In vitro-kultur af Epiteliale celler fra forskellige anatomiske områder af den humane amniotiske membran

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol beskriver isolationen af epiteliale celler fra forskellige anatomiske områder af den menneskelige amniotiske membran til at bestemme deres heterogenitet og funktionelle egenskaber for mulige anvendelse i kliniske og fysiopatologiske modeller.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Avila-González, D., García-López, G., Díaz-Martínez, N. E., Flores-Herrera, H., Molina-Hernández, A., Portillo, W., Díaz, N. F. In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane. J. Vis. Exp. (153), e60551, doi:10.3791/60551 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Flere protokoller er blevet rapporteret i litteraturen for isolation og kultur af humane amniotiske epiteliale celler (HAEC). Men, disse antager, at Foster epitelet er et homogent lag. Den menneskelige amnion kan opdeles i tre anatomiske regioner: reflekteret, placenta og navle. Hver region har forskellige fysiologiske roller, såsom i patologiske tilstande. Her beskriver vi en protokol til dissekere humant amnion væv i tre sektioner og vedligeholde det in vitro. I kulturen viste celler afledt af den reflekterede amnion en cuboidal morfologi, mens celler fra både placenta og navle lige regioner var skællede. Ikke desto mindre, alle de opnåede celler har en epitelial fænotype, demonstreret ved immunodetektion af E-cadherin. Da placenta og reflekterede regioner in situ adskiller sig fra hinanden i celle komponenter og molekylære funktioner, kan det derfor være nødvendigt for in vitro-undersøgelser at tage hensyn til disse forskelle, fordi de kan have fysiologiske konsekvenser for brugen af HAEC i biomedicinsk forskning og den lovende anvendelse af disse celler i regenerativ medicin.

Introduction

Humane amniotiske epitelceller (haec) har oprindelse i de tidlige stadier af fosterudviklingen, på omkring otte dage efter befrugtning. De opstår fra en population af plade epiteliale celler i epiblast, der stammer fra det inderste lag af den amniotiske membran1. Således betragtes HAEC som rester af pluripotente celler fra epiblast, der har potentialet til at differentiere sig til de tre kimlag i embryonet2. I de sidste ti år har forskellige forskergrupper udviklet metoder til at isolere disse celler fra Foster membranen ved drænings perioden for at karakterisere deres formodede pluripotrelaterede egenskaber i en kulturmodel in vitro3,4.

Det er derfor blevet konstateret, at HAEC har egenskaber, der er karakteristiske for humane pluripotente stamceller (HPSC), såsom overfladeantigener SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; kernen i pluripotens transkriptionsfaktorer OCT4, SOX2 og NANOG; og spredning markør KI67, tyder på, at de er selvfornyende5,6,7. Desuden er disse celler blevet udfordret ved hjælp af differentierings protokoller for at opnå celler positive for Lineage-specifikke markører for de tre kimlag (ectoderm, mesoderm, og endoderm)4,5,8, samt i dyremodeller af sygdomme hos mennesker. Endelig haec Express E-cadherin, som viser, at de bevarer en epitelial natur meget gerne hpsc5,9.

Ud over deres embryonale oprindelse har haec andre iboende egenskaber, der gør dem velegnede til forskellige kliniske anvendelser, såsom udskillelsen af antiinflammatoriske og antibakterielle molekyler10,11, vækstfaktorer og cytokinfrigivelse12, ingen dannelse af Teratomer, når de transplanteres til immunodedygtige mus i modsætning til hpsc2, og immunologisk tolerance, fordi de udtrykker HLA-G, hvilket nedsætter risikoen for afvisning efter transplantation13.

Tidligere rapporter har imidlertid antaget, at den humane amnion er en homogen membran, uden at overveje, at det kan være anatomisk og fysiologisk opdelt i tre regioner: placenta (den amnion, der dækker lærk basalis), navlestrengen (den del, der indhyller navlestrengen), og reflekteres (resten af membranen ikke er fastgjort til placenta)14. Det har vist sig, at de placentale og reflekterede områder af amnion viser forskelle i morfologi, mitokondriel aktivitet, påvisning af reaktive ilt arter15, Mirna udtryk16, og aktivering af signalering veje17. Disse resultater tyder på, at den menneskelige amnion er integreret af en heterogen population med forskellig funktionalitet, der bør overvejes for yderligere undersøgelser udført i enten in situ-eller in vitro-modeller. Mens andre laboratorier har designet protokoller til isolering af HAEC fra hele membranen, vores laboratorium har etableret en protokol til at isolere, kultur, og karakterisere celler fra forskellige anatomiske regioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol blev godkendt af det etiske udvalg i Instituto Nacional de Perinatología i Mexico City (registreringsnummer 212250-21041). Alle procedurer i disse undersøgelser var i overensstemmelse med de etiske standarder for Instituto Nacional de Perinatología, Helsingfors-erklæringen, og de retningslinjer, der er fastsat i Sundhedsministeriet officielle mexicanske standard.

1. forberedelse

  1. Forbered en opløsning af 1x PBS med EDTA. For at gøre dette, tilsættes 500 μL 0,5 M EDTA bestand i 500 mL 1x PBS for en endelig koncentration af 0,5 mM EDTA.
  2. Forbered kulturmediet for HAEC. Tag 450 mL høj glukose-DMEM, det suppleres med 5 mL natriumpyruvat (100 mM), 50 mL varme inaktiv føtal kvægserum, der er kvalificeret til stamceller, 5 mL ikke-essentielle aminosyrer (100x), 5 ml antibiotika-antimykotisk (100x), 5 mL L-glutamin (200 mM) og 500 μL mercaptoethanol (1.000 x).
  3. Steriliser beholderne til transport og forarbejdning af vævet: en rustfri stålbeholder med låg til transport af hele placenta fra Operations teatret til laboratoriet, en bakke (20 cm x 30 cm x 8 cm) til at vaske og fjerne blod fra hele placenta før dissektion af Foster membranen, og en plastik skærebræt til at adskille den foster hinde i de tre regioner.
  4. Steriliser de kirurgiske instrumenter (Scalpels, saks, pincet, og klemmer), 500 mL bægre, bomuld gauzes, og saltopløsning.

2. opnåelse af placenta væv

Bemærk: de Foster membraner blev opnået fra kvinder ved fuldtids dræelse (37 − 40 uger), under indikation af kejsersnit levering, uden nogen tegn på aktiv arbejdskraft, og ingen mikrobiologiske egenskaber af infektion. De komplette Isolations-og kultur procedurer blev udført i et biosikkerhedskabinet under sterile forhold.

  1. I operationsstuen klemmer du navlestrengen for at forhindre blodtilførslen til resten af vævet. Saml hele placenta med navlestrengen fastspændt i den sterile beholder.
  2. Tilsæt 500 mL saltopløsning til beholderen for at Hydrere placenta.
  3. Luk beholderen og transportere vævet til laboratoriet ved stuetemperatur.
  4. Sæt beholderen med placenta inde i biosikkerheds kabinettet.
    Bemærk: Hvis dissektion ikke udføres inden for 15 minutter efter opsamling af placenta, opbevares beholderen med placenta på is indtil forarbejdningen. Undgå mere end 1 time af forløbet tid mellem opnåelse af placenta og starten af dissektion.

3. mekanisk adskillelse pr. region af den amniotiske membran

Bemærk: proceduren skal udføres i et biosikkerhedskabinet under sterile forhold og ved stuetemperatur.

  1. Fjern hele placenta fra beholderen og Placer den på bakken med navlestrengen opad.
  2. Ved hjælp af en steril bomuldsgaze, rense blodpropper fra overfladen af chorion-amnion, der dækker placenta.
  3. Identificer de tre regioner i membranen: navlestrengen omslutter navlestrengen, placenta amnion, der dækker lærk basalis, og den reflekterede region, som er resten af amnion, der ikke er fastgjort til placenta (figur 1).
  4. Dissekere den navle amnion region (figur 2a).
    1. Ved hjælp af dissekting pincet, holde den del af amnion membran, der dækker krydset af placenta og navlestrengen.
    2. Med en skalpel, dissekere den region, der omgiver ledningen, mens strækker sig til at adskille det fra chorion.
    3. Indgiv det separerede væv i et mærket bægerglas med 100 mL saltvandsopløsning.
  5. Dissekere placenta amnion-regionen (figur 2b).
    1. Med en steril bomuldsgaze, Fjern blodpropper fra overfladen af chorion-amnion, der dækker placenta.
    2. Hold membranen på grænsen mellem placenta og den reflekterede region med dissekting pincet.
    3. Skær langs placenta omkredsen med skalpel.
    4. Adskil placenta amnion fra chorion, og pas på ikke at skære nogen fartøjer fra moderkagen.
    5. Det separerede væv anbringes i et andet mærket bægerglas med 300 mL saltvandsopløsning.
  6. Adskil resten af den foster membran, der ikke er fastgjort til placenta (dvs. den reflekterede del) fra chorion (figur 2c).
    1. Det reflekterede område opsamles i et andet mærket bægerglas med 300 mL saltvandsopløsning.
      Bemærk: Tilsæt saltvandsopløsning kontinuerligt under dissektion for at forhindre, at vævet tørrer ud.

4. vask af membraner

Bemærk: proceduren skal udføres i et biosikkerhedskabinet under sterile forhold ved stuetemperatur.

  1. Kassér saltopløsningen for hver membran region separat.
  2. Tilsæt 100 mL frisk saltvandsopløsning til navle området.
  3. Tilsæt 300 mL frisk saltvandsopløsning til henholdsvis placenta og reflekterede regioner.
  4. Omrør membranerne ved hjælp af dissekting pincet for at fjerne blod rester.
  5. Kassér saltopløsningen.
  6. Gentag vask og agitation mindst 3x, indtil membranerne er gennemsigtige.
  7. Placer og Udvid membranerne på tavlen for at rengøre med steril gaze de blodpropper, der ikke blev fjernet med vaske.
    Bemærk: det er meget vigtigt at fjerne så mange erythrocytter som muligt, da deres tilstedeværelse påvirker trypsin funktion og levedygtigheden af efterfølgende cellekulturer.

5. enzymatisk fordøjelse af membraner fra forskellige regioner

Bemærk: proceduren skal udføres i et biosikkerhedskabinet under sterile forhold.

  1. Skær de reflekterede og placentale regioner i to eller tre fragmenter.
  2. Du må ikke skære i navle området.
  3. Anbring fragmenter af hver region i centrifugeglas. 20 mL 0,5% trypsin/EDTA tilsættes til de reflekterede og placentale områder og 5 mL 0,5% trypsin/EDTA til henholdsvis navle området.
    Bemærk: det er vigtigt at skære de reflekterede og placentale regioner i mindre stykker, fordi de skal være helt nedsænket i trypsin-opløsningen.
  4. Ryst centrifuge rørene let i 30 s. kassér trypsin.
  5. 30 mL ny 0,5% trypsin/EDTA tilsættes til de reflekterede og placentale områder og 15 mL af den nye 0,5% trypsin/EDTA til den navle formede region.
  6. Placer rørene i en rotator inde i inkubator.
  7. Inkuber med rotation (20 rpm) i 40 min ved 37 °C.
    Bemærk: Hvis en rørrotator ikke er tilgængelig, rystes rørene let manuelt hver 10 min.
  8. Du overfører trypsin-/celleopløsninger fra hver region til nye centrifugeglas.
  9. Tilsæt 2x mængden af haec Media forvarmede ved 37 °c pr. tube for at inaktivere enzymet.
  10. Opbevar den første fordøjelse på is.
  11. Gentag trin 5.6 − 5,8 for en anden fordøjelsesperiode.
  12. For hver region skal du holde den ene ende af amnion-delen ved hjælp af dissekere-pincet, og med et andet par klemme langs vævet for at fjerne rækker af epiteliale celler, der ikke helt skrælle under tidligere inkubations perioder.
  13. Saml den anden fordøjelse i et andet sæt centrifugeglas og inaktivér med 2x mængden af HAEC-medier.
  14. Smid de Ford øjede membraner i en beholder til biologisk fare.

6. isolering af HAEC

Bemærk: proceduren skal udføres i et biosikkerhedskabinet under sterile forhold.

  1. Alle rør centrifugeres ved 200 x g i 10 minutter ved 4 °c.
  2. Supernatanten kasseres og tilsættes 10 ml forvarmede haec-medie (til 37 °c) pr. rør og pipet forsigtigt for at samle hver pellet.
  3. Kombiner de cellulære suspensioner af de to digestions i et enkelt rør for hver membran region.
  4. Filtrer de cellulære suspensioner ved hjælp af 100 μm celle-strainere for at fjerne det ekstracellulære matrix affald og opnå enkeltceller.
  5. Forbered tre aliquoter med 90 μL trypan og et blå i et mikrocentrifuge glas.
  6. Tilsæt 10 μL af hver cellesuspension pr. membran region til mikrocentrifuge rørene og bland.
  7. Tæl cellerne med et hemocytometer under et lys felt mikroskop.

7. HAEC-kulturen

  1. Haec-frøene fra de tre regioner hver for sig med en densitet på 3 × 104 celler/cm2 med forvarmede haec-medier suppleret med 10 ng/ml Human epidermal vækstfaktor (EGF).
    1. Frø cellerne i 100 mm plader for at vedligeholde dem in vitro eller i 24 brønd plader til immun kemisk analyse.
  2. Der inkubates ved 37 °C under normoxiske forhold (5% CO2) i en befuret inkubator.
  3. Tilføj EGF dagligt og Skift mellem mediet hver tredje dag.
    Bemærk: cellerne bliver flydende efter 4 − 6 dage.
  4. Brug cellerne til konventionel immun histokemi, celle sorterings analyse, Kryopreservation, RNA og protein udvinding, eller til at fortsætte passagen.

8. passage af HAEC

  1. Fjern HAEC mediet og vask 2x med PBS/EDTA 0,01 M opløsning.
  2. Der inkubates med en PBS/EDTA 0,01 M opløsning i 15 min ved 37 °C.
  3. Fjern PBS/EDTA og tilsæt 1,5 mL 0,5% trypsin/EDTA.
  4. Inkuber i 5 − 8 minutter ved 37 °C.
  5. Inaktivér enzymet med to volumener af HAEC-medier.
  6. Saml den blandede opløsning og centrifugeres i 5 minutter ved 200 x g.
  7. Tæl cellerne og Fortsæt med følgende passager eller brug cellerne til yderligere analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HAEC blev isoleret fra hver af de tre anatomiske regioner i den amniotiske membran og individuelt dyrkede in vitro. Efter 48 h af kultur, celler med en epitelial fænotype klæbet til overfladen af pladen, selv om medierne også indeholdt celleaffald og flydende celler, som blev fjernet, når mediet blev ændret (figur 3).

Under behandlingen af primær kulturen (passage Zero, p0) kan der opstå komplikationer, som kan forstyrre den eksperimentelle dataanalyse (figur 4): det er tilrådeligt at kassere kulturerne og bearbejde en anden membran ved at identificere tilstedeværelsen af bakterier på grund af kontaminering af reagenserne eller under isolations processen (figur 4a); overdreven erythrocytter på grund af utilstrækkelig vask af membraner (figur 4b); mangelfuld eller ingen vedhæftning af cellerne til pladerne (figur 4c) eller celler med fibroblast morfologi (figur 4d), hvilket tyder på, at humane amniotiske mesenchymale celler (hamc) blev isoleret i stedet for haec.

HAEC morfologi afhænger af oprindelsen af disse celler: celler fra den reflekterede zone har en cuboidal morfologi og vokse i en brostensbelagt monolayer, i modsætning til celler fra placenta og navlestrengs regioner, som er fladere og planocøs (figur 5). Disse data støtte, at epitelial lag fra amnion er ikke ensartet i hele membranen. Under passagerne stiger størrelsen af cellerne fra alle regioner, men de bevarer deres epiteliale natur og erhverver ikke en fibroblast morfologi. Immunofluorescens mod E-cadherin viste, at de primære kulturer (p0) og subkulturer (P1-P2) opretholdt deres epiteliale fænotype (figur 6), hvilket tyder på, at der ikke er nogen kontaminering af en anden celletype, såsom mesenchymal stromale celler eller epitelial-mesenchymal over Desuden viser disse celler ingen tegn på celledød i henhold til TUNEL-analysen (supplerende figur 1), men er positiv for KI-67-sprednings markøren (figur 6), selv om vores tidligere resultater ikke fandt nogen signifikant forskel for denne markør mellem hver passage5.

Antallet af opnåede celler varierer afhængigt af regionen: 61,6 x 106 og 71,8 x 106 celler fra henholdsvis de reflekterede og placentale regioner og mindre end 1 x 106 pr. prøve fra navle området (tabel 1). Det er blevet rapporteret med denne protokol, at placenta og navle region er meget ens i deres udtryks profiler, i modsætning til de reflekterede og placenta regioner, især i gener, der deltager i ECM receptor interaktion, fokal vedhæftning, og PI3K-akt signalering vej gennem RNA-SEQ6. I enighed, en tidligere undersøgelse rapporterede differentialekspression af mitogen-aktiveret protein kinase og omdanne vækstfaktor beta veje, samt proinflammatoriske cytokiner mellem begge regioner17.

Selv om beviserne viste, at subpopulationer fra amnion afviger i deres morfologi og fysiologiske egenskaber, vi tidligere påvist, at udtrykket og tilstedeværelsen af kernen af pluripotens faktorer ikke ændrer sig i HAEC afledt af placenta og reflekterede regioner6. I denne sammenhæng, ud over det relativt begrænsede antal celler fra navle området, efterfølgende undersøgelser bør fokusere på isolerede HAEC fra placenta og reflekteres uafhængigt, i betragtning af de fysiologiske konsekvenser, fordi de forskellige delpopulationer ikke ville reagere ligeligt på specifikke begivenheder, såsom forlænget graviditet eller inflammatoriske processer under fødslen, selv om der ikke er nogen specifikke positive celler til de vigtigste pluripotens markører (figur 7).

Figure 1
Figur 1: anatomiske regioner fra amniotisk membran på sigt. Umbilical amniotisk membran (gul), placenta amniotisk membran (hvid), og reflekteret amniotisk membran (sort). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: mekanisk dissektion af Foster membranen. (A) navlestrengs region,B) placenta region ogC) reflekteret region. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: HAEC-repræsentativ primær kultur afledt af den foster membran. Kultur 48 h efter isolation uden (A) og med (B) en ændring af medierne. Skala stænger = 50 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: repræsentative mikrografer over negative resultater af den primære kultur i HAEC. (A) overskud af erythrocytter. B) bakteriel kontaminering. C) haec ikke overholdt efter 48 h isoleret. D) primær kultur bestående af celler med fibroblast morfologi. Skala stænger = 200 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: morfologi af HAEC fra forskellige anatomiske regioner in vitro. Repræsentative mikrografer af flydende haec fra reflekteret (øvre panel), placenta (midterste panel) og navle formede (nedre panel) regioner, som dyrkes dog p0 − P2. Skala stænger 200 = μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: udtryk for E-cadherin og ki-67 i HAEC. Repræsentative epifluorescens-mikroskopi billeder af E-cadherin+ og ki-67+ haec fra reflekteret (venstre panel) og placenta (højre panel) amnion dyrket gennem p0 − P2. Skala stænger = 100 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: HAEC fra forskellige anatomiske områder viser et pluripotens markør panel. Repræsentative konfokale mikroskopi billeder af dobbelt immunofluorescens amnion for NANOG med TRA-1-60, OCT4 med E-cadherin, og SOX2 med SSEA-4 i HAEC (P1) fra reflekteret (øvre panel) og placenta (nedre panel) regioner. Skala stænger = 100 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

# MEMBRAN Afspejlet PLACENTA Umbilical KOMPLET MEMBRAN
1 75 X 106 130 X 106 0,2 X 106 205,2 X 106
2 38,5 X 106 52 X 106 0,53 X 106 91,03 X 106
3 59 X 106 53 X 106 0,2 X 106 112,2 X 106
4 42 X 106 27 X 106 0,36 X 106 69,36 X 106
5 44,8 X 106 22,3 X 106 Np 76,1 X 106
6 100 X 106 140 X 106 1 X 106 241 X 106
7 72 X 106 78 X 106 Np 150 X 106
Gennemsnitlige 61,6 X 106 71,8 X 106 0,45 X 106 133,8 X 106

Tabel 1: antal HAEC isoleret pr. region fra amniotiske membraner. (NP = ikke behandlet).

Supplerende figur 1: TUNEL-farvning i HAEC (passage 2) fra reflekteret region og i positive kontrol celler (HL-60-celler behandlet med camptothecin). Skala stænger = 50 μm. Klik her for at downloade dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har implementeret en ny protokol for at isolere HAEC fra term membraner. Det adskiller sig fra tidligere rapporter i, at hver membran var opdelt i sine tre anatomiske regioner forud for isolation til at analysere celler fra hver enkelt.

En af de mest kritiske trin i protokollen er vask af membranen til at fjerne alle blodpropper, fordi de kan forstyrre aktiviteten af trypsin, når adskille epiteliale celler. Undladelse af at udføre dette trin ordentligt kan føre til opnåelse af en primær kultur med overdreven erythrocytter og få vedlige epiteliale celler. Hvis der ikke observeres en vedhæftet fil i de første 24 − 48 timer efter såning af cellerne, anbefaler vi at kassere kulturen. Et andet kritisk punkt er inkubationstiden for enzymatisk fordøjelse. Hvis Inkubationstiden er for lang, kan cellens levedygtighed mindskes, og/eller cellekulturer med mesenchymal i stedet for epitelial morfologi kan opnås (figur 4). Også, hvis membran fordøjelsen ikke er gjort med den rette agitation, sandsynligheden for at opnå et lavt antal celler per membran stiger.

I denne protokol, vi kan opretholde populationer af HAEC in vitro uden at miste deres epitelial fænotype, som påvist ved tilstedeværelsen af specifikke epiteliale cellemarkør E-cadherin for de fleste celler langs passagerne (figur 6). Men efter vores erfaring kan HAEC kun udvides til tre passager (P1 − P3). Det begrænsede antal passager bør tages i betragtning ved eksperimenter, der kræver lange perioder med kultur eller flere passager. Desuden er det blevet rapporteret, at efter P3 cellerne begynder at ændre deres morfologi og reducere ekspression af E-cadherin, så den langvarige kultur kunne inducere epitelial-mesenchymal overgang (EMT)18. For nylig blev det påvist, at progesteron forhindrer EMT i får amniotiske epiteliale celler19,20, så det ville være interessant at analysere virkningen af forskellige koncentrationer af progesteron i haec-kulturmediet for at undgå mesenchymal fænotype efter den tredje passage.

I alle tidligere rapporter, hvor HAEC blev isoleret, er amnion antaget at være et ensartet væv på trods af den mulige heterogenitet af epiteliale populationer, der omfatter hele membranen. I modsætning hertil opdeler denne protokol membranen i sine tre anatomiske områder for separat isolering og kultur HAEC i betragtning af de tidligere morfologiske og genekspression rapporter, der tyder på funktionelle forskelle. Det er også unødvendigt at rense gennem celle sortering for kun at opnå epiteliale populationer, som påvist ved påvisning af E-cadherin-mærket under passager indtil P2.

Det har vist sig, at isolerede HAEC fra hver af membran regionerne har et lignende udtryk for pluripotens kerne, idet de er et latent reservoir af celler med stemthed. I denne sammenhæng kan disse celler bruges in vitro til at studere molekylære mekanismer, såsom den dynamiske lokalisering af pluripotens-relaterede transkriptionsfaktorer eller deres evne til at forblive på trods af at udtrykke kræft-associerede gener, uanset deres anatomiske oprindelsesregion. Fremtidig forskning skal dog tage hensyn til de rapporterede molekylære forskelle (globale udtryks gener, metabolisk aktivitet, signalerings veje) mellem hver region, hvilket ville have konsekvenser for deres anvendelse i regenerativ medicin. Vi har tidligere rapporteret et andet udtryk for gener involveret i PI3K/AKT og fokale vedhæftnings veje mellem de forskellige amniotiske regioner ved RNA-SEQ6. PI3K/akt regulerer selvfornyelse og vedligeholder pluripotens i hpsc, mens aktivering af fokal adhæsion kinase fremmer deres differentiering21,22. Vi foreslår således at karakterisere den rolle, som begge veje i HAEC isoleres fra forskellige anatomiske regioner under de lineale specifikke differentierings protokoller. Desuden viser flere undersøgelser forskellene mellem de to regioner med hensyn til celle komponenter, molekyle funktion og biologiske processer. For eksempel er det Regionspecifikke genekspression og protein fordelingen af aquaporiner, som er involveret i transporten af intramembranøs absorption, blevet rapporteret23. En anden undersøgelse sammenlignede miRNome med mikroarrays, viser region-specifikke udtryk for miR-145 og miR-143, sidstnævnte er i stand til posttranskriptivt regulere prostaglandin-endoperoxidase syntase 2 under specifikke betingelser såsom arbejdskraft på sigt16. Desuden er placenta regionen præsenterer højere mitokondrie respiration, men lavere reaktive ilt arter påvisning sammenlignet med reflekteret væv15. Dissekerer amnion i reflekterede og placentale regioner tilskyndes til at isolere HAEC og analysere deres ejendommelige egenskaber separat, såsom frigivelse af vækstfaktorer og cytokiner, deres lave immunogenicitet, produktion af ekstracellulære matrix, effekten af deres konditionerede medium i coculture med andre celletyper, og nye funktioner såsom deres evne til at vedligeholde HPSC linjer som et feeder-lag24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vores forskning blev støttet af tilskud fra Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 og 21081) og CONACYT (a1-S-8450 og 252756). Vi takker Jessica González Norris og Lidia Yuriria Paredes Vivas for den tekniske støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture reagents
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific/Gibco 21985023 55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific/Gibco 12430054 Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA Thermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G 0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified Thermo Fisher Scientific/Gibco 10439024
Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher Scientific/Gibco 11140050 100X
Paraformaldehyde any brand
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%) any brand
Sodium Pyruvate Thermo Fisher Scientific/Gibco 11360070 100 mM
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific/Gibco 25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352360
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator MaCSmix
Antibodies and Kits Antibody ID
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 RRID:AB_3975
Anti-KI67 Santa Cruz 23900 RRID:AB_627859)
Anti-NANOG Peprotech 500-P236 RRID:AB_1268274
Anti-OCT4 Abcam ab19857 RRID:AB_44517
Anti-SOX2 Millipore AB5603 RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4 Cell Signaling 4755 RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60 Cell Signaling 4746 RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit Abcam 66110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, (6), 700-708 (2016).
  2. Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151, (1), 66-74 (2015).
  3. Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
  4. Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).
  5. Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10, (12), 0146082 (2015).
  6. Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375, (1), 31-41 (2019).
  7. Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39, (8), 1305-1316 (2018).
  8. Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41, (4), 1983-1991 (2018).
  9. Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245, (7), 762-773 (2016).
  10. Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
  11. Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80, (4), 13003 (2018).
  12. Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39, (4), 918-926 (2017).
  13. Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37, (2), 161-171 (1997).
  14. Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. Springer. 268-318 (1995).
  15. Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36, (11), 1329-1332 (2015).
  16. Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6, (9), 24131 (2011).
  17. Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79, (5), 954-961 (2008).
  18. Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22, (8), 1351-1367 (2013).
  19. Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7, (1), 3761 (2017).
  20. Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
  21. Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10, (3), 312-326 (2012).
  22. Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34, (7), 1753-1764 (2016).
  23. Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3, (3), 12320 (2015).
  24. Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15, (2), 322-324 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics