림프절 저온 절에서 종양 세포 접착의 정량화

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Cancer Research

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Summary

여기서, 우리는 림프절 (LN) 저온 절에 접착제 종양 세포의 정량화를 허용하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. LN 부착 종양 세포는 가벼운 현미경 검사법에 의해 용이하게 규각되고 형광 기반 방법에 의해 확인되며, LN parenchyma에 종양 세포 결합 친화도를 드러내는 접착 지수를 제공합니다.

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Jandrey, E. H. F., Kuroki, M. A., Camargo, A. A., Costa, E. T. Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections. J. Vis. Exp. (156), e60531, doi:10.3791/60531 (2020).

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Abstract

종양 배수 림프절 (LN)은 종양에서 생산된 폐기물의 단순한 필터가 아닙니다. 그(것)들은 암의 다른 모형을 가진 환자에 있는 전파한 종양 세포의 잠정적인 거주의 일반적인 지역 사이트의 한개입니다. 이러한 LN 상주 종양 세포의 검출은 가난한 예후 및 보조 요법 결정과 관련된 중요한 바이오마커이다. 최근 마우스 모델은 LN 상주 종양 세포가 먼 전이에 대한 악성 세포의 실질적인 공급원이 될 수 있음을 나타냈다. LN 실질에 종양 세포의 접수성을 정량화하는 능력은 림프 /전이성 보급과 관련된 유전자 또는 신호 경로의 식별에 초점을 맞춘 실험 연구에서 중요한 게이지입니다. LN은 단면의 평면에 따라 조직 섹션에서 다양한 모양과 조성물을 가진 복잡한 3D 구조이기 때문에, 그들의 행렬은 완전히 통제된 방식으로 시험관 내에서 실험적으로 복제하기 어렵다. 여기서, 우리는 LN 극저온절에 접착제 종양 세포의 정량화를 허용하는 간단하고 저렴한 방법을 기술한다. 동일한 LN의 직렬 섹션을 사용하여 Brodt가 개발한 고전적인 방법을 적용하여 비방사성 라벨을 사용하고 LN 표면적당 부착 종양 세포의 수를 직접 계산합니다. LN 부착 종양 세포는 광 현미경 검사법에 의해 쉽게 확인되고 형광 기반 방법에 의해 확인되며, LN parenchyma에 세포 결합 친화도를 드러내는 접착 지수를 제공하며, 이는 그들의 상관 관계가 있는 LN-ligands에 대한 친화도 결합의 분자 적 변화의 암시적 증거이다.

Introduction

암 전이는 치료 실패와 암의 지배적 인 생명을 위협하는 측면의 주된 이유입니다. 130년 전 가정된 바와 같이, 전이성 확산은 전파된 종양 세포(DTC, "씨앗")의 엘리트가 1차 부위를 회피하고 먼 부위("토양")에서 악성성장을 확립할 수 있는 특정 생물학적 능력을 획득할 때 1. 최근에는 전이성 틈새("씨앗"이 번성하는 데 필요한 "비옥한 토양"으로 개념화됨), DTC에 의한 1차 종양의 자체 파종, 이차 장기의 "종자" 휴면 및 전이의 병렬 진행 모델과 같은 "종자 및 토양" 관계에 관한 몇 가지 새로운 개념이등장했습니다.

대부분의 고체 악성 종양의 경우, DTC는 임상 전이의 증거가 있거나 없는 환자에서 골수 및 림프절 (LN)과 같은 많은 중간 엽 기관에서 상주하고 검출 될 수 있습니다. 종양 배수 LN은 DTC의 국부적 확산의 첫 번째 위치이기 때문에, LN 상태는 중요한 예후 지표이며 종종 보조 요법 결정과 관련이있다 3. 일부 종양 유형의 경우, LN 상태와 악화 된 결과 사이의 상관 관계는 머리와 목4,5,유방6,전립선7,8,9,대장10,11 및 갑상선 암12를포함합니다.

LN은 망상 세포로 덮여 림프관으로 둘러싸인 림프 계의 작은 난형 기관입니다. 이 기관은 면역 체계 의 기능을 위해 절대적으로 필요합니다13. LN은 면역 순환 세포를 위한 유치플랫폼으로 작용하여 림프구와 항원 제시 세포를함께 14개. 그러나, LN은 또한 순환 종양 세포를 유치합니다. 수십 년 동안, LN은 전이성 종양 세포를 위한 수송의 수동적인 경로로 그림되었습니다. 그러나, 최근 연구는 종양 세포가 또한 화학 전술에 의해 LN을 향해 유도 될 수 있음을 나타냈다 (chemokines) 및 / 또는 haptotactic (세포 외 매트릭스 요소) 림프 내피에 의해 분비 큐15. 일례로, 종양 세포에서 CCR7 수용체의 과발현은 종양 배수 LNs16을향한 전이성 흑색종 세포의 유도를 용이하게 한다. 또한, 세포외 LN 단백질은 순환 종양세포(17)의모집 및 생존을 위한 접착 스캐폴드를 제공한다. 실제로, 종양 배수 LN은 DTC의 시드를 위한 비옥한 토양을 제공하며, 이는 특정 LN 미세 환경신호(18)에의해 증식 또는 휴면 상태에서 유지될 수 있다. 이러한 LN 거주 DTC의 마지막 운명은 논란의 여지가 있습니다. 일부 작품은 이러한 세포가 전이성 진행의 수동 지표임을 제안19,다른 사람은 저항의 가능성이 설립자 제안하는 동안 (자기 파종 기본 사이트에 의해) 및 / 또는 전이에 대한 세포 저장소 역할을 (삼차 암 성장을위한 "씨앗을 확산"20,21. 최근에는 전임상 모델을 이용하여, 이들 LN-상주 DTCs의 일부가 혈관을 적극적으로 침범하고, 혈액순환에 들어가폐(21)를식민지화하는 것으로 입증되었다.

이 연구에서는 LN에서 암세포의 존재가 암 공격성과 침략성에 대한 마커임을 고려하여, 본 연구에서는 Brodt22가 개발한 고전적인 방법을 최적화하여 시험관 내 LN에 대한 종양 세포 접착을 정량적으로 측정했습니다. 형광 기반 분석법의 사용은 우리가 종양 세포와 LN 저온 절 사이의 점착 성 변경의 검출을위한 저렴한 비용, 신속하고 민감하고 환경 친화적 인 (비 방사성) 프로토콜을 개발할 수 있었습니다. MCF-7 유방암 세포를 사용하여 NDRG4 유전자 발현 및 래트 LN 냉동 단면의 상이한 수준을 발현하는 방법을 예시하였고, 이 프로토콜은 유방암 환자24에서관찰된 LN 및 LN 전이에 대한 종양 세포 부착을 양호한 상관관계를 허용한다는 것을 보여주었다.

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Protocol

LN은 자궁 경부 탈구에 의해 희생된 건강한 성인 위스타 쥐의 신선한 시체로부터 회수되었다. 우리는 실험실 동물의 고통과 고통에 대한 NIH 지침을 따랐으며 모든 절차는 Sírio-Libanês 병원의 연구 및 교육 연구소의 윤리위원회와 동물 연구에 의해 승인되었습니다 (CEUA P 2016-04).

참고: 모든 신선한 냉동 조직은 생물학적 위험으로 간주되며 적절한 생물 안전 성 예방 조치를 사용하여 처리해야합니다.

1. 림프절 절제술 및 냉동 절제

  1. 성인 Wistar 쥐 (180-220g)의 신선한 시체를 실온에서 깨끗한 해부 보드에 등쪽 리컴에 놓습니다.
    참고: L은 안락사 후 최대 30분까지 수령해야 합니다.
  2. 쥐 시체에 70% 이소프로필 알코올을 뿌리고 LN 수확을 위해 멸균 된 도구를 사용하십시오.
  3. 핀셋의 도움으로 복부 피부를 들어 올리고 기본 조직을 손상시키지 않고 내측 절개로 구멍을 열어 복부 내장을 노출시다. 소장을 꺼내서 흉부와 복부 LN이 보이게됩니다(그림 1).
  4. 무딘 팁 가위를 사용하여 각 쥐의 LN을 조심스럽게 제거하여 뒤에 누워있는 우수한 장간막 동맥을 손상시키지 않도록하십시오.
    참고 : 절제 된 림프절의 위치에 따라 간간 절조직과 같은 다른 조직을 청소해야합니다.
  5. 멸균 인산완충식염수린(PBS)의 5mL를 포함하는 15mL 원추형 튜브로 LN을 수확합니다.
  6. 쥐 시체를 제대로 버리십시오.
  7. PBS에서 신선한 LN을 제거하고 마른 필터 용지에 노드를 굴리고 건조시십시오. 작은 페트리 접시에 넣고 냉동 조직 표본 (O.C.T.)에 대한 임베딩 용액을 2 분 동안 추가하십시오.
  8. LN을 바결을 커버하기에 충분한 O.C.T로, 크라오졸드 의 기지에서 원하는 위치로 LN을 아래로 향하게 합니다. 조직 근처의 거품을 피하십시오. 단면은 크라오졸드의 바닥입니다.
  9. 즉시 드라이 아이스와 스티로폼 쿨러에 cryomold를 스냅 동결. 냉동되지 않은 O.C.T.(~20-35s)의 작은 부분이 여전히 있을 때, 샘플을 알루미늄 호일로 옮기고 다른 샘플을 계속 동결시키면서 드라이 아이스로 쿨러에 넣습니다. 끝에서, 모든 샘플을 -80 °C에서 단면화 될 때까지 저장하십시오.
  10. 저온 유지 단면 두께를 5-8 μm로 조정하여 LN을 섹션으로 섹션.
    참고: 단면화하기 전에 냉동 시료를 -80°C 냉동실에서 제거하고 약 30분 동안 -22°C의 저온 마이크로톤 챔버의 온도에 평형을 허용합니다.

2. 형광 염료를 가진 세포 표지

참고 : 형광 염료는 세포 생물학에서 널리 사용됩니다. 우리는 긴 사슬 다이얼킬카르보시아닌 라벨링(DiI(C18),여기 549 nm, 방출 565 nm)를 사용하는 것을 선호하며, 그들은 밝고 안정적이며 배양 배지에 직접 첨가될 수 있기 때문에, 세포 생존력 또는 세포 점착 특성에 영향을 미치지 않는다25,26.

  1. 이상적인 조건(즉, 완전한 배지)에서 성장하는 세포를 해리하고 106 세포/mL의 밀도로 무혈청 배지에서 다시 중단합니다.
  2. a15 mL 원엽 튜브에 1 mL의 세포 현탁액 (106 셀)을 추가하고 37 °C에서 10 분 동안 Dil (C18)(2 μg / mL)으로 라벨을 붙입니다.
    참고 : 5 분 후, 부드럽게 세포 침전과 침전 세포의 과소 얼룩을 방지하기 위해 튜브를 교반. 밀도가 클수록 균일한 염색을 위해 더 긴 배양 시간이 필요합니다. 세포 염색을 위한 최적 배양 시간은 세포주에 따라 다릅니다. 종래의 FL2 유량 세포분석 검출채널(도 2A)을이용하여 더 나은 정량화될 수 있다.
  3. 표지된 현탁액 튜브를 300 x g에서 4분 동안 원심분리합니다.
  4. 상급체를 제거하고 무혈청 배지 10 mL로 두 번 씻으소서. 적색 펠릿으로 세포를 복구합니다. 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA)와 혈청이없는 배지에서 106 세포 / mL에서 세포를 다시 중단.

3. 파종 제어로 폴리 L-리신 용액 또는 BSA로 접시를 사전 코팅 (선택 사항)

참고 : 우리는 종양 세포의 다른 실험 그룹이 부정적인 대조군으로 BSA 코팅 표면뿐만 아니라 동일한 수로 시드되었는지 확인하기 위해 PLL로 미리 코팅 된 세포 배양 접시를 양수 로딩 제어 표면으로 사용했습니다.

  1. 멸균 조건에서 PLL 또는 BSA 코팅 웰을 준비하려면 PLL 300 μL(H2O에서0.1% w/v) 또는 BSA(H2O에서2.5% w/v로 희석)를 24웰 플레이트에 직접 넣고 4°C에서 밤새 배양합니다.
  2. 포인포에 의해 용액을 제거하고 멸균 된 PBS로 표면을 부드럽게 헹구고 세포 시딩 전에 조직 배양 후드의 실온에서 플레이트를 공기 건조시하십시오.
    참고 : PLL 또는 BSA의 최종 볼륨은 다른 웰 플레이트의 면적에 따라 조정해야합니다.

4. LN 저온 절 또는 PLL / BSA 코팅 웰에 형광 표지 종양 세포를 시종

참고: 실험 적 대조군으로서, 우리는 (1) PLL 또는 BSA로 미리 코팅된 세포 배양 접시를 사용했으며,(2) 실험당 동일한 LN의 연속적인 섹션(도 2D에서이 세부 사항 참조)을 사용했으며, 여기서 후자는 각 LN 섹션의 세포 외 매트릭스(ECM) 조성에서 국소 적 편차를 최소화할 것이며, 이는 차례로 세포 부착 속도를 지시할 수 있다. 다음 종양 세포 부착 분석의 경우, 고품질 및 순차적 LN 저온 절을 선택합니다.

  1. 냉동 분리부를 PBS로 두 번 부드럽게 세척하고 실온에서 15분 동안 PBS로 재수화합니다.
  2. 37°C에서 30분 동안 2.5% BSA로 저온절에 대한 비특이적 접착을 차단합니다. 면역히스토화학 세척실과 라미나 크래들을 사용하여 세척 및 배양 중에 전체 O.C.T를 제거합니다.
  3. 마른 종이 타월에 여분의 BSA를 빼내고 면봉으로 LN 섹션의 윤곽을 말리고 PAP 펜을 사용하여 섹션을 둘러싸십시오.
  4. 종양 세포 접착 분석의 경우, 100 μL의 세포 현탁액(단계 2.4로부터)을 각 둘러싸인 LN 절편또는 24웰 PLL 코팅 플레이트에 잘 넣고, 종래의 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 1-2시간 동안 가습 챔버 랙에 놓는다.
    참고: 셀 서스펜션의 최종 볼륨은 서로 다른 둘러싸인 LN의 면적에 따라 조정되어야 합니다.
  5. PBS로 부착되지 않은 세포를 4번 부드럽게 씻어냅니다. PBS에서 3.7% 포름알데히드로 남은 부착 형광 세포를 실온에서 15분 동안 고정합니다.

5. 접착제 지수의 수동 정량화

참고 : 점착 지수 (즉, 종양 세포 / LNmm2)는10X 목표를 사용하여 수동으로 종양 세포의 수를 계산하고, 가벼운 현미경 검사법에 의해 쉽게 식별되고 형광 현미경 검사법에 의해 확인되었습니다(그림 2D),여러 독립적 인 분야의 림프절 영역 당 (국립 보건원의 ImageJ / FIJI 소프트웨어를 사용하여 획득).

  1. 10x 목표가 있는 형광 현미경을 사용하여 밝고 적색 형광필드에 해당하는 두 개의 채널로 별도의 TIFF 이미지를 찍습니다(그림2D). 이러한 이미지의 이름을 체계적으로 지정하고 저장합니다.
  2. ImageJ/FIJI를 시작하고 이미지를 열고 배율을 설정합니다. 교정 스케일(예를 들어, 미세 측정 눈금자 1mm)(도2C)을사용해야 합니다.
  3. 마이크로메트릭 눈금자(또는 스테이지 마이크로미터)의 사진을 열고 직선 도구를 선택하고 알려진 거리를 정의하는 직선을 그립니다.
  4. 분석 메뉴에서 배율 설정을선택합니다. 픽셀 거리는 5.3단계에서 그려진 선의 길이(픽셀)를 기준으로 채워집니다. 알려진 거리는 실제 거리(이 경우 밀리미터)와 길이 단위 필드의 길이 단위(이 경우 밀리미터)로 채워집니다.
  5. 전역을 클릭 (이 보정은이 ImageJ / FIJI 세션에서 열린 모든 이미지에 적용) 확인을누릅니다 .
  6. 림프절 영역 정량화: 지팡이 도구를 선택하고 두 번 클릭하여 지팡이 도구 설정을 엽니다. 모드를 8-연결된로 설정합니다. 사진을 클릭하고 사진의 모든 림프절을 선택하고 확인을누를 때까지 허용 오차를 설정합니다. 면적을 측정하려면 분석 열기 | 측정 (CTRL + M). 영역은 이전에 설정된 단위로 표시됩니다.
  7. 종양 세포 정량화: FIJI 소프트웨어에서 광 현미경/형광 이미지를 엽니다. 플러그인 선택 | 분석 | 셀 카운터 | 셀 카운터. 정량화할 사진을 클릭하고 셀 카운터 창에서 초기화 버튼을 누릅니다. 카운터 유형(1-8)을 선택하고 사진의 셀을 클릭합니다. 다음 사진을 초기화하려면 셀 카운터 창에서 재설정 버튼을 누르고 새 사진을 열고 모든 단계를 반복합니다.
    참고: LN 접착 지수는 LN 커버된 영역당 부착 종양 세포의 수로서발현된다(세포/mm2).

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Representative Results

우리는 NDRG4 유전자의 상이한 수준을 발현하는 적색 형광 MCF-7 유방암 세포의 LN 접착 전위를 평가함으로써 분석(NDRG4 양성 및 NDRG4 음성 세포라고 함), 세포 표면에서 베타1-인테그린 클러스터링의 음성변조기(24)를분석하여, 쥐LN 종양의 분획을 검사함으로써 분석한다. 이 프로토콜의 원시 이미지의 예는 그림 2에나와 있습니다. 도 2B에서관찰된 바와 같이, 부착 세포의 형태는 모양으로 반올림되고, 이들은 LN 전체에 걸쳐 이질적으로 분산된다. LN 접착지수는 NDRG4 음성 MCF-7 세포(LN의 877±124 세포/mm2)에서 2배 더 높은 것으로, 해당 NDRG4 양성 MCF-7 세포(LN의 412±76 세포/mm2, p=0.03)에 비해 2배 더 높다.

Figure 1
도 1: 랫트 장의 장의 전담 LN의 격리에 대한 단계별 절차. (a)복부 중간선 피부 절개: 안락사된 랫트는 등쪽 의 자세로 배치하고 30-50 mm 중경계 절개를 하였고, 복부 내장(간, 소장, 소양 및 방광)을 노출시키고, 복부 내장을 덮는 피부로 만들어졌다. (B)소장은 내장 지방 조직에 내장된 쥐 장간막 LNs를 노출시키는 복강에서 부드럽게 뽑아냈다. (C)제거 후 해부 된 위장관의 총 해부학. (D)연결 지방 조직에서 장부절 림프절을 해부. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 랫트 림프절 절편으로의 종양 세포 접착의 대표적인 결과. (a)비표지 세포(하부 사분면)와 비교하여 DiI(C18)라벨링(상부 사분면)의 강도를 나타내는 예시적인 유동 세포분석 분석. (B)세척 단계 후 LN 단면에 부착된 적색 표지 MCF-7 세포의 빛(왼쪽) 및 형광(오른쪽) 현미경 이미지. (C)접착 분석 후, 커버립에 부착 된 세포는 림프절 면적과 형광 현미경을 추정하기 위해 교정 스케일을 사용하여 수동으로 정량화되어 세포 계수를 직접 계산합니다. (D)MCF-7 유방 종양 세포에서 NDRG4 녹다운은 림프절 부착을 증가시킨다. 적색 형광 MCF-7 세포(NDRG4 양성 또는 NDRG4 음성 DiIC18 표지 세포)의 대표적인 이미지는 5 μm 랫트 림프절 절편에 파종한 후 30분. LN 접착제 지수는 LN 커버된 영역당 부착 종양 세포의 수로서 발현된다(세포/mm2). 배율 막대 = 200 μm. *p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

암세포의 림프계 보급은 다양한 복잡한 세포 구동 이벤트를 필요로 한다. 그(것)들은 1 차적인 종양에서 세포 분리 및 세포외 매트릭스 (ECM) 건축의 개조로 시작하고, 센티넬 LN에 도중에 있는 구심성 림프증을 통해 지속적인 화학요법 및 액티브한 이동에 의해 지원됩니다. 암세포가 NN에서 고착하고 살아남는 경우에, 그(것)들은 그밖 이차 기관에 쉽게 퍼질 수 있습니다. 여기에서 우리는 종양 세포와 동결된 LN 사이 특정 접착제 상호 작용의 신속하고 저비용 기능 분석을 위한 쉬운 방법을 기술합니다.

구조적으로, LN은 ECM 섬유의 조밀하고 광범위한 네트워크의 이산 스폰지 와 같은 질량이며, 종종 세포 이동을위한 경로 역할을하고 LN실질27내에서 수용성 인자 (항원 및 / 또는 케모카인)의 신속한 전달을위한 도관으로 "망상 섬유"라고합니다. 분석의 동결된 LN의 보존된 망상 섬유는 haptotactic 신호를 지원하고 시험관내에서 종양 세포 접착을 위한 스캐폴드를 제공한다. 이들 섬유는 주로 콜라겐 I 및 III와 같은 구조적 단백질로 구성되며, 섬유넥틴, 테나신, 라미닌, 비트론ctin 및 헤파란 황산염 프로테오글리칸스28,29와같은 이차 ECM 원소에 의해 이루어진다. 세포 접착에 이어, 이러한 LN 유래 ECM 인자의 대부분은 인테그린 매개 신호를 통해 세포 생존(증식 또는 휴면 상태) 또는 세포 사멸(anoikis)을 결정하는 분자 단서를 제공합니다.

여기서, 우리는 xenogeneic 쥐 LN 및 인간 유방 종양 세포주를 사용하여 분석사를 입증한다. 또는 다른 L 소스를 사용할 수 있습니다. 랫트, 마우스 또는 인간 LN의 조성물은 네이티브 포유류 ECM의 일부인 동일한 구조적 및 기능적 단백질을 포함하며, 모두 세포 부착에 필요한 유사한 결합 부위를보존한다(23). 중요한 것은, 유일한 중요한 단계는 각 LN 단면도의 ECM 조성에 있는 국소 변이를 극소화하기 위하여 실험 당 동일 LN의 연속적인 조각을 사용하는 것입니다, 이는 차례차례로 세포 접착 속도를 지시할 수 있었습니다.

분석법의 단점은 림프 전파의 첫 번째 단계를 되풀이하지 않고 종양 세포의 접착제 강도를 LN에 반영한다는 것입니다. 예를 들어, LN 절편에서 덜 공격적인 유방 종양 세포를 파종, MCF-7(도 2)또는 T47D 종양 세포주(24)와 같이, 시험관 내에서 LN 단면도에 강한 접착을 유도하고, 높은 공격적인 MDA-MB-231 종양 세포에 대해 관찰된 것보다 유사한 수준에서 (데이터는 도시되지 않음). 그러나, 정형면역 MCF-7 이종이식 종양은 센티넬 LN에 도달할 수 없고, MDA-MB-231 종양은 자발적으로그(것)들에게 30에전이되는 동안 잘 알려져 있다. 분명히, MCF-7 세포 LN-전이 형성을 위한 주요 병목 현상은 MCF-7 세포의 무능력이 1 차적인 종양에서 능등하게 탈출하는 것과 같이, LN에 도달하고 부착하기 전에 단계에서 생깁니다. 따라서, 여기서 설명된 분석법의 강도는 LN-전이성 전위와 직접적인 상관관계를 확립하지 는 않지만, 시험관 내에서 보다 현실적인 ECM에서 종양 세포의 접착제 특성을 정량화하는 간단한 방법이다. 냉동 조직을 사용하여, 저온 절은 구조와 조성의 관점에서 LN의 자연적인 복잡성을 나타내며, 합성 기술, 특히 정제 된 ECM 단백질을 사용하여 재현하는 것은 불가능합니다.

상기 방법의 추가적인 제한은 (1) LN에 의해 분비되는 인자의 화학적 전위의 평가를 허용하지 않으며 (2) LN 절편에 대한 세포 특이적 접착이 ECM 단백질, 세포 또는 LN 섹션에 존재하는 임의의 다른 구조에 우선적으로 결합한 결과인지에 대해 알리지 않는다. 그러나 이 방법은 관련성이 있을 수 있으며 특정 응용 프로그램에 대해 진지하게 고려해야 한다고 생각했지만 이 특정 원고의 범위를 벗어났습니다. 예를 들면, 최근 연구 결과에서는, 우리는 유방 종양에 있는 LN 전이의 기계론적인 biomarker로 N-Myc 다운스트림 통제유전자 4 (NDGR4)를 확인했습니다24. 기계적으로, NDRG4 발현이 결여된 종양 세포는 유방 종양 세포의 선두 가장자리에서 β1-인테그린 수용체의 조립을 선호함으로써 LN의 저온절에 대한 접착력을 증가시다. 더욱이, 정제된 ECM 단백질로 코팅된 접시와 같은 추가적인 대조군을 사용하여, 우리는 LN 단면도에 차동 부착이 vitronectin24와의선택적인 협회의 결과이다는 것을 발견했습니다.

마지막으로, 이 방법은 LNs 단면도에 제한되지 않으며 비장 또는 폐의 저온 절과 같은 다른 살아있는 기관에 세포 부착을 평가하기 위하여 설치될 수 있었다는 것을 주목할 필요가 있습니다. 전이성 세포는 생체외에서 상이한 장기의 동결된 단면에서 유기성 및 접착제 강도의 측정을 나타내며, 장기 특이적 암 보급을 예측하는 데 유용한 의미가 될 수 있다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

로사나 데 리마 파가노 박사와 아나 캐롤라이나 피네이로 캄포스 박사에게 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 보조금에 의해 지원되었다: FAPESP - 상파울루 연구 재단 (2016/07463-4) 암 연구를위한 루드비히 연구소 (LICR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Tubes Corning 352096
2-propanol Merck 109634
Benchtop Laminar Flow Esco Cell Culture
Bin for Disc Leica 14020139126
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647-100
Cell culture flask T-25 cm2 Corning 430372
Cryostat Leica CM1860 UV
Cryostat-Brush with magnet Leica 14018340426
DiIC18 Cell Traker Dye Molecular Probes V-22885
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 12657-029
Fluorescence microscope Nikon Eclipse 80
Forma Series II CO2 incubator Thermo Scientific
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
High Profile Disposable Razor Leica 14035838926
Incubation Cube (IHC) KASVI K560030
Inverted microscope Olympus CKX31
Isofluran 100 mL Cristália
Liquid Bloquer Super Pap Pen Abcam, Life Science Reagents ab2601
Optimal Cutting Temperature "OCT" compound Sakura 4583
Phosphate-buffered Saline (PBS) Life Technologies 70011-044
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
RPMI Gibco 31800-022
Serological Pipettes 1 mL Jet Biofil GSP010001
Serological Pipettes 10 mL Jet Biofil GSP010010
Serological Pipettes 2 mL Jet Biofil GSP010002
Serological Pipettes 5 mL Jet Biofil GSP010005
Serological Pipettes 50 mL Jet Biofil GSP010050
Serological Pipettor Easypet 3 Eppendorf
Tissue-Tek cryomold Sakura 4557
Trypan Blue 0.4% Invitrogen T10282
Trypsin Instituto Adolfo Lutz ATV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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