In Vitro Cultura das Células Epitelias de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana

Developmental Biology

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Summary

Este protocolo descreve o isolamento de células epiteliais de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana para determinar sua heterogeneidade e propriedades funcionais para possível aplicação em modelos clínicos e fisiopatológicos.

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Avila-González, D., García-López, G., Díaz-Martínez, N. E., Flores-Herrera, H., Molina-Hernández, A., Portillo, W., Díaz, N. F. In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane. J. Vis. Exp. (153), e60551, doi:10.3791/60551 (2019).

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Abstract

Vários protocolos foram relatados na literatura para o isolamento e a cultura das células epiteliais amnióticas humanas (HAEC). No entanto, estes assumem que o epitélio amniótico é uma camada homogênea. O amnion humano pode ser dividido em três regiões anatômicas: refletida, placentária e umbilical. Cada região tem diferentes papéis fisiológicos, como em condições patológicas. Aqui, descrevemos um protocolo para dissecar o tecido amnion humano em três seções e mantê-lo in vitro. Na cultura, as pilhas derivadas do amnion refletido indicaram uma morfologia cuboidal, quando as pilhas das regiões placental e umbilicais eram escamosas. No entanto, todas as células obtidas têm um fenótipo epiteliais, demonstrado pela imunodetecção de E-cadherin. Assim, como as regiões placentárias e refletidas in situ diferem em componentes celulares e funções moleculares, pode ser necessário que estudos in vitro considerem essas diferenças, pois podem ter implicações fisiológicas para o uso de HAEC em pesquisa biomédica e a aplicação promissora dessas células na medicina regenerativa.

Introduction

As células amnióticas do epitélio (HAEC) têm origem nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário, por volta de oito dias após a fertilização. Eles surgem de uma população de células epiteliais escamosas do epiblasto que derivam da camada mais interna da membrana amniótica1. Assim, haec são considerados remanescentes de células pluripotentes do epiblasto que têm o potencial de diferenciar as três camadas germinas do embrião2. Na última década, diversos grupos de pesquisa desenvolveram métodos para isolar essas células da membrana amniótica no termo da gestação para caracterizar suas propriedades presuntivas relacionadas à pluripotência em um modelo de cultura in vitro3,4.

Assim, verificou-se que haec características características características de células-tronco pluripotentes humanas (HPSC), tais como os antígenos de superfície SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; o núcleo dos fatores de transcrição da pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG; e o marcador de proliferação KI67, sugerindo que eles são auto-renovação5,6,7. Além disso, essas células têm sido desafiadas usando protocolos de diferenciação para obter células positivas para marcadores específicos de linhagem das três camadas germinativas (ectoderme, mesoderme e endoderm)4,5,8,bem como em modelos animais de doenças humanas. Finalmente, HAEC expressar E-cadherin, que demonstram que eles mantêm uma natureza epitelial muito parecido com o HPSC5,9.

Além de sua origem embrionária, haec têm outras propriedades intrínsecas que os tornam adequados para diferentes aplicações clínicas, tais como a secreção de moléculas anti-inflamatórias e antibacterianas10,11, fatores de crescimento e citocina liberação12, nenhuma formação de teratomas quando eles são transplantados em ratos imunodeficientes em contraste com HPSC2, e tolerância imunológica, porque eles expressam HLA-G, que diminui o risco de rejeição após a rejeição transplante13.

No entanto, relatos anteriores assumiram que o amniônio humano é uma membrana homogênea, sem considerar que pode ser anatomicamente e fisiologicamente dividida em três regiões: placental (a amniônia que cobre a decidua basalis), umbilical (a parte que envolve o cordão umbilical) e refletida (o resto da membrana não ligada à placenta)14. Tem sido demonstrado que as regiões placentárias e refletidas da amniônia apresentam diferenças na morfologia, atividade mitocondrial, detecção de espécies reativas de oxigênio15,expressão miRNA16,e ativação das vias de sinalização17. Estes resultados sugerem que o amnion humano está integrado por uma população heterogênea com funcionalidade diferente que deve ser considerada para estudos mais adicionais realizados em modelos in situ ou in vitro. Enquanto outros laboratórios projetaram protocolos para o isolamento da HAEC de toda a membrana, nosso laboratório estabeleceu um protocolo para isolar, cultura e caracterizar células de diferentes regiões anatômicas.

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Protocol

Este protocolo foi aprovado pelo comitê de ética do Instituto Nacional de Perinatología, na Cidade do México (Registro número 212250-21041). Todos os procedimentos realizados nesses estudos estavam de acordo com os padrões éticos do Instituto Nacional de Perinatología, da Declaração de Helsínquia, e das diretrizes estabelecidas no Padrão Oficial mexicano do Ministério da Saúde.

1. Preparação

  1. Prepare uma solução de 1x PBS com EDTA. Para fazer isso, adicione 500 μL de 0,5 M DETA estoque em 500 mL de 1x PBS para uma concentração final de 0,5 mM EDTA.
  2. Prepare o meio de cultura para haec. Tome 450 mL de alta glicose-DMEM, complementá-lo com 5 mL de piruvato de sódio (100 mM), 50 mL de calor-inativo fetal soro bovino qualificado para células-tronco, 5 mL de aminoácidos não essenciais (100x), 5 mL de antibiótico-antimicotic (100x), 5 mL de L-glutamina (200m) e 500 μL de mercaptoetanol (1.000x).
  3. Esterilizar os recipientes para transportar e processar o tecido: um recipiente de aço inoxidável com uma tampa para transportar toda a placenta da sala de cirurgia para o laboratório, uma bandeja (20 cm x 30 cm x 8 cm) para lavar e remover o sangue de toda a placenta antes a dissecação da membrana amniótica, e uma tábua de corte de plástico para separar a membrana amniótica nas três regiões.
  4. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos (bisturis, tesouras, fórceps e grampos), copos de 500 mL, gazes de algodão e solução salina.

2. Obtenção de tecido placentária

NOTA: As membranas amnióticas foram obtidas de mulheres em gestação a termo (37 a 40 semanas), indicação de parto cesáreo, sem qualquer evidência de trabalho de parto ativo, e sem características microbiológicas de infecção. Os procedimentos completos de isolamento e cultura foram realizados dentro de um armário de biossegurança condições estéreis.

  1. Na sala de cirurgia, aperte o cordão umbilical para evitar o fluxo sanguíneo para o resto do tecido. Recolher toda a placenta com o cordão umbilical preso no recipiente estéril.
  2. Adicione 500 mL de solução sorino ao recipiente para hidratar a placenta.
  3. Feche o recipiente e transporte o tecido para o laboratório à temperatura ambiente.
  4. Coloque o recipiente com a placenta dentro do armário de biossegurança.
    NOTA: No caso de a dissecação não é realizada dentro de 15 minutos de coleta da placenta, armazenar o recipiente com a placenta no gelo até o processamento. Evite mais de 1 h de tempo decorrido entre a obtenção da placenta e o início da dissecação.

3. Separação mecânica por região da membrana amniótica

NOTA: O procedimento deve ser realizado dentro de um armário de biossegurança em condições estéreis e à temperatura ambiente.

  1. Retire toda a placenta do recipiente e coloque-o na bandeja com o cordão umbilical voltado para cima.
  2. Usando uma gaze de algodão estéril, limpe os coágulos sanguíneos da superfície do chorion-amnion que cobre a placenta.
  3. Identifique as três regiões da membrana: o amnion umbilical que envolve o cordão umbilical, a amnion placentária que cobre os basalis da decidua, e a região refletida, que é o descanso do amnion que não é unido à placenta(figura 1).
  4. Dissecar a região do amnion umbilical(Figura 2A).
    1. Usando fórceps dissecando, segure a porção de membrana de amnônio que cobre a junção da placenta e do cordão umbilical.
    2. Com um bisturi, dissecar a região que rodeia o cordão enquanto se estende para separá-lo do chorion.
    3. Deposite o tecido separado em um copo rotulado com 100 mL de solução saline.
  5. Dissecar a região do amnion placentário(Figura 2B).
    1. Com uma gaze de algodão estéril, retire os coágulos sanguíneos da superfície do chorion-amnion que cobre a placenta.
    2. Segure a membrana na fronteira entre a placenta e a região refletida com fórceps dissecando.
    3. Corte ao longo da circunferência da placenta com o bisturi.
    4. Separe o amnion placental do chorion, sendo cuidadoso não cortar nenhuma embarcação da placenta.
    5. Coloque o tecido separado em outro copo rotulado com 300 mL de solução saline.
  6. Separe o resto da membrana amniótica que não está ligada à placenta (ou seja, a porção refletida) do chorion(Figura 2C).
    1. Colete a região refletida em outro copo rotulado com 300 mL de solução sorino.
      NOTA: Adicione a solução shinhosa continuamente durante a dissecação para evitar que o tecido seque.

4. Lavar as membranas

NOTA: O procedimento deve ser realizado dentro de um armário de biossegurança condições estéreis à temperatura ambiente.

  1. Descarte a solução sismina de cada região da membrana separadamente.
  2. Adicione 100 mL de solução shinhona fresca para a região umbilical.
  3. Adicione 300 mL de solução sorino fresca para as regiões placentárias e refletidas, respectivamente.
  4. Mexa as membranas com a ajuda de dissecar fórceps para remover resíduos sanguíneos.
  5. Descarte a solução shinhosa.
  6. Repita as lavares e agitação, pelo menos, 3x até que as membranas são translúcidas.
  7. Coloque e estender as membranas na placa para limpar com gaze estéril os coágulos sanguíneos que não foram removidos com as lavares.
    NOTA: É muito importante remover o maior número possível de eritrócitos, pois sua presença afeta a função de tripsina e a viabilidade das culturas celulares subsequentes.

5. Digestão enzimática das membranas de diferentes regiões

NOTA: O procedimento deve ser realizado dentro de um armário de biossegurança condições estéreis.

  1. Corte as regiões refletidas e placentárias em dois ou três fragmentos.
  2. Não corte a região umbilical.
  3. Coloque os fragmentos de cada região em tubos de centrífuga. Adicione 20 mL de 0,5% de trippsina/EDTA às regiões refletidas e placentárias e 5 mL de 0,5% de trippsina/EDTA à região umbilical, respectivamente.
    NOTA: É importante cortar as regiões refletidas e placentárias em pedaços menores, porque eles precisam ser completamente imersos na solução de tripsina.
  4. Agite os tubos de centrífuga levemente por 30 s. Descarte a trippsina.
  5. Adicione 30 mL de nova trippsina/EDTA de 0,5% às regiões refletidas e placentárias e 15 mL de trippsina/EDTA de 0,5% para a região umbilical, respectivamente.
  6. Coloque os tubos em um rotador dentro da incubadora.
  7. Incubar com rotação (20 rpm) para 40 min em 37 °C.
    NOTA: Se um girador do tubo não está disponível, agite os tubos levemente manualmente cada 10 min.
  8. Transfira as soluções de tripsina/célula de cada região para novos tubos de centrífuga.
  9. Adicione 2x o volume de mídia HAEC pré-aquecido a 37 °C por tubo para inativar a enzima.
  10. Guarde a primeira digestão no gelo.
  11. Repita os passos 5,6-5,8 para um segundo período de digestão.
  12. Para cada região, segure uma extremidade da porção de amniônio usando fórceps dissecando, e com outro par espremer ao longo do tecido para remover fileiras de células epiteliais que não descascar completamente durante os períodos de incubação anteriores.
  13. Colete a segunda digestão em outro conjunto de tubos de centrífuga e inative com 2x o volume de mídia HAEC.
  14. Descarte as membranas digeridas em um recipiente de risco biológico.

6. Isolamento da HAEC

NOTA: O procedimento deve ser realizado dentro de um armário de biossegurança condições estéreis.

  1. Centrífuga todos os tubos a 200 x g por 10 min a 4 °C.
  2. Descarte o supernatant e adicione 10 mL de mídia haec pré-aquecida (a 37 °C) por tubo e pipet suavemente para desagregar cada pelota.
  3. Combine as suspensões celulares das duas digestões em um tubo individual para cada região da membrana.
  4. Filtre as suspensões celulares usando filtros de células de 100 μm para remover os detritos da matriz extracelular e obter células únicas.
  5. Prepare três alíquotas com 90 μL de trippan azul em um tubo de microcentrífuga.
  6. Adicione 10 μL de cada suspensão celular por região de membrana nos tubos de microcentrífuga e misture.
  7. Conte as células com um hemocytometer um microscópio de campo de luz.

7. Cultura da HAEC

  1. Semente o HAEC das três regiões separadamente a uma densidade de 3 × 104 células/cm2 com mídia haec pré-aquecida, complementada com 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano (EGF).
    1. Semeie as células em placas de 100 mm para mantê-las in vitro ou em 24 placas de poço para análise imunoquímica.
  2. Incubar os pratos a 37 °C condições normoxic (5% CO2)em uma incubadora umidificada.
  3. Adicione o EGF diariamente e altere o meio a cada três dias.
    NOTA: As células se tornarão confluentes após 4 a 6 dias.
  4. Use as células para imunohistoquímica convencional, análise de classificação celular, criopreservação, RNA e extração de proteínas, ou para continuar a passagem.

8. Passagem de HAEC

  1. Retire o meio HAEC e lave 2x com a solução PBS/EDTA 0,01M.
  2. Incubar com uma solução PBS/EDTA 0.01M por 15 min a 37 °C.
  3. Retire o PBS/EDTA e adicione 1,5 mL de 0,5% de tripsina/EDTA.
  4. Incubar por 5-8 min a 37 °C.
  5. Inativar a enzima com dois volumes de mídia HAEC.
  6. Colete a solução mista e centrífuga para 5 min a 200 x g.
  7. Conte as células e continue seguindo passagens ou use as células para uma análise mais aprofundada.

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Representative Results

Haec foram isolados de cada uma das três regiões anatômicas da membrana amniótica e individualmente cultivadas in vitro. Após 48 h de cultura, células com fenótipo epiteliais aderiram à superfície da placa, embora a mídia também continha detritos celulares e células flutuantes, que foram removidas uma vez que o meio foi alterado (Figura 3).

Durante o processamento da cultura primária (passagem zero, P0), algumas complicações podem surgir que podem interferir na análise experimental de dados (Figura 4):é aconselhável descartar as culturas e processar outra membrana ao identificar a presença de bactérias devido à contaminação dos reagentes ou durante o processo de isolamento (Figura 4A); eritrócitos excessivos devido à lavagem insuficiente das membranas (Figura 4B); deficiente ou nenhuma adesão das células às placas(Figura 4C); ou células com morfologia do fibroblasto (Figura 4D),sugerindo que as células mesenchymal amnióticas humanas (HAMC) foram isoladas em vez de HAEC.

A morfologia haec depende da origem dessas células: as células da zona refletida têm uma morfologia cuboidal e crescem em uma monocamada de paralelepípedos, ao contrário das células das regiões placentárias e umbilicais, que são mais planas e escamosas (Figura 5). Esses dados suportam que a camada epiteliana do amniônio não é uniforme em toda a membrana. Durante as passagens, o tamanho das células de todas as regiões aumenta, mas eles mantêm sua natureza epiteliana e não adquirem uma morfologia do fibroblasto. De fato, a imunofluorescência contra e-cadherin mostrou que as culturas primárias (P0) e subculturas (P1-P2) mantiveram seu fenótipo epitelia(Figura 6),sugerindo que não há contaminação de outro tipo de célula, como células estromais mesenchymal, ou transição epitelial-melóchymal. Além disso, essas células não mostram nenhuma evidência de morte celular de acordo com o ensaio tunel(Figura Suplementar 1),mas são positivas para o marcador de proliferação KI-67 (Figura 6),embora nossos resultados anteriores não encontraram diferenças significativas para este marcador entre cada passagem5.

O número de células obtidas varia de acordo com a região: 61,6 x 106 e 71,8 x 106 células das regiões refletidas e placentárias, respectivamente, e menos de 1 x 106 por amostra da região umbilical(Tabela 1). Tem sido relatado com este protocolo que a região placentária e umbilical são muito semelhantes em seus perfis de expressão, em oposição às regiões refletidas e placentárias, especialmente em genes que participam da interação do receptor ECM, adesão focal e a via de sinalização PI3K-Akt através do RNA-seq6. De acordo, um estudo anterior relatou a expressão diferencial de proteína quinase ativada por mitogênicos e transformação de vias beta fator de crescimento, bem como citocinas proinflamatórias entre ambas as regiões17.

Embora as evidências mostrassem que as subpopulações da amniônia diferem em suas morfologia e propriedades fisiológicas, demonstramos anteriormente que a expressão e a presença do núcleo dos fatores de pluripotência não mudam na HAEC derivada das regiões placentárias e refletidas6. Nesse contexto, além do número relativamente limitado de células da região umbilical, estudos subsequentes devem se concentrar em HAEC isolado do amnion placentário e refletido de forma independente, considerando as implicações fisiológicas, pois as diferentes subpopulações não responderiam igualmente a eventos específicos, como gravidez prolongada ou processos inflamatórios durante o trabalho de parto, embora não existam células positivas específicas para os principais marcadores de pluripotência (Figura 7).

Figure 1
Figura 1: Regiões anatômicas da membrana amniótica a termo. Membrana amniótica umbilical (amarela), membrana amniótica placentária (branca) e membrana amniótica refletida (preta). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Dissecação mecânica da membrana amniótica. (A)Região umbilical,(B)região placentária, e (C)refletiu região. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Cultura primária representativa da HAEC derivada da membrana amniótica. Cultura 48 h após o isolamento sem (A)e com (B) uma mudança de mídia. Barras de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Micrografias representativas de resultados negativos da cultura primária da HAEC. (A)Excesso de eritrócitos. (B)Contaminação bacteriana. (C)HAEC não aderiu após 48 h de isolamento. (D)Cultura primária composta por células com morfologia do fibroblasto. Barras de escala = 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5: Morfologia da HAEC de diferentes regiões anatômicas in vitro. Micrografias representativas de confluentes HAEC de regiões refletidas (painel superior), placental (painel médio) e umbilicais (painel inferior) cultivadas embora P0-P2. Barras de escala 200 = μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 6
Figura 6: Expressão de E-cadherin e KI-67 em HAEC. Imagens representativas de microscopia de epifluorescência de E-cadherin+ e KI-67+ HAEC de amnion refletido (painel esquerdo) e placental (painel direito) cultivados através de P0-P2. Barras de escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 7
Figura 7: HAEC de diferentes regiões anatômicas exibem um painel marcador de pluripotência. Imagens representativas de microscopia confocal de amnion de imunofluorescência dupla para NANOG com TRA-1-60, OCT4 com E-cadherin e SOX2 com SSEA-4 em HAEC (P1) de regiões refletidas (painel superior) e placentárias (painel inferior). Barras de escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

# MEMBRANA Refletido Placentária Umbilical MEMBRANA COMPLETA
1 75 X 10 6 75 X 106 130 X 10 6 130 X 106 0,2 X 106 205,2 X 106
2 38,5 X 106 52 X 10 6 52 X 106 0,53 X 106 91,03 X 106
3 59 X 10 6 59 X 106 53 X 10 6 53 X 106 0,2 X 106 112,2 X 106
4 42 X 10 6 42 X 106 27 X 10 6 27 X 106 0,36 X 106 69,36 X 106
5 44,8 X 106 22,3 X 106 Np 76.1 X 10 6 76.1 X 106
6 100 X 106 140 X 10 6 140 X 106 1 X 10 6 1 X 106 241 X 10 6 241 X 106
7 72 X 10 6 72 X 106 78 X 10 6 78 X 106 Np 150 X 106
Média 61,6 X 106 71,8 X 106 0,45 X 106 133,8 X 106

Tabela 1: Número de HAEC isolado por região de membranas amnióticas. (NP = não processado).

Figura suplementar 1: Tunel mancha sonoridade em HAEC (passagem 2) da região refletida e em células de controle positivo (HL-60 células tratadas com camptothecin). Barras de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para baixar este número.

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Discussion

Implementamos um novo protocolo para isolar a HAEC das membranas a termo. Difere dos relatórios precedentes que cada membrana estêve dividida em suas três regiões anatômicas antes da isolação para analisar pilhas de cada um.

Uma das etapas mais críticas no protocolo é a lavagem da membrana para remover todos os coágulos sanguíneos, porque eles podem interferir com a atividade da tripseao separar as células epiteliais. A falha realizar corretamente esta etapa pode conduzir a obter uma cultura preliminar com eritrócitos excessivos e poucas pilhas epiteliais aderentes. Se nenhum apego é observado nos primeiros 24-48 h após a semeadura das células, recomendamos descartar a cultura. Outro ponto crítico é o tempo de incubação para a digestão enzimática. Se o período de incubação for muito longo, a viabilidade celular pode diminuir e/ou culturas celulares com mesenchymal em vez de morfologia epitelia podem ser obtidas(Figura 4). Além disso, se a digestão da membrana não for feita com a agitação adequada, a probabilidade de obter um baixo número de células por membrana aumenta.

Neste protocolo, podemos manter populações de HAEC in vitro sem perder seu fenótipo epiteliano, como demonstrado pela presença do marcador epitelial específico de células E-cadherin para a maioria das células ao longo das passagens (Figura 6). No entanto, em nossa experiência, o HAEC só pode ser expandido para três passagens (P1-P3). O número limitado de passagens deve ser levado em consideração para experimentos que exigem longos períodos de cultura ou várias passagens. Além disso, tem sido relatado que depois de P3 as células começam a mudar sua morfologia e reduzir a expressão de E-cadherin, de modo que a cultura prolongada poderia induzir transição epitelio-mesenchymal (EMT)18. Recentemente, foi demonstrado que a progesterona impede que o EMT nas células epiteliais amnióticas ovina19,20,por isso seria interessante analisar o efeito de diferentes concentrações de progesterona no meio de cultura HAEC para evitar o fenótipo de mesenchymal após a terceira passagem.

Em todos os relatórios anteriores onde haec foram isolados, o amnion tem sido assumido como um tecido uniforme, apesar da possível heterogeneidade das populações epiteliais que compõem toda a membrana. Em contraste, este protocolo divide a membrana em suas três áreas anatômicas para isolar separadamente e cultura HAEC considerando os relatórios de expressão morfológica e gênica anteriores que sugerem diferenças funcionais. Também é desnecessário purificar através da classificação celular para obter apenas populações epiteliais, como demonstrado pela detecção do marcador De-cadherin durante passagens até P2.

Tem sido demonstrado que haec isolado de cada uma das regiões de membrana têm uma expressão semelhante do núcleo de pluripotência, sendo um reservatório latente de células com caule. Neste contexto, essas células podem ser usadas in vitro para estudar mecanismos moleculares, como a localização dinâmica de fatores de transcrição relacionados à pluripotência ou sua capacidade de permanecer quiescente apesar de expressar genes associados ao câncer, independentemente de sua região anatômica de origem. No entanto, pesquisas futuras devem considerar diferenças moleculares relatadas (genes de expressão global, atividade metabólica, vias de sinalização) entre cada região, o que teria repercussões para sua aplicação na medicina regenerativa. Anteriormente, relatamos uma expressão diferente de genes envolvidos no PI3K/AKT e nas vias de sinalização de adesão focal entre as diferentes regiões amnióticas por RNA-seq6. PI3K/AKT regula a auto-renovação e mantém pluripotência no HPSC, enquanto a ativação da adesão focal quinase promove sua diferenciação21,22. Assim, propomos caracterizar o papel de ambas as vias na HAEC isoladas de diferentes regiões anatômicas durante protocolos de diferenciação específicos da linhagem. Além disso, vários estudos demonstram as diferenças entre ambas as regiões em relação a componentes celulares, função molecular e processos biológicos. Por exemplo, a expressão gênica específica da região e a distribuição de proteínas das aquaporinas, que estão envolvidas no processo de transporte de absorção intramembranous, foram relatadas23. Outro estudo comparou o miRNome por microarrays, mostrando a expressão específica da região de miR-145 e miR-143, sendo este último capaz de regular posttranscriionamente a synthase prostaglandina-endoperoxidase 2 em condições específicas, como trabalho no termo16. Além disso, a região placentária apresenta maior respiração mitocondrial, mas menor detecção de espécies reativas de oxigênio em comparação com o tecido refletido15. Dissecar o amnion em regiões refletidas e placentárias é incentivado isolar HAEC e analisar separadamente suas propriedades peculiares, tais como a liberação de fatores de crescimento e citocinas, sua baixa imunogenicidade, produção de matriz extracelular, o efeito de seu meio condicionado na cocultura com outros tipos de células, e funções novas, como sua capacidade de manter as linhas HPSC como uma camada de alimentação24.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Nossa pesquisa contou com o apoio de doações do Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 e 21081) e CONACYT (A1-S-8450 e 252756). Agradecemos a Jessica González Norris e Lidia Yuriria Paredes Vivas pelo apoio técnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture reagents
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific/Gibco 21985023 55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific/Gibco 12430054 Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA Thermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G 0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified Thermo Fisher Scientific/Gibco 10439024
Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher Scientific/Gibco 11140050 100X
Paraformaldehyde any brand
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%) any brand
Sodium Pyruvate Thermo Fisher Scientific/Gibco 11360070 100 mM
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific/Gibco 25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352360
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator MaCSmix
Antibodies and Kits Antibody ID
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 RRID:AB_3975
Anti-KI67 Santa Cruz 23900 RRID:AB_627859)
Anti-NANOG Peprotech 500-P236 RRID:AB_1268274
Anti-OCT4 Abcam ab19857 RRID:AB_44517
Anti-SOX2 Millipore AB5603 RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4 Cell Signaling 4755 RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60 Cell Signaling 4746 RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit Abcam 66110

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References

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