人类羊膜不同解剖区域的皮下细胞体外培养

Developmental Biology

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Summary

该协议描述了从人类羊膜的不同解剖区域分离上皮细胞,以确定其异质性和功能特性,以便可能应用于临床和物理病理学模型。

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Avila-González, D., García-López, G., Díaz-Martínez, N. E., Flores-Herrera, H., Molina-Hernández, A., Portillo, W., Díaz, N. F. In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane. J. Vis. Exp. (153), e60551, doi:10.3791/60551 (2019).

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Abstract

文献中报告了关于人类羊皮上皮细胞(HAEC)的隔离和培养的若干协议。然而,这些假设羊皮上皮是同质层。人类羊膜可分为三个解剖区域:反射、胎盘和脐带。每个区域有不同的生理作用,如在病理条件下。在这里,我们描述了一个协议,解剖人类羊羊组织在三个部分,并在体外维护它。在培养中,从反射羊膜中提取的细胞呈长方体形态,而来自胎盘和脐带的细胞是鳞状的。尽管如此,所有获得的细胞都有上皮表型,通过E-cadherin的免疫检测证明。因此,由于原位胎盘和反射区域在细胞成分和分子功能上有所不同,因此体外研究可能有必要考虑这些差异,因为它们可能对HAEC的使用产生生理影响。生物医学研究及这些细胞在再生医学中的可喜应用。

Introduction

人类羊皮上皮细胞(HAEC)起源于胚胎发育的早期阶段,在受精后8天左右。它们产生于从羊膜1的最内层衍生的表征细胞的鳞状上皮细胞。因此,HAEC被认为是表征中多能细胞的残余物,有可能分化成胚胎2的三个生殖层。在过去的十年中,不同的研究小组已经开发出了在妊娠期内将这些细胞从羊膜分离出来的方法,以在体外3、4的培养模型中描述其推定多能相关特性。

因此,已发现HAEC具有人类多能干细胞(HPSC)的特征特征,如表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60、TRA 1-81;多能转录因子OCT4、SOX2和NANOG的核心;和扩散标记KI67,表明他们是自我更新5,6,7。此外,这些细胞已经受到挑战,使用分化协议获得细胞阳性的生殖层(外生,中生代和内皮)4,5,8,以及人类疾病的动物模型。最后,HAEC表示E-cadherin,这表明他们保留了上皮性质很像HPSC5,9

除了胚胎来源外,HAEC还有其他内在特性,使它们适合不同的临床应用,如抗炎和抗菌分子的分泌10,11,生长因子和细胞因子释放12,不形成畸马细胞瘤时,他们移植到免疫缺陷小鼠与HPSC2对比,和免疫耐受性,因为它们表达HLA-G,减少排斥后的风险移植13.

然而,以前的报告假设人类羊膜是同质膜,没有考虑到它可以在解剖学和生理上分为三个区域:胎盘(覆盖去皮底的羊膜),脐带(包围脐带的部分),并反射(膜的其余部分不附着在胎盘上)14 。研究表明,羊驼的胎盘和反射区域在形态学、线粒体活性、活性氧物种15检测、miRNA表达16和信号通路17激活方面存在差异。这些结果表明,人类羊皮被一个具有不同功能的异质人群所整合,在原位或体外模型中进行进一步的研究应考虑。虽然其他实验室已经设计了从整个膜分离HAEC的协议,但我们的实验室已经建立了一个协议来分离、培养和表征来自不同解剖区域的细胞。

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Protocol

该协议由墨西哥城国家研究所伦理委员会批准(注册号212250-21041)。这些研究中进行的所有程序均符合《国家佩里纳洛尼亚研究所》、《赫尔辛基宣言》和卫生部《墨西哥官方标准》中规定的指导方针的道德标准。

1. 准备

  1. 使用 EDTA 准备 1x PBS 解决方案。为此,将 500 μL 的 0.5 M EDTA 库存添加到 500 mL 的 1x PBS 中,最终浓度为 0.5 mM EDTA。
  2. 为 HAEC 准备培养基。服用450 mL的高葡萄糖-DMEM,补充5 mL的丙酸钠(100 mM),50 mL的热活性胎儿牛血清,5 mL的非必需氨基酸(100x),5 mL的抗生素-抗霉菌(100x),5 mL的L-谷氨酰胺(200mM),以及500 μL 的甲苯醇(1,000x)。
  3. 消毒用于运输和加工组织的容器:一个带盖子的不锈钢容器,用于将整个胎盘从手术室运送到实验室,一个托盘(20 厘米 x 30 厘米 x 8 厘米)用于清洗和清除整个胎盘的血液。解剖羊膜,用塑料切割板将羊膜分离成三个区域。
  4. 消毒手术器械(手术器、剪刀、钳子和钳子)、500 mL 烧杯、棉纱布和盐水溶液。

2. 获得胎盘组织

注:羊膜是在全身妊娠期(37-40周)时从妇女那里获得的,在剖腹产的指示下,没有任何活动分娩的证据,也没有感染的微生物特征。完全隔离和培养程序是在无菌条件下在生物安全柜内进行的。

  1. 在手术室中,夹紧脐带,防止血液流向组织的其余部分。用脐带夹在无菌容器中收集整个胎盘。
  2. 向容器中加入500 mL的盐水溶液,使胎盘滋润。
  3. 关闭容器,在室温下将组织运送到实验室。
  4. 将装有胎盘的容器放入生物安全柜内。
    注:如果在收集胎盘后 15 分钟内未进行解剖,则将容器与胎盘一起存放在冰上,直到加工。避免从获得胎盘到开始解剖之间超过 1 小时的时间。

3. 羊膜每个区域的机械分离

注:必须在无菌条件下和室温下在生物安全柜内进行手术。

  1. 从容器中取出整个胎盘,并将其放在托盘上,脐带朝上。
  2. 使用无菌棉纱布,清洁覆盖胎盘的胆囊-羊皮表面的血块。
  3. 识别膜的三个区域:环绕脐带的脐带、覆盖底状的胎盘羊膜和反射区域,这是未附着在胎盘上的羊膜的其余部分(图1)。
  4. 解剖脐带羊膜区域 (图2A)。
    1. 使用解剖钳,握住覆盖胎盘和脐带结的羊膜部分。
    2. 用手术刀,解剖环绕脐带的区域,同时伸展以将其与胆汁分开。
    3. 将分离的组织用100 mL的盐水溶液沉积在标记的烧杯中。
  5. 解剖胎盘羊驼碱区域 (图 2B)。
    1. 用无菌棉纱布,从覆盖胎盘的胆囊-羊皮表面清除血块。
    2. 用解剖钳将膜放在胎盘和反射区域之间的边界上。
    3. 用手术刀沿着胎盘的周长切割。
    4. 将胎盘羊皮从胆汁中分离出来,小心不要从胎盘上切下任何血管。
    5. 将分离的组织放入另一个标有300 mL的盐水溶液的烧杯中。
  6. 将未附着在胎盘上的羊膜的其余部分(即反射部分)与胎盘分离(图2C)。
    1. 用300 mL的盐水溶液在另一个标有标签的烧杯中收集反射区域。
      注:在解剖过程中不断加入盐水溶液,以防止组织干燥。

4. 清洗膜

注:必须在室温无菌条件下在生物安全柜内进行手术。

  1. 分别丢弃每个膜区域的盐水溶液。
  2. 向脐带添加100 mL的新鲜盐水溶液。
  3. 分别在胎盘和反射区域加入300 mL的新鲜盐水溶液。
  4. 在解剖钳子的帮助下搅拌膜,去除血液残留物。
  5. 丢弃盐水溶液。
  6. 重复的搅拌和搅拌至少3倍,直到膜是半透明的。
  7. 将膜放在板上并延长,用无菌纱布清洁未用洗净器去除的血块。
    注:删除尽可能多的红细胞是非常重要的,因为他们的存在会影响胰蛋白酶的功能和随后的细胞培养的生存能力。

5. 不同区域膜的酶消化

注:必须在无菌条件下在生物安全柜内进行程序。

  1. 将反射和胎盘区域切成两个或三个片段。
  2. 不要切割脐带。
  3. 将每个区域的碎片放入离心管中。将20 mL 0.5% 胰蛋白酶/EDTA分别添加到反射和胎盘区域和 5 mL 的 0.5% 胰蛋白酶/EDTA 中。
    注:将反射和胎盘区域切成小块很重要,因为它们需要完全浸入胰蛋白酶溶液中。
  4. 轻轻摇动离心管30s.丢弃胰蛋白酶。
  5. 将30 mL的新0.5%胰蛋白酶/EDTA分别添加到反射和胎盘区域,将15 mL的新0.5%胰蛋白酶/EDTA分别添加到脐带。
  6. 将管子放在培养箱内的旋转器中。
  7. 在 37°C 下以旋转(20 rpm)孵育 40 分钟。
    注:如果管旋转器不可用,则每 10 分钟轻轻手动摇动管。
  8. 将胰蛋白酶/细胞溶液从每个区域转移到新的离心管中。
  9. 将HAEC介质体积增加2倍,每管37°C预温,使酶灭活。
  10. 将第一次消化储存在冰上。
  11. 重复步骤5.6~5.8第二次消化期。
  12. 对于每个区域,使用解剖钳保持羊皮部分的一端,用另一对挤压沿组织,以去除在以前的潜伏期未完全剥离的上皮细胞行。
  13. 将第二次消化收集到另一组离心管中,用 HAEC 介质的 2 倍体积灭活。
  14. 将消化的膜丢弃到生物危害容器中。

6. HAEC 的隔离

注:必须在无菌条件下在生物安全柜内进行程序。

  1. 在 4°C 下以 200 x g将所有管切离 10 分钟。
  2. 丢弃上清液,每管加入10 mL的预加热HAEC介质(至37°C),轻轻移液,分解每粒颗粒。
  3. 将两个消化的细胞悬浮液合并到每个膜区域的单独管中。
  4. 使用 100 μm 细胞过滤器过滤细胞悬浮液,以清除细胞外基质碎片并获得单个细胞。
  5. 在微离心管中用90μL的锥蓝色制备三个等分。
  6. 将每个膜区域的每个细胞悬浮液添加10μL到微离心管中并混合。
  7. 在光场显微镜下用血细胞计对细胞进行计数。

7. HAEC文化

  1. 以3×104细胞/cm2的密度分别从三个区域播种HAEC,并辅以10纳克/mL的人类表皮生长因子(EGF)。
    1. 将细胞播种在100毫米的板中,在体外或24孔板中保持,用于免疫化学分析。
  2. 在标准条件下(5%CO2)在加湿培养箱中孵育37°C的菜肴。
  3. 每天添加 EGF,每三天更换一次介质。
    注:细胞将在4~6天后结汇。
  4. 使用细胞进行常规免疫组织化学、细胞分拣分析、冷冻保存、RNA和蛋白质提取,或继续传递。

8. HAEC 的通过

  1. 取下 HAEC 介质,使用 PBS/EDTA 0.01M 溶液清洗 2 次。
  2. 使用PBS/EDTA 0.01M溶液在37°C下孵育15分钟。
  3. 取出PBS/EDTA,并加入1.5 mL 0.5%胰蛋白酶/EDTA。
  4. 在37°C下孵育5-8分钟。
  5. 用两卷HAEC介质灭活酶。
  6. 收集混合溶液和离心机5分钟,在200 x g。
  7. 对细胞进行计数并继续以下段落,或使用单元格进行进一步分析。

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Representative Results

HAEC从羊膜的三个解剖区域分离出来,并在体外单独培养。在培养48小时后,具有上皮表型的细胞附着在板表面,尽管介质中也含有细胞碎片和浮细胞,一旦介质改变,这些细胞被移除(图3)。

在初级培养物(通道零,P0)的处理过程中,可能会出现一些并发症,从而干扰实验数据分析(图4):在识别试剂污染或分离过程中存在细菌时,最好丢弃培养物并处理另一膜(图4A);由于膜洗涤不足导致红细胞过多(图4B);细胞对板的附着力不足或没有粘附(图4C);或具有成纤维细胞形态的细胞(图4D),表明人类羊羊分泌细胞(HAMC)被分离,而不是HAEC。

HAEC形态取决于这些细胞的起源:来自反射区的细胞具有立方体形态,生长在鹅卵石单层中,不像来自胎盘和脐带区域的细胞,它们是扁平和鳞状的(图5)。这些数据支持从羊膜的上皮层在整个膜不均匀。在通道期间,来自所有区域的细胞的大小增加,但它们保持其上皮性质,并且不获得成纤维细胞形态。事实上,对E-cadherin的免疫荧光表明,主要培养物(P0)和亚培养物(P1-P2)保持其上皮表型(图6),表明没有污染另一种细胞类型,如分时位位细胞,或上皮-中位体过渡。此外,这些细胞没有显示根据TUNEL测定(补充图1)的细胞死亡的证据,但对KI-67增殖标记呈阳性(图6),尽管我们先前的研究结果发现每个段落5之间没有显著的此标记差异。

获得的细胞数量因区域而异:分别来自反射区和胎盘区的61.6 x 106和71.8 x 106细胞,以及来自脐带区域每个样本的少于1 x 106(表1)。该协议报告,胎盘和脐带区域在表达特征上非常相似,与反射和胎盘区域相反,特别是在参与ECM受体相互作用、焦点粘附和PI3K-Akt信号通路的基因中,通过RNA-seq6。在一致同意,以前的研究报告米托根激活蛋白激酶和转化生长因子β通路的差异表达,以及两个区域之间的亲炎细胞因子17。

虽然证据表明,羊膜的亚种群在形态和生理性质上有所不同,但我们以前已经证明,从胎盘和反射区域6派生的HAEC中,多能因子核心的表达和存在不会改变。在此背景下,除了脐带细胞数量相对有限外,后续研究应侧重于从胎盘中分离的HAEC,并独立地反射羊膜,因为不同的亚群体对特定事件(如分娩期间的长期怀孕或炎症过程)反应不均(图7)。

Figure 1
图1:在术语时从羊膜的解剖区域。脐带羊膜(黄色)、胎盘羊膜(白色)和反射羊膜(黑色)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:羊膜的机械解剖。A) 脐带区域 , (B) 胎盘区域, 和 (C) 反映区域.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:从羊膜衍生的HAEC代表性初级培养。文化48小时后隔离没有 (A) 和 (B) 介质的变化.比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:HAEC初级文化负结果的代表性显微图。A) 红细胞过量.(B) 细菌污染.(C) 隔离48小时后,HAEC未粘附。(D) 由成纤维细胞形态细胞组成的初级培养物。比例尺 = 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:体外不同解剖区域的HAEC形态。通过 P0_P2 培养的反射(上面板)、胎盘(中间面板)和脐带(下面板)区域的汇入 HAEC 的代表性显微图。比例尺 200 = μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:HAEC中E-cadherin和KI-67的表达。E-cadherin+和 KI-67+ HAEC 的代表性荧光显微镜图像来自反射(左面板)和胎盘(右面板)羊锥度,通过 P0_P2 培养。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图7:不同解剖区域的HAEC显示一个多能标记面板。具有 TRA-1-60 的 NANOG 双免疫荧光羊锥的代表性共聚焦显微镜图像,带 E-cadherin 的 OCT4,以及从反射(上面板)和胎盘(下面板)区域在 HAEC (P1) 中具有 SSEA-4 的 SOX2。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

• 膜 反映 胎盘 完整膜
1 75 X 106 130 X 106 0.2 X 106 205.2 X 106
2 38.5 X 106 52 X 106 0.53 X 106 91.03 X 106
3 59 X 106 53 X 106 0.2 X 106 112.2 X 106
4 42 X 106 27 X 106 0.36 X 106 69.36 X 106
5 44.8 X 106 22.3 X 106 Np 76.1 X 106
6 100 X 106 140 X 106 1 X 106 241 X 106
7 72 X 106 78 X 106 Np 150 X 106
平均 61.6 X 106 71.8 X 106 0.45 X 106 133.8 X 106

表1:每个区域与羊膜隔离的HAEC数。(NP = 未处理)。

补充图1:在HAEC(通道2)中从反射区域和正对照细胞(HL-60细胞用营管素处理)中染色。刻度条 = 50 μm.请点击此处下载此图。

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Discussion

我们实现了一种新的协议,将HAEC与术语膜分离开来。它不同于以前的报告,因为每个膜在分离前被分成三个解剖区域,以分析每个膜的细胞。

该协议中最关键的步骤之一是清洗膜以去除所有血块,因为它们在分离上皮细胞时会干扰胰蛋白酶的活动。未能正确执行此步骤可能导致获得具有过量红细胞和很少粘附上皮细胞的主要培养物。如果在设定细胞种子后的前 24-48 小时未观察到附件,我们建议丢弃培养物。另一个关键点是酶消化的孵育时间。如果潜伏期过长,细胞活力可能降低和/或细胞培养与美感,而不是上皮形态(图4)。此外,如果膜消化没有通过适当的搅拌完成,每个膜获得少量细胞的概率会增加。

在这个协议中,我们可以在体外保持HAEC的种群而不失去其上皮表型,这从沿通道的大多数细胞存在特定的上皮细胞标记E-cadherin就证明了这一点(图6)。然而,根据我们的经验,HAEC只能扩展三个段落(P1_P3)。在需要长期文化或多个段落的实验时,应考虑有限的段落数量。此外,据报道,在P3后细胞开始改变其形态和减少E-cadherin的表达,因此,长期培养可以诱发上皮-中位体过渡(EMT)18。最近,证明孕酮能防止肠羊皮细胞19、20中的EMT,因此分析HAEC培养基中不同浓度的孕酮对避免第三通道后间质表型的影响是很有趣的。

在以前所有报告,其中HAEC被分离,羊膜已被假定为一个统一的组织,尽管可能异质的上皮种群构成整个膜。相反,该协议将膜划分为三个解剖区域,以单独分离和培养HAEC,考虑先前的形态和基因表达报告,这些报告表明功能差异。也没有必要通过细胞分拣进行纯化,只获得上皮种群,在P2之前通过过程中检测E-cadherin标记就证明了这一点。

研究表明,从每个膜区域分离出的HAEC具有类似的多能核表达,是具有干细胞的细胞的潜伏库。在此背景下,这些细胞可用于体外研究分子机制,例如多能相关转录因子的动态定位,或尽管表达癌症相关基因,但能够保持静止状态,而不论其解剖源区如何。然而,未来的研究必须考虑每个区域之间报告的分子差异(全球表达基因、代谢活性、信号通路),这将对其在再生医学中的应用产生影响。我们之前通过RNA-seq6报告了PI3K/AKT中涉及的基因的不同表达,以及不同羊地区之间的焦点粘附信号通路。PI3K/AKT调节自更新,并在HPSC中保持多能性,而焦点粘附激酶的激活促进其分化21,22。因此,我们建议描述两种通路在HAEC中的作用,在系骨特异性分化协议中从不同的解剖区域分离出来。此外,几项研究还表明,两个区域在细胞成分、分子功能和生物过程方面存在差异。例如,23日报道了参与体内吸收运输过程的海波素的区域特异性基因表达和蛋白质分布。另一项研究通过微阵列比较miRNome,显示miR-145和miR-143的区域特定表达,后者能够在特定条件下(如第16期的劳动)下对前列腺素-内西酶2进行转录后调节。此外,胎盘区域具有较高的线粒体呼吸,但反应氧物种检测与反射组织15相比较低。鼓励分离反射和胎盘区域中的羊痘,分别分离HAEC并分析其特殊特性,如生长因子和细胞因子的释放、免疫原性低、细胞外基质的产生、其条件介质与其他细胞类型共培养的影响,以及其作为进料层24维持HPSC线的能力等新功能。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们的研究得到了墨西哥国家研究所(21041年和21081年)和国家委员会(A1-S-8450和252756)的资助。我们感谢杰西卡·冈萨雷斯·诺里斯和莉迪亚·尤里娅·帕里德斯·维维斯的技术支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture reagents
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific/Gibco 21985023 55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific/Gibco 12430054 Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA Thermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G 0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified Thermo Fisher Scientific/Gibco 10439024
Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher Scientific/Gibco 11140050 100X
Paraformaldehyde any brand
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%) any brand
Sodium Pyruvate Thermo Fisher Scientific/Gibco 11360070 100 mM
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific/Gibco 25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352360
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator MaCSmix
Antibodies and Kits Antibody ID
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 RRID:AB_3975
Anti-KI67 Santa Cruz 23900 RRID:AB_627859)
Anti-NANOG Peprotech 500-P236 RRID:AB_1268274
Anti-OCT4 Abcam ab19857 RRID:AB_44517
Anti-SOX2 Millipore AB5603 RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4 Cell Signaling 4755 RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60 Cell Signaling 4746 RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit Abcam 66110

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