心肌机械变形(DIAMOND)的位移分析揭示了胚胎斑马鱼心脏功能的分段异质性

Developmental Biology

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Summary

该协议的目的是详细说明一种在生理和病理条件下评估胚胎斑马鱼分段心脏功能的新方法。

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Chen, J., Packard, R. R. S. Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish. J. Vis. Exp. (156), e60547, doi:10.3791/60547 (2020).

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Abstract

斑马鱼越来越多地被用作心肌病和再生的模范生物体。目前评估心脏功能的方法无法可靠地检测分段力学,在斑马鱼中不容易实现。在这里,我们提出了一种半自动化的开源方法,用于四维(4D)分段心脏功能的定量评估:心肌机械变形(DIAMOND)的位移分析。转基因胚胎斑马鱼在体内使用具有4D心脏运动同步的光片荧光显微镜系统进行成像。获得 3D 数字心脏在端端和端端重建,心室被手动分割成二进制数据集。然后,心脏被重新定向,沿着真正的短轴对同热带重新采样,心室沿着短轴均匀地分成八个部分(I+VIII)。由于在端缩和端斜面处的不同重采样平面和矩阵,应用了变换矩阵进行图像配准,以恢复重新采样收缩体和舒张影像矩阵之间的原始空间关系。图像配准后,根据三维(3D)中质量质心的位移计算了从端向到端面各段的位移量。DIAMOND 显示,与眼道相邻的基底心肌段经历最高的机械变形,并且最易受到多索布辛引起的心脏损伤。总体而言,DIAMOND 为斑马鱼胚胎中除传统喷射分数 (EF) 之外在生理和病理条件下的分段心脏力学提供了新见解。

Introduction

化疗引起的心脏毒性和随后的心力衰竭是化疗中止的主要原因之一。因此,心脏功能评估在心脏毒性的鉴定中起着至关重要的作用,更重要的是,在预测化疗的早期心脏损伤方面起着至关重要的作用。然而,目前心脏功能评估的方法遇到了限制。方法,如左心室弹出分数(LVEF)只提供全局和经常延迟的心脏力学受伤后3,4。组织多普勒成像提供段状心肌变形信息,但存在显著的观察者内和观察者间变异性,部分原因在于超声波光束角度依赖5。二维(2D)斑点跟踪采用B型超声心动图,理论上消除了角度依赖,但其精度受到平面外运动6的限制。因此,在研究和临床环境中都缺乏量化分段心脏功能的严格方法。

在此背景下,我们开发了一种4D定量方法,用于分析分段心脏功能,将心肌机械变形(DIAMOND)的位移分析命名为"MOND",以确定3D空间中心肌质量质心的位移载体。我们应用DIAMOND在体内评估心脏功能和多索鲁比辛引起的心脏毒性与斑马鱼(达尼奥雷里奥)作为动物模型,选择由于它们再生心肌和高度保守的发育基因7。我们进一步比较了段段 DIAMOND 位移与全球喷射分数 (EF) 测定和二维应变后多索鲁比素处理。通过结合DIAMOND位移与4D光片荧光显微镜(LSFM)获得渲染胚胎斑马鱼心脏,DIAMOND表明,基底心肌段毗邻眼道发生最高的机械变形,是最容易急性多索布辛心脏损伤8。

   

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Protocol

此处描述的所有方法均已获得加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准,实验均符合加州大学洛杉矶分校动物研究办公室批准的协议。

1. 繁殖Tg(cmlc2:mCherry)斑马鱼和胚胎采集

  1. 遵循先前建立的饲养和育种实践中所述的住房、育种和胚胎收集程序。有关详细信息,请参阅梅塞施密特等人9
  2. 在E3培养基18 h后受精中,用0.003%1-苯基-2-硫尿(PTU)处理采集的胚胎,以保持LSFM成像胚胎的透明度。

2. 多索鲁比素治疗,引引心脏损伤

  1. 在受精后3天(dpf),在E3鱼水培养基中,用多索鲁比素在10μM浓度下处理胚胎。经过24小时处理到4 dpf后,用新鲜的E3介质替换多索鲁比辛介质。
    注意:多索鲁比辛是一种化疗药物。需要适当的个人防护设备(PPE),废物应放在生物危害废物容器中处理。

3. 凹槽通路调制

  1. 用Notch通路抑制剂(2S)-N-*(3,5-二氟化苯甲苯)乙酰-L-苯-2-苯基+甘氨酸1,1-二甲基乙酯(DAPT)在E3鱼水培养基中浓度为10μM的E3鱼水培养基从3-6 dpf处理斑马鱼胚胎。
  2. 将微孔下游效应器在细胞内域(NICD)Neuregulin-1(Nrg-1)mRNA中分别注入1细胞级斑马鱼胚胎8,10。
    注:在空气泵的支持下,在显微镜下进行显微注射,以准确控制注入的体积。当受精卵处于第一个细胞阶段时,将mRNA显微注射到细胞中。有关mRNA的准备和顺序的详细信息,见陈等人8。有关注射针的显微注射和制备的详细信息,请参阅 Rosen 等人10。

4. LSFM 成像和成像后同步

  1. 有关 LSFM 成像技术和后映像同步算法,请参阅以前的出版物9、11中的详细信息。
    注:简而言之,我们的系统利用连续波激光作为照明源,对所有转基因斑马鱼线进行成像。检测模块由两个科学互补的金属氧化物半导体(sCMOS)摄像机和两组双通道成像滤波器组成。检测模块垂直安装在照明平面上。每个 LSFM 帧在 20 毫秒的曝光时间内获取,而横截面的解析功率为 ±0.65 μm,连续帧之间的步长大小为 ±2 μm。589 nm 激光器用于激发 mCherry 荧光信号。

5. 重建3D收缩和舒张心

  1. 打开由后同步算法创建的文件夹,然后打开"输出"文件夹。选择心脏的中间平面,并将整个文件夹加载到 ImageJ 中。找到第一个舒张和收缩相并记录帧号。
  2. 打开"输出/按状态"文件夹,查找与刚刚记录的帧编号具有相同编号的文件夹。将文件夹中的图像转换为 3D TIFF(标记的图像文件格式)文件,并将其命名为"diastole.tif"和"systole.tif"。

6. 心室的分割

  1. 打开图像分析软件(参见材料表)。单击文件 |打开数据,并加载"diastole.tif"和"systole.tif"。根据成像设置输入体素大小。
    注:对于使用的 LSFM 系统,典型体素大小为 0.65 μm x 0.65 μm x 2 μm。
  2. 单击"SEGMENTATION"面板并手动分割出心脏心室部分。内置的"阈值"工具,可以选择高于一定强度的所有区域,可以促进此过程。心室是较厚的室,具有更强的荧光。
    注:请确保移除分段心室中的眼道和流出道,因为这会影响位移分析。
  3. 完成分段后,单击"项目"面板。右键单击"直径。标签.tif""systole。标签.tif"在控制台中的选项卡,然后单击"导出数据为"保存数据作为3D TIFF文件。

7. 为图像注册创建矩形平行图

  1. 在编程环境中运行"prepImage_1.m"(参见材料表)。在第 5 行中打开"prepImage_1.m","ImPath",使文件夹包含原始和分段的 TIFF 文件,并将第 4 行中的"切片"更改为 3D tif 文件的切片数。
  2. 运行代码后,它将生成五个新的 3D TIFF 文件("test.tif"、"diastole_200.tif"、"systole_200.tif"、"diaLabel.tif"和"sysLabel200.tif")以及两个新文件夹("resample_dia"和"resample_sys")。

8. 沿短轴平面重新采样收缩和舒张 3D 心

  1. 将所有五个 3D TIFF 文件导入图像分析软件(参见材料表)。
    注: 体素大小不变。
  2. 转到"多普拉纳"面板。选择"diastole_200.tif"作为主数据。将 X 轴(XY 平面中的绿线)与心室的垂直长轴对齐,并将 Z 轴(YZ 平面中的红线)与心室的水平长轴对齐。
    注: 垂直长轴是通过在 XY 平面中查找连接顶点和流出区的长轴来确定的,而水平长轴是通过查找连接 YZ 平面顶点和流出区的长轴来确定的。通过将光标放在轴的末端来旋转轴。
  3. 以逆时针方式从倾斜 YZ 平面(短轴平面)中选择三个随机点,并记录其 3D 位置坐标。
    注:确保以逆时针方式选择点。
  4. 对"systole_200.tif"重复步骤 8.2 和 8.3。
  5. 单击"项目"面板。通过右键单击"diastole_200.tif"并搜索"切片"对象,为"diastole_200.tif"创建"切片"对象。左键单击刚刚创建的切片对象,并在"属性"面板中单击 |选项,选中"设置平面",并在"平面定义"中选择三个点。输入步骤 7.3 中三个点的坐标。
  6. 重复步骤 8.5,"systole_200.tif"。
    注: 创建的切片对象应具有名称"切片 2"。
  7. 右键单击"diastole_200.tif"并搜索"重新采样转换的图像"并创建对象。在"属性"面板中,选择"切片"作为"参考",然后单击"应用"。这将生成名为"diastole_200.转换"的对象。
  8. 右键单击"diastole_200.转换"并搜索"重新采样"并创建对象。选择"体素大小"作为"模式",并将"体素大小"更改为 x = 1,y = 1,z = 1。"属性"面板中的"体素大小"更改为 x = 1,z = 1。
  9. 单击"应用"。这将生成名为"diastole_200.重新采样"的对象。右键单击"diastole_200.重新采样"并将其保存为 3D TIFF 文件。
  10. 对"diaLabel.tif"和"test.tif"重复相同的步骤。将"diaLabel.重新采样"和"测试.重新采样"保存为 3D TIFF 文件。对"systole_200.tif"、"sysLabel.tif"和"test.tif"重复相同的步骤,使用"切片 2"作为参考,并将"systole_200.重新采样"、"sysLable.重新采样"和"test2.重新采样"保存为 3D TIFF 文件。
    注: 确保在此步骤中共保存了六个 TIFF 文件。

9. 重新取样的心脏的分裂

  1. 将步骤 8 的所有六个重新采样的文件导入 ImageJ。选择一块"systole_200.重新采样",其中眼纹管被清晰地可视化。记录切片数。
    1. 使用"图像 |转换 |旋转"图像J"功能,使眼道垂直。对所有文件应用相同的旋转。关闭所有窗口并保存所有更改。
    2. 将"diastole_200.重新采样"、"diaLabel.重新采样"和"测试.重新采样"移动到"resample_dia"文件夹,并将"systole_200.重新采样"、"sysLable.重新采样"和"test2.重新采样"移动到"resample_sys"文件夹。
  2. 打开"divider_2_8_pieces"。将第 5 行中的"ImPath"和第 395 行中的"ImPath"更改为图像目录。将第 22 行和第 411 行中的变量"中间"更改为切片编号,其中三角管在"systole_200.重新采样"和"diastole_200重新采样"中清晰显示。
  3. 运行代码,在提示窗口中单击心室中心一次,然后单击一次,单击一次, 单击耳道中心。这需要两次为systole和diastosa图像。

10. 收缩和舒张图像矩阵的登记

  1. 打开"register_3.m",并将第 4 行中的"ImPath"更改为图像文件夹路径。根据系统的计算能力,运行此代码可能需要 5 到 20 分钟。
    注: 步骤 7 中人工创建的矩形平行表用于 3D 刚性注册,以保留两个点和三个点订阅的角度之间的距离。当端端矩形平行(红色)注册到端向矩形平行(绿色)时,随后的三维位置允许派生一个独特的刚性变换矩阵,该矩阵包括旋转和从端正矩阵转换为端正矩阵(图 1H)。我们使用图像处理工具箱执行配准和正则化能量最小化,在变换后降低矩阵的噪声(参见材料表)。有关详细的数学描述,请参阅陈等人8。

11. 位移向量的输出

  1. 打开"displacement_4.m",并将第 4 行中的"ImPath"更改为图像文件夹路径。
  2. 运行"displacement_4.m",在"矢量"文件夹中生成"矢量8.txt"文件。一旦"vector8.txt"文件打开,将有一个8 x 4矩阵。矩阵的每一行都有四个数字,即 X 分量、Y 分量、Z 分量和心室特定段位移矢量的 SUM 量。
    注:置换矢量是通过计算3D空间中每个段质量质心的位移而获得的。我们计算分割数据集中每个段(I-VI)中每个段(I-VI)的3D质量质心积(PS和PD)坐标Equation CK(其中k分别表示X、Y或Z坐标),从systole到diastole(图1J)。我们在 3D 空间Equation CK中定义质量质心,如下所示:
    Equation 1
    其中 Cx = X,Cy = Y,Cz = Z,Mi = 每个段的质量 (I = i = VI),m = 每个段的体素数,和 = 密度函数作为分段区域为 1,而其余为 0。沿 X 轴、Y 轴和 Z 轴和总和位移向量沿子位移矢量的 L2 规范在心脏周期内计算。矩阵中共有八行。第一行和第八行包含三角管,因此在我们的分析中被忽略。段 I 到 VI 由第二行表示到第七行。

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Representative Results

图1给出了开发DIAMOND评估3D分段心脏功能的过程。在胚胎斑马鱼心的3D图像采集和重建后(1A),将真正的短轴平面确定为垂直于垂直和水平长轴的平面,这两个轴在多平面查看器中确定(图1B)。然后沿短轴平面(图 1C)对心脏进行重新采样,并根据连接心室中心与心室中心(图 1E) 的虚拟分割线(红色虚线)以均匀角度构成八个相等的段。识别段的 3D 描述在横截面视图(图 1F)中与原始数据(图 2)中进行了说明。第七段和第八段被从分析中删除,因为它们包含三角管,因此与其他部分相比,其心肌含量较少。端斜面 (HS)和端斜面 (HD) 的不同重采样平面导致端收缩矩阵和端舒张矩阵的不同坐标系,需要注册才能恢复其原始空间关系(图 1G)。选择端收缩矩阵的坐标系作为一致性的参考。为了确定从端舒张矩阵到端收缩矩阵的变换矩阵 (Tm),实际上创建了三个平行表的矩阵,该矩阵在 3D 中是不对称的,与原始图像矩阵的尺寸相同。平行表被重新采样两次,首先在端轴矩阵的短轴平面上,然后在端状矩阵的短轴平面上,导致端状(绿色)和端面(红色)的不同变换的平行面(1H)。

然后,通过刚体配准算法将绿色和红色平行表一起注册,并计算 Tm并将其应用于端正矩阵以恢复坐标(图 1I)。此过程允许在心脏周期期间从心室任何部分进行质量质心质位移量的3D空间进行后续跟踪(图1J)。在心脏周期的多个时间点(图1K)中,可以跟踪心室段I+VI的DIAMOND位移(图1K),可以简化定量分析到两个时间点,从端向到端点(1L)。DIAMOND生成的段可以在图2中可视化,其中每种颜色表示一个心脏段。

通过DIAMOND,我们发现了斑马鱼心脏功能的分段异质性和对多索布林引起的心肌损伤的易感性。在用3⁄4 dpf的10μM多索布辛(3A)进行24小时治疗后,我们比较了对照组和化疗治疗组之间的心室段的DIAMOND位移(图3B)和治疗后的48小时(图3C)。所有 DIAMOND 图形都遵循与短轴重新采样心室相同的图形模式(图 1E)。数据通过将位移向量的 L2 规范规范化到心脏内周,以 X(绿色)、Y(蓝色)和 Z 分量(橙色)作为加权贡献表示。在4 dpf时,控制鱼类中段位移载体的平均L2-规范范围为6.6~11.3μm,标准化后为3.8~6.6%。我们的结果表明,在控制条件下,基底段I和VI发生最大的位移,是最容易多索布辛诱发的心脏损伤(图3B,29%,从6.6-4.7%,n = 10对照和n = 8多索布辛,p &0.01)。在6 dpf时,对照鱼中段位移向量的平均L2-规范范围为6.8~14 μm,标准化后为3.9~8%。在 6 dpf 时,基段 I 和 VI 将 DIAMOND 位移恢复到控制水平,建议分段再生(图 3C、n= 10 控制和 n = 8 多索鲁比辛)。同时,在多索鲁比素处理后,在4 dpf观察到2D基质菌株恶化,从-53到-38%,随后在6 dpf处恢复到控制水平,证实了DIAMOND位移结果(图3D,3E)。也观察到全球抛射分数在响应多索鲁比辛在4 dpf和恢复在6 dpf的平行下降(3F,3G)。

接下来,我们应用DIAMOND在多索鲁比素治疗和Notch通路调制使用Notch抑制剂DAPT和救援使用Notch下游效应器NICDNRG1 mRNA(图4A)。NICDNRG1 mRNA显微注射在4 dpf(图4B,4D)急性化疗引起的损伤后,挽救了DIAMOND位移和EF的减少。除了基础段 I 和 VI(图 4B) 外,与多索鲁比辛一起接触 Notch 抑制剂 DAPT 可导致 DIAMOND 位移的更分散性降低。此外,在化疗引起的损伤后,对Notch通路的抑制进一步阻碍了基底段和EF在6 dpf处的DIAMOND位移的恢复。抑制被Notch下游效应器NICDNRG1(4C,4E)拯救。

Figure 1
图1:4D DIAMOND位移开发。A) 原始图像由光片荧光显微镜捕获.(BC) 重建的 3D 心沿真正的短轴平面视图重新采样。(D) 胚胎斑马鱼心脏的图解图。(EF) 2D 和 3D 插图将心室划分为八个部分,不包括第七段和第八段。(G) 重采样后,端线和端坐标系的不同坐标系。(H) 为生成变换矩阵 (Tm) 创建了一组矩形平行体。(I) 通过应用 Tm注册端收缩和端舒张坐标系。(J) 段质量质心的位移向量,从端向端向端向端移。(K) 在心脏周期的多个时间点跟踪的心室段 I_VI 的 DIAMOND 位移。(L) 心室段 I_VI 从端向端的线段的菱形位移。陈先生等人8人的数字经美国临床调查协会(ASCI)许可转载。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:与3D原始数据相比,胚胎斑马鱼心脏的DIAMOND分割。胚胎斑马鱼心脏被分为六个部分(卷),这里描绘的不同颜色为显示的DIAMOND位移(左)。DIAMOND 计算的每个段的位移矢量表示其分段心脏功能。在分割过程中,中庭和流出道被移除。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:DIAMOND解开了心脏功能的段异质性和对化疗引起的损伤的易感性。A) 多索鲁比素治疗的实验时间表.(BC) 在 4 和 6 dpf(t 检验,p < 0.01, n = 8–10) 中,对照组和多索鲁比治疗组之间的区域位移向量标准化到内心肌周长的分段比较。(DE) 评估心室基中的应变,将类似的损伤和再生模式描述为 DIAMOND 位移向量(*p < 0.05,n = 每组 6-8)。(FG) 在 4 dpf 处,在 4 dpf 处恢复的 doxorubin 时,喷射分数减少,遵循类似于全局心室水平的分段 DIAMOND 位移的模式(t 测试,=p < 0.01,误差柱 SEM,n = 6-10 每组)。陈先生等人8人的数字经ASCI许可转载。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:用于评估多索鲁比辛引起的损伤后Notch介导心肌恢复的DIAMOND力学。A) 实验时间表.(BCNICDNRG1凹槽下游效应器在 4 dpf 处挽救了第 I 段和第 VI 段的 DIAMOND 位移减少。在 6 dpf 时,DAPT 抑制 Notch 信号损害段心脏功能的恢复(ANOVA, +p < 0.01 Dox vs. 控制; =p < 0.05, =p < 0.01, Dox = DAPT vs. 控制, n = 6+10 每组)。(DE) 喷射分数证实了全球级别的 DIAMOND 机制(ANOVA, =p < 0.05, =p < 0.01, 误差柱 SEM, n = 5-11 每组)。陈先生等人8人的数字经ASCI许可转载。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

对分段心肌功能进行量化的严格策略对于评估传统EF以外的心脏力学至关重要,众所周知,这是心肌损伤1、4、12的麻木不仁和延迟指标。因此,人们对早期心肌变化的标记越来越感兴趣,越来越多的文献支持心肌变形参数作为预测心室功能障碍4,13的早期指标。左心室(LV)应变的超声心电图测量提供了一种既定的心肌变形测量方法13。然而,基于多普勒的组织应变成像由于角度依赖和观察者内部和观察者间变异性14而存在一些缺陷。斑点跟踪超声心成像(STE)可以解决与角度无关的2D和3D组织变形,但2D斑点跟踪的精度受透平面运动6的影响,而3D斑点跟踪需要卓越的空间分辨率来解决3D中的正超声干扰模式(斑点)和高时间分辨率来跟踪帧15之间的斑点。在本协议中,我们将DIAMOND位移描述为斑马鱼4D段心功能体内定量的新型心肌变形参数。与 EF 和 2D 应变作为参考标准相比,DIAMOND 提供额外的段变形信息,而不受过平面运动的影响。通过将 DIAMOND 与 4D LSFM 集成,我们的技术可以评估宽度为 20–30 μm 的心脏段的位移矢量,这目前对于最先进的 3D STE 系统来说也是不可能的,该系统具有毫米范围分辨率16

   

应用 DIAMOND,全面了解胚胎斑马鱼心脏的解剖结构至关重要。在图像分割过程中,当用户执行协议中的步骤 6 时,必须正确识别眼道和流出道,并从心肌的其余部分进行分段。此外,必须精确确定心室的水平轴和垂直长轴,以便得出步骤 8 中用于图像重采样的真短轴平面。

应用 DIAMOND 的主要速率限制因素是心室的手动分割,当心脏周期中的多个阶段可能需要评估时,这变得非常耗时。随着机器学习和神经网络的进步,一种自动心脏分割方法17、18、19、20可以与DIAMOND集成,以在整个心脏周期内提供分段心脏功能的监测。DIAMOND的进一步应用还包括与超声心动图、微CT或微MRI的集成,适用于大型动物模型,用于心脏损伤和再生的多尺度评估21。然而,该方法将首先需要适应心肌纤维的存在,导致更复杂的心脏变形,包括哺乳动物的扭转22,23。

总体而言,DIAMOND 提供了一种新方法,用于评估胚胎斑马鱼在生理和病理条件下的分段心脏功能,并可用作在体内高通量筛查相关途径的平台。化疗引起的心脏毒性。

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Disclosures

提交人宣布不存在利益冲突。

Acknowledgments

本工作由美国心脏协会资助16SDG30910007和18CDA34110338,并由国家卫生研究院拨款HL083015、HL111437、HL118650和HL129727。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amira6 FEI Image analyzing software
DAPT Millipore Sigma D5942-5MG
Doxorubicin hydrochloride Millipore Sigma D1515-10MG
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Millipore Sigma E10521-10G Tricaine
MATLAB MathWorks Programming environment
MATLAB Image Processing Toolbox MathWorks Image processing toolbox

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