Integrering av bioinformatikk tilnærminger og eksperimentelle valideringer for å forstå rollen til notch signalering i eggstokkene Cancer

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bioinformatikk er en nyttig måte å behandle datasett i stor skala på. Gjennom gjennomføringen av bioinformatikk tilnærminger, kan forskerne raskt, pålitelig og effektivt få innsiktsfulle programmer og vitenskapelige oppdagelser. Denne artikkelen demonstrerer utnyttelse av bioinformatikk i eggstokkene kreftforskning. Det er også vellykket validerer bioinformatikk funn gjennom eksperimentering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Defreitas, S., Rowe, M., Paculis, L., Jia, D. Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer. J. Vis. Exp. (155), e60502, doi:10.3791/60502 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Notch signalering er en svært bevart regulatoriske veien involvert i mange cellulære prosesser. Feilregulering av denne signalering veien fører ofte til interferens med riktig utvikling og kan også føre til initiering eller progresjon av kreft i visse tilfeller. Fordi denne stien serverer komplekse og allsidige funksjoner, kan det bli studert mye gjennom mange ulike tilnærminger. Av disse gir bioinformatikk en unektelig kostnadseffektiv, imøtekommende og brukervennlig metode for å studere. Bioinformatikk er en nyttig måte å trekke ut mindre biter av informasjon fra stor skala datasett. Gjennom implementeringen av ulike bioinformatikk tilnærminger, kan forskerne raskt, pålitelig og effektivt tolke disse store datasettene, noe som gir innsiktsfulle applikasjoner og vitenskapelige oppdagelser. Her er en protokoll presentert for integrering av bioinformatikk tilnærminger for å undersøke rollen til notch signalering i eggstokkene kreft. Videre blir bioinformatikk funn validert gjennom eksperimentering.

Introduction

Den hakk signalering veien er en svært bevart vei som er viktig for mange utviklingsmessige prosesser innenfor biologiske organismer. Notch signalering har vist seg å spille en betydelig rolle i celle spredning og selv fornyelse, og defekter i hakk signalering veien kan føre til mange typer kreft1,2,3,4,5,6. I noen tilfeller har notch signalering veien er knyttet til både vev vekst og kreft, samt celle død og tumor undertrykkelse7. Flere hakk reseptorer (NOTCH 1 − 4) og co\u2012activator Mastermind (MAML 1 − 3), alle med ulike funksjoner, legge til et ekstra nivå av kompleksitet. Mens notch signalbanen er sofistikert når det gjelder funksjoner, er dens kjerne vei enkel på molekyl basis8. Hakk reseptorer fungerer som transmembrane proteiner bestående av ekstracellulære og intracellulære regioner9. En ligand binding til ekstracellulære-regionen i notch-reseptorer forenkler proteolytiske kløft, noe som gjør at notch intracellulære-domenet (NICD) kan slippes ut i kjernen. NICD deretter binder seg til co\u2012activator Mastermind å aktivere nedstrøms genuttrykk10.

I de senere årene har notch signalering vist å spille en rekke roller i initiering og progresjon av flere typer kreft på tvers av ulike arter6,11. For eksempel har notch signalering vært knyttet til tumorigenesis involverer den menneskelige NOTCH1 genet12. Nylig, den NOTCH2, NOTCH3, delta-lignende 3 (DLL3), Mastermind\u2012like protein 1 (MAML1), og en disintegrin og metalloproteinase domain\u2012containing PROTEIN 17 (ADAM17) gener ble vist å være sterkt assosiert med eggstokkene kreft, spesielt med dårlig generell overlevelse av pasienter13.

Ettersom mengden av eksperimentelle og pasient-tilknyttede data kontinuerlig øker, etterspørselen etter analyse av tilgjengelige data øker også. De tilgjengelige dataene er spredt over flere publikasjoner, og de kan levere inkonsekvente eller til og med motstridende funn. Med utviklingen av ny teknologi i de siste ti årene, for eksempel neste generasjons sekvensering, har mengden tilgjengelige data vokst eksponentielt. Selv om dette representerer raske fremskritt innen vitenskap og muligheter for fortsatt biologisk forskning, er det en stor utfordring14å vurdere betydningen av offentlig tilgjengelige data for å løse spørsmål om forskning. Vi tror bioinformatikk er en nyttig måte å trekke ut mindre biter av informasjon fra stor skala datasett. Gjennom gjennomføringen av ulike bioinformatikk tilnærminger, kan forskerne raskt, pålitelig og effektivt tolke disse store datasettene, noe som gir innsiktsfulle funn. Disse funnene kan variere fra identifisering av potensielle nye narkotika terapi mål eller sykdom biomarkører, til personlig pasientbehandling15,16.

Bioinformatikk seg selv er i rask utvikling, og tilnærminger er i stadig endring som teknologiske fremskritt feie medisinsk og biologisk vitenskap. Foreløpig felles bioinformatikk tilnærminger inkluderer utnyttelse av offentlig tilgjengelige databaser og programmer for å analysere DNA eller protein sekvenser, identifisere gener av spesiell relevans eller betydning, og bestemme relevansen av gener og gen produkter gjennom funksjonell Genomics16. Selv om bioinformatikk ikke er begrenset til disse tilnærmingene, er disse viktige for å hjelpe klinikere og forskere med å administrere biologiske data til fordel for pasientene som helhet.

Denne studien tar sikte på å fremheve flere viktige databaser og deres bruk for forskning om notch signalering veien. NOTCH2, NOTCH3, og deres co\u2012activator MAML1 ble brukt som eksempler for database studien. Disse genene ble brukt fordi viktigheten av notch signalering veien i eggstokkene kreft har blitt validert. Systematisk analyse av hentet data bekreftet viktigheten av notch signalering i eggstokkene kreft. I tillegg, fordi notch signalering er godt bevart på tvers av arter, ble det bekreftet at overuttrykte av Drosophila Melanogaster NICD og Mastermind sammen kan indusere svulster i Drosophila eggstokkene, støtter databasen funn og betydelig og bevart rolle notch signalering i eggstokkene kreft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. prediksjon av kliniske utfall fra genomisk profiler (PRECOG)

Merk: PRECOG portalen (precog.stanford.edu) har tilgang til offentlig tilgjengelige data fra 165 datasett for kreft uttrykk, inkludert gen uttrykks nivåer og pasientens kliniske utfall17. Det gir spesielt Meta\u2012Z analyse, som inkorporerer store datasett for å gi Z\u2012scores av ulike gener i 39 krefttyper for å indikere pasientens generelle overlevelse. Dårlige og gode overlevelses rater indikeres av henholdsvis positive og negative Z\u2012score-verdier.

  1. Opprett en konto med en akademisk tilknyttet e-post for å få tilgang til denne databasen. Skriv inn e-postadressen og passordet som er knyttet til kontoen.
  2. Klikk på Vis detaljer knappen som ligger under meta-Z analyse overskriften.
  3. Input genet av interesse i søke feltet.
  4. Bruk rullefeltet som ligger på bunnen av skjermen for å oppnå overlevelse Z-poengsum for den spesifikke kreft typen av interesse.

2. CSIOVDB

Merk: CSIOVDB (csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html) er en Microarray database utviklet av Cancer Science Institute of Singapore for å studere eggstokkene kreft18. Denne databasen inneholder data om kreftsvulster fra ulike tumor områder samt normal eggstokk vev data. I tillegg gir CSIOVDB Kaplan\u2012Meier overlevelse tomter for å vurdere pasientens overlevelse med differensial genuttrykk nivåer. CSIOVDB kan brukes til å undersøke tilknytningen mellom gen uttrykks nivåer og kreft stadier i eggstokkene/karakterene.

  1. Input gen av interesse, deretter klikker du på Søk -knappen.
  2. Klikk på kategorien sykdomstilstand .
    Merk: denne kategorien gir oppsummering statistikk av genet uttrykk for målet genet av interesse for eggstokkene kreft sykdom tilstander.
  3. Klikk på histologi -fanen.
    Merk: denne kategorien gir oppsummering statistikk av genet uttrykk for målet genet av interesse for store eggstokkene kreft histologies.
  4. Klikk på Clinico-patologiske parametre kategorien.
    Merk: denne kategorien gir en sammenligning av gen uttrykks nivåene mellom ulike kreft nivåer for eggstokkene, karakterer og kliniske reaksjoner med mann-Whitney-tester.
  5. Klikk på Survival -fanen.
    Merk: denne kategorien gir Kaplan-Meier-plott knyttet til Total overlevelse og sykdoms fri overlevelse. For denne databasen, sykdom-fri overlevelse anses progresjon-og gjentakelse-fri overlevelse18. Multivariabel analyse for generell overlevelse og sykdom-Free Survival er også funnet under denne kategorien. Den multivariabel analyser sammenligne funksjoner som er knyttet til eggstokkene kreft prognoser (scene, grade, kirurgisk "debulking", histologi, alder) og genet av interesse.
  6. Klikk kategorien under type .
    Merk: denne kategorien gir Oppsummerings statistikk og mann-Whitney tester for uttrykks nivået av genet av interesse for molekylære under typer av kreft i eggstokkene. Denne kategorien gir også Kaplan-Meier-plott knyttet til Total overlevelse og sykdoms fri overlevelse av genet av interesse for molekylære under typer av kreft i eggstokkene.

3. Gene Expression på tvers av normal og tumor vev (GENT)

Merk: GENT-portalen (medisinsk \ u2012genome. kribb. re. Kr/GENT) er utviklet og vedlikeholdt av Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)19. Det samler inn 16 400 (U133A; 241 datasett) og 24 300 (U133plus2; 306 datasett) allment tilgjengelige eksempler. Etter standardisering, tilbyr GENT genuttrykk data på tvers av ulike vev, som er videre delt inn i tumor og normalt vev.

  1. Klikk på Søk -fanen øverst på skjermen.
  2. I delen merket 1. Søkeord, velger genet symbol for vilkårene fra rullegardinmenyen, input genet symbol av genet av interesse i det tomme området av søkeord delen, og velg vev for typen alternativ.
  3. Klikk på Søk -knappen nederst på 1. Nøkkelord seksjon. Det viser sammendraget grafer av genuttrykk i normal og tumor vev av ulike krefttyper basert på U133A og U122Plus2 plattformer.
    Merk: det er valgfritt å velge data filtrering alternativet på toppen av sammendraget grafen til enkelt ut en bestemt database for å studere.
  4. Klikk koblingen ved siden av resultat data nedlasting for å få tilgang til detaljert informasjon om gen uttrykks verdiene, vevs typene og data kildene.

4. bred Institutt kreftcelle linje Encyclopedia (CCLE)

Merk: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) ble opprettet av Broad Institute og gir genomisk profiler og mutasjoner av 947 menneskelig kreftcelle linjer20.

  1. Input det ønsket gener inn i søke stang og så falle i staver gjennom søkningen knapp.
  2. I delen merket Velg datasettklikker du alternativet MRNA Expression (RNAseq) på rullegardinmenyen.
    Merk: andre alternativer inkluderer mRNA-uttrykk (Affy), Achilles shRNA-knockdownog kopierings nummer.
  3. Falle i staver på pinnen alle spor knapp. Velg vevs typen av interesse fra den grå boksen til høyre. Rullet ned å bunnen av skjermen og falle i staver det dataoverføre mRNA gjengivelsen knapp.
  4. Åpne det nedlastede tekst dokumentet. Kopier og lim inn all teksten i ark 1. Kopier all teksten i ark 1.
  5. Klikk på arket i arkfanen for regnearkprogram vare 2 nederst i regnearket. Høyreklikk på en kolonne, velg Lim inn spesielt, og velg deretter transponere alternativet i ark 2.
  6. Når teksten er overført til to kolonner på ark 2, klikker du rullegardinpilen for sorterings & filter alternativ overskrift, og deretter velger du filter alternativet. Det vises en pil i overskrifts området merket med Gene. Klikk på pilen og skriv inn vevet type interesse.
    Merk: dette trinnet vil filtrere alle data og bare vise genuttrykk nivåer for vevet type interesse.

5. cBioPortal

Merk: cBioPortal (www.cioportal.org) ble utviklet ved Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK), og åpner, analyserer og visualiserer stor skala kreft genomisk data21,22. Nærmere bestemt gjør denne portalen at forskerne kan søke etter genetiske endringer og signalnettverk.

  1. Ved hjelp av spørringen på destinasjonssiden, klikker du på organer/vev av interesse under delen merket Velg studier. Velg den aktuelle studien av interesse, og trykk deretter på Query by Gene knappen.
  2. I seksjonen merket Velg genomisk profiler, Velg mellom de tre alternativene: mutasjoner, antatte Kopier-nummer endringer fra GISTIC, eller mRNA Expression. Velg deretter tilsvarende data fra rullegardinmenyen for Velg pasient/tilfelle sett.
  3. Angi mål gen symbolet (e) i spørringsboksen for Enter gener. Klikk Send spørring -knappen.
  4. Klikk på fanen nettverk øverst på siden for å hente ønsket gen nettverk.
    Merk: signal nettverket er fargekodet. De angitt genene er indikert av frø noder med en tykk kant. Hvert gen representeres av en rød sirkel, og farge intensiteten til den røde sirkelen reflekterer dens mutasjon frekvens. Gener er forbundet med forskjellige fargede linjer. Brune linjer betyr "i samme komponent", som indikerer involvering i samme biologiske komponenten. Blå linjer betyr "reaksjoner med", som indikerer gen reaksjoner. Grønne linjer betyr "State Change", noe som tyder på at ett gen kan føre til en statlig endring av et annet gen.
  5. Falle i staver på arkiv tab på høyden av bildet å foretrekker bevare idet image (PNG) for nettverk image dataoverfører.

6. Disseksjon av Drosophila med ønsket GENOTYPER og DAPI farging

NOTE samle det kvinner Drosophila med det ønsket genotyper, så analysere det fly eggstokkene å gjennomgå prosedyrene av DAPI flekk for tenkelig.

  1. Forbered fly aksjer TJ-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w *; UAS-Mam. A; og w [1118] for å lage fluer med NICD-overuttrykte (TJ-Gal4, Gal80ts/+; UAS-NICD-GFP/+) og NICD og Mam-overuttrykte (TJ-Gal4, Gal80ts/UAS-Mam. A; UAS-NICD-GFP/+) evne.
  2. Anvende den timelige og regionale genuttrykk målretting (TARGET) teknikk for å kontrollere spatiotemporal genuttrykk23. Raise fluer ved 18 ° c til voksen, deretter skifte til 29 ° c for 48 h med gjær før disseksjon.
    Merk: TJ-Gal4 kan bare kjøre UAS uttrykk under høyere temperaturer, når hemming av Gal80ts er lettet. Tilsetning av gjær før disseksjon forstørrer eggstokkene for høsting.
  3. Plasser 3 mL 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2PO4) i et embryo samling parabolen. Bruk en CO2 pad å bedøve fluene.
  4. Velg en kvinnelig flue, deretter forsiktig ta den nedre thorax av fly ved hjelp av et par dissekere tang og senk den inn i 1x PBS løsningen i et embryo samling parabolen. Bruk et annet par tang for å klype nedre del av magen og trekk forsiktig for å løsne de indre organene.
  5. Identifiser og løsne par eggstokkene fra flue kroppen. Bryte muskel kappe plassert på bakre enden av eggstokkene og skille ovarioles.
    Merk: skille ovarioles og bryte muskel kappe er nødvendig for å oppnå høyere kvalitet flekker resultater.
  6. Plasser eggstokkene i et 1,5 mL sentrifugerør som inneholder 500 μL av 1x PBS. Røret skal være på isen til alle eggstokkene er samlet.
  7. Fjern 1x PBS og plasser 0,5 mL Fix løsning (4% formaldehyd) inn i røret. Plasser røret på nutator i 10 min.
  8. Fjern reparasjonsløsningen fra røret og kast den i en egnet avfallsbeholder. Bruk 1 mL 1x PBT (1x PBS supplert med 0,4% Triton™ X-100) for å vaske eggstokkene 3x i 15 min.
  9. Kast den endelige PBT-vasken og tilsett 1 mL PBTG (0,2% blod serum albumin, 5% normal geit serum i 1x PBT) for å forhindre ikke-spesifikk binding.
    Merk: dette trinnet kan hoppes over for DAPI farging, men det er viktig for antistoff farging. Detaljert immunhistokjemi farging kan bli funnet i Jia et al.24.
  10. Plasser 150 μL av DAPI (10 μg/mL) i slangen i 10 − 15 minutter nutasjon. Kast DAPI og vask eggstokkene 1x i 10 min med 1 mL 1x PBT. Fjern PBT og vask 2x i 10 min ved hjelp av 1x PBS.
  11. Fjern overflødig PBS inntil ca 300 μL av PBS forblir i røret med eggstokkene. Pipet eggstokkene opp og ned flere ganger ved hjelp av en 200 μL pipette, for å frigjøre egg kamrene.
  12. Snurr forsiktig ned røret og forsiktig fjerne så mye 1x PBS løsning som mulig uten å fjerne eggstokkene. Plasser 120 μL av monteringsløsning (1 g n-propyl gallate, 5 ml 10X PBS, 40 ml glyserol og 5 ml dH2O) inn i røret.
    Merk: monterings løsningen er klebrig, så det er vanskelig å overføre nøyaktig 120 μL av monteringsløsning i et rør. For å lindre dette problemet, en 1 000 μL pipette spissen kan brukes til å legge tre dråper monteringsløsning i røret.
  13. Fjern ca 0,33 mm fra en 200 μL dråpespiss og bruk den nylig kuttet pipette spissen til å plassere monterings løsningen på et mikroskop glass lysbilde.
  14. Forsiktig plassere dekkglass glass på monterings løsningen og forsegle kantene på dekselet slip med gjennomsiktig neglelakk.
    Merk: tetting av kantene på dekselet glass er nødvendig for å hindre at egg kamre fra strømmer innsiden av monterings løsningen når du tar konfokalmikroskopi bilder.
  15. Skaff bilder med et konfokalmikroskopi mikroskop med følgende innstillinger: objektiv linse = 10x forstørrelse; numerisk blenderåpning = 0,8; DAPI utslipps bølgelengde = 410 − 513 NM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av prosedyren nevnt i trinn 1 ved hjelp av PRECOG portalen, Z-scorene til NOTCH2, NOTCH3og MAML1 i eggstokkene ble innhentet (1,3, 2,32, 1,62, henholdsvis). De negative Z\u2012score-verdiene indikerer den dårlige total overlevelse hos pasienter med høye uttrykks nivåer av de tre genene. Ved å bruke betinget formatering av regnearkprogramvaren, vises Z\u2012score-verdiene i et farget stolpediagram i figur 1.

CSIOVDB-databasen ble brukt til å bekrefte funnene. Ved hjelp av instruksjonene i trinn 2, NOTCH2, NOTCH3og MAML1 ble SEKVENSIELT angitt i søkeområdet for CSIOVDB-databasen, og pasient overlevelse data som ligger under kategorien overlevelse ble hentet. I tillegg til Total Survival data, CSIOVDB gir sykdom-Free Survival. CSIOVDB videre skiller pasientene å presentere overlevelse data basert på Q1 vs Q4 (nedre kvartilen kontra øvre kvartilen) av genuttrykk nivåer. I samsvar med tidligere funn, høy uttrykk for NOTCH2, NOTCH3og MAML1 relatere med dårlig generell overlevelse og sykdoms fri overlevelse (figur 2A, B). I mellomtiden gir Clinico-kategorien patologiske parametre i CSIOVDB også en sammenligning av gen uttrykks nivåene mellom ulike kreft stadier i eggstokkene, karakterer og kliniske reaksjoner med mann-Whitney-tester. Resultatene viser at høyere uttrykks nivåer for NOTCH2, NOTCH3og MAML1 er forbundet med avanserte kreft nivåer for eggstokkene (figur 2C).

Fordi NOTCH2, NOTCH3og MAML1 er kritiske for total pasient overlevelse, ble gen uttrykks nivåene i eggstokkene svulster og kreftcelle linjer undersøkt ytterligere. Uttrykket data for NOTCH2, NOTCH3, og MAML1 i normal og tumor eggstokkene vev ble lastet ned fra U133A plattformen ved hjelp av trinn 3 instruksjoner for Gent. Forskere kan behandle den nedlastede data i henhold til sine egne spesifikke forskningsformål. Her benyttet vi dataene til å produsere boksen og whisker tomter bruker GraphPad Prism (versjon 8). Videre permutasjon tester antydet at NOTCH2, NOTCH3, og MAML1 er svært uttrykt i tumor vev (Figur 3A). Deretter ble uttrykks dataene for NOTCH2, NOTCH3og MAML1 i kreftceller for eggstokkene lastet ned i henhold til protokoll trinn 4, ved hjelp av CCLE. Gene Expression nivåer i kreftcelle linjer vises ved boksen og whisker tomter (Figur 3B). Selv om uttrykks nivåene for NOTCH2, NOTCH3og MAML1 er høye i kreftcelle linjer, kan ikke konklusjoner tegnes på grunn av mangelen på normale cellelinje kontroller i CCLE-databasen. Forskerne kan imidlertid identifisere opprinnelsen til kreftcelle linjer og sammenligne uttrykks nivåene basert på forskjellige karakterer, stadier og andre clinicopathological parametre.

Når betydningen av NOTCH2, NOTCH3og MAML1 i kreft i eggstokkene ble bekreftet, ble cBioPortal benyttet for å studere deres tilhørende signalnettverk. Bruke protokollen trinn 5, eggstokk/egglederne tube ble valgt for Utvalgte studier, så eggstokkene Serøs cystadenosarcoma (TCGA, Nature 2011) datasett ble valgt for analyse. For seksjonen merket Velg genomisk profiler, mRNA Expression ble valgt, og til slutt sin profil mRNA uttrykk Z-score (alle gener). For seksjonen Velg pasient/sak sett, ble prøvene med MRNA data (Agilent microarray) (489) alternativet valgt fra rullegardinmenyen. På slutten ble genene NOTCH2, NOTCH3og MAML1 valgt for å sende inn spørringen. Basert på de trekjerne genene ble et signalnettverk opprettet for å gi de 50 mest endrede nabo genene, som også er i samme vei med den høyeste mutasjon ratene (Figur 4).

Fordi notch signalering er godt bevart på tvers av arter, ble det undersøkt i Drosophila eggstokkene kreft. Hakk signalering har tidligere blitt rapportert å regulere hårsekken cellespredning 25, differensiering26,27, og celle syklus regulering28,29. Overuttrykte av NICD alene ikke indusere svulster i Drosophila (figur 5A), som epitel av Drosophila egg kamre forble intakt med ett enkelt lag. Men overuttrykte av NICD og Mam sammen indusert svulster i Drosophila (figur 5B), som er demonstrert av flere epitel lag og akkumulerte celler.

Figure 1
Figur 1: uttrykk for NOTCH2, NOTCH3og MAML1 i kreft i eggstokkene er forbundet med dårlig generell overlevelse. Overlevelse Z-resultater av NOTCH2, NOTCH3, og MAML1 i eggstokkene kreftpasienter er presentert. Dårlig overlevelse indikeres av negative Z\u2012score-verdier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: høye nivåer av NOTCH2, NOTCH3, og MAML1 i kreft i eggstokkene er forbundet med dårlig generell overlevelse, dårlig sykdom-fri overlevelse, og avanserte kreft stadier. Den Microarray databasen CSIOVDB gir Kaplan-Meier generell overlevelse og sykdoms fri overlevelse plott av NOTCH2, NOTCH3, og MAML1 i eggstokkene kreftpasienter, og genuttrykk nivåer i ulike kreft stadier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: NOTCH2, NOTCH3, og MAML1 er svært uttrykt i eggstokkene svulster og kreftcelle linjer. P-verdier er indisert for å sammenligne genuttrykk i normale eggstokkene og tilsvarende svulster i eggstokkene. (Forkortelser: eggstokk-N = normal eggstokk vev; Eggstokk-C = eggstokkene kreft vev). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: NOTCH2/NOTCH3/MAML1 gener og deres tilhørende signalnettverk med 50 som oftest endrede nabo gener. Signal nettverket er fargekodet. De angitt genene er indikert av frø noder med en tykk kant. Hvert gen representeres av en rød sirkel, og farge intensiteten til den røde sirkelen reflekterer dens mutasjon frekvens. Gener er forbundet med forskjellige fargede linjer. Brune linjer betyr "i samme komponent", som indikerer involvering i samme biologiske komponenten. Blå linjer betyr "reaksjoner med", som indikerer gen reaksjoner. Grønne linjer betyr "State Change", noe som tyder på at ett gen kan føre til en statlig endring av et annet gen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: NICD og Mam i Drosophila også indusere eggstokkene svulster. A. overuttrykte av NICD alene ikke induserer tumor dannelse i Drosophila. B. overuttrykte av NICD og Mam sammen induserer svulster i Drosophila. Scale bar = 50 μm Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ettersom det finnes utallige tilnærminger og metoder for utnyttelse av bioinformatikk, er det mange databaser tilgjengelig online for allmennheten. En overflod av informasjon kan trekkes ut fra hver av disse databasene, men noen er best egnet for bestemte formål, for eksempel vurdering av pasientens overlevelse basert på visse innganger. Systematiske analyser av hentet data fra ulike individuelle databaser kan overbevisende gi viktige vitenskapelige funn.

Den nåværende analysen fokuserer på rollen som notch signalering i eggstokkene kreft gjennom utnyttelse av bioinformatikk tilnærminger. Meta-Z-analysen på PRECOG Portal database ble for eksempel brukt til å oppnå Z-resultater som tyder på at pasienten overlever utfall i kliniske kreft studier. CSIOVDB er en annen meta-analyse database som ble brukt til å studere overlevelse utfall av eggstokkene kreftpasienter. CSIOVDB-dataene validerte funnene fra PRECOG-portalen som NOTCH2, NOTCH3og MAML1 er kritiske for generell pasient overlevelse. Senere demonstrerte anvendelser av GENT og CCLE databaser videre at NOTCH2, NOTCH3, og MAML1 er svært uttrykt i eggstokkene svulster og kreftcelle linjer. Kombinasjonen av disse databasene avslørte systematisk de viktige rollene som NOTCH2, NOTCH3og MAML1 i kreft i eggstokkene. Denne bruken av bioinformatikk metoder ga en effektiv måte å gjøre kreftforskning kostnadseffektivt og viser hvordan det kan gi viktige funn for fremtidige eksperimentelle og kliniske applikasjoner.

Bioinformatikk gir publikum muligheten til å få tilgang til resultater fra tusenvis av eksperimenter på en gang. Informasjonen avledet fra offentlige databaser gir en kostnadseffektiv og effektiv måte å etablere en eksperimentell design før du utfører eksperimenter. I tillegg er det viktig å merke seg at offentlig tilgjengelige data kan spres på tvers av publikasjoner og kan levere inkonsekvente eller til og med motstridende funn, som krever meta-analyser som skal utføres gjennom bioinformatikk tilnærminger. Forskere kan designe og utføre eksperimenter basert på data funnet gjennom store bioinformatikk databaser for å validere spesifikke vitenskapelige hypoteser. Resultater fra Drosophila eksperimentet bekreftet funnene fra bioinformatikk databaser og videre støttet ideen om at notch Pathway komponenter bør fortsette å bli undersøkt som potensielle terapeutiske narkotika mål. Den vellykkede godkjenningen av bioinformatikk funn gjennom eksperimentering antyder også viktigheten av bioinformatikk tilnærminger for vitenskapelige oppdagelser.

Det kan være noen begrensninger av bioinformatikk. Først, noen nettsteder/verktøy kan ikke oppdatere sine funn på grunn av tid innsats eller kostnader forbundet med vedlikehold. For det andre, noen nettsteder/verktøy gjør stadig oppdatering, men oppdateringen med ekstra innspill kan endre tidligere oppnådde resultater. Tredje, utviklere av enkelte nettsteder/verktøy forbeholder opphavsrett og begrense bruken av innholdet. For det fjerde, analyserer eller algoritmer av bestemt websites/verktøy kunne ikke alltid være akkurat.

For å overkomme disse begrensningene foreslås noen trinn eller modifikasjoner og feilsøking for bedre fremtidige programmer. Først noen nettsteder/verktøy gjør at forskerne å manuelt laste nye data for analyse. Hvis ikke, kan forskerne laste ned og analysere de nyeste dataene på egenhånd. For det andre må forskerne gjentatte ganger kjøre sine analyser, og holde oversikt over datoene. Hvis resultatene betydelig endres, kan forskerne må bruke ekstra input av data for å finne ut årsakene. For det tredje kan forskerne finne et alternativ nettsted/verktøy for å kjøre sine analyser for å unngå potensielle opphavsrettslige spørsmål. Fjerde, kan forskerne få flere nettsteder/verktøy for å validere sine viktige funn. Hvis det er noen problemer med analyser eller algoritmer, kan forskerne laste ned og re-analysere dataene for å rette opp feil eller bruke andre nettsteder/verktøy med de riktige innstillingene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av start-up finansiering, College of Science and Mathematics Research Grant, Summer Research Session Award, og Research Seed Funding Award fra Georgia Southern University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4 ThermoFisher FLBP6651 Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum Gibco 16210064 Serum
Embryo dish Electron Microscopy Sciences 70543-45 Dissection Dish
Nutating mixers Fisherbrand 88861041 Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B Dr. Wu-Min Deng at Florida State University N/A Fly stock
w*; UAS-mam.A Bloomington Drosophila Stock Center #27743 Fly stock
w[1118] Bloomington Drosophila Stock Center #5905 Fly stock
The PRECOG portal Stanford University precog.stanford.edu Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB Cancer Science Institute of Singapore csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) medical–genome.kribb.re.kr/GENT Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research portals.broadinstitute.org/ccle Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) cioportal.org Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope Carl Zeiss ID #M 210491 Examination and image collection of fluorescently labeled specimens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bocchicchio, S., Tesone, M., Irusta, G. Convergence of Wnt and Notch signaling controls ovarian cancer cell survival. Journal of Cellular Physiology. (2019).
  2. Hibdon, E. S., et al. Notch and mTOR Signaling Pathways Promote Human Gastric Cancer Cell Proliferation. Neoplasia. 21, (7), 702-712 (2019).
  3. Kucukkose, C., Yalcin Ozuysal, O. Effects of Notch signalling on the expression of SEMA3C, HMGA2, CXCL14, CXCR7, and CCL20 in breast cancer. Turkish Journal of Biology. 43, (1), 70-76 (2019).
  4. Lan, G., et al. Notch pathway is involved in the suppression of colorectal cancer by embryonic stem cell microenvironment. OncoTargets and Therapy. 12, 2869-2878 (2019).
  5. Lian, H., et al. Notch signaling promotes serrated neoplasia pathway in colorectal cancer through epigenetic modification of EPHB2 and EPHB4. Cancer Management and Research. 10, 6129-6141 (2018).
  6. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  7. Bray, S. J. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, (11), 722-735 (2016).
  8. Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138, (17), 3593-3612 (2011).
  9. Brou, C., et al. A novel proteolytic cleavage involved in Notch signaling: the role of the disintegrin-metalloprotease TACE. Molecular Cell. 5, (2), 207-216 (2000).
  10. Oswald, F., et al. p300 acts as a transcriptional coactivator for mammalian Notch-1. Molecular and Cellular Biology. 21, (22), 7761-7774 (2001).
  11. Xiu, M. X., Liu, Y. M. The role of oncogenic Notch2 signaling in cancer: a novel therapeutic target. American Journal of Cancer Research. 9, (5), 837-854 (2019).
  12. Allenspach, E. J., Maillard, I., Aster, J. C., Pear, W. S. Notch signaling in cancer. Cancer Biololgy & Therapy. 1, (5), 466-476 (2002).
  13. Jia, D., Underwood, J., Xu, Q., Xie, Q. NOTCH2/NOTCH3/DLL3/MAML1/ADAM17 signaling network is associated with ovarian cancer. Oncology Letters. 17, (6), 4914-4920 (2019).
  14. Weng, J. T., et al. Novel bioinformatics approaches for analysis of high-throughput biological data. Biomed Research International. 2014, 814092 (2014).
  15. Readhead, B., Dudley, J. Translational Bioinformatics Approaches to Drug Development. Advances in Wound Care (New Rochelle). 2, (9), 470-489 (2013).
  16. Bayat, A. Science, medicine, and the future: Bioinformatics. BMJ. 324, (7344), 1018-1022 (2002).
  17. Gentles, A. J., et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nature Medicine. 21, (8), 938-945 (2015).
  18. Tan, T. Z., et al. CSIOVDB: a microarray gene expression database of epithelial ovarian cancer subtype. Oncotarget. 6, (41), 43843-43852 (2015).
  19. Shin, G., et al. GENT: gene expression database of normal and tumor tissues. Cancer Informatics. 10, 149-157 (2011).
  20. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483, (7391), 603-607 (2012).
  21. Gao, J. J., et al. Integrative Analysis of Complex Cancer Genomics and Clinical Profiles Using the cBioPortal. Science Signaling. 6, (269), (2013).
  22. Cerami, E., et al. The cBio Cancer Genomics Portal: An Open Platform for Exploring Multidimensional Cancer Genomics Data. Cancer Discovery. 2, (5), 401-404 (2012).
  23. McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Science's STKE. 2004, (220), 6 (2004).
  24. Jia, D., Huang, Y. C., Deng, W. M. Analysis of Cell Cycle Switches in Drosophila Oogenesis. Methods in Molecular Biology. 1328, 207-216 (2015).
  25. Lo, P. K., Huang, Y. C., Corcoran, D., Jiao, R., Deng, W. M. Inhibition of Notch signaling by the p105 and p180 subunits of Drosophila chromatin assembly factor 1 is required for follicle cell proliferation. Journal of Cell Science. 132, (2), (2019).
  26. Keller Larkin, M., et al. Role of Notch pathway in terminal follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. Development Genes and Evolution. 209, (5), 301-311 (1999).
  27. Sun, J., Deng, W. M. Notch-dependent downregulation of the homeodomain gene cut is required for the mitotic cycle/endocycle switch and cell differentiation in Drosophila follicle cells. Development. 132, (19), 4299-4308 (2005).
  28. Jia, D., et al. A large-scale in vivo RNAi screen to identify genes involved in Notch-mediated follicle cell differentiation and cell cycle switches. Scientific Reports. 5, 12328 (2015).
  29. Shcherbata, H. R., Althauser, C., Findley, S. D., Ruohola-Baker, H. The mitotic-to-endocycle switch in Drosophila follicle cells is executed by Notch-dependent regulation of G1/S, G2/M and M/G1 cell-cycle transitions. Development. 131, (13), 3169-3181 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics