In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Developmental Biology

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Summary

Ce protocole décrit l'isolement des cellules épithéliales de différentes régions anatomiques de la membrane amniotique humaine pour déterminer leur hétérogénéité et leurs propriétés fonctionnelles pour l'application possible dans les modèles cliniques et physiopathologiques.

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Avila-González, D., García-López, G., Díaz-Martínez, N. E., Flores-Herrera, H., Molina-Hernández, A., Portillo, W., Díaz, N. F. In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane. J. Vis. Exp. (153), e60551, doi:10.3791/60551 (2019).

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Abstract

Plusieurs protocoles ont été rapportés dans la littérature pour l'isolement et la culture des cellules épithéliales amniotiques humaines (HAEC). Cependant, ceux-ci supposent que l'épithélium amniotique est une couche homogène. L'amnion humain peut être divisé en trois régions anatomiques : réfléchie, placentaire et ombilicale. Chaque région a des rôles physiologiques différents, tels que dans des conditions pathologiques. Ici, nous décrivons un protocole pour disséquer le tissu humain d'amnion dans trois sections et le maintenir in vitro. Dans la culture, les cellules dérivées de l'amnion réfléchi ont montré une morphologie cuboïde, alors que les cellules des régions placentaires et ombilicales étaient squamous. Néanmoins, toutes les cellules obtenues ont un phénotype épithélial, démontré par l'immunodétection de l'E-cadherin. Ainsi, étant donné que les régions placentales et réfléchies in situ diffèrent dans les composants cellulaires et les fonctions moléculaires, il peut être nécessaire que les études in vitro tiennent compte de ces différences, car elles pourraient avoir des implications physiologiques pour l'utilisation de l'AOHC dans biomédecine et l'application prometteuse de ces cellules en médecine régénérative.

Introduction

Les cellules d'épithélium amniotique humaine (HAEC) proviennent des premiers stades du développement embryonnaire, à environ huit jours de postfertilisation. Ils proviennent d'une population de cellules épithéliales squameuses de l'épiblaste qui dérivent de la couche la plus interne de la membrane amniotique1. Ainsi, HAEC sont considérés comme des restes de cellules pluripotentes de l'épiblaste qui ont le potentiel de se différencier en trois couches germinales de l'embryon2. Au cours de la dernière décennie, divers groupes de recherche ont mis au point des méthodes pour isoler ces cellules de la membrane amniotique à la période de gestation afin de caractériser leurs propriétés présomptives liées à la pluripotence dans un modèle culturel in vitro3,4.

En conséquence, il a été constaté que HAEC caractéristiques caractéristiques des cellules souches pluripotentes humaines (HPSC), tels que les antigènes de surface SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; le noyau des facteurs de transcription de pluripotence OCT4, SOX2, et NANOG ; et le marqueur de prolifération KI67, suggérant qu'ils sont auto-renouvellement5,6,7. En outre, ces cellules ont été contestées en utilisant des protocoles de différenciation pour obtenir des cellules positives pour les marqueurs spécifiques à la lignée des trois couches germinales (ectoderm, mesoderm et endoderm)4,5,8, ainsi que dans les modèles animaux des maladies humaines. Enfin, HAEC exprime E-cadherin, qui démontrent qu'ils conservent une nature épithéliale un peu comme le HPSC5,9.

En dehors de leur origine embryonnaire, HAEC ont d'autres propriétés intrinsèques qui les rendent adaptés à différentes applications cliniques, telles que la sécrétion de molécules anti-inflammatoires et antibactériennes10,11, facteurs de croissance et la libération de cytokine12, aucune formation de tératomes quand ils sont transplantés dans des souris immunodéficientes en contraste avec HPSC2, et la tolérance immunologique parce qu'ils expriment HLA-G, qui diminue le risque de rejet après transplantation13.

Cependant, les rapports précédents ont supposé que l'amnion humain est une membrane homogène, sans considérer qu'il peut être anatomiquement et physiologiquement divisé en trois régions : placentaire (l'amnion qui couvre le basalis de cidua),ombilical (la partie qui enveloppe le cordon ombilical), et réfléchi (le reste de la membrane non attachée au placenta)14. Il a été démontré que les régions placentales et réfléchies de l'amnion présentent des différences dans la morphologie, l'activité mitochondriale, la détection des espèces réactives d'oxygène15, l'expression miRNA16, et l'activation des voies de signalisation17. Ces résultats suggèrent que l'amnion humain est intégré par une population hétérogène avec des fonctionnalités différentes qui devraient être considérées pour d'autres études menées dans des modèles in situ ou in vitro. Alors que d'autres laboratoires ont conçu des protocoles pour l'isolement de HAEC de toute la membrane, notre laboratoire a établi un protocole pour isoler, culturer et caractériser les cellules de différentes régions anatomiques.

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Protocol

Ce protocole a été approuvé par le comité d'éthique de l'Instituto Nacional de Perinatologa à Mexico (numéro d'enregistrement 212250-21041). Toutes les procédures effectuées dans le cours de ces études étaient conformes aux normes éthiques de l'Instituto Nacional de Perinatologa, de la Déclaration d'Helsinki et des lignes directrices énoncées dans la Norme officielle mexicaine du ministère de la Santé.

1. Préparation

  1. Préparer une solution de 1x PBS avec EDTA. Pour ce faire, ajouter 500 oL de 0,5 M de stock EDTA dans 500 ml de 1x PBS pour une concentration finale de 0,5 mM EDTA.
  2. Préparer le milieu de culture pour HAEC. Prendre 450 ml de glucose-DMEM élevé, le compléter avec 5 ml de pyruvate de sodium (100 mM), 50 ml de sérum bovin fœtal inactif qualifié pour les cellules souches, 5 mL d'acides aminés non essentiels (100x), 5 mL d'antibiotique-antimycotique (100x), 5 mL de L-glutamine (200 mM), et 500 l de mercaptoéthanol (1 000x).
  3. Stériliser les conteneurs pour le transport et le traitement du tissu: un récipient en acier inoxydable avec un couvercle pour transporter l'ensemble du placenta de la salle d'opération au laboratoire, un plateau (20 cm x 30 cm x 8 cm) pour laver et enlever le sang de l'ensemble du placenta avant la dissection de la membrane amniotique, et une planche à découper en plastique pour séparer la membrane amniotique dans les trois régions.
  4. Stériliser les instruments chirurgicaux (scalpels, ciseaux, forceps et pinces), les béchers de 500 ml, les gazes de coton et la solution saline.

2. Obtenir le tissu placentaire

REMARQUE : Les membranes amniotiques ont été obtenues des femmes à la gestation à terme (37-40 semaines), sous l'indication de l'accouchement césarienne, sans aucune évidence du travail actif, et aucune caractéristique microbiologique de l'infection. Les procédures complètes d'isolement et de culture ont été effectuées au sein d'un cabinet de biosécurité dans des conditions stériles.

  1. Dans la salle d'opération, serrer le cordon ombilical pour empêcher le flux sanguin vers le reste du tissu. Recueillir le placenta entier avec le cordon ombilical serré dans le récipient stérile.
  2. Ajouter 500 ml de solution saline au récipient pour hydrater le placenta.
  3. Fermer le contenant et transporter le tissu au laboratoire à température ambiante.
  4. Placez le récipient avec le placenta à l'intérieur de l'armoire de biosécurité.
    REMARQUE : Dans le cas où la dissection n'est pas effectuée dans les 15 minutes suivant la collecte du placenta, entreposez le contenant avec le placenta sur la glace jusqu'au traitement. Évitez plus de 1 h de temps écoulé entre l'obtention du placenta et le début de la dissection.

3. Séparation mécanique par région de la membrane amniotique

REMARQUE : La procédure doit être effectuée dans un cabinet de biosécurité dans des conditions stériles et à température ambiante.

  1. Retirer le placenta entier du récipient et le placer sur le plateau avec le cordon ombilical orienté vers le haut.
  2. À l'aide d'une gaze de coton stérile, nettoyer les caillots sanguins de la surface du chorion-amnion qui recouvre le placenta.
  3. Identifier les trois régions de la membrane : l'amnion ombilical enveloppant le cordon ombilical, l'amnion placentaire recouvrant la décidua basalis, et la région réfléchie, qui est le reste de l'amnion qui n'est pas attaché au placenta (Figure 1).
  4. Disséquer la région de l'amnion ombilical (figure 2A).
    1. À l'aide de forceps disséquants, maintenez la partie de la membrane amnion qui recouvre la jonction du placenta et du cordon ombilical.
    2. À l'effile, disséquer la région qui entoure le cordon tout en s'étirant pour le séparer du chorion.
    3. Déposer le tissu séparé dans un bécher étiqueté avec 100 ml de solution saline.
  5. Disséquer la région de l'amnion placentaire (figure 2B).
    1. À l'effigie de coton stérile, retirer les caillots sanguins de la surface du chorion-amnion qui recouvre le placenta.
    2. Maintenez la membrane sur la bordure entre le placenta et la région réfléchie avec des forceps disséquants.
    3. Couper le long de la circonférence du placenta avec le scalpel.
    4. Séparer l'amnion placentaire du chorion, en prenant soin de ne pas couper les navires du placenta.
    5. Placer le tissu séparé dans un autre bécher étiqueté avec 300 ml de solution saline.
  6. Séparer le reste de la membrane amniotique qui n'est pas attaché au placenta (c.-à-d. la partie réfléchie) du chorion (figure 2C).
    1. Recueillir la région réfléchie dans un autre bécher étiqueté avec 300 ml de solution saline.
      REMARQUE : Ajoutez la solution saline continuellement pendant la dissection pour empêcher le tissu de sécher.

4. Laver les membranes

REMARQUE : La procédure doit être effectuée dans un cabinet de biosécurité dans des conditions stériles à température ambiante.

  1. Jeter la solution saline de chaque région membranaire séparément.
  2. Ajouter 100 ml de solution saline fraîche à la région ombilicale.
  3. Ajouter 300 ml de solution saline fraîche aux régions placentaires et réfléchies respectivement.
  4. Remuer les membranes à l'aide de la disséquer les forceps pour enlever les résidus sanguins.
  5. Jetez la solution saline.
  6. Répétez les lavages et l'agitation au moins 3x jusqu'à ce que les membranes soient translucides.
  7. Placez et étendez les membranes sur la planche pour nettoyer à l'œil stérile les caillots de sang qui n'ont pas été enlevés avec les lavages.
    REMARQUE : Il est très important d'enlever autant d'érythrocytes que possible, car leur présence affecte la fonction de trypsine et la viabilité des cultures cellulaires suivantes.

5. Digestion enzymatique des membranes de différentes régions

REMARQUE : La procédure doit être effectuée dans un cabinet de biosécurité dans des conditions stériles.

  1. Couper les régions réfléchies et placentales en deux ou trois fragments.
  2. Ne coupez pas la région ombilicale.
  3. Placer les fragments de chaque région dans des tubes de centrifugeuse. Ajouter 20 mL de trypsine/EDTA de 0,5 % aux régions réfléchies et placentales et 5 ml de 0,5 % de trypsine/EDTA à la région ombilicale, respectivement.
    REMARQUE : Il est important de couper les régions réfléchies et placentales en petits morceaux parce qu'elles doivent être complètement immergées dans la solution de trypsine.
  4. Agiter légèrement les tubes de centrifugeuse pendant 30 s. Jeter la trypsine.
  5. Ajoutez 30 mL de nouvelle trypsine/EDTA de 0,5 % aux régions réfléchies et placentales et 15 ml de nouvelle trypsine/EDTA de 0,5 % à la région ombilicale, respectivement.
  6. Placer les tubes dans un rotateur à l'intérieur de l'incubateur.
  7. Incuber à la rotation (20 tr/min) pendant 40 min à 37 oC.
    REMARQUE : Si un rotateur de tube n'est pas disponible, secouez les tubes manuellement toutes les 10 minutes.
  8. Transférer les solutions trypsine/cellule de chaque région dans de nouveaux tubes de centrifugeuse.
  9. Ajouter 2 fois le volume de la maréchette haeC préréchauffé à 37 oC par tube pour inactiver l'enzyme.
  10. Conserver la première digestion sur la glace.
  11. Répétez les étapes 5.6-5.8 pour une deuxième période de digestion.
  12. Pour chaque région, tenir une extrémité de la partie amnion à l'aide de forceps disséquants, et avec une autre paire presser le long du tissu pour enlever les rangées de cellules épithéliales qui n'ont pas complètement décoller au cours des périodes d'incubation précédentes.
  13. Recueillir la deuxième digestion dans un autre ensemble de tubes centrifugeurs et inactiver avec 2x le volume de médias HAEC.
  14. Jeter les membranes digérées dans un récipient de biorisque.

6. Isolement de l'ACI

REMARQUE : La procédure doit être effectuée dans un cabinet de biosécurité dans des conditions stériles.

  1. Centrifugetous les tubes à 200 x g pendant 10 min à 4 oC.
  2. Jeter le supernatant et ajouter 10 ml de support HAEC préchauffé (à 37 oC) par tube et pipet doucement pour désagréger chaque granule.
  3. Combiner les suspensions cellulaires des deux digestions dans un tube individuel pour chaque région membranaire.
  4. Filtrer les suspensions cellulaires à l'aide de passoires cellulaires de 100 m pour enlever les débris de matrice extracellulaire et obtenir des cellules uniques.
  5. Préparer trois aliquots avec 90 oL de bleu trypan dans un tube de microcentrifuge.
  6. Ajouter 10 L de chaque suspension cellulaire par région membranaire dans les tubes de microcentrifuge et mélanger.
  7. Comptez les cellules avec un hémocytomètre sous un microscope de champ léger.

7. Culture de HAEC

  1. Ensemencer le HAEC des trois régions séparément à une densité de 3 à 104 cellules/cm2 avec des supports HAEC préchauffés, complétés par 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique humain (EGF).
    1. Ensemencez les cellules dans des plaques de 100 mm pour les maintenir in vitro ou dans 24 plaques de puits pour l'analyse immunochimique.
  2. Incuber les plats à 37 oC dans des conditions normoxiques (5 % de CO2) dans un incubateur humidifié.
  3. Ajouter eGF tous les jours et changer le médium tous les trois jours.
    REMARQUE : Les cellules deviendront confluentes après 4 à 6 jours.
  4. Utilisez les cellules pour l'immunohistochimie conventionnelle, l'analyse du tri cellulaire, la cryoconservation, l'extraction de l'ARN et des protéines, ou pour poursuivre le passage.

8. Passage de HAEC

  1. Retirez le support HAEC et lavez 2x avec la solution PBS/EDTA 0.01M.
  2. Incuber avec une solution PBS/EDTA 0,01M pendant 15 min à 37 oC.
  3. Retirez le PBS/EDTA et ajoutez 1,5 ml de trypsine/EDTA de 0,5 %.
  4. Incuber de 5 à 8 min à 37 oC.
  5. Inactiver l'enzyme avec deux volumes de médias HAEC.
  6. Recueillir la solution mixte et la centrifugeuse pendant 5 min à 200 x g.
  7. Comptez les cellules et continuez avec les passages suivants ou utilisez les cellules pour une analyse plus approfondie.

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Representative Results

HAEC ont été isolés de chacune des trois régions anatomiques de la membrane amniotique et individuellement cultivés in vitro. Après 48 h de culture, les cellules avec un phénotype épithélial ont adhéré à la surface de la plaque, bien que le milieu ait également contenu des débris de cellules et des cellules flottantes, qui ont été enlevés une fois que le milieu a été changé (figure 3).

Pendant le traitement de la culture primaire (passage zéro, P0), certaines complications pourraient survenir qui peuvent interférer avec l'analyse expérimentale des données (figure 4A): il est conseillé de jeter les cultures et de traiter une autre membrane lors de l'identification de la présence de bactéries dues à la contamination des réactifs ou pendant le processus d'isolement (figure 4A); érythrocytes excessifs en raison d'un lavage insuffisant des membranes (figure 4B); insuffisance ou pas d'adhérence des cellules aux plaques (figure 4C); ou cellules avec la morphologie de fibroblaste (figure 4D), suggérant que les cellules mésenchymales amniotiques humaines (HAMC) aient été isolées au lieu de HAEC.

La morphologie de l'ACI dépend de l'origine de ces cellules : les cellules de la zone réfléchie ont une morphologie cuboïde et se développent dans une monocouche pavée, contrairement aux cellules des régions placentaires et ombilicales, qui sont plus plates et squamous (figure 5). Ces données confirment que la couche épithéliale de l'amnion n'est pas uniforme dans toute la membrane. Pendant les passages, la taille des cellules de toutes les régions augmente, mais elles maintiennent leur nature épithéliale et n'acquièrent pas une morphologie de fibroblaste. En effet, l'immunofluorescence contre l'E-cadherin a montré que les cultures primaires (P0) et les sous-cultures (P1-P2) maintenaient leur phénotype épithélial (figure 6), suggérant qu'il n'y ait aucune contamination d'un autre type de cellule, telle que les cellules stromales mésenchymales, ou la transition épithéliale-mesenchymal. En outre, ces cellules ne montrent aucune preuve de mort cellulaire selon l'analyse TUNEL (figure supplémentaire 1) mais sont positives pour le marqueur de prolifération KI-67 ( Figure6), bien que nos résultats précédents n'ont trouvé aucune différence significative pour ce marqueur entre chaque passage5.

Le nombre de cellules obtenues varie selon la région : 61,6 x 106 et 71,8 x 106 cellules des régions réfléchies et placentaires, respectivement, et moins de 1 x 106 par échantillon de la région ombilicale (tableau 1). Il a été rapporté avec ce protocole que la région placentaire et ombilicale sont très semblables dans leurs profils d'expression, par opposition aux régions réfléchies et placentaires, particulièrement dans les gènes qui participent à l'interaction de récepteur d'ECM, à l'adhérence focale, et à la voie de signalisation de PI3K-Akt par l'ARN-seq6. En accord, une étude précédente a rapporté l'expression différentielle de la kinase de protéine mitogen-activée et transformant des voies bêta de facteur de croissance, aussi bien que les cytokines proinflammatoires entre les deux régions17.

Bien que les preuves aient montré que les sous-populations de l'amnion diffèrent dans leur morphologie et leurs propriétés physiologiques, nous avons déjà démontré que l'expression et la présence du noyau des facteurs de pluripotence ne changent pas dans les régions placentaires et réfléchies6. Dans ce contexte, en plus du nombre relativement limité de cellules de la région ombilicale, les études ultérieures devraient se concentrer sur l'AOHC isolé du placenta l'amnion réfléchi indépendamment, compte tenu des implications physiologiques, parce que les différentes sous-populations ne réagiraient pas également à des événements spécifiques, tels que la grossesse prolongée ou des processus inflammatoires pendant le travail, bien qu'il n'y ait pas de cellules positives spécifiques aux principaux marqueurs de la pluripotence (Figure 7).

Figure 1
Figure 1 : Régions anatomiques de la membrane amniotique à terme. Membrane amniotique ombilicale (jaune), membrane amniotique placentaire (blanche) et membrane amniotique réfléchie (noir). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Dissection mécanique de la membrane amniotique. (A) Région ombilicale, (B) région placentaire, et (C) région réfléchie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Culture primaire représentative de l'AOHC dérivée de la membrane amniotique. Culture 48 h après isolement sans (A) et avec (B) un changement de médias. Barres d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Micrographies représentatives des résultats négatifs de la culture primaire de l'AOHC. (A) Excès d'érythrocytes. (B) Contamination bactérienne. (C) HAEC n'a pas adhéré après 48 h d'isolement. (D) Culture primaire composée de cellules avec la morphologie de fibroblaste. Barres d'échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Morphologie de l'AOHC de différentes régions anatomiques in vitro. Micrographies représentatives des régions de L'AOHC confluentàe à partir de régions réfléchies (panneau supérieur), placental (panneau moyen) et ombilicales (panneau inférieur) cultivées par P0-P2. Barres d'échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Expression de l'E-cadherin et du KI-67 dans HAEC. Images de microscopie épifluorescence représentatives de l'E-cadherin et du KI-67et de l'AIEA à partir d'amnion réfléchi (panneau gauche) et placentaire (panneau droit) cultivé s'est fait passer par P0-P2. Barres d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : HAEC de différentes régions anatomiques affiche un panneau de marqueur de pluripotence. Images de microscopie confocales représentatives de l'amnion double immunofluorescence pour NANOG avec TRA-1-60, OCT4 avec E-cadherin, et SOX2 avec SSEA-4 dans les régions réfléchies (panneau supérieur) et placental (panneau inférieur). Barres d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

MEMBRANE Reflète Placentaire Ombilical MEMBRANE COMPLÈTE
1 75 X 106 Annonces 130 X 106 Annonces 0,2 X 106 Annonces 205,2 X 106
2 38,5 X 106 Annonces 52 X 106 Annonces 0,53 X 106 Annonces 91,03 X 106
3 59 X 106 Annonces 53 X 106 Annonces 0,2 X 106 Annonces 112,2 X 106
4 42 X 106 Annonces 27 X 106 Annonces 0,36 X 106 69,36 X 106
5 44,8 X 106 22,3 X 106 Np 76,1 X 106
6 100 X 106 Annonces 140 X 106 Annonces 1 X 106 241 X 106 Annonces
7 72 X 106 Annonces 78 X 106 Annonces Np 150 X 106 Annonces
Moyenne 61,6 X 106 71,8 X 106 0,45 X 106 133,8 X 106

Tableau 1 : Nombre d'AOHC isolés par région à partir de membranes amniotiques. (NP et non traité).

Figure supplémentaire 1 : TUNEL coloration dans HAEC (passage 2) de la région réfléchie et dans les cellules témoins positives (cellules HL-60 traitées avec la camptothécine). Barres d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

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Discussion

Nous avons mis en œuvre un nouveau protocole pour isoler HAEC des membranes à terme. Il diffère des rapports précédents en ce que chaque membrane a été divisée en ses trois régions anatomiques avant l'isolement pour analyser des cellules de chacun.

Une des étapes les plus critiques dans le protocole est le lavage de la membrane pour enlever tous les caillots sanguins, car ils peuvent interférer avec l'activité de la trypsine lors de la séparation des cellules épithéliales. Le défaut d'exécuter ceci correctement peut mener à obtenir une culture primaire avec les érythrocytes excessifs et peu de cellules épithéliales adhérentes. Si aucun attachement n'est observé dans les 24 à 48 premiers h après l'ensemencement des cellules, nous recommandons de jeter la culture. Un autre point critique est le temps d'incubation pour la digestion enzymatique. Si la période d'incubation est trop longue, la viabilité cellulaire peut diminuer et/ou les cultures cellulaires avec la morphologie mésenchymale au lieu de la morphologie épithéliale peuvent être obtenues (figure 4). En outre, si la digestion de membrane n'est pas faite avec l'agitation appropriée, la probabilité d'obtenir un faible nombre de cellules par membrane augmente.

Dans ce protocole, nous pouvons maintenir des populations de HAEC in vitro sans perdre leur phénotype épithélial, comme démontré par la présence du marqueur épithélial spécifique de cellules E-cadherin pour la plupart des cellules le long des passages (figure 6). Cependant, d'après notre expérience, le HAEC ne peut être élargi que pour trois passages (P1-P3). Le nombre limité de passages doit être pris en considération pour les expériences qui nécessitent de longues périodes de culture ou de passages multiples. En outre, il a été rapporté qu'après P3 les cellules commencent à changer leur morphologie et de réduire l'expression de l'E-cadherin, de sorte que la culture prolongée pourrait induire la transition épithéliale-mésenchymale (EMT)18. Récemment, il a été démontré que la progestérone empêche EMT dans les cellules épithéliales amniotiquesovine19,20, il serait donc intéressant d'analyser l'effet de différentes concentrations de progestérone dans le milieu de culture HAEC pour éviter le phénotype mésenchymal après le troisième passage.

Dans tous les rapports précédents où HAEC ont été isolés, l'amnion a été supposé être un tissu uniforme en dépit de l'hétérogénéité possible des populations épithéliales qui composent la membrane entière. En revanche, ce protocole divise la membrane en ses trois zones anatomiques pour isoler séparément et la culture HAEC compte tenu des rapports morphologiques et d'expression génique précédents qui suggèrent des différences fonctionnelles. Il est également inutile de purifier par le tri cellulaire pour n'obtenir que des populations épithéliales, comme en témoigne la détection du marqueur E-cadhérine pendant les passages jusqu'à la P2.

Il a été démontré que l'AOHC isolé de chacune des régions membranaires a une expression similaire de noyau de pluripotence, étant un réservoir latent de cellules avec la tige. Dans ce contexte, ces cellules peuvent être utilisées in vitro pour étudier les mécanismes moléculaires, tels que la localisation dynamique des facteurs de transcription liés à la pluripotence ou leur capacité à rester calmes malgré l'expression de gènes associés au cancer, quelle que soit leur région d'origine anatomique. Cependant, la recherche future doit tenir compte des différences moléculaires signalées (gènes d'expression globale, activité métabolique, voies de signalisation) entre chaque région, ce qui aurait des répercussions sur leur application en médecine régénérative. Nous avons précédemment rapporté une expression différente des gènes impliqués dans PI3K/AKT et les voies focales de signalisation d'adhérence entre les différentes régions amniotiques par RNA-seq6. PI3K/AKT régule l'auto-renouvellement et maintient la pluripotence dans HPSC, tandis que l'activation de l'adhérence focale kinase favorise leur différenciation21,22. Ainsi, nous proposons de caractériser le rôle des deux voies dans HAEC isolés de différentes régions anatomiques pendant les protocoles de différenciation de lignée-spécifique. En outre, plusieurs études démontrent les différences entre les deux régions en ce qui concerne les composants cellulaires, la fonction moléculaire et les processus biologiques. Par exemple, l'expression génique spécifique à la région et la distribution de protéines des aquaporines, qui sont impliquées dans le processus de transport de l'absorption intramembrane, ont été signalées23. Une autre étude a comparé le miRNome par microarrays, montrant l'expression région-spécifique de miR-145 et miR-143, ce dernier étant capable de réguler posttranscriptionally la synthase prostaglandin-endoperoxidase 2 dans des conditions spécifiques telles que le travail à la limite16. En outre, la région placentaire présente une respiration mitochondriale plus élevée, mais une détection plus faible des espèces d'oxygène réactive par rapport aux tissus réfléchis15. Disséquer l'amnion dans les régions réfléchies et placentales est encouragé à isoler HAEC et analyser leurs propriétés particulières séparément, telles que la libération de facteurs de croissance et de cytokines, leur faible immunogénicité, la production de matrice extracellulaire, l'effet de leur milieu conditionné en coculture avec d'autres types de cellules, et de nouvelles fonctions telles que leur capacité à maintenir les lignes HPSC comme couche d'alimentation24.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nos recherches ont été soutenues par des subventions de l'Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 et 21081) et du CONACYT (A1-S-8450 et 252756). Nous remercions Jessica Gonzalez Norris et Lidia Yuriria Paredes Vivas pour le soutien technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture reagents
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific/Gibco 21985023 55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific/Gibco 12430054 Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA Thermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G 0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified Thermo Fisher Scientific/Gibco 10439024
Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher Scientific/Gibco 11140050 100X
Paraformaldehyde any brand
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%) any brand
Sodium Pyruvate Thermo Fisher Scientific/Gibco 11360070 100 mM
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific/Gibco 25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352360
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator MaCSmix
Antibodies and Kits Antibody ID
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 RRID:AB_3975
Anti-KI67 Santa Cruz 23900 RRID:AB_627859)
Anti-NANOG Peprotech 500-P236 RRID:AB_1268274
Anti-OCT4 Abcam ab19857 RRID:AB_44517
Anti-SOX2 Millipore AB5603 RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4 Cell Signaling 4755 RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60 Cell Signaling 4746 RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit Abcam 66110

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References

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