Cultura in vitro di cellule epiteliali provenienti da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana

Developmental Biology

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Summary

Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule epiteliali da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana per determinarne l'eterogeneità e le proprietà funzionali per una possibile applicazione nei modelli clinici e fisiopatologici.

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Avila-González, D., García-López, G., Díaz-Martínez, N. E., Flores-Herrera, H., Molina-Hernández, A., Portillo, W., Díaz, N. F. In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane. J. Vis. Exp. (153), e60551, doi:10.3791/60551 (2019).

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Abstract

Diversi protocolli sono stati riportati nella letteratura per l'isolamento e la coltura delle cellule epiteliali amniotiche umane (HAEC). Tuttavia, questi presuppongono che l'epitelio amniotico sia uno strato omogeneo. L'amnione umano può essere diviso in tre regioni anatomiche: riflesse, placentare e ombelicali. Ogni regione ha diversi ruoli fisiologici, come in condizioni patologiche. Qui, descriviamo un protocollo per sezionare il tessuto amnione umano in tre sezioni e mantenerlo in vitro. Nella coltura, le cellule derivate dall'amnione riflesso mostravano una morfologia cuboidale, mentre le cellule delle regioni placentarie e ombelicali erano squamose. Ciò nonostante, tutte le cellule ottenute hanno un fenotipo epiteliale, dimostrato dall'immunorilevamento dell'E-cadherin. Pertanto, poiché le regioni placentari e riflesse in situ differiscono nei componenti cellulari e nelle funzioni molecolari, potrebbe essere necessario che gli studi in vitro considerino queste differenze, poiché potrebbero avere implicazioni fisiologiche per l'uso dell'HAEC biomedica e la promettente applicazione di queste cellule nella medicina rigenerativa.

Introduction

Le cellule dell'epitelio amniotico umano (HAEC) hanno origine durante le prime fasi dello sviluppo embrionale, a circa otto giorni dopo la fecondazione. Nascono da una popolazione di cellule epiteliali squamose dell'epiblasto che derivano dallo strato più interno della membrana amniotica1. Così, HAEC sono considerati resti di cellule pluripotenti dall'epiblast che hanno il potenziale di differenziarsi nei tre strati germinali dell'embrione2. Nell'ultimo decennio, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per isolare queste cellule dalla membrana amniotica al termine di gestazione per caratterizzare le loro presunte proprietà legate alla pluripotenza in un modello culturale in vitro3,4.

Di conseguenza, è stato scoperto che HAEC presentano tratti caratteristici delle cellule staminali pluripotenti umane (HPSC), come gli antigeni superficiali SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; il nucleo dei fattori di trascrizione pluripotenza OCT4, SOX2 e NANOG; e il marcatore di proliferazione KI67, suggerendo che si stanno rinnovando5,6,7. Inoltre, queste cellule sono state sfidate utilizzando protocolli di differenziazione per ottenere cellule positive per marcatori specifici del lignaggio dei tre strati germinali (ectodermi, mesoderm ed endoderm)4,5,8, così come nei modelli animali di malattie umane. Infine, HAEC esprimono l'E-cadherin, che dimostrano che mantengono una natura epiteliale molto simile all'HPSC5,9.

Oltre alla loro origine embrionale, gli HAEC hanno altre proprietà intrinseche che le rendono adatte a diverse applicazioni cliniche, come la secrezione di molecole antinfiammatorie e antibatteriche10,11, fattori di crescita e citochina rilasciano12, nessuna formazione di teratomi quando vengono trapiantati in topi immunodeficienti in contrasto con HPSC2, e tolleranza logica perché esprimono HLA-G, che diminuisce il rischio di trapianto13.

Tuttavia, i rapporti precedenti hanno ipotizzato che l'amnione umano sia una membrana omogenea, senza considerare che possa essere suddivisa anatomicamente e fisiologicamente in tre regioni: placentale (l'amnione che copre la decidua basalis),ombelicale (la parte che avvolge il cordone ombelicale), e riflessa (il resto della membrana non attaccata alla placenta)14. È stato dimostrato che le regioni placentarie e riflesse dell'amnion mostrano differenze nella morfologia, nell'attività mitocondriale, nel rilevamento delle specie reattive dell'ossigeno15, sull'espressione miRNA16e nell'attivazione delle vie di segnalazione17. Questi risultati suggeriscono che l'amnione umano è integrato da una popolazione eterogenea con funzionalità diverse che dovrebbero essere prese in considerazione per ulteriori studi condotti in modelli in situ o in vitro. Mentre altri laboratori hanno progettato protocolli per l'isolamento di HAEC da tutta la membrana, il nostro laboratorio ha stabilito un protocollo per isolare, coltura e caratterizzare le cellule provenienti da diverse regioni anatomiche.

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Protocol

Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico dell'Instituto Nacional de Perinatologa a Città del Messico (numero di registro 212250-21041). Tutte le procedure eseguite in questi studi erano conformi agli standard etici dell'Instituto Nacional de Perinatolog, della Dichiarazione di Helsinki e delle linee guida stabilite nello standard messicano ufficiale del Ministero della Salute.

1. Preparazione

  1. Preparare una soluzione di 1x PBS con EDTA. A tale scopo, aggiungere 500 : L di 0,5 M di scorte EDTA in 500 mL di 1x PBS per una concentrazione finale di 0,5 mM EDTA.
  2. Preparare il supporto di coltura per HAEC. Prendere 450 mL di alto glucosio-DMEM, integrarlo con 5 mL di piravadi di sodio (100 mM), 50 mL di siero bovino fetale termale-inattivo qualificato per le cellule staminali, 5 mL di aminoacidi non essenziali (100x), 5 mL di antibiotico-antimicotico (100x), 5 mL di glutamine (200 m), 500 l di mercaptoetanolo (1.000x).
  3. Sterilizzare i contenitori per il trasporto e la lavorazione del tessuto: un contenitore in acciaio inossidabile con un coperchio per trasportare l'intera placenta dalla sala operatoria al laboratorio, un vassoio (20 cm x 30 cm x 8 cm) per lavare e rimuovere il sangue dall'intera placenta prima la dissezione della membrana amniotica, e un tagliere di plastica per separare la membrana amniotica nelle tre regioni.
  4. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (scalpel, forbici, pinze e morsetti), becher da 500 mL, garze di cotone e soluzione salina.

2. Ottenere tessuto placentare

NOTA: Le membrane amniotiche sono state ottenute dalle donne a gestazione a termine (37-40 settimane), sotto indicazione della consegna cesarea, senza alcuna prova di lavoro attivo, e senza caratteristiche microbiologiche di infezione. Le procedure complete di isolamento e cultura sono state eseguite all'interno di un gabinetto di biosicurezza in condizioni sterili.

  1. In sala operatoria, bloccare il cordone ombelicale per evitare il flusso sanguigno al resto del tessuto. Raccogliere l'intera placenta con il cordone ombelicale fissato nel contenitore sterile.
  2. Aggiungere 500 mL di soluzione salina al contenitore per idratare la placenta.
  3. Chiudere il contenitore e trasportare il tessuto al laboratorio a temperatura ambiente.
  4. Mettere il contenitore con la placenta all'interno dell'armadietto della biosicurezza.
    NOTA: Nel caso in cui la dissezione non venga effettuata entro 15 min dalla raccolta della placenta, conservare il contenitore con la placenta sul ghiaccio fino alla lavorazione. Evitare più di 1 h di tempo trascorso tra l'ottenimento della placenta e l'inizio della dissezione.

3. Separazione meccanica per regione della membrana amniotica

NOTA: La procedura deve essere eseguita all'interno di un armadietto di biosicurezza in condizioni sterili e a temperatura ambiente.

  1. Rimuovere l'intera placenta dal contenitore e posizionarla sul vassoio con il cordone ombelicale rivolto verso l'alto.
  2. Utilizzando una garza sterile di cotone, pulire i coaguli di sangue dalla superficie del chorion-amnion che copre la placenta.
  3. Identificare le tre regioni della membrana: l'amnione ombelicale che avvolge il cordone ombelicale, l'amnione placentare che copre la decidua basalis e la regione riflessa, che è il resto dell'amnione che non è attaccato alla placenta (Figura 1).
  4. Dissezio della regione dell'amnione ombelicale (Figura 2A).
    1. Utilizzando pinze dissetanti, tenere la porzione di membrana di amnione che copre la giunzione della placenta e del cordone ombelicale.
    2. Con un bisturi, sezionare la regione che circonda il cavo mentre si estende per separarlo dal chorion.
    3. Depositare il tessuto separato in un becher etichettato con 100 mL di soluzione salina.
  5. Dissezionare la regione dell'amnione placentare (Figura 2B).
    1. Con una garza di cotone sterile, rimuovere i coaguli di sangue dalla superficie del chorion-amnion che copre la placenta.
    2. Tenere la membrana sul confine tra la placenta e la regione riflessa con pinze di dissezione.
    3. Tagliare lungo la circonferenza della placenta con il bisturi.
    4. Separare l'amnione placenta dal chorion, facendo attenzione a non tagliare i vasi dalla placenta.
    5. Posizionare il tessuto separato in un altro becher etichettato con 300 mL di soluzione salina.
  6. Separare il resto della membrana amniotica che non è attaccata alla placenta (cioè la parte riflessa) dal coro (Figura 2C).
    1. Raccogliere la regione riflessa in un altro becher etichettato con 300 mL di soluzione salina.
      NOTA: Aggiungere continuamente una soluzione salina durante la dissezione per evitare che il tessuto si secchi.

4. Lavare le membrane

NOTA: La procedura deve essere eseguita all'interno di un armadietto di biosicurezza in condizioni sterili a temperatura ambiente.

  1. Scartare separatamente la soluzione salina di ogni regione della membrana.
  2. Aggiungere 100 mL di soluzione salina fresca alla regione ombelicale.
  3. Aggiungere 300 mL di soluzione salina fresca rispettivamente alle regioni placentari e riflesse.
  4. Mescolare le membrane con l'aiuto di piscio di dissezione per rimuovere i residui di sangue.
  5. Eliminare la soluzione salina.
  6. Ripetere i lavamenti e l'agitazione almeno 3x fino a quando le membrane sono traslucide.
  7. Posizionare ed estendere le membrane sulla scheda per pulire con garza sterile i coaguli di sangue che non sono stati rimossi con i lavatori.
    NOTA: È molto importante rimuovere il maggior numero possibile di eritrociti, poiché la loro presenza influisce sulla funzione della trypsin e sulla fattibilità delle successive colture cellulari.

5. Digestione enzimatica delle membrane provenienti da diverse regioni

NOTA: La procedura deve essere eseguita all'interno di un armadietto della biosicurezza in condizioni sterili.

  1. Tagliare le regioni riflesse e placentari in due o tre frammenti.
  2. Non tagliare la regione ombelicale.
  3. Posizionare i frammenti di ogni regione in tubi di centrifuga. Aggiungere 20 mL dello 0,5% di trypsin/EDTA alle regioni riflesse e placentari e di 5 mL dello 0,5% trypsin/EDTA rispettivamente all'area ombelicale.
    NOTA: È importante tagliare le regioni riflesse e placentari in pezzi più piccoli perché devono essere completamente immerse nella soluzione trypsin.
  4. Agitare leggermente i tubi di centrifuga per 30 s. Scartare la metapsina.
  5. Aggiungere 30 mL di nuovo 0,5% trypsin/EDTA alle regioni riflesse e placentari e 15 mL di nuovo 0,5% trypsin/EDTA rispettivamente nella regione ombelicale.
  6. Posizionare i tubi in un rotatore all'interno dell'incubatrice.
  7. Incubare con rotazione (20 giri/) per 40 min a 37 gradi centigradi.
    NOTA: Se non è disponibile un rotatore di tubi, agitare leggermente i tubi manualmente ogni 10 min.
  8. Trasferire le soluzioni trypsin/cell da ogni regione in nuovi tubi di centrifuga.
  9. Aggiungere 2 volte il volume dei supporti HAEC preriscaldati a 37 gradi centigradi per tubo per inattivare l'enzima.
  10. Conservare la prima digestione sul ghiaccio.
  11. Ripetere i passaggi di 5,6 x 5,8 per un secondo periodo di digestione.
  12. Per ogni regione, tenere un'estremità della porzione di amnione utilizzando pinze dissetanti, e con un'altra coppia stringere lungo il tessuto per rimuovere file di cellule epiteliali che non si staccavano completamente durante i precedenti periodi di incubazione.
  13. Raccogliere la seconda digestione in un altro set di tubi di centrifuga e inattivare con 2 volte il volume dei supporti HAEC.
  14. Scartare le membrane digerite in un contenitore di rischio biologico.

6. Isolamento dell'HAEC

NOTA: La procedura deve essere eseguita all'interno di un armadietto della biosicurezza in condizioni sterili.

  1. Centrifugare tutti i tubi a 200 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
  2. Scartare il supernatante e aggiungere 10 mL di supporti HAEC preriscaldati (a 37 gradi centigradi) per tubo e pipet delicatamente per disaggregare ogni pellet.
  3. Combinare le sospensioni cellulari delle due digestione in un singolo tubo per ogni regione della membrana.
  4. Filtrare le sospensioni cellulari utilizzando più di 100 ceppi cellulari m per rimuovere i detriti della matrice extracellulare e ottenere singole cellule.
  5. Preparare tre aliquote con 90 litri di trippan blu in un tubo di microcentrifuga.
  6. Aggiungere 10 litri di ciascuna sospensione cellulare per regione di membrana nei tubi di microcentrismo e mescolare.
  7. Contare le cellule con un emocitometro al microscopio del campo luminoso.

7. Cultura dell'HAEC

  1. Semina l'HAEC delle tre regioni separatamente ad una densità di 3 x 104 cellule/cm2 con supporti HAEC preriscaldati, integrati con 10 ng/mL del fattore di crescita epidermico umano (EGF).
    1. Semina le cellule in piastre da 100 mm per mantenerle in vitro o in 24 pozze per l'analisi immunochimica.
  2. Incubare i piatti a 37 gradi centigradi in condizioni di norma (5% CO2)in un'incubatrice umidificata.
  3. Aggiungere EGF ogni giorno e cambiare il supporto ogni terzo giorno.
    NOTA: Le cellule diventeranno confluenti dopo 4/6 giorni.
  4. Utilizzare le cellule per l'immunohistochimica convenzionale, l'analisi di smistamento cellulare, criopreservazione, estrazione di RNA e proteine, o per continuare il passaggio.

8. Passaggio di HAEC

  1. Rimuovere il supporto HAEC e lavare 2x con soluzione PBS/EDTA 0.01M.
  2. Incubare con una soluzione PBS/EDTA 0,01M per 15 min a 37 gradi centigradi.
  3. Rimuovere il PBS/EDTA e aggiungere 1,5 mL di 0,5% trypsin/EDTA.
  4. Incubare per 5/8 min a 37 gradi centigradi.
  5. Inattivare l'enzima con due volumi di supporti HAEC.
  6. Raccogliere la soluzione mista e centrifugare per 5 min a 200 x g.
  7. Contare le celle e continuare con i passaggi successivi o utilizzare le cellule per ulteriori analisi.

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Representative Results

Gli HAEC sono stati isolati da ciascuna delle tre regioni anatomiche della membrana amniotica e coltivati individualmente in vitro. Dopo 48 h di coltura, le cellule con un fenotipo epiteliale aderito alla superficie della piastra, anche se i media contenevano anche detriti cellulari e cellule galleggianti, che sono stati rimossi una volta che il mezzo è stato cambiato (Figura 3).

Durante l'elaborazione della cultura primaria (passaggio zero, P0), potrebbero sorgere alcune complicazioni che possono interferire con l'analisi dei dati sperimentali (Figura 4): si consiglia di scartare le colture ed elaborare un'altra membrana dopo aver identificato la presenza di batteri dovuti alla contaminazione dei reagenti o durante il processo di isolamento (Figura 4A); eritrociti eccessivi a causa di lavaggio insufficiente delle membrane(Figura 4B); carente o assenza di adesione delle cellule alle piastre(Figura 4C); o cellule con morfologia fibroblasta (Figura 4D), suggerendo che le cellule mesenchymal amniotiche umane (HAMC) sono state isolate al posto dell'HAEC.

La morfologia HAEC dipende dall'origine di queste cellule: le cellule della zona riflessa hanno una morfologia cuboidale e crescono in un monostrato acciottolato, a differenza delle cellule delle regioni placentarie e ombelicali, che sono più piatte e squamose (Figura 5). Questi dati supportano che lo strato epiteliale dall'amnione non è uniforme in tutta la membrana. Durante i passaggi, la dimensione delle cellule di tutte le regioni aumenta, ma mantengono la loro natura epiteliale e non acquisiscono una morfologia fibroblasta. Infatti, l'immunofluorescenza contro l'E-cadherin ha mostrato che le colture primarie (P0) e le sottoculture (P1-P2) hanno mantenuto il loro fenotipo epiteliale(Figura 6), suggerendo che non vi è contaminazione di un altro tipo di cellula, come le cellule stromali mesenchy, o la transizione epiteliale-mesenchymal. Inoltre, queste cellule non mostrano alcuna prova della morte cellulare secondo l'aspetto TUNEL (Figura supplementare 1) ma sono positive per il marcatore di proliferazione KI-67 (Figura 6), anche se i nostri risultati precedenti non hanno trovato differenze significative per questo marcatore tra ogni passaggio5.

Il numero di cellule ottenute varia a seconda della regione: 61,6 x 106 e 71,8 x 106 cellule rispettivamente dalle regioni riflesse e placentari, e meno di 1 x 106 per campione dalla regione ombelicale (Tabella 1). È stato riportato con questo protocollo che la regione placentare e ombelicale sono molto simili nei loro profili di espressione, in contrapposizione alle regioni riflesse e placentari, in particolare nei geni che partecipano all'interazione del recettore ECM, all'adesione focale e al percorso di segnalazione PI3K-Akt attraverso RNA-seq6. In accordo, uno studio precedente ha riportato l'espressione differenziale della chinasi proteica attivata dal mitogeno e la trasformazione delle vie beta del fattore di crescita, nonché le citochine proinfiammatorie tra le due regioni17.

Anche se le prove hanno dimostrato che le sottopopolazioni dall'amnione differiscono nella loro morfologia e nelle proprietà fisiologiche, abbiamo dimostrato in precedenza che l'espressione e la presenza del nucleo dei fattori di pluripotenza non cambia nell'HAEC derivata dalle regioni placentarie e riflesse6. In questo contesto, oltre al numero relativamente limitato di cellule della regione ombelicale, studi successivi dovrebbero concentrarsi sull'HAEC isolato dall'amnione placentare e riflesso in modo indipendente, considerando le implicazioni fisiologiche, perché le diverse sottopopolazioni non risponderebbero ugualmente a eventi specifici, come gravidanza prolungata o processi infiammatori durante il travaglio, anche se non ci sono cellule positive specifiche ai marcatori di pluripotenza principale (Figura 7).

Figure 1
Figura 1: Regioni anatomiche della membrana amniotica a termine. Membrana amniotica mbelicale (giallo), membrana amniotica placentare (bianca) e membrana amniotica riflessa (nero). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: dissezione meccanica della membrana amniotica. (A) Regione ombelicale,(B) regione placentare e (C) regione riflessa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Cultura primaria rappresentativa dell'HAEC derivato dalla membrana amniotica. Cultura 48 h dopo l'isolamento senza (A) e con (B) un cambiamento di media. Barre di scala - 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Micrografie rappresentative dei risultati negativi della cultura primaria dell'HAEC. (A) Eccesso di eritrociti. (B) Contaminazione batterica. (C) HAEC non aderito dopo 48 h di isolamento. (D) Coltura primaria composta da cellule con morfologia del fibroblasto. Barre di scala - 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Morfologia dell'HAEC da diverse regioni anatomiche in vitro. Micrografie rappresentative di HAEC confluente da regioni riflesse (pannello superiore), placentare (pannello centrale) e ombelicali (pannello inferiore) coltivate attraverso P0-P2. Barre di scala 200 x m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Espressione di E-cadherin e KI-67 in HAEC. Immagini rappresentative di microscopia a epifluorescenza di E-cadherin e KI-67- HAEC da amnion riflessi (pannello sinistro) e placentare (pannello destro) coltivati attraverso P0 .P2. Barre di scala : 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: HAEC di diverse regioni anatomiche mostra un pannello marcatore di pluripotenza. Rappresentativo delle immagini di microscopia confocale di amnione a doppia immunofluorescenza per NANOG con TRA-1-60, OCT4 con E-cadherin e SOX2 con SSEA-4 in HAEC (P1) da regioni riflesse (pannello superiore) e placentare (pannello inferiore). Barre di scala : 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

- MEMBRANA Riflette Placentare Ombelicale MEMBRANA COMPLETA
1 75 X 106 130 X 106 0,2 X 106 205,2 X 106
2 38,5 X 106 52 X 106 0,53 X 106 91.03 X 106
3 59 X 106 53 X 106 0,2 X 106 112,2 X 106
4 42 X 106 27 X 106 0,36 X 106 69,36 X 106
5 44,8 X 106 22,3 X 106 Np 76,1 X 106
6 100 X 106 140 X 106 1 X 106 241 X 106
7 72 X 106 78 X 106 Np 150 X 106
Nella media 61,6 X 106 71,8 X 106 0,45 X 106 133,8 X 106

Tabella 1: Numero di HAEC isolati per regione da membrane amniotiche. (NP - non elaborato).

Figura supplementare 1: Colorazione TUNEL in HAEC (passaggio 2) dalla regione riflessa e nelle cellule di controllo positive (cellule HL-60 trattate con camptotina). Barre di scala - 50 m. Fare clic qui per scaricare questa figura.

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Discussion

Abbiamo implementato un nuovo protocollo per isolare l'HAEC dalle membrane di termine. Si differenzia dai rapporti precedenti in quanto ogni membrana è stata divisa nelle sue tre regioni anatomiche prima dell'isolamento per analizzare le cellule da ciascuna di esse.

Uno dei passaggi più critici nel protocollo è il lavaggio della membrana per rimuovere tutti i coaguli di sangue, perché possono interferire con l'attività della trypsin quando si separano le cellule epiteliali. La mancata esecuzione corretta di questo passaggio può portare ad ottenere una coltura primaria con eritrociti eccessivi e poche cellule epiteliali aderenti. Se non viene osservato alcun attaccamento nelle prime 24-48 h dopo il seeding delle cellule, si consiglia di eliminare la coltura. Un altro punto critico è il tempo di incubazione per la digestione ezimatica. Se il periodo di incubazione è troppo lungo, la vitalità cellulare può diminuire e/o le colture cellulari con morfologia mesenchica invece di epiteliale(Figura 4). Inoltre, se la digestione della membrana non viene eseguita con l'agitazione corretta, aumenta la probabilità di ottenere un basso numero di cellule per membrana.

In questo protocollo, possiamo mantenere le popolazioni di HAEC in vitro senza perdere il loro fenotipo epiteliale, come dimostrato dalla presenza di specifico marcatore di cellule epiteliali E-cadherin per la maggior parte delle cellule lungo i passaggi (Figura 6). Tuttavia, nella nostra esperienza, l'HAEC può essere ampliato solo per tre passaggi (P1-P3). Il numero limitato di passaggi dovrebbe essere preso in considerazione per gli esperimenti che richiedono lunghi periodi di cultura o passaggi multipli. Inoltre, è stato riferito che dopo P3 le cellule iniziano a cambiare la loro morfologia e riducono l'espressione di E-cadherin, quindi la coltura prolungata potrebbe indurre la transizione epiteliale-mesenchymal (EMT)18. Recentemente, è stato dimostrato che il progesterone previene l'EMT nelle cellule epiteliali amniotiche19,20, quindi sarebbe interessante analizzare l'effetto di diverse concentrazioni di progesterone nel mezzo di coltura HAEC per evitare il fenotipo mesenchymal dopo il terzo passaggio.

In tutti i rapporti precedenti in cui l'HAEC è stato isolato, l'amnione è stato assunto come un tessuto uniforme nonostante la possibile eterogeneità delle popolazioni epiteliali che compongono l'intera membrana. Al contrario, questo protocollo divide la membrana nelle sue tre aree anatomiche per isolare separatamente e la cultura HAEC considerando i precedenti rapporti di espressione morfologica e genica che suggeriscono differenze funzionali. Non è inoltre necessario purificare attraverso lo smistamento cellulare per ottenere solo popolazioni epiteliali, come dimostrato dal rilevamento del marcatore E-cadherin durante i passaggi fino alla P2.

È stato dimostrato che l'HAEC isolato da ciascuna delle regioni della membrana ha un'espressione simile di nucleo di pluripotenza, essendo un serbatoio latente di cellule con stelo. In questo contesto, queste cellule possono essere utilizzate in vitro per studiare meccanismi molecolari, come la localizzazione dinamica dei fattori di trascrizione legati alla pluripotenza o la loro capacità di rimanere quiescenti pur esprimendo geni associati al cancro, indipendentemente dalla loro regione anatomica di origine. Tuttavia, la ricerca futura deve considerare le differenze molecolari segnalate (geni di espressione globale, attività metabolica, vie di segnalazione) tra ogni regione, che avrebbe ripercussioni per la loro applicazione nella medicina rigenerativa. In precedenza abbiamo riportato una diversa espressione dei geni coinvolti nel PI3K/AKT e le vie di segnalazione dell'adesione focale tra le diverse regioni amniotiche da parte dell'RNA-seq6. PI3K/AKT regola l'auto-rinnovamento e mantiene la pluripotenza in HPSC, mentre l'attivazione della chinasi focale promuove la loro differenziazione21,22. Pertanto, proponiamo di caratterizzare il ruolo di entrambi i percorsi in HAEC isolati da diverse regioni anatomiche durante i protocolli di differenziazione specifici del lignaggio. Inoltre, diversi studi dimostrano le differenze tra le due regioni per quanto riguarda i componenti cellulari, la funzione molecolare e i processi biologici. Ad esempio, l'espressione genica specifica della regione e la distribuzione delle proteine delle acquaporine, che sono coinvolte nel processo di trasporto dell'assorbimento intramembranoso, sono state segnalate23. Un altro studio ha confrontato il miRNome da microarray, mostrando espressione specifica della regione di miR-145 e miR-143, quest'ultimo è in grado di regolamentare posttranscriptionally regolare la synthase prostaglandin-endoperossiase 2 in condizioni specifiche come il lavoro a termine16. Inoltre, la regione placentare presenta una maggiore respirazione mitocondriale ma una minore rilevazione reattiva delle specie di ossigeno rispetto al tessuto riflesso15. La dissezione dell'amnione nelle regioni riflesse e placentari è incoraggiata a isolare l'HAEC e ad analizzare separatamente le loro proprietà peculiari, come il rilascio di fattori di crescita e citochine, la loro bassa immunogenicità, la produzione di matrice extracellulare, l'effetto del loro mezzo condizionato nella cocultura con altri tipi di cellule e nuove funzioni come la loro capacità di mantenere le linee HPSC come strato di alimentatore24.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

La nostra ricerca è stata sostenuta dalle sovvenzioni dell'Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 e 21081) e del CONACYT (A1-S-8450 e 252756). Ringraziamo Jessica Gonzàlez Norris e Lidia Yuriria Paredes Vivas per il supporto tecnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture reagents
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific/Gibco 21985023 55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific/Gibco 12430054 Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA Thermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G 0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified Thermo Fisher Scientific/Gibco 10439024
Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher Scientific/Gibco 11140050 100X
Paraformaldehyde any brand
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%) any brand
Sodium Pyruvate Thermo Fisher Scientific/Gibco 11360070 100 mM
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific/Gibco 25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352360
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator MaCSmix
Antibodies and Kits Antibody ID
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 RRID:AB_3975
Anti-KI67 Santa Cruz 23900 RRID:AB_627859)
Anti-NANOG Peprotech 500-P236 RRID:AB_1268274
Anti-OCT4 Abcam ab19857 RRID:AB_44517
Anti-SOX2 Millipore AB5603 RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4 Cell Signaling 4755 RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60 Cell Signaling 4746 RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit Abcam 66110

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References

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