हेलिएथस एन्युस में बड़े पैमाने पर थर्मल इमेजिंग स्क्रीनिंग द्वारा पौधों के वाष्पीकरण के उपन्यास नियामकों की पहचान

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Biology

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Summary

हम एक यौगिक पुस्तकालय की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग द्वारा पत्तेदार वाष्पीकरण के मॉड्यूलर की पहचान करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं ।

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Guo, K., Mellinger, P., Doan, V., Allen, J., Pringle, R. N., Jammes, F. Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus. J. Vis. Exp. (155), e60535, doi:10.3791/60535 (2020).

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Abstract

बायोटिक और अजैविक तनावों के लिए पौधे अनुकूलन विभिन्न कारकों द्वारा नियंत्रित होते हैं, जिनमें से पानी की कमी या रोगजनकों के जवाब में स्टोमटाल एपर्चर का विनियमन एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसलिए स्टॉमटाल आंदोलन को विनियमित करने वाले छोटे अणुओं की पहचान करने से शारीरिक आधार को समझने में योगदान मिल सकता है जिसके द्वारा पौधे अपने पर्यावरण के अनुकूल होते हैं । बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग दृष्टिकोण है कि स्टोमटाल आंदोलन के नियामकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है संभावित सीमाएं हैं: कुछ abscisic एसिड (ABA) हार्मोन संकेत मार्ग पर भारी भरोसा करते हैं, इसलिए ABA स्वतंत्र तंत्र को छोड़कर, जबकि दूसरों को अप्रत्यक्ष, दीर्घकालिक शारीरिक प्रभाव जैसे संयंत्र के विकास और विकास के अवलोकन पर भरोसा करते हैं । यहां प्रस्तुत स्क्रीनिंग विधि थर्मल इमेजिंग द्वारा उनके वाष्पीकरण के प्रत्यक्ष मात्रा के साथ मिलकर रसायनों की एक पुस्तकालय के साथ पौधों के बड़े पैमाने पर उपचार की अनुमति देता है । चूंकि पत्तियों की सतह ठंडा होने के परिणामस्वरूप वाष्पीकरण के माध्यम से पानी का वाष्पीकरण होता है, थर्मल इमेजिंग समय के साथ स्टोमेटल आचरण में परिवर्तन की जांच करने के लिए एक गैर-आक्रामक दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में, हेलिनथस एन्युअलस रोपण को हाइड्रोपोनिक रूप से उगाया जाता है और फिर रूट फीडिंग द्वारा इलाज किया जाता है, जिसमें प्राथमिक जड़ को काट कर परीक्षण किए जा रहे रसायन में डुबोया जाता है। थर्मल इमेजिंग के बाद समय के साथ कोटाइलेडरी तापमान परिवर्तन के सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद जैव सक्रिय अणुओं की पहचान के लिए अनुमति देता है स्टोमेटल एपर्चर । हमारे प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट प्रयोगों से पता चलता है कि एक रसायन कट रूट से 10 मिनट के भीतर सूरजमुखी अंकुर के कोटाइलेडन तक ले जाया जा सकता है । इसके अलावा, जब पौधों को एबीए के साथ सकारात्मक नियंत्रण के रूप में माना जाता है, तो पत्तियों की सतह के तापमान में वृद्धि का पता मिनटों के भीतर लगाया जा सकता है। इस प्रकार हमारी विधि स्टॉमेंटल एपर्चर को विनियमित करने वाले उपन्यास अणुओं की कुशल और तेजी से पहचान की अनुमति देती है।

Introduction

पौधों में तनाव सहनशीलता एक पॉलीजेनिक विशेषता है जो विभिन्न आणविक, सेलुलर, विकासात्मक और शारीरिक विशेषताओं और तंत्र1से प्रभावित होती है। एक उतार चढ़ाव वाले वातावरण में पौधों को पर्याप्त पानी बनाए रखते हुए कार्बन की फोटोसिंथेटिक मांग को संतुलित करने और रोगजनक आक्रमण को रोकनेकेलिए अपने स्टोमटाल आंदोलनों को लगातार मिलाना चाहिए । हालांकि, तंत्र जिसके द्वारा इन व्यापार बंद "निर्णय" किया जाता है खराब3समझ रहे हैं . पौधों में जैव सक्रिय अणुओं का परिचय उनके शरीर विज्ञान को मिलाना और विनियमन के नए तंत्र की जांच में मदद कर सकते हैं ।

छोटे अणुओं की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग एक प्रभावी रणनीति है जिसका उपयोग कैंसर रोधी दवा खोज और औषधीय परखों में किया जाता है ताकि कम समय मेंसैकड़ोंसे हजारों अणुओं के शारीरिक प्रभावों का परीक्षण किया जा सके संयंत्र जीव विज्ञान में, उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग ने सिंथेटिक अणु पायराबैक्टिन6की पहचान में उदाहरण के लिए अपनी प्रभावशीलता दिखाई है, साथ ही एबीएससीआईसी एसिड (एबीए)7,8के लंबे समय से मांग वाले रिसेप्टर की खोज की है। तब से, ABA रिसेप्टर्स के agonists और विरोधी, और छोटे अणुओं ABA-inducible रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति को मिलाना करने में सक्षम9,10,11,12,13,14,15की पहचान की गई है । उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग वर्तमान में छोटे यौगिकों की पहचान करने के लिए उपलब्ध दृष्टिकोण जो स्टोमेटल एपर्चर को मिला सकते हैं कुछ कमियां हैं: (i) एबीए सिग्नलिंग मार्ग के आसपास घूमने वाले प्रोटोकॉल उपन्यास एबीए-स्वतंत्र तंत्र की पहचान को रोक सकते हैं, और (ii) जैव सक्रिय छोटे अणुओं की पहचान के लिए उपयोग की जाने वाली वीवो रणनीतियों में मुख्य रूप से अंकुरण या अंकुर वृद्धि पर उनके शारीरिक प्रभावों पर भरोसा करते हैं, न कि पौधे के नियमन पर।

इसके अतिरिक्त, जबकि जैव सक्रिय अणुओं के साथ पौधों के इलाज के कई तरीके हैं, उनमें से अधिकांश स्टॉमटाल आंदोलन के बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हैं। संक्षेप में, तीन सबसे आम तकनीकों छिड़काव या सूई, जड़ प्रणाली के उपचार, और जड़ सिंचाई द्वारा पत्तेदार आवेदन कर रहे हैं । पत्ते की सतह पर बूंदों की उपस्थिति बड़े पैमाने पर डेटा संग्रह में हस्तक्षेप के बाद से स्टॉमीटल एपर्चर को मापने के लिए सबसे आम और तेजी से पद्धतियों के साथ फोलियार एप्लिकेशन संगत नहीं है। रूट सिंचाई की प्रमुख सीमाएं बड़े नमूना मात्रा आवश्यकताएं, राइजोस्फीयर में तत्वों द्वारा यौगिकों की संभावित अवधारण, और सक्रिय जड़ तेज पर निर्भरता हैं।

यहां, हम संयंत्र के वाष्पीकरण को विनियमित करने वाले नए यौगिकों की पहचान करने के लिए एक बड़े पैमाने पर विधि प्रस्तुत करते हैं जिसमें जरूरी नहीं कि ABA-या ज्ञात सूखा-उत्तरदायी तंत्र शामिल हो और पौधों के कुशल और विश्वसनीय उपचार के लिए अनुमति देता है । इस प्रणाली में, हेलिएथस एन्युअलस पौधों को एक रूट फीडिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके इलाज किया जाता है जिसमें हाइड्रोपोनिक रूप से उगाए गए रोपण की प्राथमिक जड़ को काटना और कट साइट को नमूना समाधान में डुबोना शामिल है। एक बार इलाज के बाद, पौधों के वाष्पीकरण पर प्रत्येक यौगिक के प्रभाव को अवरक्त थर्मल इमेजिंग कैमरे का उपयोग करके मापा जाता है। चूंकि पत्ती की सतह के तापमान का एक प्रमुख निर्धारक पत्ती से वाष्पीकरण की दर है, थर्मल इमेजिंग डेटा सीधे स्टोमटाल चालन से सहसंबद्ध हो सकता है। रासायनिक उपचार के बाद पत्तेदार तापमान में सापेक्ष परिवर्तन इस प्रकार पौधे के वाष्पीकरण की मात्रा निर्धारित करने का प्रत्यक्ष साधन प्रदान करता है।

एच annuus दुनिया में पांच सबसे बड़ी तिलहन फसलों में से एक है16 और इस संयंत्र पर सीधे की गई खोजों प्रौद्योगिकी के भविष्य के हस्तांतरण की सुविधा हो सकती है । इसके अलावा, एच एन्युस रोपण में बड़े और फ्लैट कोटाइलेडन होते हैं, साथ ही एक मोटी प्राथमिक जड़ होती है, जो इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए आदर्श थी। हालांकि, इस विधि को आसानी से अन्य पौधों और विभिन्न यौगिकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग स्टॉमेंटल क्लोजर को ट्रिगर करने या स्टोमटाल ओपनिंग को बढ़ावा देने में सक्षम अणुओं की प्रभावी पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें पर्यावरण के लिए स्टोमटाल आचरण और पौधे अनुकूलन को विनियमित करने वाले संकेतों को समझने के लिए प्रमुख निहितार्थ हैं तनाव.

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Protocol

1. पौधों को उगाना

  1. मानक 10 इंच x 20 इंच (254 मिमी x 501 मिमी) पौधे ट्रे में 4 सेमी मोटी परत डालकर कोई छेद नहीं है।
  2. पौधे की ट्रे में बीज धारकों (सामग्री की तालिकादेखें) 2 सेमी अलग रखें।
  3. वर्मीकुलाइट से बीज धारकों को भरें।
  4. प्रत्येक बीज धारक में अपने नुकीले अंत के साथ एक सूरजमुखी बीज रखें, बीज का आधा हिस्सा उजागर रहता है।
    नोट: एक सूरजमुखी का बीज विषम है और जहां से मूलांक उभरेगा वह नीचे की ओर इंगित करना चाहिए। उचित बीज प्लेसमेंट महत्वपूर्ण है क्योंकि बीज धारकों के भीतर जड़ और तना का पुन: अभिविन्यास संभव नहीं है। बीज के गोल अंत बीज धारक के शीर्ष पिछले विस्तार करना चाहिए ।
  5. एक बार बीज जगह में हैं, उन्हें ठीक वर्मीकुलाइट की एक अतिरिक्त 2 सेमी मोटी परत के साथ कवर। ऊपर से धुंध करके पानी। सतह एक घंटे के बाद गीली रहनी चाहिए। अगर ऐसा है तो ट्रे को ढक्कन से ढक दें।
  6. एक विकास कक्ष या ग्रीनहाउस में पौधे उगाएं। अनुशंसित स्थितियां 140 माइक्रोनमोल फोटॉन्सएम-2'एस-1 की हल्की तीव्रता और 22 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे की रोशनी और 5 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 9 घंटे अंधेरे की प्रकाश तीव्रता हैं।
    नोट: पानी आवश्यक नहीं होना चाहिए जब तक कि सतह सूखी दिख न जाए।

2. हाइड्रोपोनिक सिस्टम की स्थापना

  1. बढ़ते पौधों के लिए उपयुक्त उचित आकार के कंटेनर का पता लगाएं। कंटेनर के आकार को विकास कक्ष या ग्रीनहाउस में उपलब्ध स्थान के अनुकूल होना चाहिए। 15 सेमी की न्यूनतम गहराई की सिफारिश की जाती है।
  2. कंटेनर को आसुत पानी से भरें और निर्माता द्वारा इंगित सामान्य हाइड्रोपोनिक्स उर्वरक जोड़ें। परिणामस्वरूप हाइड्रोपोनिक समाधान को वातित किया जाना चाहिए और निरंतर आंदोलन में, जिसे हवा और पानी पंपों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।
  3. हाइड्रोपोनिक्स फ्लोटर्स तैयार करें।
    1. कंटेनर के आयामों के लिए 2 सेमी मोटी विस्तारित पॉलीस्टीरिन फोम (सामग्री की तालिकादेखें) की एक शीट काटें। शैवाल के विकास को सीमित करने के लिए शीट को कंटेनर की अधिकांश सतह को कवर करना चाहिए। एक लकड़ी जलने वाला उपकरण पॉलीस्टीरिन फोम काटने के लिए प्रभावी है और इस प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त बहुमुखी है।
      सावधानी: पॉलीस्टीरिन फोम के गर्म काटने के दौरान जारी धुएं या वाष्प गंभीर स्वास्थ्य खतरे हैं। उचित श्वसन सुरक्षा का उपयोग करें। उपयोगकर्ता एक धुएं के हुड के नीचे फोम को काटकर वेंटिलेशन आवश्यकताओं को भी पूरा कर सकते हैं।
    2. लकड़ी के जलने वाले उपकरण का उपयोग करके पॉलीस्टीरिन फोमशीट में छेद (व्यास में 1-2 सेमी) बनाएं। दो छेद के केंद्रों के बीच की दूरी को प्रयोग की जरूरतों के लिए समायोजित किया जा सकता है। हालांकि, 2.5 सेमी की न्यूनतम दूरी की सिफारिश की जाती है।

3. हाइड्रोपोनिक्स और पौधों के विकास के लिए रोपण का हस्तांतरण

  1. धीरे-धीरे वर्मीक्यूलाइट से 5 दिन पुरानी रोपण को बाहर निकालें और तुरंत 30 किमी के लिए पानी से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें। इस कदम से अतिरिक्त वर्मीकुलाइट दूर हो जाएगी और शेष पेरिकार्प्स नरम हो जाएंगे। उभरते प्राथमिक जड़ दिखाई देना चाहिए।
  2. कोटाइलेडन के भविष्य के विस्तार को अनुकूलित करने के लिए यदि आवश्यक हो तो पेरिकार्प दीवारों को हाथ से हटा दें।
  3. बीज धारकों के भीतर रोपण को पॉलीस्टीरिन फोम फ्लोटर में स्थानांतरित करें। पौधों को 140 माइक्रोमोल फोटॉन्सएम-2'एस-1,65% की सापेक्ष आर्द्रता और 22 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे की रोशनी की फोटोअवधि और 2 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 9 घंटे अंधेरा होता है।

4. उपचार से पहले तैयारी

नोट: यह प्रक्रिया ट्रिपलेट में एक छोटे यौगिक पुस्तकालय से 20 रसायनों के परीक्षण के लिए है, 10 mM एमईएस-KOH (पीएच = 6.2) और 10 mM एमईएस-KOH (पीएच = 6.2) में 10 0 mM एमईएस-कोएच (पीएच = 6.2) जिसमें 1% (v/v) डाइमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल हैं।

  1. सुनिश्चित करें कि उपचार के लिए पर्याप्त पौधे तैयार हैं। उपचार के लिए तैयार पौधों को पूरी तरह से सामने आने के लिए पर्याप्त परिपक्व होना चाहिए, लेकिन काफी युवा है कि पार्श्व जड़ प्रसार कम है । एक मानक स्क्रीनिंग करने के लिए, ऐसे 69 पौधों की आवश्यकता है।
  2. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से छोटे यौगिकों वाली 96-अच्छी प्लेट निकालें। कमरे के तापमान पर गल।
  3. 1 एम एमईएस-कोह बफर के 80 mL को 1 एम कोएच के साथ 6.2 के पीएच में समायोजित तैयार करें।
  4. लेबल कैप-कम 2 mL माइक्रोट्यूब। 1% (v/v) DMSO युक्त नकारात्मक नियंत्रण उपचार (10 एमएम एमईएस-कोएच (पीएच = 6.2) के लिए कम से कम छह ट्यूब तैयार करें। ABA उपचार के लिए तीन ट्यूबों का उपयोग करें (10 mM एमईएस में 100 माइक्रोएम ABA-KOH पीएच = 6.2), सकारात्मक नियंत्रण)। त्रिमूर्ति में 20 रसायनों के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए शेष 60 ट्यूबों का उपयोग करें।
  5. प्रत्येक रसायन (डीएमएसओ में 10 एमएम) के 10 माइक्रोन को तीन उचित लेबल वाली ट्यूबों में से प्रत्येक में स्थानांतरित करें। 10 एमएम एबीए के पिपेट 10 माइक्रोन डीएमएसओ में तीन ट्यूबों में भंग और डीएमएसओ के 10 माइक्रोन छह नियंत्रण ट्यूबों में।
    सावधानी: स्वभाव से, कुछ यौगिकों गंभीर स्वास्थ्य प्रभाव पैदा कर सकते है और उपयोगकर्ताओं को उचित सुरक्षात्मक उपाय करना चाहिए ।
  6. 69 ट्यूबों में से प्रत्येक में 10 एमएम एमईएस-कोएच (पीएच = 6.2) के 990 माइक्रोन जोड़ें। एमईएस बफर के साथ रासायनिक मिश्रण करने के लिए पर्याप्त बल के साथ एमईएस बफर को बांटें, लेकिन बहुत सावधान रहें कि इतने बल का उपयोग न करें कि रसायन और एमईएस बफर ट्यूब से बाहर निकलना। वैकल्पिक रूप से, कम गति पर भंवर।

5. थर्मल इमेजिंग कैमरा स्थापित करें

  1. एक कॉपी स्टैंड पर थर्मल इमेजिंग कैमरा माउंट। सभी केबल को लैपटॉप से कनेक्ट करें।
    नोट: रिकॉर्डिंग तापमान (20 डिग्री सेल्सियस से 25 डिग्री सेल्सियस), आर्द्रता (50% से 70%) की शर्तों के तहत किया जाता है और पौधों को उगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रकाश गुणवत्ता (110 से 140 μmol फोटॉन·एम-2·एस-1)समान है।
  2. कैमरे को चालू करें तो लैपटॉप और थर्मल इमेजिंग एनालिसिस सॉफ्टवेयर खोलें।
    नोट: रिकॉर्डिंग के लिए बाद के निर्देश उपयोग किए गए किसी विशिष्ट सॉफ़्टवेयर पर लागू होते हैं (सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. रिकॉर्डिंग सेटिंग्स को समायोजित करें।
    1. केंद्रीय खिड़की के शीर्ष पर रिकॉर्ड लाल बटन पर माउस। एक ड्रॉपडाउन मेनू दिखाई देगा। रिंच आइकन रिकॉर्ड सेटिंग्सपर क्लिक करें ।
    2. उपयुक्त रिकॉर्ड मोड और विकल्पों का चयन करें। रिकॉर्ड समय-समय पर विकल्प, प्रति मिनट एक फ्रेम पर कब्जा कर लिया और एक मैनुअल स्टॉप का उपयोग किया जा सकता है। फाइल डेस्टिनेशन पर ध्यान दें जहां सॉफ्टवेयर वीडियो सेव करेगा। रिकॉर्ड सेटिंग विंडो बंद करें।

6. पौधे तैयार करने और उपचार

  1. ट्यूब रैक में रसायनयुक्त कैप-लेस ट्यूब रखें। वैकल्पिक रूप से, एक पॉलीस्टीरिन फोम शीट को काटकर लकड़ी के जलने वाले उपकरण के साथ पोक किया जा सकता है जैसा कि एक कस्टम ट्यूब रैक बनाने के लिए चरण 2.3 में वर्णित है। प्रत्येक छेद का व्यास कैपलेस ट्यूबों के बाहरी व्यास के बहुत करीब होना चाहिए ताकि उन्हें मजबूती से पकड़ सके।
    नोट: कैमरे के दृश्य का क्षेत्र एक सीमित कारक है जिसे इस बात पर निर्णय लेते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कैप-लेस ट्यूबों को कैसे रखा जाएगा।
  2. समान रूप से सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण ट्यूबों के साथ-साथ रैक में प्रायोगिक ट्यूबों को स्थिति से संबंधित पूर्वाग्रह17के लिए खाते में वितरित करें।
  3. हाइड्रोपोनेली रूप से उगाए गए पौधों के बगल में निम्नलिखित सामग्री तैयार करें: माइक्रोडिसेक्शन कैंची, पानी के साथ एक उथले पकवान, नाजुक कार्य पोंछे, विभिन्न रसायनों वाले 69 कैप-कम ट्यूब।
  4. प्रत्येक पौधे का इलाज करने के लिए निम्नलिखित चरणों को दोहराएं। सूरजमुखी का अंकुर हमेशा बीज धारक में रहेगा।
    1. ध्यान से बीज धारक उठा और तेजी से पानी युक्त उथले पकवान में जड़ डुबकी ।
    2. कैविटेशन को रोकने के लिए प्राथमिक जड़ पानी के नीचे काटें। कटौती बीज धारक के सबसे बेसल अंत के नीचे 0.8-1 सेमी होनी चाहिए।
    3. हौसले से काटे गए पौधे को रसायनों से युक्त ट्यूबों में से एक में सेट करें।
    4. यदि कोटाइलेडन पर पानी की कोई बूंदें हैं, तो धीरे-धीरे उन्हें नाजुक कार्य पोंछने के साथ सूखना।
      नोट: ये चार चरण काइनेटिक्स अध्ययन में विसंगतियों को रोकने के लिए जितनी जल्दी हो सके (10 min या उससे कम) किया जाना चाहिए।
  5. थर्मल इमेजिंग कैमरे के नीचे पौधों को स्थानांतरित करें और सुनिश्चित करें कि सभी पौधे कैमरे के दृश्य के क्षेत्र के भीतर हैं। आवश्यक के रूप में कैमरा ऊंचाई और रैक की स्थिति समायोजित करें।

7. रिकॉर्डिंग

  1. कैमरे को Ctrl + Alt + Aदबाकर कोटाइलेडन की सतह पर केंद्रित करें ।
  2. लाल बटन पर माउस और रिकॉर्ड एक फिल्म विकल्प पर क्लिक करें। रिकॉर्डिंग की पुष्टि करने वाली एक नई खिड़की खुलनी चाहिए।
  3. रिकॉर्डिंग 1-2 घंटे बाद बंद कर दें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

8. डेटा संग्रह

  1. फाइल पर जाएं । खुला । सही के लिए ब्राउज़ करें । एसईक्यू फाइल करके खोलें।
  2. फिल्म खेलना बंद करो।
  3. मुख्य खिड़की के बाईं ओर, एक माप कर्सर आरओआई (3x3 पिक्सल) आइकन जोड़ने पर क्लिक करें। आरओआई ब्याज के क्षेत्र के लिए खड़ा है।
  4. पहले पौधे के कोटाइलेडन के केंद्र पर माउस और एक बार बाएं क्लिक करें। कर्सर 1 अब जगह में है। प्रक्रिया को दोहराकर पहले पौधे के दूसरे कोटाइलेडन को लेबल करें। लेबल के आदेश पर ध्यान दिया जाना चाहिए।
  5. प्रक्रिया दोहराएं। सभी पौधों को दो कर्सर के साथ लेबल किया जाना चाहिए।
  6. एडिट आरओआई आइकन पर क्लिक करें। मुख्य खिड़की में, बाएं क्लिक करें और शीर्ष बाएं कोने पर पकड़ और सभी ROIs का चयन करने के लिए नीचे दाएं कोने में स्क्रॉल करें।
  7. सांख्यिकीय दर्शक आइकन पर माउस और शंख प्लॉटका चयन करें । एक नई खिड़की खुलेगी।
  8. फिल्म चलाते हैं। एक ग्राफ डेटा से भर जाएगा।
  9. इस विंडो में नया मेन्यू खोलने के लिए टॉप राइट कॉर्नर में डबल एरो पर क्लिक करें।
  10. सेव आइकन पर क्लिक करें। साजिश (.csv) में एक्स और वाई मूल्यों केरूप में सहेजें । एक बार डेटा निर्यात होने के बाद सॉफ्टवेयर बंद कर लें।

9. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल) का उपयोग करके .CSv फ़ाइल खोलें। ध्यान दें कि तीन पहले कॉलम (ए से सी) फ्रेम नंबर, पूर्ण समय और सापेक्ष समय के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। शेष कॉलम समय के साथ प्रत्येक आरओआई का तापमान देते हैं।
  2. उपयोग किए जाने वाले सांख्यिकीय उपकरण की प्रकृति पर निर्णय लें; यह निर्णय प्रायोगिक डिजाइन सहित विभिन्न कारकों पर निर्भर करता है।
    नोट: हमारे उदाहरण में, जनसंख्या मतलब और जनसंख्या मानक विचलन के आधार पर प्रत्येक नमूने के लिए एक मानक स्कोर, या जेड-स्कोर की गणना की जाती है। प्रत्येक नमूने के लिए, एक पी-वैल्यू की गणना जेड-स्कोर से की जाती है। यह विधि सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों की पुष्टि के साथ-साथ नए यौगिकों की पहचान को आगे परीक्षण करने की अनुमति देती है।

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Representative Results

लाल रंग एरिथ्रोसिन बी (0.8 केडीए) का उपयोग करने वाला एक प्रयोग रसायनों की क्षमता को दर्शाता है कि 10 मिनट के भीतर सूरजमुखी के अंकुर के कोटाइलेडन में कट रूट के माध्यम से अवशोषित हो सकता है(चित्रा 1)।

जब पौधों को एबीए के साथ इलाज किया जाता है, तो मिनटों के भीतर सूरजमुखी कोटाइलेडन में पत्तियों के तापमान में वृद्धि का पता लगाया जाता है। पत्ती के तापमान में यह वृद्धि स्टोमटाल अपर्चर और स्टोमटाल आचरण में कमी के साथ जुड़ी हुई है। बढ़ी हुई पत्तेदार तापमान 10 माइक्रोन एबीए (पी-वैल्यू = 0.02) और 20 मिन के साथ 5 माइक्रोन एबीए (पी-वैल्यू = 0.003)(चित्रा 2)के साथ उपचार के बाद 15 न्यूनतम देखा जाता है। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि थर्मल इमेजिंग द्वारा पत्ती के तापमान के मापस्टोटल एपर्चर और संचालन को मापने के लिए एक अच्छा प्रॉक्सी है ।

चित्रा 3 सकारात्मक (100 माइक्रोएम एबीए) और नकारात्मक नियंत्रण के साथ नेटप्रोड संग्रह से 20 रसायनों के सबसेट का उपयोग करअवधारणा प्रयोग का एक सबूत दिखाता है। इस प्रतिनिधि प्रयोग में, एक मानक-स्कोर-आधारित सांख्यिकीय उपचार स्टोमेटल बंद करने को बढ़ावा देने वाले रसायनों की पहचान की अनुमति देता है या, जबकि परख को उस विशिष्ट उद्देश्य के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, स्टॉमेटल खोलने को बढ़ावा देने वाले रसायन। दिए गए उदाहरण में, मानक स्कोर का एक हीट-मैप विज़ुअलाइज़ेशन संभावित उम्मीदवारों के रूप में रसायनों की तेजी से पहचान #02 और #16 की अनुमति देता है।

चित्र4 कार्यप्रवाह के महत्वपूर्ण चरणों का सारांश देता है।

Figure 1
चित्रा 1: कट रूट फीडिंग दृष्टिकोण की प्रभावशीलता। (क)10 mM एमईएस-कोह (पीएच = 6.2) में एरिथ्रोसिन बी के साथ 1 घंटे के लिए खिलाया गया एक अंकुर नियंत्रण (बाएं छवि) की तुलना में लाल (दाएं छवि) दिख रहा है। छवियों को प्राकृतिक पौधे के पिगमेंट को हटाने के लिए पूर्ण इथेनॉल में रात भर ऊष्मायन के बाद कट रूट फीडिंग के बाद लिया गया था। बार = 10 मिमी .(बी)समय के साथ कोटाइलेडन में एरिथ्रोसिन बी का संचय। एरिथ्रोसिन बी कोडाइटन 8 मिन (पी-वैल्यू = 0.032) से पौधे के अर्क में स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा डाइ में कट-रूट सूरजमुखी रोपण के हस्तांतरण के बाद पता लगाया जा सकता है। त्रुटि बार एसईएम का संकेत देते हैं। * पी-वैल्यू एंड एलटी; 0.05 (एन = 3) को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रयोगात्मक डिजाइन की संवेदनशीलता दिखाने के लिए पत्ती के तापमान, स्टोमटाल अपर्चर और आचरण के बीच संबंध। (A)प्रतिनिधि छवि थर्मल इमेजिंग द्वारा कल्पना 30 मिन के बाद 100 माइक्रोएम एबीए-इलाज (+एबीए) और गैर-उपचारित (नियंत्रण) सूरजमुखी रोपण के बीच पत्ती के तापमान में अंतर दिखा रही है। (ख)बाएं: 30 वर्ष के लिए 100 माइक्रोएम एबीए के साथ इलाज किए गए पौधों में नियंत्रण संयंत्रों की तुलना में तापमान में वृद्धि दिखाई देती है (* पी-वैल्यू & 0.01), एन = 3 को इंगित करता है। सही: एक ही पौधों से एपिडर्मल छिलके पर स्टोमैटल एपर्चर की माप स्टॉमैटल अपर्चर (चौड़ाई/लंबाई) (* पी-वैल्यू एंड एलटी; 0.01, एन = 3, प्रति प्लांट स्टोमा टापू की संख्या को इंगित करता है । (ग)पत्ती के पोरोमीटर के साथ मापा गया पत्ती आचरण और पत्ती के तापमान मापन के साथ मिलकर बताता है कि पत्ती की सतह के तापमान और स्टोमटाल आचरण के बीच एक मजबूत सहसंबंध (पियर्सन का गुणांक = -0.89, एन = 6) है। 30 न्यूनतम के लिए 100 माइक्रोन एबीए के साथ इलाज किए गए पौधे नियंत्रण संयंत्रों (एन = 6) की तुलना में तापमान में वृद्धि और कमी दिखाते हैं। (डी)खुराक-प्रतिक्रिया अध्ययन से पता चलता है कि 20 न्यूनतम उपचार के बाद एबीए सांद्रता के साथ इलाज किए गए पौधों में पत्तियों का तापमान कम हो गया है (पी-वैल्यू = 0.0037, एन = 3)। त्रुटि बार एसईएम का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: 20 रासायनिक यौगिकों की स्क्रीनिंग से प्रतिनिधि परिणाम । (A)जेड-स्कोर का हीटमैप ट्रिपलिकेट्स में परीक्षण किए गए 20 यौगिकों के लिए संयंत्र प्रतिक्रियाओं को दर्शाती है। गहरे लाल और गहरे नीले रंग के विश्वास स्तर और क्रमशः स्टोमटाल बंद करने और खोलने के लिए 99% का संकेत मिलता है। छह पौधों का इलाज डीएमएसओ (नियंत्रण) के साथ किया गया, तीन का इलाज १०० माइक्रोएम एबीए से किया गया और अन्य पौधों का त्रिपाल में १०० माइक्रोन केमिकल से इलाज किया गया । यौगिक 16 (सी #16) का जवाब देने वाले पौधे एबीए-इलाज संयंत्रों में देखे गए एक स्टोमटाल बंद होते हैं। कंपाउंड 02 (सी#02) के साथ इलाज किए गए तीन में से दो पौधे स्टोमेटल ओपनिंग में काफी बढ़ोतरी दिखाते हैं । (ख)यौगिकों 02 और 16 के लिए पौधों की प्रतिक्रिया के काइनेटिक्स । समय के साथ तापमान में औसत परिवर्तन नियंत्रण उपचार (एन = 6), 100 माइक्रोएम एबीए (एन = 3) या प्रत्येक यौगिक के 100 माइक्रोन (एन = 3) का जवाब देने वाले पौधों के लिए दिखाए जाते हैं। त्रुटि सलाखों से संकेत मिलता है SEM. तापमान में परिवर्तन लगातार ABA उपचार के 10 min के बाद सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है (पी मूल्य = 0.026, एन = 3), सी #16 के साथ उपचार के 15 min (पी मूल्य = 0.030, एन = 3) और सी #02 के 71 मिन (पी-मूल्य = 0.044, एन = 3) नियंत्रण की तुलना में. विकास कक्ष में परिवेश के तापमान के गतिशील नियंत्रण के कारण सभी नमूनों द्वारा साझा उतार-चढ़ाव पृष्ठभूमि शोर है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: स्क्रीनिंग कार्यप्रवाह का सारांश । ध्यान दें कि छवियां महत्वपूर्ण चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं और एक दूसरे से स्वतंत्र हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

किसी दिए गए दिन पर परीक्षण किए जा सकने वाले यौगिकों की संख्या ज्यादातर पौधों को विकसित करने और स्क्रीन करने के लिए उपलब्ध पर्यावरण की दृष्टि से नियंत्रित स्थान के साथ-साथ (ii) उन व्यक्तियों की संख्या पर निर्भर करती है जो प्रोटोकॉल के चरण 6 में शामिल हो सकते हैं। हम सांख्यिकीय उपचार के बाद परिणामों की व्याख्या को मजबूत करने के लिए तीन प्रयोगात्मक प्रतिकृतियों के उपयोग की सलाह देते हैं। एक ठेठ दिन में, एक से दो व्यक्ति सुबह, दोपहर और दोपहर में [60 रसायन + 6 नकारात्मक (डीएमएसओ) नियंत्रण + 3 सकारात्मक (एबीए) नियंत्रण + 3 सकारात्मक (एबीए) नियंत्रण के लिए परीक्षण करके बिना कठिनाई के ट्रिपलिकेट्स में 60 यौगिकों को स्क्रीन कर सकते हैं।

यह विधि पूरी तरह से विकसित कोटाइलेडन के साथ स्वस्थ रोपण पर निर्भर करती है। जैसा कि इमेजिंग ऊपर से होती है, एक आदर्श अंकुर को हाइपोकोटाइल और कोटाइलेडरी ब्लेड के बीच 90 डिग्री का कोण दिखाना चाहिए ताकि जितना संभव हो उतना जानकारी एकत्र की जा सके। यह कोण मुख्य रूप से प्रकाश द्वारा विनियमित किया जाता है और इसलिए बढ़ती स्थितियों को समायोजित करके अनुकूलित किया जाना चाहिए। हमारे परिणाम बताते हैं कि कोटाइलेडन तक पहुंचने के लिए एक रसायन के लिए लगभग 10 मिनट लगते हैं और एबीए जैसे रसायन का जवाब देने में कुछ और मिनट लगते हैं। यह अवलोकन प्रोटोकॉल में कदम 6.4 सबसे अधिक समय-संवेदनशील कदम बनाता है। इसलिए पौधे की प्रतिक्रियाओं के बीच विसंगतियों से बचने के लिए 15 से कम में दिए गए परख में सभी पौधों का इलाज करना महत्वपूर्ण है। बाहरी कारकों में से जो निष्क्रिय रूप से पत्तेदार तापमान मापको प्रभावित करते हैं, वेंटिलेशन प्रतिकृति यों के बीच स्थिति से संबंधित पूर्वाग्रहों या महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता को पेश करने की संभावना है। उपयोगकर्ताओं को रिकॉर्डिंग से पहले नमूनों को बेतरतीब ढंग से वितरित करके वेंटिलेशन प्रवाह को नियंत्रित करके सावधानी बरतनी चाहिए और स्थिति से संबंधित पूर्वाग्रहों को सीमित करना चाहिए। अन्य संभावित कारकों के लिए खाते में, रिकॉर्डिंग समान तापमान, आर्द्रता, और पौधों को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए प्रकाश की स्थिति के तहत किया जाना चाहिए क्योंकि इन स्थितियों में किसी भी परिवर्तन stomata बंद करने और/ अंत में, एक यौगिक स्टॉमीटल बंद करने के लिए संग्राहक को मिलाना अपनी विषाक्तता के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए । यह विशेष रूप से सच है अगर यौगिक स्टोमेटल बंद करने से चलाता है, क्योंकि यह संयंत्र द्वारा अनुभवी तीव्र तनाव का एक अप्रत्यक्ष परिणाम माना जाता है ।

जैव सक्रिय अणुओं की एक प्रभावी वितरण विधि और सीधे पौधे के वाष्पीकरण को मापने की विधि प्रदान करके, यह प्रोटोकॉल वर्तमान स्क्रीनिंग दृष्टिकोणों से जुड़ी कुछ कमियों को संबोधित करता है, जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है। हमारा प्रोटोकॉल सूरजमुखी रोपण के लिए अनन्य नहीं है और 90 डिग्री के हाइपोकोटाइल से कोटाइलेडन कोण के साथ अधिकांश डाइकॉट पर लागू किया जा सकता है। अरबीडोप्सिस कोटायलेडन की थर्मल इमेजिंग18, 19 प्रभावी है और इसलिए हमारे प्रोटोकॉल को इसी तरह छोटे कोटाइलेडन के साथ रोपण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग संयोजन में फोटोसिंथेटिक प्रदर्शन को मापने के लिए किया जा सकता है। जबकि कम समय प्रभावी, प्रत्येक रसायन में जोड़ा एरिथ्रोसिन बी के cotyledons में वाष्पीकरण संचालित संचय के माप संभवतः वाष्पीकरण दरों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर एक थर्मल इमेजिंग कैमरा उपलब्ध नहीं है । सभी में, यह बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग विधि कुशलतापूर्वक बायोएक्टिव अणुओं के लिए संयंत्र पत्तेदार प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करती है और विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए आसानी से अनुकूलनीय है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को पोमोना कॉलेज स्टार्ट-अप फंड्स और हिर्श रिसर्च दीक्षा ग्रांटफंड (एफजे के साथ-साथ तारकीय ग्रीष्मकालीन अनुसंधान सहायक कार्यक्रम (केजी के लिए) के माध्यम से पोमोना कॉलेज आणविक जीव विज्ञान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1020 plastic growing trays without drain holes Standard 10 x 20 inch trays
2.0 mL microtubes, capless Genesee Scientific 22-283NC
Abscisic acid (ABA) Sigma-Aldrich A1049
Air pump Active Aqua AAPA7.8L 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min
Airstones
Chemical compound library MicroSource Discovery Natural Product Collection
Creative Versa-Tool (wood burning tool) Nasco 9724549
Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested Sigma-Aldrich D4540
Dwarf Sunspot Sunflower seeds Outsidepride.com
Erythrosin B Sigma-Aldrich 200964
Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) General Hydroponics GL51GH1421.31.11
Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional 34155
Laptop Dell
MES hydrate Sigma-Aldrich M2933
Microdissection scissors
Microsoft Excel Microsoft
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich P5958
ResearchIR Software FLIR
R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board Insulfoam
Seedholders Araponics N/A
Super Tub (plastic utility tub) Maccourt ST3608 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics
T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera FLIR FLIR-T62101 Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop
Vermiculite
Water filter SunSun HW-304B Pro Canister Filter

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References

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