 여름 연구 세션 상, 조지아 남부 대학에서 연구 종자 자금 조달 상.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4 ThermoFisher FLBP6651 Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum Gibco 16210064 Serum
Embryo dish Electron Microscopy Sciences 70543-45 Dissection Dish
Nutating mixers Fisherbrand 88861041 Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B Dr. Wu-Min Deng at Florida State University N/A Fly stock
w*; UAS-mam.A Bloomington Drosophila Stock Center #27743 Fly stock
w[1118] Bloomington Drosophila Stock Center #5905 Fly stock
The PRECOG portal Stanford University precog.stanford.edu Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB Cancer Science Institute of Singapore csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) medical–genome.kribb.re.kr/GENT Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research portals.broadinstitute.org/ccle Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) cioportal.org Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope Carl Zeiss ID #M 210491 Examination and image collection of fluorescently labeled specimens

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