मायोकार्डियल मैकेनिकल विरूपण (डायमंड) के विस्थापन विश्लेषण से भ्रूणीय जेब्राफिश में कार्डियक फ़ंक्शन की खंडीय विषमता का पता चलता है

Developmental Biology

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Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों के तहत भ्रूणीय जेब्राफिश में खंडीय हृदय समारोह के आकलन के लिए एक उपन्यास विधि का विस्तार करना है।

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Chen, J., Packard, R. R. S. Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish. J. Vis. Exp. (156), e60547, doi:10.3791/60547 (2020).

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Abstract

जेब्राफिश का उपयोग कार्डियोमायोपैथियों और उत्थान के लिए एक मॉडल जीव के रूप में तेजी से किया जाता है। कार्डियक फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने वाले वर्तमान तरीके विभाजनीय यांत्रिकी का मज़बूती से पता लगाने में विफल रहते हैं और जेब्राफ़िश में आसानी से संभव नहीं होते हैं। यहां हम चार आयामी (4डी) सेगमेंटल कार्डियक फंक्शन के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक अर्धस्वचालित, ओपन-सोर्स विधि प्रस्तुत करते हैं: मायोकार्डियल यांत्रिक विरूपण (डायमंड) का विस्थापन विश्लेषण। ट्रांसजेनिक भ्रूणीय जेब्राफिश को वीवो में 4डी कार्डियक मोशन सिंक्रोनाइजेशन के साथ लाइट-शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग करके इमेज किया गया था। अधिग्रहीत 3 डी डिजिटल दिलों को एंड-सिस्टोल और एंड-डायस्टोल में खंगाला गया, और वेंट्रिकल को मैन्युअल रूप से बाइनरी डेटासेट में खंडित किया गया। फिर, दिल को फिर से उन्मुख किया गया और सच्चे छोटी धुरी के साथ आइसोट्रॉपिकल को फिर से नमूना दिया गया, और वेंट्रिकल को समान रूप से छोटी धुरी के साथ आठ भागों (आई-आठवीं) में विभाजित किया गया था। अंत-सिस्टोल और एंड-डायस्टोल में विभिन्न पुनर्नमूना विमानों और मैट्रिस के कारण, पुनर्नमूना सिस्टोलिक और डायस्टोलिक छवि मैट्रिस के बीच मूल स्थानिक संबंध को बहाल करने के लिए छवि पंजीकरण के लिए एक परिवर्तन मैट्रिक्स लागू किया गया था। छवि पंजीकरण के बाद, एंड-सिस्टोल से एंड-डायस्टोल तक प्रत्येक सेगमेंट के विस्थापन वेक्टर की गणना तीन आयामों (3 डी) में मास सेंट्रोइड के विस्थापन के आधार पर की गई थी। डायमंड से पता चलता है कि एट्रिओवेनेट्रिकुलर नहर से सटे बेसल मायोकार्डियल सेगमेंट उच्चतम यांत्रिक विरूपण से गुजरते हैं और डोक्सोरुबिसिन-प्रेरित हृदय चोट के लिए सबसे अधिक संवेदनशील होते हैं। कुल मिलाकर, डायमंड शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों के तहत पारंपरिक रिजेक्शन अंश (ईएफ) से परे ज़ेब्राफिश भ्रूण में खंडीय हृदय यांत्रिकी में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

Introduction

कीमोथेरेपी प्रेरित हृदय विषाक्तता और आगामी दिल की विफलता कीमोथेरेपी विच्छेदन के मुख्य कारणों में से एक हैं1। इसलिए, कार्डियक कार्यात्मक मूल्यांकन हृदय विषाक्तता की पहचान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और, अधिक महत्वपूर्ण बात, कीमोथेरेपी2के बाद जल्दी हृदय चोट की भविष्यवाणी में । हालांकि, हृदय कार्यात्मक मूल्यांकन मुठभेड़ सीमाओं के लिए वर्तमान दृष्टिकोण। बाएं वेंट्रिकुलर रिजेक्शन अंश (एलवीईएफ) जैसे तरीके चोट3,4के बाद केवल वैश्विक और अक्सर देरी कार्डियक यांत्रिकी प्रदान करते हैं। ऊतक डॉप्लर इमेजिंग खंडीय मायोकार्डियल विरूपण जानकारी प्रदान करता है, लेकिन अल्ट्रासाउंड बीम कोण निर्भरता5के कारण भाग में महत्वपूर्ण इंट्राऑब्जर्वर और इंटरऑब्जर्वर परिवर्तनशीलता से ग्रस्त है। द्वि-आयामी (2डी) स्पेक्टल ट्रैकिंग इकोकार्डियोग्राफी के बी-मोड का उपयोग करती है, जो सैद्धांतिक रूप से कोण निर्भरता को समाप्त करती है, लेकिन इसकी सटीकता आउट-ऑफ-प्लेन मोशन6द्वारा सीमित है। इसलिए, खंडीय हृदय समारोह की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक कठोर दृष्टिकोण अनुसंधान और नैदानिक दोनों सेटिंग्स में कमी है।

इस संदर्भ में, हमने खंडीय हृदय समारोह के विश्लेषण के लिए एक 4D क्वांटिफिकेशन विधि विकसित की है जिसे हमने 3 डी अंतरिक्ष में मायोकार्डियल मास सेंट्रोइड के विस्थापन वेक्टर का निर्धारण करने के लिए मायोकार्डियल मैकेनिकल विरूपण (डायमंड) के विस्थापन विश्लेषण का नाम दिया है। हमने कार्डियक फ़ंक्शन के वीवो मूल्यांकन और जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)के साथ डोक्सोरुबिसिन-प्रेरित कार्डियक विषाक्तता के लिए डायमंड लागू किया, जो उनके पुनर्जीवित मायोकार्डियम और अत्यधिक संरक्षित विकासात्मक जीन7के कारण चुना गया था। हमने डोक्सोरुबिसिन उपचार के बाद वैश्विक रिजेक्शन अंश (ईएफ) दृढ़ संकल्प और 2डी तनाव के साथ सेगमेंटल डायमंड विस्थापन की तुलना की। 4डी लाइट-शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) के साथ डायमंड विस्थापन को एकीकृत करके भ्रूणीय जेब्राफिश दिलों का प्रतिपादन प्राप्त किया, डायमंड से पता चलता है कि एट्रिओवेट्रिककुलर नहर से सटे बेसल मायोकार्डियल सेगमेंट उच्चतम यांत्रिक विरूपण से गुजरते हैं और तीव्र डोक्सोरुबिसिन हृदय चोट8के लिए सबसे अधिक संवेदनशील होते हैं।

   

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को यूसीएलए इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है, और यूसीएलए कार्यालय ऑफ एनिमल रिसर्च द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुपालन में प्रयोग किए गए थे ।

1. प्रजनन टीजी (cmlc2:mCherry) ज़ेब्राफिश और भ्रूण का संग्रह

  1. आवास, प्रजनन, और भ्रूण संग्रह प्रक्रियाओं का पालन करें के रूप में पहले से स्थापित पशुपालन और प्रजनन प्रथाओं में वर्णित है । विवरण के लिए, Messerschmidt एट अल9देखें ।
  2. एलएसएफएम इमेजिंग के लिए भ्रूण की पारदर्शिता बनाए रखने के लिए ई 3 मीडियम 18 एच पोस्टफर्टिलाइजेशन में 0.003% 1-फिनाइल-2-थिओरिया (पीटीयू) के साथ एकत्र ित भ्रूण का इलाज करें।

2. हृदय की चोट को प्रेरित करने के लिए डोक्सोरुबिसिन उपचार

  1. 3 दिनों में पोस्टफर्टिलाइजेशन (डीपीएफ), ई3 मछली जल माध्यम में 10 माइक्रोन की एकाग्रता पर डोक्सोरुबिसिन के साथ भ्रूण का इलाज करें। 4 डीपीएफ के लिए 24 घंटे के उपचार के बाद, डोक्सोरुबिसिन माध्यम को ताजा E3 माध्यम से बदलें।
    सावधानी: Doxorubicin एक कीमोथेरेपी दवा है। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) की आवश्यकता है और कचरे को बायोहैज़र्ड अपशिष्ट कंटेनरों में निपटाया जाना चाहिए।

3. पायदान पाथवे मॉड्यूलेशन

  1. 3-6 डीपीएफ से E3 मछली जल माध्यम में 10 माइक्रोन की एकाग्रता पर नोच पाथवे अवरोधक (2S) -एन-[(3,5-डिफ्लोरोफेनाइल) एसीटाइल]-एल-अलिनॉल-2-फिनाइल] ग्लाइसिन 1,1-डाइमेथिलेथिल एस्टर (डीएपीटी) के साथ ज़ेब्राफिश भ्रूण का इलाज करें।
  2. माइक्रोइंजेक्ट पायदान डाउनस्ट्रीम प्रभावकों पायदान इंट्रासेलर डोमेन (एनआईसीडी) और Neuregulin-1 (एनआरजी-1) mRNA क्रमशः 1-सेल चरण जेब्राफिश भ्रूण8,10में सांद्रता पर ।
    नोट: माइक्रोइंजेक्शन इंजेक्शन की मात्रा को सही ढंग से नियंत्रित करने के लिए एक एयर पंप के समर्थन के साथ एक माइक्रोस्कोप के नीचे किया जाता है। कोशिका में एमआरएनए माइक्रोइंजेक्शन तब किया जाता है जब निषेचित अंडा पहले कोशिका चरण में होता है। MRNAs की तैयारी और अनुक्रम पर विवरण के लिए, चेन एट अल8देखें । माइक्रोइंजेक्शन और इंजेक्शन सुइयों की तैयारी के बारे में जानकारी के लिए, रोसेन एट अल10देखें ।

4. एलएसएफएम इमेजिंग और पोस्ट-इमेजिंग सिंक्रोनाइजेशन

  1. एलएसएफएम इमेजिंग तकनीकों और पोस्ट-इमेजिंग सिंक्रोनाइजेशन एल्गोरिदम के लिए, पिछले प्रकाशनों9,11में विवरण देखें।
    नोट: संक्षेप में, हमारा सिस्टम सभी ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों को छवि देने के लिए रोशनी स्रोत के रूप में एक सतत-तरंग लेजर का उपयोग करता है। डिटेक्शन मॉड्यूल दो वैज्ञानिक पूरक धातु-ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (एससीएमओएस) कैमरों और दोहरे चैनल इमेजिंग के लिए फिल्टर के दो सेट से बना है। डिटेक्शन मॉड्यूल को रोशनी विमान में लंबवत रूप से स्थापित किया गया है। प्रत्येक एलएसएफएम फ्रेम 20 एमसेक एक्सपोजर समय के भीतर अधिग्रहीत किया जाता है, जबकि क्रॉस सेक्शन में हल करने की शक्ति ~ 0.65 माइक्रोन है और लगातार फ्रेम के बीच चरण आकार ~ 2 माइक्रोन है। एमचेरी फ्लोरोसेंट संकेतों को उत्तेजित करने के लिए 589 एनएम लेजर का उपयोग किया गया था।

5. 3डी सिस्टोलिक और डायस्टोलिक हार्ट का पुनर्निर्माण

  1. पोस्ट सिंक्रोनाइजेशन एल्गोरिदम द्वारा बनाए गए फोल्डर को खोलें, फिर'आउटपुट'फोल्डर खोलें। दिल के मध्य विमान का चयन करें और इमेजजे में पूरे फ़ोल्डर लोड करें। पहले डायस्टोलिक और सिस्टोलिक चरण का पता लगाएं और फ्रेम नंबर रिकॉर्ड करें।
  2. "आउटपुट/बाय स्टेट" फ़ोल्डर खोलें और उन फ़ोल्डर्स को ढूंढें जिनके पास फ्रेम नंबरों के समान संख्याएं हैं। फ़ोल्डर में छवियों को 3डी झगड़ा (टैग किया गया छवि फ़ाइल प्रारूप) फ़ाइलों में परिवर्तित करें और उन्हें "diastole.tif" और "systole.tif" नाम दें।

6. वेंट्रिकल का विभाजन

  1. सॉफ्टवेयर का विश्लेषण छवि खोलें (सामग्री की तालिकादेखें)। क्लिक करें फाइल . डेटा खोलें,और "diastole.tif" और "systole.tif" लोड करें। इमेजिंग सेटिंग्स के अनुसार वोक्सल आकार दर्ज करें।
    नोट: इस्तेमाल किए जाने वाले एलएसएफएम सिस्टम के लिए ठेठ वोक्सल का साइज 0.65 माइक्रोन एक्स 0.65 माइक्रोन एक्स 2 माइक्रोन है।
  2. क्लिक करें'सेगमेंटेशन'पैनल और मैन्युअल रूप से दिल के वेंट्रिकल हिस्से को सेगमेंट करें। बिल्ट-इन'थ्रेसहोल्ड'टूल जो एक निश्चित तीव्रता से ऊपर के सभी क्षेत्रों का चयन कर सकता है, इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बना सकता है। वेंट्रिकल एक मजबूत फ्लोरेसेंस के साथ मोटा कक्ष है।
    नोट: खंडित वेंट्रिकल में एट्रिओवेंट्रिकुलर नहर और बहिर्वाह पथ को हटाना सुनिश्चित करें, क्योंकि यह विस्थापन विश्लेषण को प्रभावित करता है।
  3. विभाजन होने के बाद'प्रोजेक्ट'पैनल पर क्लिक करें। राइट क्लिक करें'डायस्टोल। Labels.tif" और"systole। लेबल.टिफ"कंसोल में टैब और 3D TIFF फ़ाइलों के रूप में डेटा को बचाने के लिए"निर्यात डेटापर क्लिक करें।

7. छवि पंजीकरण के लिए आयताकार समानांतर का निर्माण

  1. प्रोग्रामिंग वातावरण में"prepImage_1'mभागो (सामग्री की तालिकादेखें)। ओपन"prepImage_1.एम.एम","इम्पाथ" लाइन 5 में तो फ़ोल्डर में मूल और खंडित झगड़ा फ़ाइलें शामिल हैं, और 3डी टीफ फ़ाइलों के स्लाइस की संख्या में 4 लाइन में "स्लाइस" बदलें।
  2. कोड चलाने के बाद, यह पांच नई 3D झगड़ा फ़ाइलें उत्पन्न करेगा ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif", और "sysLabel200.tif") के साथ-साथ दो नए फ़ोल्डर्स ("resample_dia" और "resample_sys")।

8. लघु धुरी विमान के साथ सिस्टोलिक और डायस्टोलिक 3 डी दिलों का पुनर्नमूना

  1. सॉफ्टवेयर का विश्लेषण करने वाली छवि में सभी पांच 3डी झगड़ा फ़ाइलों का आयात करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: स्वर आकार अपरिवर्तित है।
  2. मल्टीप्लानर पैनल में जाएं। प्राथमिक डेटा के रूप में "diastole_200.tif" चुनें। वेंट्रिकल की ऊर्ध्वाधर लंबी धुरी के साथ एक्स-एक्सिस (XY विमान में हरी रेखा) को संरेखित करें, और वेंट्रिकल की क्षैतिज लंबी धुरी के साथ जेड-एक्सिस (वाईजेड विमान में लाल रेखा) को संरेखित करें।
    नोट: ऊर्ध्वाधर लंबी धुरी XY विमान में शीर्ष और बहिर्वाह पथ को जोड़ने वाली सबसे लंबी धुरी खोजने के द्वारा निर्धारित की जाती है, और क्षैतिज लंबी धुरी वाईजेड विमान में शीर्ष और बहिर्वाह पथ को जोड़ने वाली सबसे लंबी धुरी खोजने के द्वारा निर्धारित की जाती है। धुरी के अंत में कर्सर रखकर धुरी को घुमाएं।
  3. तिरछे वाईजेड विमान (लघु धुरी विमान) से तीन यादृच्छिक बिंदुओं को एक वामावर्त तरीके से चुनें और उनकी 3 डी स्थिति निर्देशांक रिकॉर्ड करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि अंक एक वामावर्त तरीके से चुने जाते हैं ।
  4. "systole_200.टिफ" के लिए 8.2 और 8.3 चरण दोहराएं।
  5. 'प्रोजेक्ट'पैनल पर क्लिक करें। "diastole_200.टिफ" पर सही क्लिक करके और"स्लाइस"ऑब्जेक्ट की खोज करके "diastole_200.tif" के लिए"स्लाइस"ऑब्जेक्ट बनाएं। बाएं क्लिक करें स्लाइस ऑब्जेक्ट सिर्फ बनाया है, और गुण पैनल में । विकल्प,'सेट प्लेन'की जांच करें और"प्लेन डेफिनेशन"में तीन अंक चुनें। चरण 7.3 से तीन बिंदुओं के निर्देशांक दर्ज करें।
  6. "systole_200.टिफ" के लिए चरण 8.5 दोहराएं।
    नोट: बनाई गई स्लाइस ऑब्जेक्ट का नाम'स्लाइस 2'होना चाहिए।
  7. सही क्लिक करें "diastole_200.tif" और"Resample तब्दील छवि"के लिए खोज और वस्तु बनाएं । गुण पैनल में ,'स्लाइस'को'संदर्भ'के रूप में चुनें और क्लिक करें। इसे"diastole_200.ट्रांसफॉर्मेड"नाम से एक ऑब्जेक्ट उत्पन्न करना चाहिए।
  8. सही क्लिक करें'diastole_200.बदली'और'रीसैंपल'खोजें और ऑब्जेक्ट बनाएं। 'वोक्सल साइज'को'मोड'के रूप में चुनें और गुण पैनल में एक्स= 1, वाई = 1 और जेड = 1 होने के लिए'वोक्सल साइज'को बदलें।
  9. क्लिक करें'आवेदनकरें'। इसे"diastole_200.पुनर्नमूना"नामक वस्तु उत्पन्न करनी चाहिए। सही क्लिक करें "diastole_200.resampled" और यह एक 3 डी झगड़ा फ़ाइल के रूप में बचाने के लिए ।
  10. "diaLabel.tif" और "test.tif" के लिए एक ही कदम दोहराएं। 3डी झगड़ा फ़ाइलों के रूप में "diaLabel.resampled" और "test.resampled" सहेजें। "systole_200.tif", "sysLabel.tif", और "test.tif" एक संदर्भ के रूप में"स्लाइस 2"का उपयोग कर के लिए एक ही कदम दोहराएं, और बचाने के लिए "systole_200.resampled", "sysLable.resampled", और "test2.resampled" 3D झगड़ा फ़ाइलों के रूप में ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि इस चरण में कुल छह झगड़ा फाइलें सहेजी गई हैं।

9. पुनर्नमूना दिल का विभाजन

  1. सभी छह पुनर्नमूना फाइलों को चरण 8 से इमेजजे में आयात करें। "systole_200.पुनर्नमूना" का एक टुकड़ा चुनें जिसमें एट्रिओवेनेट्रिकुलर नहर स्पष्ट रूप से कल्पना की जाती है। स्लाइस की संख्या रिकॉर्ड करें।
    1. 'छवि ' का प्रयोग करें। ट्रांसफॉर्म । इमेजजे का "फ़ंक्शन घुमाएं ताकि एट्रिओवेन्ट्रिकुलर नहर ऊर्ध्वाधर हो। सभी फाइलों पर एक ही रोटेशन लगाएं। सभी खिड़कियों को बंद करें और सभी परिवर्तनों को बचाएं।
    2. "diastole_200.पुनर्नमूना", "diaLabel.resampled", और "resample_dia" फ़ोल्डर के लिए "test.resampled", और "systole_200.resampled", "sysLable.resampled", और "2.resampled" "resample_sys" फ़ोल्डर के लिए ले जाएं ।
  2. "divider_2_8_pieces"। लाइन 395 में लाइन 5 और'इम्पाथ'में'इम्पाथ'बदलें। 22 और लाइन 411 में चर"मध्य"को स्लाइस नंबरों में बदलें जहां एट्रिओवेनेट्रिकुलर नहर को स्पष्ट रूप से "systole_200.पुनर्नमूना" और "diastole_200.पुनर्नमूना" में कल्पना की जाती है।
  3. कोड चलाएं, और प्रेरित खिड़कियों में वेंट्रिकल के केंद्र में एक बार क्लिक करें और एट्रिओवेंट्रिकुलर नहर के केंद्र में एक बार क्लिक करें। यह दोनों systole और डायस्टोल छवियों के लिए दो बार किया जाना चाहिए।

10. सिस्टोलिक और डायस्टोलिक इमेज मैट्रिस का पंजीकरण

  1. ओपन "register_3एम" और छवि फ़ोल्डर पथ के लिए 4 लाइन में"ImPath"बदलें । सिस्टम की गणना शक्ति के आधार पर इस कोड को चलाने में 5-20 सीन लग सकते हैं।
    नोट: चरण 7 में कृत्रिम रूप से निर्मित आयताकार समानांतर 3 डी कठोर पंजीकरण के लिए उपयोग किया जाता है जो तीन बिंदुओं द्वारा सब्सक्राइब किए गए दो बिंदुओं और कोणों के बीच की दूरी को बरकरार रखता है। जब अंत-डायस्टोल आयताकार समानांतर (लाल) को अंतिम-सिस्टोल आयताकार समानांतर (हरा) में पंजीकृत किया जाता है, तो आगामी असतत 3 डी स्थान कठोर परिवर्तन के एक अद्वितीय मैट्रिक्स के व्युत्पन्न की अनुमति देता है जिसमें अंत-डायस्टोल मैट्रिक्स से अंत-सिस्टोल मैट्रिक्स(चित्र ा 1एच)तक रोटेशन और अनुवाद शामिल है। हम छवि प्रसंस्करण टूलबॉक्स (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके परिवर्तन के बाद मैट्रिक्स को डिशोर करने के लिए पंजीकरण और नियमित ऊर्जा न्यूनीकरण करते हैं। एक विस्तृत गणितीय विवरण के लिए, कृपया चेन एट अल8देखें ।

11. विस्थापन वेक्टर का उत्पादन

  1. ओपन"displacement_4"औरबदल"ImPath"लाइन 4 में छवि फ़ोल्डर पथ के लिए ।
  2. भागो"displacement_4",जो "वेक्टर" फ़ोल्डर में एक "vector8.txt" फ़ाइल उत्पन्न करता है। एक बार "vector8.txt" फ़ाइल खुली है, वहां एक 8 x 4 मैट्रिक्स होगा । मैट्रिक्स की प्रत्येक पंक्ति में चार संख्याएं होती हैं, जो एक्स घटक, वाई घटक, जेड घटक और वेंट्रिकल के एक विशिष्ट खंड के विस्थापन वेक्टर के योग परिमाण हैं।
    नोट: विस्थापन वेक्टर 3 डी अंतरिक्ष में प्रत्येक खंड के द्रव्यमान सेंट्रोइड के विस्थापन की गणना करके प्राप्त किया जाता है। हम सिस्टोल से डायस्टोल(चित्रा 1 Equation CK जे)तक विभाजन डेटासेट में प्रत्येक खंड (आई-VI) के क्रमशः एक्स, वाई या जेड समन्वय (जहां कश्मीर एक्स, वाई या जेड समन्वय) को इंगित करता है (पीएस और पीडी)की गणना करते हैं। हम इस प्रकार 3डी स्पेस में मास सेंट्रोइड Equation CK को परिभाषित करते हैं:
    Equation 1
    जहां सीएक्स = एक्स, सीवाई = वाई, और सीजेड = जेड, एमआई = प्रत्येक सेगमेंट का द्रव्यमान (आई ओँसोट आई =VI), एम = प्रत्येक सेगमेंट के स्वरों की संख्या, और सेगमेंट किए गए क्षेत्र के रूप में घनत्व कार्य 1 है जबकि बाकी 0 है। एक्स-, वाई-, और जेड-कुल्हाड़ियों और योग विस्थापन वेक्टर के साथ उप-विस्थापन वेक्टर के एल2-आदर्श की गणना हृदय चक्र के दौरान की जाती है। मैट्रिक्स में कुल आठ पंक्तियां हैं। पहली पंक्ति और आठवीं पंक्ति में एट्रिओवेंट्रिकुलर नहर होती है और इस प्रकार हमारे विश्लेषण में अनदेखी की जाती है। मैं छठी से सेगमेंट सातवीं पंक्ति के लिए दूसरी पंक्ति द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं ।

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Representative Results

3डी सेगमेंटल कार्डियक फंक्शन का आकलन करने के लिए डायमंड को जिस प्रक्रिया के द्वारा विकसित किया गया था, उसे चित्रा 1में प्रस्तुत किया गया है । भ्रूणीय जेब्राफिश हार्ट(चित्रा 1ए)के 3डी में एलएसएफएम छवि अधिग्रहण और पुनर्निर्माण के बाद, सही छोटी धुरी विमान ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज लंबी कुल्हाड़ियों के लिए लंबवत विमान के रूप में निर्धारित किया गया था, जिनमें से दोनों एक मल्टीप्लेन दर्शक(चित्रा 1बी)में निर्धारित किए जाते हैं। दिल तो छोटे धुरी विमान(चित्रा 1सी)के साथ फिर से नमूना था, और आठ बराबर एक आभासी विभाजन लाइन (लाल बिंदीदार लाइन) एट्रिओवेंट्रिकल नहर(चित्रा 1ई)के केंद्र को एंडोकार्डियल वेंट्रिकुलर गुहा के केंद्र को जोड़ने के अनुसार भी कोणों द्वारा गठित आठ बराबर खंडों में विभाजित किया गया था । पहचाने गए खंडों के 3डी चित्रण को क्रॉस-सेक्शनल व्यू(चित्रा 1एफ)और कच्चे डेटा(चित्र ा 2)की तुलना में सचित्र किया गया है। सेगमेंट सातवीं और आठवीं को विश्लेषण से हटा दिया गया क्योंकि वे एट्रिओवेट्रिककुलर नहर को शामिल करते हैं और इस प्रकार अन्य खंडों की तुलना में कम मायोकार्डियम होते हैं। एंड-सिस्टोल (एचएस)और एंड-डायस्टोल (एचडी)के लिए अलग-अलग रिसैंपलिंग विमान ों से अंत-सिस्टोलिक और एंड-डायस्टोलिक मैट्रिक्स के लिए अलग-अलग समन्वय प्रणालियां बन जाती हैं, जिन्हें उनके मूल स्थानिक संबंध(चित्र 1जी)को बहाल करने के लिए पंजीकृत करने की आवश्यकता होती है। अंत सिस्टोलिक मैट्रिक्स की समन्वय प्रणाली को स्थिरता के संदर्भ के रूप में चुना गया था। अंत-डायस्टोलिक मैट्रिक्स से अंत-सिस्टोलिक मैट्रिक्स तक परिवर्तन मैट्रिक्स (टीएम)निर्धारित करने के लिए, तीन समानांतर मैट्रिक्स का मैट्रिक्स, जो 3 डी में विषम है और मूल छवि मैट्रिक्स के समान आयाम है, वस्तुतः बनाया गया था। समानांतर ों को दो बार फिर से नमूना दिया गया था, पहले अंत-सिस्टोल मैट्रिक्स के छोटे अक्ष विमान में, और फिर अंत-डायस्टोल मैट्रिक्स के छोटे अक्ष विमान में, जिससे अंत-सिस्टोल (हरे) और अंत-डायस्टोल्स (लाल)(चित्रा 1एच)के लिए अलग-अलग रूपांतरित समानांतर हो गए।

हरे और लाल समानांतर तो एक कठोर शरीर पंजीकरण एल्गोरिथ्म द्वारा एक साथ पंजीकृत किया गया था और टीएम की गणना की गई थी और निर्देशांक(चित्र 1I)को बहाल करने के लिए अंत-डायस्टोल मैट्रिक्स पर लागू किया गया था। यह प्रक्रिया हृदय चक्र(चित्रा 1जे)के दौरान वेंट्रिकल के किसी भी खंड से बड़े पैमाने पर सेंट्रोइड के विस्थापन वैक्टर के 3 डी अंतरिक्ष में बाद की ट्रैकिंग की अनुमति देती है। वेंट्रिकुलर सेगमेंट का डायमंड विस्थापन I-VI हृदय चक्र(चित्रा 1K)में कई समय बिंदुओं के दौरान ट्रैक किया जा सकता है, जिसे मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अंतिम-सिस्टोल से लेकर एंड-डायस्टोल(चित्रा 1एल)तक दो समय अंक तक सरल बनाया जा सकता है। डायमंड द्वारा उत्पन्न खंडों को चित्रा 2में कल्पना की जा सकती है, जहां प्रत्येक रंग एक हृदय खंड का प्रतिनिधित्व करता है।

डायमंड के साथ, हमने कार्डियक फ़ंक्शन की खंडीय विषमता और जेब्राफिश में डोक्सोरुबिसिन-प्रेरित मायोकार्डियल चोट के लिए संवेदनशीलता का पर्दाफाश किया। 3-4 डीपीएफ(चित्रा 3ए)से 10 माइक्रोन डोक्सोरुबिसिन के साथ 24 घंटे के उपचार के बाद, हमने नियंत्रण और कीमोथेरेपी-उपचारित समूहों(चित्रा 3बी)और उपचार के बाद 48 घंटे(चित्रा 3सी)के बीच वेंट्रिकुलर सेगमेंट के डायमंड विस्थापन की तुलना की। सभी डायमंड आंकड़े एक ही ग्राफिकल पैटर्न का पालन करते हैं क्योंकि छोटी धुरी(चित्रा 1ई)के साथ पुनर्नमूना वेंट्रिकल्स। डेटा को विस्थापन वेक्टर के एल2-आदर्श को दिल के भीतरी परिधि में सामान्य करके प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, जिसमें एक्स (हरा), वाई (नीला), और जेड घटक (नारंगी) उनके भारित योगदान के रूप में सचित्र होते हैं। 4 डीपीएफ पर, नियंत्रण मछली में खंडीय विस्थापन वेक्टर का औसत L2-आदर्श सामान्यीकरण के बाद 6.6-11.3 माइक्रोन या 3.8-6.6% से लेकर हुआ। हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि नियंत्रण स्थितियों के तहत, बेसल सेगमेंट मैं और छठी सबसे बड़े विस्थापन से गुजरते हैं और डोक्सोरुबिसिन प्रेरित हृदय चोट के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं(चित्रा 3बी,6.6-4.7%, एन = 10 नियंत्रण और एन = 8 डोक्सोरुबिसिन, पी एंड एलटी; 0.01) से कमी। 6 डीपीएफ पर, नियंत्रण मछली में खंडीय विस्थापन वेक्टर का औसत L2-आदर्श सामान्यीकरण के बाद 6.8-14 माइक्रोन या 3.9-8% से लेकर हुआ। 6 डीपीएफ में, बेसल सेगमेंट मैंने और VI ने स्तरों को नियंत्रित करने के लिए डायमंड विस्थापन बरामद किया, जो खंडीय उत्थान(चित्रा 3सी,एन = 10 नियंत्रण और एन = 8 डोक्सोरुबिसिन) का सुझाव देता है। समानांतर में, 2डी बेसल स्ट्रेन में -53 से -38% तक 2डी बेसल स्ट्रेन में बिगड़ती हुई 4 डीपीएफ पर डोक्सोरुबिसिन उपचार के बाद देखी गई, जिसके बाद 6 डीपीएफ पर नियंत्रण स्तर पर वापसी हुई, जिससे डायमंड विस्थापन परिणामों की पुष्टि(चित्रा 3डी, 3E)। 6 डीपीएफ पर रिकवरी के साथ 4 डीपीएफ पर डोक्सोरुबिसिन के जवाब में ग्लोबल रिजेक्शन अंश में समानांतर कमी भी देखी गई(चित्रा 3एफ, 3जी)।

हम अगले डोक्सोरुबिसिन उपचार और पायदान मार्ग मॉड्यूलेशन के दौरान डायमंड लागू नॉच अवरोधक DAPT और बचाव का उपयोग कर पायदान डाउनस्ट्रीम प्रभावक एनआईसीडी और एनआरजी1 mRNA(चित्रा 4ए)का उपयोग कर । एनआईसीडी और एनआरजीएन माइक्रोइंजेक्शन ने 4 डीपीएफ(चित्रा 4बी, 4डी)में तीव्र कीमोथेरेपी-प्रेरित चोट के बाद डायमंड विस्थापन और ईएफ में कमी को बचाया। डोक्सोरुबिसिन के साथ नॉच अवरोधक DAPT के संपर्क में आने से बेसल सेगमेंट I और VI(चित्रा 4बी)के अलावा डायमंड विस्थापन में अधिक फैलाना कम हुआ। इसके अलावा, कीमो-प्रेरित चोट के बाद पायदान मार्ग के अवरोध ने 6 डीपीएफ पर बेसल खंडों और ईएफ के डायमंड विस्थापन की वसूली में और रुकावट पैदा की। अवरोध को नॉच डाउनस्ट्रीम इफेक्टर एनआईसीडी और एनआरजी1 (चित्रा 4सी, 4E)द्वारा बचाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: 4डी डायमंड विस्थापन विकास। (A)कच्चे चित्रों को प्रकाश-शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा कैप्चर किया गया था। (बी और सी)खंगाला 3डी हार्ट सच कम धुरी विमान देखने के साथ फिर से नमूना था । (D)भ्रूणीय जेब्राफिश हृदय का योजनाबद्ध चित्रण। (ई और एफ)सातवीं और आठवीं खंडों को छोड़कर आठ खंडों में वेंट्रिकल के विभाजन के 2डी और 3 डी चित्र । (जी)रिसैंपलिंग के बाद एंड-सिस्टोल और एंड डायस्टोल की विभिन्न समन्वय प्रणालियां । (ज)परिवर्तन मैट्रिक्स (टीएम)की पीढ़ी के लिए आयताकार समानांतर ों का एक समूह बनाया गया था। (I)टीएमलागू करके पंजीकृत एंड-सिस्टोलिक और एंड-डायस्टोलिक समन्वय प्रणाली । (जम्मू)खंडीय मास सेंट्रोइड के विस्थापन वेक्टर अंत से अंत-डायस्टोल तक। (K)कार्डियक चक्र में कई समय बिंदुओं के दौरान वेंट्रिकुलर सेगमेंट का हीरा विस्थापन मैंने-VI ट्रैक किया। (L)वेंट्रिकुलर सेगमेंट का डायमंड विस्थापन मैं-VI अंत-सिस्टोल से अंत-डायस्टोल तक। चेन एट अल8 से यह आंकड़ा अमेरिकन सोसायटी फॉर क्लीनिकल इन्वेस्टिगेशन (ASCI) से अनुमति के साथ पुन: पेश किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: भ्रूणीय जेब्राफिश दिल का हीरा विभाजन 3 डी में कच्चे डेटा की तुलना में। भ्रूणीय जेब्राफिश हृदय को डायमंड विस्थापन (बाएं) की गणना के लिए विभिन्न रंगों में यहां चित्रित छह खंडों (मात्रा) में विभाजित किया गया था। डायमंड द्वारा गणना किए गए प्रत्येक खंड का विस्थापन वेक्टर इसके सेगमेंटल कार्डियक फ़ंक्शन का प्रतिनिधित्व करता है। विभाजन के दौरान एट्रियम और बहिर्वाह पथ को हटा दिया गया था। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: हीरा हृदय समारोह में खंडीय विषमता और कीमोथेरेपी प्रेरित चोट के लिए संवेदनशीलता को सुलझाता है । (A)डोक्सोरुबिसिन उपचार का प्रायोगिक कार्यक्रम। (बी और सी)डायमंड विस्थापन वेक्टर की खंडीय तुलना 4 और 6 डीपीएफ (टी परीक्षण, **पी एंड एलटी; 0.01, एन = 8-10 प्रति समूह) पर नियंत्रण और डोक्सोरुबिसिन-उपचारित समूहों के बीच आंतरिक मायोकार्डियल परिधि के लिए सामान्यीकृत की गई। (डी और ई)वेंट्रिकुलर बेस में तनाव का आकलन डायमंड विस्थापन वैक्टर (*पी एंड एलटी; ०.०५, एन = 6-8 प्रति समूह) के रूप में एक समान चोट और उत्थान पैटर्न का चित्रण करता है । (एफ और जी)वैश्विक वेंट्रिकुलर स्तर पर खंडीय हीरा विस्थापन के समान पैटर्न के बाद 6 डीपीएफ पर वसूली के साथ 4 डीपीएफ पर डोक्सोरुबिसिन के जवाब में रिजेक्शन अंश में कमी (टी परीक्षण, **पी एंड एलटी; 0.01, त्रुटि बार एसईएम, एन = 6-10 प्रति समूह)। चेन एट अल8 से यह आंकड़ा ASCI से अनुमति के साथ पुन: पेश किया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: डोक्सोरुबिसिन-प्रेरित चोट के बाद नॉच-मध्यस्थता मायोकार्डियल वसूली के आकलन के लिए डायमंड यांत्रिकी। (A)प्रायोगिक अनुसूची। (बी और सी) एनआईसीडी और एनआरजी1 नॉच डाउनस्ट्रीम इफेक्टरों ने 4 डीपीएफ पर सेगमेंट I और VI में डायमंड विस्थापन की कमी को बचाया । 6 डीपीएफ में, डीएपीटी द्वारा नॉच सिग्नलिंग के अवरोध ने खंडीय हृदय समारोह (एनोवा, **पी एंड एलटी; 0.01 डॉक्स बनाम नियंत्रण; †पी एंड एलटी; 0.05, ††पी एंड एलटी; 0.01, डॉक्स + डीएपीटी बनाम नियंत्रण, एन = 6-10 प्रति समूह) की बहाली को बाधित किया। (डी और ई)रिजेक्शन अंश वैश्विक स्तर पर डायमंड यांत्रिकी की पुष्टि करता है (एनोवा, *पी एंड एलटी; 0.05, **पी एंड एलटी; 0.01, त्रुटि सलाखों सेम, एन = 5-11 प्रति समूह)। चेन एट अल8 से यह आंकड़ा ASCI से अनुमति के साथ पुन: पेश किया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

खंडीय मायोकार्डियल फ़ंक्शन के परिमाणीकरण के लिए एक कठोर रणनीति पारंपरिक ईएफ से परे हृदय यांत्रिकी का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है, जिसे मायोकार्डियल चोट1,4,12का एक असंवेदनशील और विलंबित संकेतक माना जाता है। इसलिए, प्रारंभिक मायोकार्डियल परिवर्तनों के मार्कर में रुचि बढ़ रही है, और साहित्य का एक बढ़ता हुआ शरीर वेंट्रिकुलर डिसफंक्शन4,13का पूर्वानुमान लगाने के लिए प्रारंभिक संकेतक के रूप में मायोकार्डियल विरूपण मापदंडों का समर्थन करता है। बाएं वेंट्रिकुलर (एलवी) तनाव का इकोकार्डियोग्राफिक माप मायोकार्डियल विरूपण माप13की एक स्थापित विधि प्रदान करता है। हालांकि, ऊतक डॉप्लर आधारित तनाव इमेजिंग कोण निर्भरता और इंट्राऑब्जर्वर और इंटरऑब्जर्वर परिवर्तनशीलता14के कारण कई कमियों से ग्रस्त है। स्पेक्टल ट्रैकिंग इकोकार्डियोग्राफी (STE) कोण-स्वतंत्र 2डी और 3 डी ऊतक विरूपण को हल कर सकता है, लेकिन 2डी स्पेक्टल ट्रैकिंग की सटीकता विमान गति6के माध्यम से प्रभावित होती है, जबकि 3 डी स्पेक्टल ट्रैकिंग के लिए 3डी में सकारात्मक अल्ट्रासाउंड हस्तक्षेप पैटर्न (धब्बे) को हल करने के लिए बेहतर स्थानिक संकल्प की आवश्यकता होती है और फ्रेम15के बीच धब्बे को ट्रैक करने के लिए उच्च अस्थायी संकल्प। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम जेब्राफिश में 4डी सेगमेंटल कार्डियक फंक्शन के वीवो क्वाटिफिकेशन में डायमंड विस्थापन को एक उपन्यास मायोकार्डियल विरूपण पैरामीटर के रूप में वर्णित करते हैं। संदर्भ मानकों के रूप में ईएफ और 2डी तनाव की तुलना में, डायमंड विमान गति से प्रभावित हुए बिना अतिरिक्त खंडीय विरूपण जानकारी प्रदान करता है। 4D LSFM के साथ डायमंड को एकीकृत करके, हमारी तकनीक चौड़ाई में 20-30 माइक्रोन के विस्थापन वेक्टर का आकलन कर सकती है, जो वर्तमान में सबसे उन्नत 3डी STE सिस्टम के लिए भी असंभव है, जिसमें मिलीमीटर-रेंज रिज़ॉल्यूशन16है।

   

डायमंड लागू करने के लिए, भ्रूणीय जेब्राफिश दिल की शारीरिक संरचना की व्यापक समझ होना महत्वपूर्ण है। छवि विभाजन के दौरान, यह आवश्यक है कि एट्रिओवेन्ट्रिकुलर नहर और बहिर्वाह पथ की सही पहचान की जाती है और बाकी मायोकार्डियम से खंडित किया जाता है जब उपयोगकर्ता प्रोटोकॉल में चरण 6 का प्रदर्शन कर रहा होता है। इसके अलावा, वेंट्रिकल के क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर लंबी कुल्हाड़ियों को 8 चरण में छवि पुनर्नमूनाकरण के लिए सही छोटे अक्ष विमान को प्राप्त करने के लिए सही तरीके से निर्धारित किया जाना चाहिए।

डायमंड लागू करने का प्रमुख दर सीमित कारक वेंट्रिकल का मैनुअल विभाजन है, जो हृदय चक्र के दौरान कई चरणों का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होने पर समय लेने वाला हो जाता है। मशीन लर्निंग और तंत्रिका नेटवर्क की उन्नति के साथ, एक स्वचालित हृदय विभाजन विधि17,18,19,20 को पूरे हृदय चक्र में खंडीय हृदय समारोह की निगरानी प्रदान करने के लिए डायमंड के साथ एकीकृत किया जा सकता है। डायमंड के आगे के अनुप्रयोगों में इकोकार्डियोग्राफी, माइक्रो-सीटी, या माइक्रो-एमआरआई के साथ एकीकरण भी शामिल है, जो हृदय की चोट और पुनर्जनन21के मल्टीस्केल मूल्यांकन के लिए बड़े पशु मॉडल में उपयुक्त है। हालांकि, विधि को पहले मायोकार्डियल फाइबर की उपस्थिति के अनुकूलन की आवश्यकता होगी जिससे स्तनधारियों में22,23में टोरसिशन सहित अधिक जटिल हृदय विरूपण होता है।

कुल मिलाकर, डायमंड शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों के तहत भ्रूणीय जेब्राफिश में खंडीय हृदय समारोह का मूल्यांकन करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रदान करता है और इससे जुड़े रास्तों की वीवो स्क्रीनिंग में उच्च-थ्रूपुट के लिए एक मंच के रूप में उपयोग किया जा सकता है कीमोथेरेपी प्रेरित हृदय विषाक्तता।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि हितों का कोई टकराव मौजूद नहीं है ।

Acknowledgments

वर्तमान कार्य अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान 16SDG30910007 और 18CDA34110338 द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थानों HL083015, HL111437, HL118650, और HL129727 द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amira6 FEI Image analyzing software
DAPT Millipore Sigma D5942-5MG
Doxorubicin hydrochloride Millipore Sigma D1515-10MG
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Millipore Sigma E10521-10G Tricaine
MATLAB MathWorks Programming environment
MATLAB Image Processing Toolbox MathWorks Image processing toolbox

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