कीमोटैक्टिक और मानव न्यूट्रोफिल झुंड के आणविक विश्लेषण के लिए बायोपार्टिकल माइक्रोरेज़ विट्रो में झुंड

Bioengineering

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Summary

यह प्रोटोकॉल बायोपार्टिकल माइक्रोरे उत्पन्न करता है जो स्थानिक रूप से नियंत्रित न्यूट्रोफिल झुंड प्रदान करते हैं। यह मध्यस्थों तक आसान पहुंच प्रदान करता है जो माइग्रेशन के दौरान न्यूट्रोफिल जारी करते हैं और मात्रात्मक इमेजिंग विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।

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Walters, N., Reátegui, E. Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro. J. Vis. Exp. (156), e60544, doi:10.3791/60544 (2020).

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Abstract

न्यूट्रोफिल झुंड एक सहकारी प्रक्रिया है जिसके द्वारा न्यूट्रोफिल संक्रमण की एक साइट को सील करते हैं और ऊतक पुनर्गठन को बढ़ावा देते हैं। झुंड शास्त्रीय पशु कोशिका प्रवास के विशेषता पैटर्न दिखा मॉडल में वीवो में अध्ययन किया गया है । हालांकि, वीवो मॉडल में कई सीमाएं हैं, जिनमें इंटरकोशियलर मध्यस्थ शामिल हैं जो उपयोग और विश्लेषण करने में मुश्किल हैं, साथ ही मानव न्यूट्रोफिल का सीधे विश्लेषण करने में असमर्थता भी शामिल है। इन सीमाओं के कारण, एक इन विट्रो प्लेटफॉर्म की आवश्यकता होती है जो मानव न्यूट्रोफिल के साथ झुंड का अध्ययन करता है और झुंड के दौरान उत्पन्न आणविक संकेतों तक आसान पहुंच प्रदान करता है। यहां, एक मल्टीस्टेप माइक्रोस्टैंपिंग प्रक्रिया का उपयोग बायोपार्टिकल माइक्रोव्यूरी उत्पन्न करने के लिए किया जाता है जो वीवो संक्रमण में नकल करके झुंड को उत्तेजित करता है। बायोपार्टिकल माइक्रोव्यूरे न्यूट्रोफिल को नियंत्रित और स्थिर तरीके से झुंड में लाती है। माइक्रोसरणी पर, न्यूट्रोफिल गति में वृद्धि और बायोपार्टिकल समूहों के आसपास स्थिर झुंड के रूप में । इसके अतिरिक्त, न्यूट्रोफिल द्वारा उत्पन्न अलौकिक का विश्लेषण किया गया था और 16 प्रोटीन ों को झुंड के दौरान अलग ढंग से व्यक्त किया गया था। यह इन विट्रो झुंड मंच न्यूट्रोफिल माइग्रेशन और प्रोटीन रिलीज के प्रत्यक्ष विश्लेषण को प्रजनन योग्य, स्थानिक रूप से नियंत्रित तरीके से प्रदान करता है।

Introduction

न्यूट्रोफिल, रक्तप्रवाह 1में सबसे प्रचुर मात्रा में सफेद रक्त कोशिका, संभावित नैदानिक और चिकित्सीय लक्ष्य2,3 के रूप में ध्यान प्राप्त कर रहे हैंक्योंकिवे गाउट4,सेप्सिस3,आघात5,6,कैंसर1,7,8,और विभिन्न ऑटोइम्यून रोगों सहित विभिन्न चिकित्सा स्थितियों में शामिल हो सकते हैं5,9। न्यूट्रोफिल झुंड एक बहुमंचीय, कसकर विनियमित प्रक्रिया है जिसमें जटिलता है जो इसे अध्ययन5,10,11का विशेष रूप से दिलचस्प ध्यान देती है। झुंड के दौरान, न्यूट्रोफिल आसपास के स्वस्थ ऊतक5,10,11से सूजन की एक साइट को अलग करते हैं। घाव भरने को बढ़ावा देने के लिए न्यूट्रोफिल झुंड का उचित नियमन आवश्यक है और अंततः सूजन संकल्प5,12। न्यूट्रोफिल झुंड मुख्य रूप से कृंतक12,13,14,15 और जेब्राफिश10,11,12,15 मॉडलों में वीवो में अध्ययन किया गया है। हालांकि, वीवो पशु मॉडल में इन की प्रकृति सीमाओं को जन्म देती है5। उदाहरण के लिए, झुंड के दौरान न्यूट्रोफिल द्वारा जारी मध्यस्थों विश्लेषण5के लिए आसानी से सुलभ नहीं हैं । इसके अतिरिक्त, वीवो में किसी दिए गए मध्यस्थ के लिए कई संभावित स्रोत हैं, इसलिए वीवो प्रयोग में एक आनुवंशिक कमी को सेलुलर उत्पादन और/या बातचीत को बाधित करने के लिए एक निश्चित प्रक्रिया13में उस मध्यस्थ की भूमिका की जांच करने के लिए शुरू करना चाहिए । एक इन विट्रो प्रयोग अतिरिक्त कोशिकाओं के संदर्भ के बिना न्यूट्रोफिल अवलोकन को सक्षम करके इस जटिलता को दरकिनार करता है। इसके अतिरिक्त, मानव न्यूट्रोफिल समन्वित प्रवास का वर्णन अनुसंधान सीमित16है । एक इन विट्रो झुंड मंच पर, मानव न्यूट्रोफिल का सीधा विश्लेषण किया जा सकता है। एक इन विट्रो झुंड मंच वीवो अध्ययन में की सीमाओं से छोड़ दिया अंतराल को भरने के अवसर प्रदान करके वीवो अध्ययन में से प्राप्त ज्ञान पर विस्तार कर सकता है ।

वीवो न्यूट्रोफिल झुंड में नकल करने वाले इन विट्रो प्लेटफॉर्म की आवश्यकता को दूर करने के लिए, हमने एक माइक्रोस्टैंपिंग प्लेटफॉर्म विकसित किया जो हमें बायोपार्टिकल माइक्रोरे पैटर्न करने में सक्षम बनाता है जो एक स्थानिक रूप से नियंत्रित तरीके से न्यूट्रीफिल को उत्तेजित करता है। हम दो चरण की प्रक्रिया में ग्लास स्लाइड पर बायोपार्टिकल माइक्रोरे उत्पन्न करते हैं। सबसे पहले, हम सीनिक पॉलीइलेक्ट्रोलाइट (सीपी) स्पॉट की माइक्रोसरणी उत्पन्न करने के लिए माइक्रोस्टैंपिंग का उपयोग करते हैं। दूसरा, हम बायोकणों का एक समाधान जोड़ते हैं जो इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के माध्यम से सीपी स्पॉट का पालन करते हैं। पहले सीपी परत पैटर्निंग करके, हम चुनिंदा रूप से वांछित न्यूट्रोफिल झुंड पैटर्न उत्पन्न करने के लिए नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए बायोकणों को पैटर्न कर सकते हैं। सकारात्मक रूप से आवेशित परत जोरदार धुलाई कदम के माध्यम से नकारात्मक रूप से आवेशित बायोकणरखती है जो ग्लास स्लाइड पर उन क्षेत्रों से बायोकणों को हटा देती है जिनमें सीपी नहीं है। इसके अतिरिक्त, सीपी यहां इस्तेमाल किया जाता है, एक्रिलामाइड और क्वार्नेइज्ड कॉशनिक मोनोमर का एक कोपॉलीमर बायोसंगत है, इसलिए यह न्यूट्रोफिल ्स से प्रतिक्रिया को प्रेरित नहीं करता है। इसमें एक बहुत ही उच्च सतह आवेश है जो माइक्रोन के आकार के बायोकणों को ग्लास स्लाइड में स्थिर करता है, इस प्रकार ग्लास स्लाइड पर नमूनों की स्थिति से कणों को हटाने से न्यूट्रोफिल को बाधित करता है। इसके परिणामस्वरूप माइक्रोएरे में व्यवस्थित बायोपार्टिकल क्लस्टर होते हैं। जब हमने माइक्रोव्यूरी में न्यूट्रोफिल जोड़े, तो उन्होंने बायोपार्टिकल क्लस्टर के चारों ओर स्थिर झुंड बनाए। न्यूट्रोफिल माइग्रेशन पर नज़र रखने के माध्यम से, हमने पाया कि झुंड न्यूट्रोफिल सक्रिय रूप से बायोपार्टिकल समूहों की ओर प्रवास करते हैं। इसके अलावा, हमने झुंड के दौरान न्यूट्रोफिल जारी करने वाले कुछ मध्यस्थों का विश्लेषण करने के लिए इस मंच का उपयोग किया। हमें 16 मध्यस्थ मिले जो झुंड के दौरान अलग ढंग से व्यक्त किए जाते हैं। उनकी सांद्रता समय के साथ तीन सामान्य रुझानों का पालन करती है: वृद्धि, कमी या स्पाइक। हमारे इन विट्रो न्यूट्रोफिल झुंड मंच स्थानिक नियंत्रित मानव न्यूट्रोफिल झुंड के विश्लेषण की सुविधा, साथ ही संग्रह और न्यूट्रोफिल झुंड द्वारा जारी मध्यस्थों के विश्लेषण । पिछले प्रकाशन में, हमने दिखादिया कि कुछ चिकित्सा स्थितियों (आघात, ऑटोइम्यून रोग और सेप्सिस) वाले रोगियों में न्यूट्रोफिल थे जो स्वस्थ दानदाताओं5से अलग कार्य करते थे। भविष्य के शोध अध्ययनों में, हमारे मंच का उपयोग विभिन्न प्रकार की रोगी आबादी के बीच न्यूट्रोफिल फ़ंक्शन का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। यह मंच मात्रात्मक रूप से न्यूट्रोफिल झुंड में शामिल जटिल समन्वय का विश्लेषण कर सकता है। एक विशिष्ट रोगी आबादी के न्यूट्रोफिल फ़ंक्शन या ब्याज के रोगजनक के लिए न्यूट्रोफिल प्रतिक्रिया के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन किए जा सकते हैं।

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Protocol

लेखक स्वस्थ स्वयंसेवकों को स्वीकार करते हैं जिन्होंने कृपया अपना रक्तदान किया । ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी में बायोमेडिकल साइंसेज कमेटी द्वारा समीक्षा की #2018H0268 संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) प्रोटोकॉल के अनुसार सूचित स्वयंसेवक सहमति के बाद रक्त के नमूनों को प्राप्त किया गया ।

1. बायोपार्टिकल माइक्रोरेका माइक्रोफैब्रिकेशन

  1. मानक फोटोलिथोग्राफी प्रक्रियाओं का उपयोग करके, मास्टर सिलिकॉन वेफर उत्पन्न करें।
    1. कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वांछित डिजाइन का प्रमाण उत्पन्न करें, फिर क्रोम फोटोमास्क का उत्पादन करने के लिए एक फोटोमास्क निर्माता को भेजें। यहां उपयोग किया जाने वाला डिजाइन 150 माइक्रोन सेंटर-टू-सेंटर स्पेसिंग के साथ सर्कल में भरे 30 माइक्रोन व्यास के 4 मिमी x 4 मिमी आयताकार सरणी है। इस डिजाइन को विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए वांछित के रूप में संशोधित किया जा सकता है।
    2. स्पिनकोट एक सिलिकॉन वेफर पर एक नकारात्मक फोटोविरोध की एक 40 μm मोटी परत। 5 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और 10 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर बेक वेफर।
    3. 150-160 mJ/cm2 (चित्रा 1ए)के साथ एक क्रोम फोटोमास्क के माध्यम से यूवी प्रकाश के लिए वेफर बेनकाब ।
    4. 5 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और 10 00 के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना। 10 मिन के लिए फोटोरिड डेवलपर में जलमग्न वेफर और आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ कुल्ला करें। इस स्तर पर, पैटर्न वेफर(चित्रा 1बी)पर दिखाई देना चाहिए।
  2. पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन प्रीपॉलिमर और इसके इलाज एजेंट (यानी, 20 ग्राम प्रीपॉलिमर और 2 ग्राम क्यूरिंग एजेंट) का 10:1 अनुपात अच्छी तरह से मिलाएं और पेट्री डिश(चित्रा 1सी)में मास्टर वेफर पर ठीक पॉलीडिमिथाइलसिलिक्सन (पीडीएमएस) मिश्रण डालें।
  3. वैक्यूम ठीक नहीं पीडीएम मिश्रण का इलाज तब तक करें जब तक कि मास्टर वेफर पर कोई हवा के बुलबुले मौजूद न हों। रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर इलाज कराएं।
  4. वेफर के पैटर्न वाले खंड के बाहरी हिस्से के चारों ओर कटौती करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें, और धीरे-धीरे ठीक पीडीएफ एसलैब को हटा दें। पीडीएम स्लैब को एक साफ काटने वाले बोर्ड पर रखें जिसका सामना करना पड़ रहा है(चित्रा 1डी)।
  5. 8 मिमी बायोप्सी पंच(चित्रा 1ई)के साथ पीडीएम स्लैब से व्यक्तिगत टिकटों को पंच करें। एक ग्लास स्लाइड के लिए आठ टिकटों की जरूरत होगी।
  6. किसी भी मलबे को हटाने के लिए चिपकने वाला टेप पर प्रत्येक स्टांप चेहरा नीचे रखें।
  7. पहले से ही पानी में सीपी का 16 एमजी/एमजी का घोल तैयार करें।
    1. सीपी पाउडर की उचित मात्रा को पानी में जोड़ें (उदाहरण के लिए, 0.8 ग्राम से 500 मीटर)।
    2. रात भर कमरे के तापमान पर एक हलचल प्लेट पर मिलाएं, या जब तक सभी ठोस पानी में भंग न हो जाएं। सीपी समाधान 6 महीने के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. यदि वांछित हो, तो फ्लोरोसेइन आइसोथिओसाइनेट (पीएलएल-फिटसी) के साथ लेबल किए गए पॉली-एल-लिसिन को जोड़कर सीपी समाधान फ्लोरोसेंट बनाएं।
      1. अलीकोट सीपी समाधान के बारे में 10 mL । एलिकोहल की मात्रा में पीएलएल-फिटसी (0.05 मिलीग्राम) की एक छोटी राशि जोड़ें। इच्छानुसार फ्लोरेसेंस की चमक को समायोजित करने के लिए राशि को बदला जा सकता है।
      2. भंवर सीपी समाधान 20 एस के लिए FITC के साथ लेबल, या जब तक समाधान एक समान, पीला पीला रंग है । 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश और स्टोर से सुरक्षित रखें।
  8. टिकटों के साथ आमने-सामने, सीपी के १.६ मिलीग्राम/mL समाधान के १०० μL के साथ प्रधानमंत्री प्रत्येक स्टांप, सीपी समाधान और स्टांप(चित्रा 1एफ)के बीच कोई हवा बुलबुले फार्म सुनिश्चित करने ।
  9. सीपी समाधान की एक परत पर टिकटों उलटा(चित्रा 1जी)
  10. 1 घंटे के बाद सीपी सॉल्यूशन से स्टांप निकालें।
  11. अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए प्रत्येक गीले स्टांप को एक साफ ग्लास स्लाइड 6-8x पर नीचे का सामना करना पड़ता है।
  12. वैक्यूम 1-2 मिन के लिए टिकटों का इलाज करें।
  13. स्टांप प्लेसमेंट के लिए एक गाइड के रूप में एक साफ ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर एक आठ अच्छी तरह से, 9 मिमी व्यास इमेजिंग स्पेसर का पालन करें। इस स्पेसर के साथ, प्रत्येक ग्लास स्लाइड में आठ माइक्रोरे हो सकते हैं।
  14. इमेजिंग स्पेसर के प्रत्येक कुएं के केंद्र में ग्लास स्लाइड पर एक स्टांप चेहरा नीचे रखें (यानी, कुल आठ टिकटों का उपयोग करें)।
  15. प्रत्येक स्टांप के शीर्ष पर 5.6 ± 0.1 ग्राम संतुलित वजन रखें और मुद्रांकन के लिए 10 ग्राम की अनुमति दें(चित्रा 1एच)। यह सुनिश्चित करने के लिए एक संतुलित वजन की आवश्यकता होती है कि स्टांप को ग्लास स्लाइड पर समान रूप से दबाया जाता है और सीपी के ग्लास स्लाइड में भी हस्तांतरण को बढ़ावा दिया जाता है।
  16. ग्लास स्लाइड(चित्रा 1I)से वजन और टिकटों को हटा दें। सीपी परत को बायोकणों को जोड़ने से पहले 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सूखने की अनुमति दें, जैसा कि चरण 1.17 में वर्णित है। यदि सीपी को फिटेसी के साथ टैग किया जाता है, तो 1.17 कदम(चित्रा 1एम)के कदम से पहले 488 एनएम पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ इस बिंदु पर मुद्रांकन की प्रभावशीलता की जांच की जा सकती है।
  17. इमेजिंग स्पेसर के आकार के लिए एक खाली पीडीएम स्लैब काटें और पीडीएम में कुओं को बनाने के लिए 8 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करें जो इमेजिंग स्पेसर के कुओं के साथ संरेखित होते हैं। इमेजिंग स्पेसर(चित्रा 1जे)के साथ ग्लास स्लाइड करने के लिए पीडीएम स्लैब का पालन करें।
  18. जैव कणों (जैसे, ई कोलाई या zymosan) का एक समाधान गल और इंजेक्शन (WFI) के लिए पानी में ५०० μg/mL को पतला ।
    नोट: बायोकणों को ऑपोनाइज्ड करने की आवश्यकता नहीं है। न्यूट्रोफिल सतह रिसेप्टर्स इन बायोकणों पर अणुओं को सीधे पहचानते हैं19,20,21.
  19. ग्लास स्लाइड(चित्रा 1K)पर प्रत्येक पीडीएम के लिए बायोपार्टिकल समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  20. 30 मिन के लिए ग्लास स्लाइड रॉक।
  21. कुएं को अच्छी तरह से पानी से कुल्लाएं। बायोपार्टिकल माइक्रोव्यू को 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर धूल मुक्त वातावरण में संग्रहित किया जा सकता है। इस बिंदु पर, पैटर्न को चरण 2.1(चित्रा 1एन)के आगे बढ़ने से पहले 594 एनएम पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ जांच की जानी चाहिए।

2. नमूना तैयारी

  1. वांछित दाता से K2-EDTA ट्यूबों में ताजा रक्त के कम से कम 2 मिलील इकट्ठा करें। न्यूट्रोफिल की अपेक्षित उपज 1-2 x 106 कोशिकाओं/1 mL साबुत रक्त है। इमेजिंग परख के लिए लगभग 1.5 x 105 न्यूट्रोफिल की आवश्यकता होती है, और सुपरनेट के विश्लेषण के लिए 1 x 106 न्यूट्रोफिल की आवश्यकता होती है। 4 घंटे के भीतर रक्त का प्रयोग करें।
  2. पूरे रक्त में 1:5 अनुपात में एक एरिथ्रोसाइट एकत्रीकरण एजेंट जोड़कर अलग लाल रक्त कोशिकाएं (आरडीसी)। आरडीसी की परत से अलग होने के लिए पारदर्शी परत (बफी कोट) के लिए 45 मिन रुको।
  3. बफी कोट निकालें और 1 mL बफी कोट का उपयोग करफॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) के साथ धोएं: 9 mL PBS।
  4. 190 x जी और 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए सेंट्रलाइज।
  5. अधिनायक को एस्पिरेट करें और 5 x 107 कोशिकाओं/mL पर गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. न्यूट्रोफिल को अलग करने के लिए एक नकारात्मक इम्यूनोमैग्नेटिक चयन किट का उपयोग करें।
    1. एंटीबॉडी कॉकटेल/1 mL सेल निलंबन के ५० μL जोड़ें । 10 मिन रुको।
    2. चुंबकीय मोतियों/1 mL सेल निलंबन के 100 μL जोड़ें। 10 मिन रुको।
    3. एक गोल-नीचे ट्यूब में सेल निलंबन जोड़ें और बेलनाकार चुंबक में रखें। 10 मिन रुको।
  7. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में अधिनेत करें। पीबीएस के 10 एमएल तक जोड़ें। 190 x जी और 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए सेंट्रलाइज।
  8. एस्पिरेट सुपरनेटेंट। 0.4% मानव सीरम एल्बुमिन के साथ आईएमडी एमडीएम में सफेद गोली को फिर से निलंबित करें।
  9. दाग नाभिक के साथ 20 μg/mL Hoechst ३३३४२ के लिए 10 मिन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
  10. कुल्ला करने के लिए 0.4% मानव सीरम एल्बुमिन के साथ आईएमडीएम के 5 एमआईएल जोड़ें। 190 x जी और 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए सेंट्रलाइज।
  11. 0.4% मानव सीरम एल्बुमिन के साथ आईएमडीएम में 7.5 x 105 कोशिकाओं/mL पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  12. एक बायोपार्टिकल माइक्रोव्यूरे से युक्त पीडीएफएमएस में सेल निलंबन के 100 माइक्रोन जोड़ें। सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन पीडीएफएमएस के शीर्ष पर उत्तल है और इसमें कोई बुलबुला नहीं है।
  13. 12 मिमी व्यास कवरस्लिप के साथ सील करें। 12 मिमी व्यास कवरस्लिप के साथ पीडीएफके उद्घाटन को अच्छी तरह से कवर करें। चिमटी के साथ कवरस्लिप पर धीरे से नीचे दबाएं ताकि अतिरिक्त सेल निलंबन कुएं के किनारे तक बच जाए। अतिरिक्त सेल निलंबन को हटाने के लिए एक ऊतक का उपयोग करें।

3. परख और छवि विश्लेषण चल रहा है

  1. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2और 90% सापेक्ष आर्द्रता के लिए सेट एक माइक्रोस्कोप के साथ लाइव सेल इमेजिंग स्टेशन पर कोशिकाओं के साथ सूक्ष्मकण सरणी लोड करें।
  2. 405 एनएम, 594 एनएम और ब्राइटफील्ड पर हर 10 एस में छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए समय-चूक फ्लोरोसेंट और ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें। एक विशिष्ट प्रयोग में, छवियों को 2 घंटे तक एकत्र किया जाता है।
  3. बायोपार्टिकल क्लस्टर की ओर व्यक्तिगत न्यूट्रोफिल के प्रवास को ट्रैक करने के लिए एक स्वचालित सेल ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    1. स्पॉट डिटेक्शन सेल ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के ऑटोरेग्रेशन मोड का उपयोग करें। स्पॉट त्रिज्या को 5 माइक्रोन (न्यूट्रोफिल नाभिक का अनुमानित आकार) में सेट करें। न्यूनतम ट्रैक की लंबाई 120 एस और एक फ्रेम का अधिकतम गैप आकार निर्धारित करें।
    2. सेल ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न डेटा से, उन फ़ाइलों को निकालें जिनमें न्यूट्रोफिल स्थिति और गति होती है। इन फ़ाइलों का उपयोग क्रमशः न्यूट्रोफिल माइग्रेशन ट्रैक(चित्रा 2सी)और गति बनाम समय(चित्रा 2डी)के गर्मी मानचित्र उत्पन्न करने के लिए एक ग्राफिंग सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है।
  4. अपनी पसंद के छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर समय के साथ झुंड के आकार को ट्रैक करने के लिए 405 एनएम फ्लोरोसेंट छवियों का उपयोग करें।
    1. प्रत्येक बायोपार्टिकल क्लस्टर के आसपास ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) को परिभाषित करें जहां न्यूट्रोफिल झुंड होंगे। प्रत्येक बायोपार्टिकल क्लस्टर का विश्लेषण करने के लिए एक ही आकार आरओआई रखें।
    2. समय के साथ प्रत्येक आरओआई के भीतर 405 एनएम छवियों की औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता का विश्लेषण करें।
    3. 0 μm2 से अधिकतम झुंड आकार के लिए विभिन्न झुंड आकार ों पर मैनुअल माप लेने के द्वारा झुंड आकार के लिए मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता का एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करें। समय के साथ झुंड के आकार की गणना करने के लिए इस अंशांकन का उपयोग करें।

4. अलौकिक संग्रह और प्रोटीन का पता लगाने

  1. बायोपार्टिकल माइक्रोरे युक्त कुओं में न्यूट्रोफिल 37 डिग्री सेल्सियस और 3 घंटे के लिए 5% सीओ2 को इनक्यूबेट करें। वांछित समय बिंदुओं पर नमूने लें। आमतौर पर, नमूने 0, 0.5, 1, और 3 घंटे में लिया जाएगा। प्रोटीन सरणी परख का पता लगाने की सीमा को दूर करने के लिए, हर समय बिंदु के लिए एक ही कुएं (200 माइक्रोन) के अधिनात की पूरी मात्रा का उपयोग किया जाता था। हर बार बिंदु ट्रिपलेट में विश्लेषण किया गया था।
  2. एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, सत्यापित करें कि माइक्रोसरणी पर झुंड बनते हैं।
  3. 200 माइक्रोन पिपेट के साथ सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें और 0.45 माइक्रोन अपकेंद्रित्र फिल्टर ट्यूब में लोड करें।
  4. 5 मिन के लिए 190 x ग्राम और 20 डिग्री सेल्सियस पर अधिस्थान को केंद्रित करें और निस्पंदक मात्रा एकत्र करें।
  5. प्रसंस्करण समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
  6. एक माइक्रोएरेकिट का उपयोग करें जो नमूनों को संसाधित करने के लिए मानव प्रोटीन की एक श्रृंखला का पता लगाता है।
    1. किट के साथ प्रदान की एक अलग डायलिसिस ट्यूब के लिए प्रत्येक नमूने के 200 μL जोड़ें।
    2. डायलिसिस ट्यूबों को बीकर में रखें जिसमें कम से कम 500 एमएल पीबीएस (पीएच = 8.0) हो। 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 3 घंटे के लिए एक हलचल प्लेट पर धीरे हिलाओ। बीकर में पीबीएस बदलें और इस कदम को दोहराएं।
    3. किसी भी उपजी को हटाने के लिए प्रत्येक नमूने को 5 मिन के लिए 9,000 x ग्राम पर एक साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें। प्रत्येक अधिनान्तर को एक साफ ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
    4. डायलेड नमूने के 180 माइक्रोन में कुल प्रोटीन के प्रति 1 मिलीग्राम किट से 1x लेबलिंग रिएजेंट के 36 माइक्रोन जोड़कर प्रत्येक नमूने को बायोटिनिट करें। 30 मिन के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। हर 5 मिन में धीरे-धीरे मिलाएं।
    5. प्रत्येक नमूना ट्यूब में किट के साथ प्रदान स्टॉप समाधान के 3 μL जोड़ें। प्रत्येक नमूने को एक ताजा डायलिसिस ट्यूब पर स्थानांतरित करें और चरण4.6.2-4.6.3 दोहराएं। इस स्तर पर, नमूना -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि आप आगे बढ़ने के लिए तैयार न हो जाएं।
    6. किट के साथ प्रदान की गई ग्लास स्लाइड -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत की जाती है। इसे कमरे के तापमान पर आने दें। कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए एक लैमिनार प्रवाह हुड में इकट्ठे ग्लास स्लाइड रखें।
    7. इकट्ठे ग्लास स्लाइड के प्रत्येक कुएं में किट के साथ प्रदान अवरुद्ध बफर के 400 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।
    8. वर्षा या कणों को हटाने के लिए 9,000 x ग्राम पर 5 मिन के लिए तैयार नमूनों को केंद्रित करें। बफर को अवरुद्ध करने के साथ 5x पतला।
    9. प्रत्येक कुएं से अवरुद्ध बफर निकालें। उपयुक्त कुओं में पतला नमूनों के 400 μL जोड़ें। कमाल करते समय कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    10. प्रत्येक कुएं से नमूने डिडेंट करें। 1x धोने बफर मैं 5 मिन प्रत्येक के लिए कमरे के तापमान पर किट के साथ प्रदान की है, जबकि कमाल के 800 μL के साथ 3x धोने.
    11. एक साफ कंटेनर में, 1x वॉश बफर I में इकट्ठे ग्लास स्लाइड को जलमग्न करें। कमाल करते समय प्रत्येक कमरे के तापमान पर 2x को 5 न्यूनतम के लिए धोएं।
    12. प्रत्येक उप-सरणी में 1x Cy3-conjugated स्ट्रेप्टाविडिन के 400 माइक्रोन जोड़ें। प्लास्टिक चिपकने वाली स्ट्रिप्स के साथ कवर करें। प्रोटोकॉल के शेष के लिए प्रकाश से रक्षा करें।
    13. कमाल करते समय कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    14. समाधान को डिडेंट करें और नमूना कक्षों से ग्लास स्लाइड को अलग करें।
    15. किट के साथ प्रदान की 30 mL अपकेंद्रित्र ट्यूब में, ध्यान से ग्लास स्लाइड और पर्याप्त 1x धोने बफर मैं गिलास स्लाइड को कवर करने के लिए जोड़ें । कमाल करते समय कमरे के तापमान पर प्रत्येक 10 न्यूनतम के लिए 3x धोएं।
    16. 30 mL अपकेंद्री ट्यूब में, कमाल करते समय कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 1x वॉश बफर II के साथ 2x धोएं।
    17. 5 मिन के लिए डीडीएच2ओ के 30 मिलील के साथ ग्लास स्लाइड धोएं। सेंट्रलाइज ट्यूब से ग्लास स्लाइड निकालें और लैमिनार फ्लो हुड में 20 मिन के लिए सूखने की अनुमति दें। तैयार ग्लास स्लाइड को स्कैन करने के लिए तैयार होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    18. 555 एनएम के फ्लोरेसेंस उत्सर्जन में माइक्रोरेस्कैनर के साथ ग्लास स्लाइड को स्कैन करें।

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Representative Results

जब बायोपार्टिकल माइक्रोसरणी में न्यूट्रोफिल जोड़े जाते हैं, तो बायोपार्टिकल समूहों से संपर्क करने वाले न्यूट्रोफिल सक्रिय हो जाते हैं और झुंड की प्रतिक्रिया शुरू करते हैं। बायोपार्टिकल माइक्रोव्यू को बायोपार्टिकल क्लस्टर(वीडियो एस1)की ओर न्यूट्रोफिल माइग्रेशन को ट्रैक करने के लिए टाइम-लैप्स फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मान्य किया गया था। व्यक्तिगत न्यूट्रोफिल नाभिक के प्रवास को ट्रैक किया जाता है क्योंकि वे बायोपार्टिकल क्लस्टर की ओर प्रवास करते हैं। जब न्यूट्रोफिल बायोपार्टिकल क्लस्टर तक पहुंचते हैं, तो उनकी नाभिक क्लस्टर में अन्य नाभिक के साथ ओवरलैप होती है। इस प्रकार, इस विधि का उपयोग करके क्लस्टर के भीतर एक न्यूट्रोफिल को सटीक रूप से ट्रैक करना संभव नहीं है। ज़िमोसन और ई. कोलाई बायोपार्टिकल क्लस्टर दोनों न्यूट्रोफिल झुंड की पीढ़ी में परिणाम देते हैं। हमारे परिणामों के लिए, चित्रा 2बी ई. कोलाई कणों द्वारा उत्पन्न न्यूट्रोफिल झुंड से डेटा का उपयोग करता है। चित्रा 3 और चित्रा 2 के अन्य पैनल ज़िमोसन कणों द्वारा उत्पन्न न्यूट्रोफिल झुंड का उपयोग करते हैं। प्राप्त परिणामों से यह प्रदर्शित होता है कि बायोपार्टिकल क्लस्टर न्यूट्रोफिल सक्रियण को उत्तेजित करता है जब एक न्यूट्रोफिल ने क्लस्टर से संपर्क किया, जिसके कारण अंततः 30-60 मिन(चित्रा 2ए,शीर्ष) के बाद प्रत्येक क्लस्टर के चारों ओर स्थिर न्यूट्रोफिल झुंड का गठन हुआ। इसके विपरीत, न्यूट्रोफिल ने बायोपार्टिकल क्लस्टर(चित्रा 2ए,बॉटम और वीडियो एस 2)की अनुपस्थिति में सामूहिक प्रवास नहीं दिखाया। 405 एनएम पर दाग न्यूट्रोफिल नाभिक की फ्लोरोसेंट तीव्रता का उपयोग करते हुए, औसत न्यूट्रोफिल झुंड का आकार 30 माइक्रोन व्यास ई. कोलाई बायोपार्टिकल क्लस्टर के आसपास 1,490 ± 680मीटर2 (मतलब ± एसडी, चित्रा 2बी,शीर्ष) पाया गया। ब्याज के किसी दिए गए क्षेत्र की फ्लोरेसेंस तीव्रता जहां कोई बायोपार्टिकल क्लस्टर मौजूद नहीं हैं, समय के साथ लगभग स्थिर था, जिसने इस सेटिंग(चित्रा 2बी,नीचे) में सामूहिक प्रवास के अभाव की पुष्टि की। न्यूट्रोफिल माइग्रेशन के ट्रैक बताते हैं कि न्यूट्रोफिल एक बायोपार्टिकल क्लस्टर पर जुटे जब कोई मौजूद था(चित्रा 2सी,शीर्ष)। इसके विपरीत, नियंत्रण प्रणाली(चित्रा 2सी,नीचे) में कोई अभिसरण नहीं देखा गया। झुंड और गैर सक्रिय न्यूट्रोफिल की गति (दूरी की यात्रा/समय) मापा गया था और गति वितरण में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर पाया गया था (ANOVA, पी & 0.0001), जैसा कि चित्रा 2डीमें दिखाया गया है । झुंड न्यूट्रोफिल के लिए औसत गति २०.६ ± १३.० μm/min (मतलब ± एसडी) था, और नियंत्रण न्यूट्रोफिल के लिए औसत गति २.० ± २.२ μm/मिन था ।

इसके अतिरिक्त, 16 प्रोटीन की एकाग्रता जो झुंड के दौरान जारी किए गए न्यूट्रोफिल का विश्लेषण किया गया था(चित्रा 3)। झुंड की प्रक्रिया में विभिन्न समय बिंदुओं पर प्रत्येक प्रोटीन की सामान्यीकृत एकाग्रता (टी = 0, 0.5, 1 और 3 एच) की गणना की गई थी, जहां सामान्यीकृत एकाग्रता (सी - सीमिन)/ (सीमैक्स - सीमिन)। 10 प्रोटीन झुंड भर में एकाग्रता में वृद्धि हुई । ये प्रोटीन एडिप्सिन, गैलेक्टिन-3, जीआरओए, आईएल-6आर, एमआईपी-1ए, एमएमपी-8, एमएमपी-9, निडोजेन-1, टीएमपी-1 और टीएलआर2 थे। दो प्रोटीन (पेंट्राक्सिन 3 और रैंक) झुंड भर में एकाग्रता में कमी आई । शेष चार प्रोटीन (क्लस्टरिन, पीएफ4, रैंटेस और ट्रैपिन-2) झुंड के पहले घंटे के दौरान बढ़े लेकिन उसके बाद कम हो गए। दूसरे शब्दों में, उन प्रोटीन ों की सांद्रता झुंड के दौरान "नुकीला" । हमारे पिछले प्रकाशन5में पहचाने गए 16 प्रोटीनों में से 12 प्रोटीन की पहचान की गई थी । एडिप्सिन, गैलेक्टिन-3, निडोजेन-1, पेंट्राक्सिन 3, टीएमपी-1 और टीएलआर2 को झुंड-विशिष्ट दिखाया गया, जबकि क्लस्टरइन, आईएल-6आर, एमएमपी-8, और एमएमपी-9, रैंक और ट्रैपइन-25नहीं थे ।

Figure 1
चित्रा 1: बायोपार्टिकल माइक्रोव्यूरे का उत्पादन। नकारात्मक फोटोविरोध के साथ लेपित एक सिलिकॉन वेफर क्रोम फोटोमास्क(ए)के माध्यम से यूवी प्रकाश के संपर्क में आता है। सिलिकॉन वेफर बेक और विकसित होने के बाद, सिलिकॉन वेफर की सतह पर एक फोटोप्रतिरोध पैटर्न रहता है। यह मास्टर वेफर(बी)है । पेट्री डिश में मास्टर वेफर के शीर्ष पर पीडीएम मिश्रण जोड़ा जाता है। पीडीएम मोल्ड(सी)बनाने के लिए पीडीएम को रातोंरात 65 डिग्री सेल्सियस पर ठीक कर दिया जाता है। पीडीएम मोल्ड मास्टर वेफर से काटा जाता है और एक बायोप्सी पंच का उपयोग व्यक्तिगत पीडीएम टिकटों(डी)को पंच करने के लिए किया जाता है। एक पीडीएम स्टांप(ई)सीपी समाधान(एफ)के साथ लेपित है । स्टांप सीपी समाधान(जी)की एक पतली परत पर उलटा है । 1 घंटे के लिए सीपी समाधान में इनक्यूबेटिंग के बाद, अतिरिक्त सीपी को हटाने के लिए एक ग्लास स्लाइड पर स्टांप को दाग दिया जाता है। आठ टिकटों को 5.6 ± 0.1 ग्राम वजन के साथ एक साफ ग्लास स्लाइड पर दबाया जाता है, जो एक इमेजिंग स्पेसर(एच)के साथ गठबंधन होता है। जब स्टांप हटा दिया जाता है, एक सीपी पैटर्न रहता है(मैं)। प्रीकट कुओं के साथ एक पीडीएम स्लैब ग्लास स्लाइड(जे)का पालन किया जाता है। फिर, सीपी पैटर्न(के)के ऊपर एक बायोपार्टिकल समाधान जोड़ा जाता है। नकारात्मक रूप से आवेशित बायोपार्टिकल्स इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के माध्यम से सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए पॉलीइलेक्ट्रोलाइट से बांधते हैं। अतिरिक्त बायोपार्टिकल समाधान बह जाता है, जिससे सीपी पैटर्न(एल)के शीर्ष पर बायोपार्टिकल्स होते हैं। (एम)पीएलईसी (स्केल बार = 50 माइक्रोन, बड़ी छवि) के साथ लेबल सीपी परत की फ्लोरोसेंट छवि; स्केल बार = 25 माइक्रोन, इनसेट)। (एन)टेक्सास रेड (स्केल बार = 100 माइक्रोन, बड़ी छवि) के साथ संयुग्मित पैटर्न वाले ज़िमोसन बायोकणों की फ्लोरोसेंट छवि; स्केल बार = 50 माइक्रोन, इनसेट)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बायोपार्टिकल समूहों के आसपास न्यूट्रोफिल झुंड वृद्धि। बायोपार्टिकल समूहों की उपस्थिति में, न्यूट्रोफिल बायोपार्टिकल समूहों (नीचे,नियंत्रण न्यूट्रोफिल) की ओर सामूहिक प्रवास से गुजरते हैं। जब कोई बायोपार्टिकल्स मौजूद नहीं होते हैं, तो न्यूट्रोफिल सामूहिक प्रवास नहीं करते हैं। (A)ज़िमोसियन बायोपार्टिकल क्लस्टर की उपस्थिति में, न्यूट्रोफिल 30 मिन में झुंड बनाते हैं। बायोपार्टिकल क्लस्टर के बिना, कोई झुंड नहीं बनाता है (स्केल बार = 50 माइक्रोन)। (ख)न्यूट्रोफिल झुंड 30 माइक्रोन व्यास ई. कोलाई बायोपार्टिकल समूहों के आसपास 1,490 ± 680 माइक्रोन2 (मतलब ± एसडी) के औसत आकार तक बढ़ते हैं। नियंत्रण न्यूट्रोफिल एक निरंतर घनत्व प्रदर्शित करता है जो कोई झुंड वृद्धि (एनोवा, पी एंड एलटी; 0.0001, एन = 32 न्यूट्रोफिल झुंड, एन = 1 दाता, त्रुटि सलाखों = मानक विचलन) से मेल खाता है। (ग)झुंड न्यूट्रोफिल के ट्रैक ज़िमोसियन बायोपार्टिकल समूहों पर एकाग्र होते हैं, जबकि नियंत्रण न्यूट्रोफिल कोई अभिसरण बिंदु (स्केल बार = 50 माइक्रोन) नहीं दिखाते हैं। (D)एक zymosan लक्ष्य की ओर झुंड Neutrophils २०.६ ± १३.० μm/min (मतलब ± एसडी) की एक मतलब गति है, जबकि नियंत्रण neutrophils २.० ± २.२ मीटर/मिन की एक औसत गति है । गर्मी के नक्शे पर प्रत्येक गिनती दिए गए समय बिंदु पर दिए गए तात्कालिक गति के साथ एक न्यूट्रोफिल का प्रतिनिधित्व करती है। ये गर्मी नक्शे एक प्रयोग के प्रतिनिधि हैं (एन = 1 झुंड; एन = 1 दाता; ANOVA, 6,114 = झुंड न्यूट्रोफिल, 32,116 = नियंत्रण न्यूट्रोफिल, पी एंड एलटी; 0.0001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: स्ट्रीप न्यूट्रोफिल द्वारा जारी मुफ्त मध्यस्थ। न्यूट्रोफिल झुंड समय के साथ विभिन्न प्रोटीन के उत्पादन को प्रभावित करता है। प्रोटीन एकाग्रता 0, 0.5, 1, और 3 घंटे पर मापा गया था। डेटा पॉइंट्स में स्मूदिंग स्प्लेस (0.05) स्मूदिंग लगे हुए थे। ये प्रोटीन तीन विशेषता प्रवृत्तियों में से एक का पालन करते हैं: समय के साथ कम होना, समय के साथ बढ़ना, या 1 घंटे के आसपास स्पाइकिंग और फिर कम होना (त्रुटि सलाखों = मानक विचलन; एन = 3 प्रतिकृति; एन = 1 दाता) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो S1: न्यूट्रोफिल zymosan बायोपार्टिकल समूहों की ओर झुंड । न्यूट्रोफिल नाभिक नीले रंग में दिखाया गया है। Zymosan लक्ष्य लाल हलकों के साथ चिह्नित कर रहे है (स्केल बार = ५० μm; मूल अधिग्रहण समय = ६० min) । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो S2: गैर सक्रिय न्यूट्रोफिल यादृच्छिक प्रवास। न्यूट्रोफिल नाभिक नीले रंग में दिखाए जाते हैं (स्केल बार = 50 माइक्रोन; मूल अधिग्रहण समय = 60 मिन)। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हमने इन विट्रो न्यूट्रोफिल झुंड को उत्तेजित करने के लिए बायोकणों की एक समान सरणी उत्पन्न करने के लिए एक माइक्रोस्टैंपिंग मंच विकसित किया। हमारे मंच की इन विट्रो प्रकृति हमें विवो झुंड प्रयोगों में उत्पन्न होने वाली जटिलताओं को दरकिनार करने की अनुमति देती है, अर्थात् झुंड न्यूट्रोफिल ्स द्वारा जारी मध्यस्थों का विश्लेषण करने की खराब क्षमता5। इसके अतिरिक्त, वीवो मॉडल में आमतौर पर कृंतक11,12,13,15,22,23, या जेब्राफिश11,12,15,23में किया जाता है। हमारा मंच मानव न्यूट्रोफिल का उपयोग करता है, जो हमें मानव रोग के संदर्भ में हमारे परिणामों की अधिक सीधे व्याख्या करने में सक्षम बनाता है, हालांकि माउस और मानव न्यूट्रोफिल के बीच कुछ समानताएं5,11देखी गई हैं। इसके अतिरिक्त, हम एक स्थानिक रूप से नियंत्रित झुंड वातावरण बनाए रखते हैं जो हमारे मंच को उच्च स्तर की प्रजनन क्षमता प्रदान करके विवो मॉडलों से अलग करता है जो मानव न्यूट्रोफिल सामूहिक प्रवास के विश्लेषण के साथ-साथ झुंड वाले न्यूट्रोफिल द्वारा जारी मध्यस्थों के संग्रह और विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है।

हमारे माइक्रोस्टांपिंग प्रोटोकॉल के विकास के दौरान, कई चुनौतियां पैदा हुईं जिन्हें सावधानीपूर्वक समस्या निवारण की आवश्यकता थी। सबसे पहले, माइक्रोस्टैंपिंग के लिए इस्तेमाल किया सीपी अत्यधिक हाइड्रोफिलिक है, और पीडीएफ टिकटहाइड्रोफोबिक हैं । क्योंकि सीपी पीडीएम के लिए एक उच्च लगाव नहीं है, हमारी प्रक्रिया ध्यान से बुलबुले के गठन से बचने के लिए और गीला को बढ़ावा देने के लिए डिज़ाइन किया गया था । पहले सीपी के साथ स्टांप भड़काना जबकि आमने-सामने (चरण १.८), हम सीपी और स्टांप के बीच बुलबुले के गठन को कम करते हैं । स्टांप तो सीपी की एक परत पर उलटा है और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड है । यह लंबे ऊष्मायन समय यह सुनिश्चित करता है कि स्टांप के हर वर्ग गीला है। दूसरा, एक साफ ग्लास स्लाइड (चरण 1.11) पर मुद्रांकन से पहले अतिरिक्त सीपी को हटाने की प्रक्रिया असंगत हो सकती है। कदम 1.11 प्रदर्शन करते समय, स्टांप की सावधानीपूर्वक जांच की जानी चाहिए। जब पैटर्न दिखाई देना शुरू होता है, तो स्टांप चरण 1.12 के लिए तैयार हो जाता है। इसके अतिरिक्त, टिकटों को सुखाने के लिए आवश्यक वैक्यूम समय (चरण 1.12) भिन्न हो सकते हैं। यह मुख्य रूप से मौसम पर निर्भर है। एक गर्म, आर्द्र दिन पर, वैक्यूम समय के 2 मिन की आवश्यकता होती है। एक शांत, शुष्क दिन पर, वैक्यूम समय का 1 मिन पर्याप्त है।

हमने दिखाया है कि स्वस्थ दानदाताओं से न्यूट्रोफिल बायोपार्टिकल समूहों के आसपास स्थिर झुंड बनाते हैं । समय-चूक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ, हम झुंड के आकार की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं और न्यूट्रोफिल माइग्रेशन को ट्रैक कर सकते हैं, जो हमें न्यूट्रोफिल कीमोटैक्सिस मात्रात्मक रूप से5का विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है। उदाहरण के लिए, हमने पहले दिखाया है कि इस मंच का उपयोग कीमोटैक्टिक इंडेक्स (सीआई, न्यूट्रोफिल वेग वेक्टर और न्यूट्रोफिल और निकटतम बायोपार्टिकल क्लस्टर के बीच स्थिति वेक्टर के बीच कोण के कोसिन) की गणना करने के लिए किया जा सकता है,गति (समय से विभाजित न्यूट्रोफिल की दूरी), रेडियल वेग (सीआई द्वारा गुणा की गई गति), और कुल दूरी (प्रारंभिक और अंतिम न्यूट्रोफिल स्थिति के बीच अंतर) माइग्रेट िंग अधिकांश इन विट्रो अध्ययन24,25,26 केविपरीत, हमारे प्लेटफ़ॉर्म में कृत्रिम कीमोटैक्टिक ग्रेडिएंट नहीं है, इसलिए न्यूट्रोफिल इंटरसेलुलर संचार न्यूट्रोफिल माइग्रेशन की एकमात्र प्रेरक शक्ति है। इसके अतिरिक्त, झुंड न्यूट्रोफिल द्वारा उत्पन्न अधिनेत आसानी से सुलभ है। हम वीवो में मौजूद अन्य सेल प्रकारों के हस्तक्षेप के बिना न्यूट्रोफिल द्वारा जारी इंटरकोशियलर मध्यस्थों के लिए अधिनेत और विश्लेषण कर सकते हैं। 16 प्रोटीन देखे गए जिनकी झुंड के दौरान अभिव्यक्ति को तीन प्रवृत्तियों में से एक के रूप में वर्णित किया जा सकता है: वृद्धि (10 प्रोटीन), कमी (दो प्रोटीन), और स्पाइक (चार प्रोटीन)। इनमें से छह प्रोटीन ों ने 5 समय के साथ झुंड के दौरान पहले रिपोर्ट किए गए रुझानोंकीपुष्टि की । पहचाने गए कुछ प्रोटीनों को पहले झुंड-विशिष्ट दिखाया गया था, जबकि अन्य को सक्रिय गैर-झुंड न्यूट्रोफिल5द्वारा अलग ढंग से व्यक्त किया गया था। समय के साथ एकाग्रता में वृद्धि करने वाले प्रोटीन की संभावना समर्थक सूजन प्रतिक्रिया से जुड़ी होती है। समय के साथ एकाग्रता में वृद्धि प्रोटीन के कुछ पहले से ही समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया में शामिल होने के लिए जाना जाता है (जैसे, galectin-3 और एमएमपी-9)27,28। अन्य प्रोटीन और सूजन के बीच संबंध कम अच्छी तरह से समझ में आता है। झुंड के दौरान स्पाइक या कमी वाले प्रोटीन सूजन के नियमन में शामिल हो सकते हैं। हालांकि, झुंड के दौरान अलग-अलग व्यक्त किए जाने वाले कई प्रोटीनों की सूजन में भूमिका को समझने के लिए आगे शोध आवश्यक है। न्यूट्रोफिल माइग्रेशन के साथ जारी मध्यस्थों का विश्लेषण करने से हमें सूजन की जटिल तस्वीर को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिल सकती है और न्यूट्रीफिल झुंड के दौरान आसपास के ऊतकों को कैसे प्रभावित करते हैं।

भविष्य के अध्ययनों में, हमारे मंच का उपयोग पैटर्न वाले बायोपार्टिकल समूहों के आसपास स्थिर झुंड उत्पन्न करने के लिए अस्वस्थ न्यूट्रोफिल की क्षमता का अच्छी तरह से अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। विभिन्न चिकित्सा स्थितियां न्यूट्रोफिल से संबंधित हैं, जिनमें सेप्सिस3,ट्रॉमा6और कैंसर1,8,17,18शामिल हैं, जो इन रोगियों में न्यूट्रोफिल को बदल सकते हैं। इस मंच का उपयोग स्वस्थ और अस्वस्थ न्यूट्रोफिल द्वारा जारी इंटरकोशियलर मध्यस्थों के बीच मतभेदों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस प्लेटफ़ॉर्म को लाइव रोगाणुओं को पैटर्न करने के लिए संशोधित किया जा सकता है और इसका उपयोग विट्रो में जीवित रोगाणुओं के लिए न्यूट्रोफिल प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

निष्कर्ष में, हमने विट्रो में न्यूट्रोफिल झुंड का विश्लेषण करने के लिए एक उपन्यास मंच विकसित किया है। हमारे मंच की अत्यधिक नियंत्रित प्रकृति हमें उन मुद्दों को कम करने की अनुमति देती है जो वीवो न्यूट्रोफिल झुंड प्रयोगों के दौरान उत्पन्न होते हैं। बायोपार्टिकल माइक्रोसरणी पर कण आसानी से समय-चूक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मात्रात्मक है। इसके अतिरिक्त, हम वीवो में मौजूद अन्य ऊतकों के हस्तक्षेप के बिना न्यूट्रोफिल द्वारा जारी मध्यस्थों को एकत्र कर सकते हैं। इस मंच का उपयोग भविष्य के शोध में स्वस्थ और अस्वस्थ दानदाताओं से न्यूट्रोफिल के प्रवास व्यवहार के बीच मतभेदों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते ।

Acknowledgments

इस काम को विलियम जी लोरी डिपार्टमेंट ऑफ केमिकल एंड बायोमॉलिक्यूलर इंजीनियरिंग और ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी में कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर से फंडिंग से सपोर्ट किया गया था । इस रिपोर्ट में प्रस्तुत डेटा परिसर माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सुविधा, ओहियो राज्य विश्वविद्यालय में उपलब्ध Imaris x64 (ver. ९.३.० बिटप्लेन) का उपयोग कर संसाधित छवियों से आया था । यह सुविधा अनुदान पी 30 सीए016058, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, बेथेस्डा, एमडी द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
"The Big Easy" EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18001 Magnet to use with neutrophil isolation kit
Cell Incubator Okolab 777057437 / 77057343 Okolab cage incubator for temperature and CO2 control
EasySep Human Neutrophil Isolation Kit STEMCELL Technologies 17957 Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils
Eclipse Ti2 Nikon Instruments MEA54010 / MEF55037 Inverted research microscope
Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array
Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch Sigma Aldrich Z708925 To cut PDMS stamps
HetaSep STEMCELL Technologies 7906 Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Nucleus fluorescent stain
Human L1000 Array Raybiotech Inc. AAH-BLG-1000-4 High density array to detect 1000 human proteins
Human Serum Albumin (HSA) Sigma Aldrich A5843 Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils
Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053 To resuspend isolated neutrophils
K2-EDTA tubes Thermo Fisher Scientific 02-657-32 Tubes for blood collection
Low Reflective Chrome Photomask Front Range Photomask N/A Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D)
Microarray Scanner Perkin Elmer ASCNGX00 Fluorescence reader of protein patterned microdomains
Microscopy Image Analsysis Software - Imaris Bitplane 9.3.0 Software for automatic cell tracking analysis
NiS Elements Advanced Research Software Package Nikon Instruments MQS31100 Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation
Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) Sigma Aldrich P3069-10MG 30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution
SecureSeal 8-well Imaging Spacer Grace Bio-Labs 654008 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer
Silicon Wafer University Wafer 590 Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test
Spin Coater Laurell WS-650MZ-23NPPB Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer
SU-8 2025 MicroChem 2025 Negative photoresist to make silicon master wafer
SU-8 Developer MicroChem Y020100 Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer
Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) Dow 1673921 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells
UV Exposure Masking System Kloé UV-KUB 2 Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light
Water Thermo Fisher Scientific A1287303 High quality water to dilute bioparticles
Zetag 8185 BASF 8185 Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water
Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate Invitrogen Z2843 Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array

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References

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