Integration von Bioinformatik-Ansätzen und experimentellen Validierungen, um die Rolle der Notch-Signalisierung bei Eierstockkrebs zu verstehen

Cancer Research

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Summary

Bioinformatik ist eine nützliche Möglichkeit, große Datensätze zu verarbeiten. Durch die Umsetzung von Bioinformatik-Ansätzen können Forscher schnell, zuverlässig und effizient aufschlussreiche Anwendungen und wissenschaftliche Entdeckungen erhalten. Dieser Artikel zeigt den Einsatz von Bioinformatik in der Eierstockkrebsforschung. Es validiert auch erfolgreich bioinformatische Erkenntnisse durch Experimente.

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Defreitas, S., Rowe, M., Paculis, L., Jia, D. Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer. J. Vis. Exp. (155), e60502, doi:10.3791/60502 (2020).

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Abstract

Notch-Signalisierung ist ein hochkonservierter regulatorischer Weg, der an vielen zellulären Prozessen beteiligt ist. Dysregulation dieses Signalwegs führt oft zu Störungen in der richtigen Entwicklung und kann in bestimmten Fällen sogar zur Einleitung oder Progression von Krebs führen. Da dieser Weg komplexen und vielseitigen Funktionen dient, kann er durch viele verschiedene Ansätze ausgiebig untersucht werden. Davon bietet die Bioinformatik eine unbestreitbar kosteneffiziente, ansprechbare und benutzerfreundliche Methode. Bioinformatik ist eine nützliche Möglichkeit, kleinere Informationen aus großen Datensätzen zu extrahieren. Durch die Implementierung verschiedener Bioinformatik-Ansätze können Forscher diese großen Datensätze schnell, zuverlässig und effizient interpretieren und so aufschlussreiche Anwendungen und wissenschaftliche Entdeckungen liefern. Hier wird ein Protokoll zur Integration von bioinformatischen Ansätzen vorgestellt, um die Rolle der Notch-Signalisierung bei Eierstockkrebs zu untersuchen. Darüber hinaus werden bioinfordische Erkenntnisse durch Experimente validiert.

Introduction

Der Notch-Signalweg ist ein hochkonservierter Weg, der für viele Entwicklungsprozesse innerhalb biologischer Organismen wichtig ist. Kerb-Signalisierung hat gezeigt, dass eine bedeutende Rolle bei der Zellproliferation und Selbsterneuerung zu spielen, und Defekte in der Kerb Signalweg kann zu vielen Arten von Krebs1,2,3,4,5,6führen. Unter bestimmten Umständen wurde der Notch-Signalweg sowohl mit Gewebewachstum und Krebs als auch mit Zelltod und Tumorsuppression in Verbindung gebracht7. Multiple Notch-Rezeptoren (NOTCH 1-4) und Co-u2012-Aktivativator Mastermind (MAML 1-3), alle mit unterschiedlichen Funktionen, fügen eine zusätzliche Komplexität hinzu. Während der Notch-Signalweg in Bezug auf Funktionen ausgeklügelt ist, ist sein Kernweg auf molekularer Basis einfach8. Notch-Rezeptoren fungieren als Transmembranproteine, die aus extrazellulären und intrazellulären Regionen bestehen9. Eine Ligandenbindung an die extrazelluläre Region der Notch-Rezeptoren erleichtert die proteolytische Spaltung, wodurch die Kerb-Intrazelluläre Domäne (NICD) in den Zellkern freigesetzt werden kann. NICD bindet dann an co-u2012activator Mastermind, um die nachgeschaltete Genexpression10zu aktivieren.

In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass Notch-Signalisierung eine Vielzahl von Rollen bei der Initiierung und dem Fortschreiten verschiedener Krebsarten bei verschiedenen Arten von Krebs arten6,11spielt. Zum Beispiel wurde Notch-Signalisierung mit Tumorigenese unter Einbeziehung des menschlichen NOTCH1-Gens 12in Verbindung gebracht. Kürzlich wurden die NotCH2, NOTCH3, Delta-like 3 (DLL3), Mastermind-u2012like Protein 1 (MAML1), und eine Disintegrin und Metalloproteinase Domain-u2012enthaltende Protein 17 (ADAM17) Gene gezeigt, stark mit Eierstockkrebs verbunden sein, vor allem mit dem schlechten Gesamtüberleben der Patienten13.

Da die Menge an experimentellen und patientenassoziierten Daten kontinuierlich zunimmt, steigt auch die Nachfrage nach Deranalyse der verfügbaren Daten. Die verfügbaren Daten sind über Veröffentlichungen verstreut und können zu inkonsistenten oder sogar widersprüchlichen Ergebnissen führen. Mit der Entwicklung neuer Technologien in den letzten Jahrzehnten, wie z. B. der Sequenzierung der nächsten Generation, ist die Menge der verfügbaren Daten exponentiell gewachsen. Obwohl dies einen raschen Fortschritt in der Wissenschaft und Möglichkeiten für eine fortsetzung der biologischen Forschung darstellt, ist die Bewertung der Bedeutung öffentlich verfügbarer Daten zur Lösung von Forschungsfragen eine große Herausforderung14. Wir glauben, dass Bioinformatik eine nützliche Möglichkeit ist, kleinere Informationen aus großen Datensätzen zu extrahieren. Durch die Implementierung verschiedener Bioinformatik-Ansätze können Forscher diese großen Datensätze schnell, zuverlässig und effizient interpretieren und so aufschlussreiche Entdeckungen liefern. Diese Entdeckungen können von der Identifizierung potenzieller neuer drogentherapeutischer Ziele oder Krankheitsbiomarker bis hin zu personalisierten Patientenbehandlungen15,16reichen.

Die Bioinformatik selbst entwickelt sich rasant, und die Ansätze verändern sich ständig, während der technologische Fortschritt die medizinische und biologische Wissenschaft durchzieht. Derzeit umfassen gängige Bioinformatik-Ansätze die Nutzung öffentlich zugänglicher Datenbanken und Softwareprogramme, um DNA- oder Proteinsequenzen zu analysieren, Gene von besonderer Relevanz oder Bedeutung zu identifizieren und die Relevanz von Genen und Genprodukten durch funktionelle Genomik zu bestimmen16. Obwohl der Bereich der Bioinformatik sicherlich nicht auf diese Ansätze beschränkt ist, sind diese für die Unterstützung von Ärzten und Forschern bei der Verwaltung biologischer Daten zum Nutzen der Patienten insgesamt von Bedeutung.

Diese Studie zielt darauf ab, mehrere wichtige Datenbanken und deren Verwendung für die Forschung über den Notch-Signalweg hervorzuheben. ALS Beispiele für die Datenbankstudie wurden NOTCH2, NOTCH3und ihr Co-u2012-Aktivativator MAML1 verwendet. Diese Gene wurden verwendet, weil die Bedeutung des Notch-Signalwegs bei Eierstockkrebs validiert wurde. Systematische Analysen der abgerufenen Daten bestätigten die Bedeutung der Notch-Signalisierung bei Eierstockkrebs. Darüber hinaus, weil Notch Signalisierung ist gut konserviert über Arten, Es wurde bestätigt, dass Überexpression von Drosophila melanogaster NICD und Mastermind zusammen Tumoren in Drosophila Eierstöcke induzieren können, Unterstützung der Datenbank Ergebnisse und die signifikante und konservierte Rolle der Notch Signalisierung bei Eierstockkrebs.

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Protocol

1. Vorhersage klinischer Ergebnisse aus Genomprofilen (PRECOG)

HINWEIS: Das PRECOG-Portal (precog.stanford.edu) greift auf öffentlich verfügbare Daten aus 165 Krebsexpressions-Datensätzen zu, einschließlich Genexpressionsniveaus und klinischen Ergebnissen der Patienten17. Es bietet speziell die Meta-u2012Z-Analyse, die große Datensätze enthält, um Z-u2012scores verschiedener Gene in 39 Krebsarten bereitzustellen, um das Gesamtüberleben des Patienten anzuzeigen. Schlechte und gute Überlebensraten werden durch positive bzw. negative Z-2012score-Werte angezeigt.

  1. Erstellen Sie ein Konto mit einer akademischen verbundenen E-Mail, um auf diese Datenbank zuzugreifen. Geben Sie die E-Mail-Adresse und das Kennwort ein, die dem Konto zugeordnet sind.
  2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Details anzeigen unter der Meta-Z-Analyseüberschrift.
  3. Geben Sie das von Interesse belangende Gen in die Suchleiste ein.
  4. Verwenden Sie die Bildlaufleiste am unteren Bildschirmrand, um den Überlebens-Z-Score für die spezifische Krebsart zu erhalten.

2. CSIOVDB

HINWEIS: CSIOVDB (csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html) ist eine Mikroarray-Datenbank, die vom Cancer Science Institute of Singapore zur Untersuchung von Eierstockkrebs18entwickelt wurde. Diese Datenbank enthält Daten von Karzinomen von verschiedenen Tumorstellen sowie normale Eierstockgewebedaten. Darüber hinaus bietet CSIOVDB Kaplan-u2012Meier-Überlebensplots zur Beurteilung des Überlebens von Patienten mit differentialen Genexpressionsspiegeln. CSIOVDB kann angewendet werden, um den Zusammenhang zwischen Genexpressionsniveaus und Eierstockkrebsstadien/-graden zu untersuchen.

  1. Geben Sie ein Gen von Interesse ein, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Suchen.
  2. Klicken Sie auf die Registerkarte Krankheitszustand.
    HINWEIS: Diese Registerkarte enthält zusammenfassende Statistiken über die Genexpression des Zielgens, das in Zuständen von Eierstockkrebs von Interesse ist.
  3. Klicken Sie auf die Registerkarte Histologie.
    HINWEIS: Diese Registerkarte enthält zusammenfassende Statistiken über die Genexpression des Zielgens, das für große Eierstockkrebs-Histologien von Interesse ist.
  4. Klicken Sie auf die Registerkarte Clinico-pathologische Parameter.
    HINWEIS: Diese Registerkarte bietet einen Vergleich der Genexpressionsniveaus zwischen verschiedenen Ovarialkarzinaden, -graden und klinischen Reaktionen mit Mann-Whitney-Tests.
  5. Klicken Sie auf die Registerkarte Überleben.
    HINWEIS: Diese Registerkarte bietet Kaplan-Meier-Plots, die mit dem Gesamtüberleben und dem krankheitsfreien Überlebenverbunden sind. Für diese Datenbank gilt das krankheitsfreie Überleben als progressions- und rezidivfreies Überleben18. Multivariate Analysen für das Gesamtüberleben und das krankheitsfreie Überleben finden Sie ebenfalls unter dieser Registerkarte. Die multivariaten Analysen vergleichen Merkmale, die sich auf Eierstockkrebsprognosen (Stadium, Grad, chirurgische Debulking, Histologie, Alter) und das Gen von Interesse beziehen.
  6. Klicken Sie auf die Registerkarte Subtype.
    HINWEIS: Diese Registerkarte enthält zusammenfassende Statistiken und Mann-Whitney-Tests für die Expressionsebene des Gens, das für molekulare Subtypen von Eierstockkrebs von Interesse ist. Diese Registerkarte bietet auch Kaplan-Meier-Plots, die mit dem Gesamtüberleben und dem krankheitsfreien Überleben des Gens von Interesse an molekularen Subtypen von Eierstockkrebs in Verbindung gebracht werden.

3. Genexpression über Normal- und Tumorgewebe (GENT)

HINWEIS: Das GENT-Portal (medical-u2012genome.kribb.re.kr/GENT) wird vom Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)19entwickelt und gepflegt. Es sammelt 16.400 (U133A; 241 Datensätze) und 24.300 (U133plus2; 306 Datensätze) öffentlich verfügbare Samples. Nach der Standardisierung bietet GENT Genexpressionsdaten über verschiedene Gewebe hinweg an, die weiter in Tumor- und Normalgewebe unterteilt sind.

  1. Klicken Sie auf die Registerkarte Suchen oben auf dem Bildschirm.
  2. Im Abschnitt mit der Bezeichnung 1. Keyword, wählen Sie das Gensymbol für die Begriffe aus dem Dropdown-Menü aus, geben Sie das Gensymbol des Gens ein, das im leeren Bereich des Abschnitts Schlüsselwort angezeigt wird, und wählen Sie Gewebe für die Option Typ aus.
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Suchen am unteren Rand der 1. Schlüsselwortabschnitt. Es zeigt die zusammenfassenden Graphen der Genexpression in normalem und Tumorgewebe verschiedener Krebsarten basierend auf den U133A- und U122Plus2-Plattformen.
    HINWEIS: Es ist optional, die Option Datenfilterung oben im Zusammenfassungsdiagramm auszuwählen, um eine bestimmte Datenbank auszuwählen, die untersucht werden soll.
  4. Klicken Sie auf den Link neben Ergebnisdatendownload, um auf die detaillierten Informationen zu den Genexpressionswerten, Gewebetypen und Datenquellen zuzugreifen.

4. Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)

HINWEIS: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) wurde vom Broad Institute erstellt und liefert genomische Profile und Mutationen von 947 menschlichen Krebszelllinien20.

  1. Geben Sie die gewünschten Gene in die Suchleiste ein und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Suchen.
  2. Klicken Sie im Abschnitt Dataset auswählenim Dropdown-Menü auf die Option mRNA-Expression (RNAseq).
    HINWEIS: Weitere Optionen sind mRNA-Expression (Affy), Achilles shRNA Knockdownund Copy Number.
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Alle Spuren umschalten. Wählen Sie den Gewebetyp des Interesses aus dem grauen Feld auf der rechten Seite aus. Scrollen Sie nach unten zum unteren Bildschirmrand und klicken Sie auf die Schaltfläche mRNA-Ausdruck herunterladen.
  4. Öffnen Sie das heruntergeladene Textdokument. Kopieren und fügen Sie den gesamten Text in Blatt 1ein. Kopieren Sie den gesamten Text im Blatt 1.
  5. Klicken Sie auf das Blatt in der Registerkarte Tabellenkalkulation Blatt 2 am unteren Rand der Kalkulationstabelle. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Spalte A, wählen Sie Spezial einfügenaus, und wählen Sie dann die Option Transponieren in Blatt 2 aus.
  6. Nachdem der Text in zwei Spalten in Blatt 2transponiert wurde, klicken Sie auf den Dropdown-Pfeil für die Option Sortieren & Filtern, und wählen Sie dann die Option Filter aus. Im Überschriftenbereich mit der Bezeichnung Genewird ein Pfeil angezeigt. Klicken Sie auf den Pfeil und geben Sie die Gewebeart ein.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden alle Daten gefiltert und nur die Genexpressionsniveaus für die Gewebeart angezeigt.

5. cBioPortal

HINWEIS: cBioPortal (www.cioportal.org) wurde am Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) entwickelt und greift auf genomische Daten von Krebs im großen Maßstab21,22zu, analysiert und visualisiert. Insbesondere ermöglicht dieses Portal Forschern, nach genetischen Veränderungen und Signalnetzwerken zu suchen.

  1. Klicken Sie mithilfe der Abfrage auf der Zielseite auf die von Interesse befindlichen Organe/Gewebe unter dem Abschnitt Select Studies. Wählen Sie die jeweilige Studie aus, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Abfrage nach Gene.
  2. Wählen Sie im Abschnitt "Genomprofile auswählen"aus den drei Optionen: Mutationen, Änderungen der Putativen Kopiernummer aus GISTICoder mRNA Expression. Wählen Sie im Dropdown-Menü für Patient/Case Setentsprechende Daten weiter aus.
  3. Geben Sie das Zielgensymbol(e) in das Abfragefeld von Enter Genesein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Abfrage senden.
  4. Klicken Sie auf die Registerkarte Netzwerk oben auf der Seite, um das gewünschte Gennetzwerk abzurufen.
    HINWEIS: Das Signalnetzwerk ist farbcodiert. Die eingegebenen Gene werden durch Samenknoten mit einem dicken Rand angezeigt. Jedes Gen wird durch einen roten Kreis dargestellt, und die Farbintensität des roten Kreises spiegelt seine Mutationshäufigkeit wider. Gene sind durch verschiedenfarbige Linien verbunden. Braune Linien bedeuten "In Same Component", was auf die Beteiligung an derselben biologischen Komponente hinweist. Blaue Linien bedeuten "Reacts With", was auf Genreaktionen hinweist. Grüne Linien bedeuten "State Change", was darauf hindeutet, dass ein Gen eine Zustandsänderung eines anderen Gens verursachen könnte.
  5. Klicken Sie auf die Registerkarte Datei oben im Bild, um Zum Herunterladen von Netzwerkbildern speichern als Bild (PNG) auszuwählen.

6. Dissektion von Drosophila mit gewünschten Genotypen und DAPI-Färbung

HINWEIS: Sammeln Sie die weibliche Drosophila mit den gewünschten Genotypen, dann sezieren Sie die Eierstöcke der Fliege, um sich den Verfahren der DAPI-Färbung zur Bildgebung zu unterziehen.

  1. Vorbereitung Flugbestände tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w*; UAS-mam.A; und w[1118] fliegen mit NICD-Overexpressionzu erstellen (tj-Gal4, Gal80ts/+; UAS-NICD-GFP/+) und NICD und mam-overexpression(tj-Gal4, Gal80ts/UAS-mam.A; UAS-NICD-GFP/+.
  2. Wenden Sie die zeitliche und regionale Genexpressions-Targeting-Technik (TARGET) an, um die raumzeitliche Genexpression23zu kontrollieren. Fliegen bei 18 °C bis zum Erwachsenenalter anheben, dann vor der Zerlegung 48 h mit Hefe auf 29 °C verschieben.
    HINWEIS: tj-Gal4 kann den UAS-Ausdruck nur bei höheren Temperaturen antreiben, wenn die Hemmung durch Gal80ts gelindert wird. Die Zugabe von Hefe vor der Zerlegung vergrößert die Eierstöcke für die Ernte.
  3. 3 ml 1x phosphatgepufferte Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) in eine Embryo-Entnahmeschale geben. Verwenden Sie ein CO 2-Pad, um die Fliegen zu beästhesieren.
  4. Wählen Sie eine weibliche Fliege, dann nehmen Sie vorsichtig den unteren Thorax der Fliege mit einem Paar sezierender Zangen und tauchen Sie sie in die 1x PBS-Lösung in einer Embryo-Sammelschale. Verwenden Sie ein zweites Paar Zangen, um den Unterbauch zu kneifen und ziehen Sie sanft, um die inneren Organe zu lösen.
  5. Identifizieren und lösen Sie das Paar Eierstöcke vom Fliegenkörper. Brechen Sie die Muskelhülle am hinteren Ende der Eierstöcke und trennen Sie die Ovariolen.
    HINWEIS: Das Trennen der Ovariolen und das Brechen der Muskelhülle ist erforderlich, um qualitativ hochwertigere Färbeergebnisse zu erzielen.
  6. Legen Sie die Eierstöcke in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr, das 500 l 1x PBS enthält. Die Röhre sollte auf Eis bleiben, bis alle Eierstöcke gesammelt sind.
  7. Entfernen Sie die 1x PBS und legen Sie 0,5 ml Fixlösung (4% Formaldehyd) in das Rohr. Legen Sie das Rohr 10 min auf den Nutator.
  8. Entfernen Sie die Fixlösung aus dem Rohr und entsorgen Sie sie in einem geeigneten Abfallbehälter. Verwenden Sie 1 ml 1x PBT (1x PBS ergänzt mit 0,4% Triton™ X-100), um die Eierstöcke 3x für 15 min zu waschen.
  9. Entsorgen Sie die endgültige PBT-Wäsche und fügen Sie 1 ml PBTG (0,2% Rinderserumalbumin, 5% normales Ziegenserum in 1x PBT) hinzu, um eine unspezifische Bindung zu verhindern.
    HINWEIS: Dieser Schritt könnte für die DAPI-Färbung übersprungen werden, aber er ist für die Antikörperfärbung unerlässlich. Detaillierte immunhistochemische Färbung finden Sie in Jia et al.24.
  10. Legen Sie 150 l DAPI (10 g/ml) für 10 bis 15 Minuten Nutation in das Rohr. Entsorgen Sie die DAPI und waschen Sie die Eierstöcke 1x 10 min mit 1 ml 1x PBT. Entfernen Sie die PBT und waschen 2x für 10 min mit 1x PBS.
  11. Überschüssige PBS entfernen, bis ca. 300 l PBS mit den Eierstöcken im Rohr verbleibt. Die Eierstöcke mehrmals mit einer 200-L-Pipette nach oben und unten pfeifen, um die Eierkammern zu befreien.
  12. Drehen Sie das Rohr vorsichtig herunter und entfernen Sie vorsichtig so viel 1x PBS-Lösung wie möglich, ohne die Eierstöcke zu entfernen. 120 l Montagelösung (1 g n-Propylgallat, 5 ml 10X PBS, 40 ml Glycerin und 5 ml dH2O) in die Tube geben.
    HINWEIS: Die Montagelösung ist klebrig, so dass es schwierig ist, genau 120 l Montagelösung in ein Rohr zu übertragen. Um dieses Problem zu lindern, kann eine 1.000 l PipetteSpitze verwendet werden, um drei Tropfen Montagelösung in das Rohr hinzuzufügen.
  13. Entfernen Sie ca. 0,33 mm von einer 200-L-Pipettenspitze und platzieren Sie die Montagelösung mit der neu geschnittenen Pipettenspitze auf einem Mikroskopglasschlitten.
  14. Legen Sie das Decksglas vorsichtig auf die Montagelösung und versiegeln Sie die Ränder des Deckelschlupfes mit transparentem Nagellack.
    HINWEIS: Das Versiegeln der Ränder des Deckglases ist erforderlich, um zu verhindern, dass die Eierkammern innerhalb der Montagelösung fließen, wenn konfokale Bilder aufnehmen.
  15. Erfassen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop mit den folgenden Einstellungen: Objektivlinse = 10-fache Vergrößerung; numerische Blende = 0,8; DAPI-Emissionswellenlänge = 410-513 nm.

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Representative Results

Mit dem in Schritt 1 genannten Verfahren wurden die Z-Scores von NOTCH2, NOTCH3und MAML1 bei Eierstockkrebs (1.3, 2.32, 1.62) erhalten. Die negativen Z-2012score-Werte deuten auf das schlechte Gesamtüberleben von Patienten mit hohem Expressionsniveau der drei Gene hin. Mit der bedingten Formatierung der Tabellenkalkulationssoftware werden die Werte von Z-u2012score in einem farbigen Balkendiagramm in Abbildung 1dargestellt.

Die CSIOVDB-Datenbank wurde verwendet, um die Ergebnisse zu bestätigen. Mithilfe der Anweisungen in Schritt 2 wurden NOTCH2, NOTCH3und MAML1 sequenziell in den Suchbereich der CSIOVDB-Datenbank eingegeben, und die Überlebensdaten des Patienten, die sich unter der Registerkarte Überleben befinden, wurden abgerufen. Zusätzlich zu den Gesamtüberlebensdaten bietet CSIOVDB krankheitsfreies Überleben. CSIOVDB trennt Patienten weiter, um die Überlebensdaten basierend auf Q1 vs. Q4 (unteres Quartil vs. oberes Quartil) der Genexpressionsniveaus darzustellen. In Übereinstimmung mit früheren Befunden korrelieren eine hohe Expression von NOTCH2, NOTCH3und MAML1 mit einem schlechten Gesamtüberleben und einem krankheitsfreien Überleben (Abbildung 2A,B). In der Zwischenzeit bietet die Clinico-pathologische Parameter Registerkarte von CSIOVDB auch einen Vergleich der Genexpressionsniveaus zwischen verschiedenen Eierstockkrebsstadien, -graden und klinischen Reaktionen mit Mann-Whitney-Tests. Die Ergebnisse zeigen, dass höhere Expressionsniveaus von NOTCH2, NOTCH3und MAML1 mit fortgeschrittenen Eierstockkrebsstadien assoziiert sind (Abbildung 2C).

Da NOTCH2, NOTCH3und MAML1 für das Gesamtüberleben der Patienten entscheidend sind, wurden die Genexpressionswerte in Eierstocktumoren und Krebszelllinien weiter untersucht. Die Expressionsdaten von NOTCH2, NOTCH3und MAML1 in normalen und Tumor-Ovarialgeweben wurden von der U133A-Plattform mit den Schritt 3 Anleitungen für GENT heruntergeladen. Wissenschaftler können die heruntergeladenen Daten nach ihrem eigenen Forschungszweck verarbeiten. Hier nutzten wir die Daten, um die Box- und Whisker-Plots mit GraphPad Prism (Version 8) zu erstellen. Weitere Permutationstests legten nahe, dass NOTCH2, NOTCH3und MAML1 stark in Tumorgeweben exprimiert sind (Abbildung 3A). Als nächstes wurden die Expressionsdaten von NOTCH2, NOTCH3und MAML1 in Eierstockkrebszelllinien gemäß Protokollschritt 4 mit CCLE heruntergeladen. Die Genexpressionsniveaus in Krebszelllinien werden durch die Box- und Schnurrhaare dargestellt (Abbildung 3B). Obwohl die Expressionsniveaus von NOTCH2, NOTCH3und MAML1 in Krebszelllinien hoch sind, können aufgrund des Fehlens normaler Zellliniensteuerelemente in der CCLE-Datenbank keine Schlussfolgerungen gezogen werden. Die Wissenschaftler können jedoch den Ursprung von Krebszelllinien identifizieren und die Expressionsniveaus basierend auf verschiedenen Graden, Stadien und anderen klinikopathologischen Parametern vergleichen.

Nachdem die Bedeutung von NOTCH2, NOTCH3und MAML1 bei Eierstockkrebs bestätigt wurde, wurde das cBioPortal genutzt, um ihr zugehöriges Signalnetzwerk zu untersuchen. Mit Protokollschritt 5 wurde Ovary/Fallopian Tube für Select Studiesausgewählt, dann wurde der Ovarian Serous Cystadenocarcinoma (TCGA, Nature 2011) Datensatz für die Analyse ausgewählt. Für den Abschnitt Select Genomic Profileswurde die mRNA-Expression ausgewählt und schließlich ihr Profil mRNA-Expression Z-scores (alle Gene). Für den Abschnitt Patienten/Fallsatzauswählen wurde die Option Samples mit mRNA-Daten (Agilent microarray) (489) aus dem Dropdown-Menü ausgewählt. Am Ende wurden die Gene NOTCH2, NOTCH3und MAML1 ausgewählt, um die Abfrage zu senden. Basierend auf den drei Kerngenen wurde ein Signalnetz geschaffen, um die 50 am häufigsten veränderten Nachbargene bereitzustellen, die sich ebenfalls im selben Pfad mit den höchsten Mutationsraten befinden (Abbildung 4).

Da Notch-Signalisierung artenübergreifend gut konserviert ist, wurde sie bei Drosophila-Ovarialkrebs untersucht. Kerbsignalisierung wurde zuvor berichtet, follikel Zellproliferation zu regulieren25, Differenzierung26,27, und Zellzyklus Regulation28,29. Die Überexpression von NICD allein induzierte keine Tumore in Drosophila (Abbildung 5A), da das Epithel der Drosophila-Eikammern mit einer einzigen Schicht intakt blieb. Jedoch, Überexpression von NICD und Mam zusammen induzierte Tumoren in Drosophila (Abbildung 5B), die durch mehrere Epithelschichten und angesammelte Zellen demonstriert wird.

Figure 1
Abbildung 1: Die Expression von NOTCH2, NOTCH3und MAML1 bei Eierstockkrebs ist mit einem schlechten Gesamtüberleben verbunden. Die Überlebens-Z-Scores von NOTCH2, NOTCH3und MAML1 bei Eierstockkrebs-Patienten werden vorgestellt. Ein schlechtes Überleben wird durch negative Z-werte von 2012score angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Hohe Konzentrationen von NOTCH2, NOTCH3und MAML1 bei Eierstockkrebs sind mit einem schlechten Gesamtüberleben, einem schlechten krankheitsfreien Überleben und fortgeschrittenen Krebsstadien verbunden. Die Mikroarray-Datenbank CSIOVDB bietet Kaplan-Meier Gesamtüberlebens- und krankheitsfreie Überlebensplots von NOTCH2, NOTCH3und MAML1 bei Eierstockkrebspatienten und Genexpressionsniveaus in verschiedenen Krebsstadien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: NOTCH2, NOTCH3und MAML1 sind stark in Eierstocktumoren und Krebszelllinien exprimiert. P-Werte sind angegeben, um die Genexpression in normalen Eierstöcken und entsprechenden Eierstocktumoren zu vergleichen. (Abkürzungen: Ovary-N = normales Eierstockgewebe; Ovar-C = Eierstockkrebsgewebe). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: NOTCH2/NOTCH3/ MAML1-Gene und das zugehörige Signalnetzwerk mit den 50 am häufigsten veränderten Nachbargenen. Das Signalnetzwerk ist farbcodiert. Die eingegebenen Gene werden durch Samenknoten mit einem dicken Rand angezeigt. Jedes Gen wird durch einen roten Kreis dargestellt, und die Farbintensität des roten Kreises spiegelt seine Mutationshäufigkeit wider. Gene sind durch verschiedenfarbige Linien verbunden. Braune Linien bedeuten "In Same Component", was auf die Beteiligung an derselben biologischen Komponente hinweist. Blaue Linien bedeuten "Reacts With", was auf Genreaktionen hinweist. Grüne Linien bedeuten "State Change", was darauf hindeutet, dass ein Gen eine Zustandsänderung eines anderen Gens verursachen könnte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: NICD und Mam in Drosophila induzieren auch Eierstocktumoren. A. Überexpression von NICD allein induziert keine Tumorbildung bei Drosophila. B. Überexpression von NICD und Mam zusammen induzieren Tumore in Drosophila. Maßstabsleiste = 50 'm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Da es unzählige Ansätze und Methoden für den Einsatz von Bioinformatik gibt, stehen der breiten Öffentlichkeit zahlreiche Datenbanken online zur Verfügung. Aus jeder dieser Datenbanken kann eine Fülle von Informationen extrahiert werden, aber einige eignen sich am besten für bestimmte Zwecke, wie z. B. die Beurteilung des Überlebens von Patienten auf der Grundlage bestimmter Inputs. Systematische Analysen von abgerufenen Daten aus verschiedenen einzelnen Datenbanken können überzeugende wissenschaftliche Erkenntnisse liefern.

Die aktuelle Analyse konzentriert sich auf die Rolle der Notch-Signalisierung bei Eierstockkrebs durch den Einsatz von Bioinformatik-Ansätzen. Zum Beispiel wurde die Meta-Z-Analyse in der PRECOG-Portaldatenbank verwendet, um Z-Scores zu erhalten, die auf überlebensbasierte Ergebnisse von Patienten in klinischen Krebsstudien hinweisen. CSIOVDB ist eine weitere Metaanalyse-Datenbank, die verwendet wurde, um Überlebensergebnisse von Eierstockkrebspatienten zu untersuchen. Die CSIOVDB-Daten validierten erfolgreich die Ergebnisse des PRECOG-Portals, dass NOTCH2, NOTCH3und MAML1 für das Gesamtüberleben der Patienten entscheidend sind. Später zeigten die Anwendungen der GENT- und CCLE-Datenbanken weiter, dass NOTCH2, NOTCH3und MAML1 stark in Eierstocktumoren und Krebszelllinien exprimiert werden. Die Kombination dieser Datenbanken zeigte systematisch die signifikanten Rollen von NOTCH2, NOTCH3und MAML1 bei Eierstockkrebs. Dieser Einsatz von Bioinformatik-Methoden bot eine effiziente Möglichkeit, die Krebsforschung kostengünstig zu betreiben und zeigt, wie sie wichtige Erkenntnisse für zukünftige experimentelle und klinische Anwendungen liefern kann.

Bioinformatik bietet der Öffentlichkeit die Möglichkeit, auf Ergebnisse von Tausenden von Experimenten auf einmal zuzugreifen. Die aus öffentlichen Datenbanken gewonnenen Informationen bieten eine kostengünstige und effiziente Möglichkeit, vor der Durchführung von Experimenten ein experimentelles Design zu erstellen. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass öffentlich zugängliche Daten über Publikationen verstreut werden können und inkonsistente oder sogar widersprüchliche Ergebnisse liefern können, die meta-Analysen durch bioinformatische Ansätze erfordern. Wissenschaftler können Experimente auf der Grundlage der Daten entwerfen und durchführen, die in großen Bioinformatik-Datenbanken gefunden wurden, um spezifische wissenschaftliche Hypothesen zu validieren. Die Ergebnisse des Drosophila-Experiments bestätigten die Ergebnisse der Bioinformatik-Datenbanken und unterstützten die Idee, dass Notch-Signalwegkomponenten weiterhin als potenzielle therapeutische Wirkstoffziele untersucht werden sollten. Die erfolgreiche Validierung bioinformatischer Erkenntnisse durch Experimente legt auch die Bedeutung bioinformatischer Ansätze für wissenschaftliche Entdeckungen nahe.

Es kann einige Einschränkungen der Bioinformatik geben. Erstens können einige Websites/Tools ihre Ergebnisse aus Zeitaufwand oder Wartungskosten nicht aktualisieren. Zweitens werden einige Websites/Tools ständig aktualisiert, aber das Update mit zusätzlicher Eingabe kann zuvor erhaltene Ergebnisse ändern. Drittens vorbehalten Entwickler einiger Websites/Tools Urheberrechte und schränken die Nutzung ihrer Inhalte ein. Viertens sind Analysen oder Algorithmen bestimmter Websites/Tools möglicherweise nicht immer korrekt.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, werden einige Schritte oder Änderungen und Die Fehlerbehebung für bessere zukünftige Anwendungen vorgeschlagen. Erstens ermöglichen einige Websites/Tools es Forschern, neue Daten manuell für die Analyse zu laden. Wenn nicht, können Forscher die neuesten Daten selbst herunterladen und analysieren. Zweitens müssen die Forscher ihre Analysen immer wieder durchführen und die Daten erfassen. Wenn sich die Ergebnisse erheblich ändern, müssen die Forscher möglicherweise die zusätzliche Eingabe von Daten verwenden, um die Gründe herauszufinden. Drittens können Forscher eine alternative Website/ein alternatives Tool finden, um ihre Analysen durchzuführen, um potenzielle Urheberrechtsprobleme zu vermeiden. Viertens können Forscher zusätzliche Websites/Tools erhalten, um ihre wichtigen Ergebnisse zu validieren. Wenn es Irgendwelche Probleme mit Analysen oder Algorithmen gibt, können Forscher die Daten herunterladen und erneut analysieren, um die Fehler zu korrigieren oder andere Websites/Tools mit den entsprechenden Einstellungen zu verwenden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Start-Up Funding, College of Science and Mathematics Research Grant, Summer Research Session Award und Research Seed Funding Award der Georgia Southern University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4 ThermoFisher FLBP6651 Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum Gibco 16210064 Serum
Embryo dish Electron Microscopy Sciences 70543-45 Dissection Dish
Nutating mixers Fisherbrand 88861041 Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B Dr. Wu-Min Deng at Florida State University N/A Fly stock
w*; UAS-mam.A Bloomington Drosophila Stock Center #27743 Fly stock
w[1118] Bloomington Drosophila Stock Center #5905 Fly stock
The PRECOG portal Stanford University precog.stanford.edu Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB Cancer Science Institute of Singapore csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) medical–genome.kribb.re.kr/GENT Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research portals.broadinstitute.org/ccle Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) cioportal.org Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope Carl Zeiss ID #M 210491 Examination and image collection of fluorescently labeled specimens

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