İnsan Amniyotik Membranının Farklı Anatomik Bölgelerinden Epitel Hücrelerin In Vitro Kültürü

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu protokol, klinik ve fizyopatolojik modellerde olası uygulama için heterojenliklerini ve fonksiyonel özelliklerini belirlemek için insan amniyotik zarının farklı anatomik bölgelerinden epitel hücrelerinin izolasyonu açıklanmaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Avila-González, D., García-López, G., Díaz-Martínez, N. E., Flores-Herrera, H., Molina-Hernández, A., Portillo, W., Díaz, N. F. In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane. J. Vis. Exp. (153), e60551, doi:10.3791/60551 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Literatürde insan amniyotik epitel hücrelerinin (HAEC) izolasyonu ve kültürü için çeşitli protokoller bildirilmiştir. Ancak, bu amniyotik epitel homojen bir tabaka olduğunu varsayalım. İnsan amnionu üç anatomik bölgeye ayrılabilir: yansıyan, plasental, ve göbek. Her bölgenin patolojik koşullar gibi farklı fizyolojik rolleri vardır. Burada, insan amnion dokusunu üç bölümden ayırıp tüp bebek olarak muhafaza etmek için bir protokol uyguluyoruz. Kültürde, yansıyan amniondan elde edilen hücreler küloidal morfoloji speküel, hem plasental hem de göbek bölgelerindeki hücreler skuamözdür. Bununla birlikte, elde edilen tüm hücrelerde e-kadherin immünositinin immünotespiti ile gösterilen bir epitel fenotip vardır. Bu nedenle, yerinde plasental ve yansıyan bölgeler hücresel bileşenler ve moleküler fonksiyonlar farklı olduğundan, in vitro çalışmalar için bu farklılıkları dikkate almak için gerekli olabilir, çünkü HAEC kullanımı için fizyolojik etkileri olabilir biyomedikal araştırma ve rejeneratif tıpta bu hücrelerin umut verici uygulama.

Introduction

İnsan amniyotik epitel hücreleri (HAEC) embriyonik gelişimin erken aşamalarında, yaklaşık sekiz gün postfertilizasyon kaynaklanır. Onlar amniyotik membran1en iç tabakasından türetilen epiblast skuamöz epitel hücrelerinin bir popülasyon ortaya çıkar. Böylece, HAEC embriyo nun üç mikrop katmanları na ayırt etme potansiyeline sahip epiblast pluripotent hücrelerin kalıntıları olarak kabul edilir2. Son on yılda, çeşitli araştırma grupları in vitro bir kültür modeli onların varsayımsal pluripotency ile ilgili özellikleri karakterize etmek için gebelik döneminde amniyotik membran bu hücreleri izole etmek için yöntemler geliştirdik3,4.

Buna göre, HAEC'in yüzey antijenleri SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; pluripotency transkripsiyon faktörleri OCT4, SOX2 ve NANOG çekirdek; ve çoğalma belirteci KI67, kendi kendini yenileyen olduğunu düşündüren5,6,7. Ayrıca, bu hücreler üç germ katmanları (ektoderm, mezoderm ve endoderm)4,5,8,yanı sıra insan hastalıklarının hayvan modellerinde soy-spesifik belirteçleri için pozitif hücreleri elde etmek için farklılaşma protokolleri kullanılarak meydan edilmiştir. Son olarak, HAEC ekspres E-kadherin, onlar hpsc gibi bir epitel doğasını korumak olduğunu göstermektedir5,9.

Onların embriyonik kökenli dışında, HAEC farklı klinik uygulamalar için uygun hale diğer içsel özelliklere sahip, anti-inflamatuar ve antibakteriyel moleküllerin salgılanması gibi10,11, büyüme faktörleri ve sitokin salınımı12, onlar HPSCileaksine immüneksik fareler içine nakledildiğinde teratom oluşumu , ve immünolojik tolerans ifade hla-G ifade çünkü, hangi reddedilme riskini azaltır transplantasyon13.

Ancak, önceki raporlar insan amnion homojen bir membran olduğunu varsayılmıştır, anatomik ve fizyolojik olarak üç bölgeye ayrılabilir dikkate almadan: plasental (decidua bazaliskapsayan amnion ), göbek (göbek kordonu saran parçası), ve yansıyan (plasenta bağlı olmayan membran geri kalanı)14. Bu morfoloji, mitokondriyal aktivite, reaktif oksijen türlerinin tespiti15,miRNA ekspresyonu16ve sinyal yollarının aktivasyonu nda amnion ekran farklılıkları plasental ve yansıyan bölgelerde gösterilmiştir17. Bu sonuçlar, insan amnion yerinde veya in vitro modellerde yapılan ileri çalışmalar için düşünülmelidir farklı işlevsellik ile heterojen bir popülasyon tarafından entegre olduğunu göstermektedir. Diğer laboratuvarlar HAEC'in tüm membrandan izolasyonu için protokoller tasarlarken, laboratuvarımız farklı anatomik bölgelerdeki hücreleri izole etmek, kültürünü ve karakterizesini sağlamak için bir protokol oluşturmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol Mexico City'deki Instituto Nacional de Perinatología etik komitesi tarafından onaylanmıştır (Kayıt numarası 212250-21041). Bu çalışmalarda yapılan tüm prosedürler Instituto Nacional de Perinatología'nın etik standartlarına, Helsinki Deklarasyonu'na ve Sağlık Bakanlığı'nın Resmi Meksika Standardı'nda belirtilen yönergelere uygun olarak yapılmıştır.

1. Hazırlık

  1. EDTA ile 1x PBS bir çözüm hazırlayın. Bunun için, 0,5 mM EDTA'lık son konsantrasyon için 500 mL 1x PBS'ye 500 mL 0,5 M EDTA stoku ekleyin.
  2. HAEC için kültür ortamını hazırlayın. 450 mL yüksek glukoz-DMEM alın, 5 mL sodyum pirüuvat (100 mM), kök hücreler için uygun 50 mL ısı-inaktif fetal sığır serumu, 5 mL anti-antimikotik (100x), 5 mL L-glutamin (200 mM) ve 500 μL mercaptoetanol (1000x).
  3. Doku taşıma ve işleme için konteyner sterilize: laboratuvara ameliyathane tüm plasenta taşımak için bir kapak ile paslanmaz çelik konteyner, bir tepsi (20 cm x 30 cm x 8 cm) yıkamak ve tüm plasenta önce kan kaldırmak için amniyotik membran diseksiyon ve üç bölgeye amniyotik membran ayırmak için plastik bir kesme tahtası.
  4. Cerrahi aletleri (neşterler, makaslar, forsepsler ve kelepçeler), 500 mL bealer, pamuk gazlı bezler ve tuzlu çözeltiyi sterilize edin.

2. Plasental dokunun elde edilmesi

NOT: Amniyotik membranlar tam süreli gebelikte (37−40 hafta) kadınlardan, sezaryen doğum endikasyonu altında, aktif doğum bulgusu olmaksızın ve enfeksiyonun mikrobiyolojik özellikleri olmaksızın elde edilmiştir. Tam izolasyon ve kültür prosedürleri steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabineiçinde gerçekleştirildi.

  1. Ameliyathanede, doku geri kalanına kan akışını önlemek için göbek kordonu kelepçeleyin. Steril kapta kenetlenmiş göbek kordonu ile tüm plasenta toplamak.
  2. Plasentayı nemlendirmek için kabın 500 mL'lik tuz çözeltisini ekleyin.
  3. Kabı kapatın ve odayı sıcaklıkta laboratuvara taşıyın.
  4. Plasentalı kabı biyogüvenlik dolabının içine koy.
    NOT: Diseksiyonu 15 dakika içinde plasenta nın toplanmasından sonra yapılmazsa, plasenta ile birlikte işleme konana kadar saklayın. Plasenta nın alınması ile diseksiyonun başlaması arasında geçen sürenin 1 saatten fazla lığından kaçının.

3. Amniyotik membranın bölgeye göre mekanik ayrıştırma

NOT: Prosedür steril koşullarda ve oda sıcaklığında bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır.

  1. Tüm plasentayı kaptan çıkarın ve göbek kordonu yukarı bakacak şekilde tepsiye yerleştirin.
  2. Steril pamuklu gazlı bez kullanarak, plasentayı kaplayan korrion-amnion yüzeyinden kan pıhtılarını temizleyin.
  3. Membranın üç bölgesini tanımlayın: göbek kordonu saran göbek amnionu, decidua bazalis'i kaplayan plasental amnion ve plasentaya bağlı olmayan amnın geri kalanı olan yansıyan bölge(Şekil 1).
  4. Göbek amnion bölgesini inceleyin (Şekil 2A).
    1. Kesme forceps kullanarak, plasenta ve göbek kordonu kavşak kapsayan amnion membran kısmını tutun.
    2. Bir neşter ile, kordodan ayırmak için germe sırasında kordonçevreleyen bölgeyi inceleyin.
    3. Ayrılmış dokuyu 100 mL tuzlu çözelti ile etiketli bir kabın içinde yatırın.
  5. Plasental amnion bölgesini diseksiyon (Şekil 2B).
    1. Steril bir pamuk gazlı bez ile, plasenta kapsayan chorion-amnion yüzeyinden kan pıhtıları kaldırın.
    2. Plasenta ile yansıyan bölge arasındaki sınırda membranı diseksiyon forceps ile tutun.
    3. Neşter ile plasenta çevresi boyunca kesin.
    4. Plasentadan herhangi bir damar kesmemeye dikkat edin, chorion plasenta dan plasental amnion ayırın.
    5. Ayrılmış dokuyu 300 mL tuzlu çözeltiile etiketlenmiş başka bir kabın içinde yerleştirin.
  6. Plasentaya bağlı olmayan amniyotik zarın geri kalanını chorion'dan(Şekil 2C)ayırın.
    1. 300 mL tuzlu çözeltiile yansıtılan bölgeyi başka bir etiketli kabın içinde toplayın.
      NOT: Dokuların kurumasını önlemek için diseksiyon sırasında sürekli olarak tuz çözeltisi ekleyin.

4. Membranların yıkanması

NOT: İşlem, oda sıcaklığında steril koşullarda bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır.

  1. Her membran bölgesinin tuzlu çözeltisini ayrı ayrı atın.
  2. Göbek bölgesine 100 mL taze tuzlu çözelti ekleyin.
  3. Plasental ve yansıyan bölgelere sırasıyla 300 mL taze tuzlu çözelti ekleyin.
  4. Kan kalıntısını gidermek için kopma forceps yardımı ile membranları karıştırın.
  5. Tuzlu çözeltiyi atın.
  6. Membranlar yarı saydam olana kadar yıkıntıları ve ajitasyonu en az 3x tekrarlayın.
  7. Steril gazlı bez ile temizlemek için tahta üzerindeki membranları yerleştirin ve genişletin yıkar ile çıkarılmadı kan pıhtıları.
    NOT: Mümkün olduğunca çok eritrositin çıkarılması çok önemlidir, çünkü bunların varlığı tripsin fonksiyonunu ve sonraki hücre kültürlerinin canlılığını etkiler.

5. Farklı bölgelerden membranların enzimatik sindirimi

NOT: Prosedür steril koşullarda bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır.

  1. Yansıyan ve plasental bölgeleri iki veya üç parçaya bölün.
  2. Göbek bölgesini kesmeyin.
  3. Santrifüj tüpleri her bölgenin parçaları yerleştirin. Yansıyan ve plasental bölgelere 20 mL tripsin/EDTA, göbek bölgesine sırasıyla %0,5 tripsin/EDTA 5 mL ekleyin.
    NOT: Tripsin çözeltisine tamamen daldırılması gerektiğinden, yansıyan ve plasental bölgelerin daha küçük parçalara dönüştürülmesi önemlidir.
  4. Santrifüj tüplerini 30 s. Tripsin için hafifçe çalkalayın.
  5. Yansıyan ve plasental bölgelere %0,5 tripsin/EDTA 30 mL, göbek bölgesine ise %0,5 tripsin/EDTA ekleyin.
  6. Tüpleri kuvözün içine bir rotator yerleştirin.
  7. 37 °C'de 40 dk boyunca rotasyonlu (20 rpm) inkübül.
    NOT: Tüp rotator yoksa, tüpleri her 10 dakikada bir hafifçe elle sallayın.
  8. Her bölgeden tripsin/hücre çözümlerini yeni santrifüj tüplerine aktarın.
  9. Enzimi inaktive etmek için tüp başına 37 °C'de ısınmış HAEC ortamının hacmini 2 kat artırın.
  10. İlk sindirimi buzda saklayın.
  11. İkinci bir sindirim dönemi için 5.6−5.8 adımlarını tekrarlayın.
  12. Her bölge için, diseksiyon forsepskullanarak amnion kısmının bir ucunu tutun ve önceki kuluçka dönemlerinde tamamen soyulmamış epitel hücrelerinin satırlarını kaldırmak için doku boyunca başka bir çift sıkmak ile.
  13. Santrifüj tüpleri başka bir dizi içine ikinci sindirim toplamak ve 2x HAEC medya hacmi ile inaktive.
  14. Sindirilmiş membranları biyolojik tehlike kabına atın.

6. HAEC'in İzolasyon

NOT: Prosedür steril koşullarda bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır.

  1. Tüm tüpleri 200 x g'de 10 dk 4 °C'de santrifüj edin.
  2. Supernatant atın ve her pelet ayrıştırmak için tüp başına önceden ısıtılmış HAEC medya (37 °C) ve boru hafifçe ekleyin.
  3. Her membran bölge için ayrı bir tüp iki sindirim hücresel süspansiyonlar birleştirin.
  4. Hücre dışı matris enkazını çıkarmak ve tek hücre elde etmek için hücre içi selektonu kullanarak hücresel süspansiyonları filtreleyin.
  5. Mikrosentrifuge tüpiçinde 90 μL trypan mavisi ile üç aliquot hazırlayın.
  6. Membran bölgesi başına her hücre süspansiyonunun 10 μL'sini mikrosantrifüj tüplere ekleyin ve karıştırın.
  7. Hücreleri hemositometreile ışık alanı mikroskobu altında sayın.

7. HAEC Kültürü

  1. Tohum HAEC ayrı ayrı üç bölgeden 3 × 104 hücre/ cm2 önceden ısıtılmış HAEC medya ile bir yoğunluk, insan epidermal büyüme faktörü (EGF) 10 ng / mL ile desteklenmektedir.
    1. Hücreleri 100 mm plakahalinde tohumlayarak in vitro veya immünokimyasal analiz için 24 kuyu plakasında saklayın.
  2. Tabakları 37 °C'de normoksik koşullarda (%5 CO2)nemli bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
  3. Günlük EGF ekleyin ve her üç günde bir ortamı değiştirin.
    NOT: Hücreler 4−6 gün sonra konspalanrolurlar.
  4. Konvansiyonel immünohistokimya, hücre sıralama analizi, kriyokoruma, RNA ve protein ekstraksiyonu için hücreleri kullanın, ya da geçişi devam etmek için.

8. HAEC'in geçişi

  1. HAEC ortamını çıkarın ve PBS/EDTA 0.01M çözeltisi ile 2 kat yıkayın.
  2. 37 °C'de 15 dk pbs/EDTA 0.01M çözeltisi ile kuluçkaya yatırın.
  3. PBS/EDTA'yı çıkarın ve 1,5 mL %0,5 tripsin/EDTA ekleyin.
  4. 37 °C'de 5−8 dk kuluçka.
  5. Enzimi iki cilt HAEC media ile inaktive edin.
  6. 200 x g5 dakika karışık çözelti ve santrifüj toplamak.
  7. Hücreleri sayın ve aşağıdaki pasajlar ile devam edin veya daha fazla analiz için hücreleri kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HAEC amniyotik membranın üç anatomik bölgesinin her birinden izole edildi ve in vitro olarak ayrı ayrı kültürlendi. 48 saat kültürden sonra, epitel fenotipli hücreler plaka yüzeyine yapışmış olsa da, ortam değiştirildikten sonra çıkarılan hücre enkazı ve yüzen hücreler de içeriyordu(Şekil 3).

Birincil kültürün işlenmesi sırasında (sıfır, P0 geçidi) deneysel veri analizini etkileyebilecek bazı komplikasyonlar ortaya çıkabilir (Şekil 4): reaktiflerin kontaminasyonu nedeniyle veya izolasyon işlemi sırasında bakterilerin varlığını tespit ederek kültürleri atmak ve başka bir membranı işlemek tavsiye edilir(Şekil 4A); zarların yetersiz yıkanması nedeniyle aşırı eritrositler (Şekil 4B); hücrelerin plakalara yapışmaması veya yapışmaması(Şekil 4C); veya fibroblast morfolojisi olan hücreler(Şekil 4D),insan amniyotik mezenkimal hücrelerinin (HAMC) HAEC yerine izole edildiğini düşündürmektedir.

HAEC morfolojisi bu hücrelerin kökenine bağlıdır: yansıyan bölgeden hücreler kütipoidal morfolojiye sahiptir ve plasental ve göbek bölgelerindeki düz ve skuamöz hücrelerin aksine arnavut kaldırımlı bir monotabaka halinde büyürler (Şekil 5). Bu veriler amniondan epitel tabakasının membran boyunca düzgün olmadığını destekler. Pasajlar sırasında, tüm bölgelerden hücrelerin boyutu artar, ancak epitel doğasını korumak ve bir fibroblast morfolojisi elde etmez. Nitekim, E-kadherin karşı immünofloresans birincil kültürler (P0) ve alt kültürleri (P1-P2) epitel fenotip muhafaza gösterdi(Şekil 6), mezenkimal stromal hücreler gibi başka bir hücre tipi hiçbir kontaminasyon olduğunu düşündüren, veya epitel-mezenkimal geçiş. Buna ek olarak, bu hücreler TUNEL testine göre hücre ölümü belirtisi göstermezler (Ek Şekil 1) ancak KI-67 proliferasyon belirteci için pozitiftir ( Şekil6), ancak önceki sonuçlarımız hergeçitarasında bu belirteç için anlamlı bir fark bulunmaz 5 .

Elde edilen hücre sayısı bölgeye göre değişir: 61.6 x 106 ve 71.8 x 10 6 yansıyan ve plasental bölgelerden6 hücre, ve göbek bölgesinden örnek başına 1 x 106'dan az(Tablo 1). Bu protokol ile plasental ve göbek bölgesinin ekspresyon profillerinde, yansıyan ve plasental bölgelerin aksine, özellikle ECM reseptör etkileşimine, fokal yapVereye ve RNA-seq6ile PI3K-Akt sinyal yoluna katılan genlerde çok benzer olduğu bildirilmiştir. Anlaşma, bir önceki çalışmada mitojen-aktive protein kilaz diferansiyel ekspresyon ve büyüme faktörü beta yollarının transforme, yanı sıra her iki bölge arasında proinflamatuar sitokinler17.

Kanıtlar amniondan alt popülasyonların morfolojisi ve fizyolojik özellikleri farklı olduğunu göstermiş olsa da, plasental ve yansıyan bölgelerden elde edilen HAEC'te pluripotency faktörlerinin özünün ifade ve varlığının değişmediğini daha önce gösterdik6. Bu bağlamda, göbek bölgesinden nispeten sınırlı sayıda hücreye ek olarak, sonraki çalışmalar plasental izole HAEC odaklanmak gerekir ve bağımsız amnion yansıyan, fizyolojik etkileri göz önünde bulundurularak, farklı alt popülasyonlar belirli olaylara eşit yanıt olmaz çünkü, doğum sırasında uzun süreli gebelik veya inflamatuar süreçler gibi, ana pluripotency belirteçleri belirli pozitif hücreler olmasına rağmen(Şekil 7).

Figure 1
Şekil 1: Amniyotik membrandan anatomik bölgeler. Umbilikal amniyotik membran (sarı), plasental amniyotik membran (beyaz) ve yansıyan amniyotik membran (siyah). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Amniyotik zarın mekanik diseksiyonu. (A) Göbek bölgesi, (B) plasental bölge ve (C) yansıyan bölge. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: AMNiyotik membrandan elde edilen HAEC'in temsili birincil kültürü. Kültür 48 h izolasyondan sonra (A) ve (B) medya değişikliği. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: HAEC'in birincil kültürünün olumsuz sonuçlarının temsili mikrografları. (A) Eritrosit fazlalığı. (B) Bakteriyel kontaminasyon. (C) HAEC 48 saat izolasyondan sonra yapışmaz. (D) Fibroblast morfolojisi olan hücrelerden oluşan birincil kültür. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Haec'in farklı anatomik bölgelerden in vitro morfolojisi. Yansıyan (üst panel), plasental (orta panel) ve p0−P2'ye rağmen kültürlü göbek (alt panel) bölgelerinden confluent HAEC'in temsili mikrografları. Ölçek çubukları 200 = μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: HAEC'te E-kadherin ve KI-67 ifadesi. E-kadherin+ ve KI-67+ HAEC'in temsili epifloresan mikroskopi görüntüleri p0−P2 ile kültürlenen yansıyan (sol panel) ve plasental (sağ panel) amniyonundan. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Farklı anatomik bölgelerden HAEC pluripotency marker paneli görüntüler. TRA-1-60 ile NANOG için çift immünofensans amnion temsilcisi konfokal mikroskopi görüntüleri, E-kadherin ile OCT4, ve SOX2 Ile SSEA-4 HAEC (P1) yansıyan (üst panel) ve plasental (alt panel) bölgelerden. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

# MEMBRAN Yansıyan Plasental Göbek KOMPLE MEMBRAN
1 75 X 106 130 X 106 0,2 X 106 205,2 X 106
2 38,5 X 106 52 X 106 0,53 X 106 91,03 X 106
3 59 X 106 53 X 106 0,2 X 106 112,2 X 106
4 42 X 106 27 X 106 0,36 X 106 69,36 X 106
5 44,8 X 106 22,3 X 106 Np 76.1 X 106
6 100 X 106 140 X 106 1 X 106 241 X 106
7 72 X 106 78 X 106 Np 150 X 106
Ortalama 61,6 X 106 71,8 X 106 0,45 X 106 133,8 X 106

Tablo 1: Amniyotik membranlardan bölgeye göre izole edilen HAEC sayısı. (NP = işlenmedi).

Ek Şekil 1: YANSıYAN bölgeden ve pozitif kontrol hücrelerinden (camptothecin ile tedavi edilen HL-60 hücreleri) HAEC'te TUNEL boyama (pasaj 2). Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HAEC'i dönem zarlarından izole etmek için yeni bir protokol uyguladık. Her zarın izolasyondan önce üç anatomik bölgeye bölünerek her bir membrandan hücreleri analiz ettiği önceki raporlardan farklıdır.

Protokoldeki en kritik adımlardan biri, epitel hücrelerini ayırırken tripsin aktivitesine engel olabileceğinden, tüm kan pıhtılarını temizlemek için zarın yıkanmasıdır. Bu adımın düzgün bir şekilde gerçekleştirilememesi, aşırı eritrositler ve az sayıda yapışık epitel hücreleri ile birincil kültürün elde edilmesine yol açabilir. Hücrelerin tohumlanmasından sonra ilk 24−48 h'de ek gözlenmezse, kültürün atılmasını öneririz. Bir diğer kritik nokta da enzimatik sindirim için kuluçka süresidir. Kuluçka dönemi çok uzunsa, epitelyal morfoloji yerine mezenkimal hücre canlılığı azalabilir ve/veya hücre kültürleri elde edilebilir(Şekil 4). Ayrıca, membran sindirim uygun ajitasyon ile yapılmazsa, membran başına hücre düşük sayıda elde etme olasılığı artar.

Bu protokolde, ayetler boyunca çoğu hücre için spesifik epitel hücre belirteci E-kadherin varlığından da anlaşılarak, haec in vitro popülasyonlarını epitel fenotiplerini kaybetmeden koruyabiliriz (Şekil 6). Ancak, deneyimlerimize göre HAEC sadece üç pasaj (P1−P3) için genişletilebilir. Uzun kültür dönemleri veya birden fazla pasaj gerektiren deneyler için sınırlı sayıda pasaj dikkate alınmalıdır. Buna ek olarak, P3 hücrelerin morfolojisini değiştirmek ve E-kadherin ekspresyonu azaltmak başlar sonra bildirilmiştir, bu yüzden uzun süreli kültür epitel-mezenkimal geçiş neden olabilir (EMT)18. Son zamanlarda, bu progesteron ovine amniyotik epitel hücrelerinde EMT önler gösterilmiştir19,20, Bu yüzden üçüncü pasajdan sonra mezenkimal fenotip önlemek için HAEC kültür orta progesteron farklı konsantrasyonlarının etkisini analiz etmek ilginç olurdu.

HAEC izole edildi tüm önceki raporlarda, amnion tüm membran oluşturan epitel popülasyonların olası heterojenite rağmen tek tip bir doku olarak kabul edilmiştir. Buna karşılık, bu protokol membranı ayrı ayrı izole etmek ve haec'i işlevsel farklılıklar öneren önceki morfolojik ve gen ekspresyonu raporlarını göz önünde bulundurarak kültüre ayırmak için üç anatomik alana böler. P2'ye kadar olan geçişler sırasında E-kadherin belirteci nin saptanmasıyla gösterildiği gibi, sadece epitel popülasyonları elde etmek için hücre sıralama yoluyla arındırmak da gereksizdir.

Bu membran bölgelerin her izole HAEC pluripotency çekirdek benzer bir ifadeye sahip olduğu gösterilmiştir, köklüğe sahip hücrelerin gizli bir rezervuar olmak. Bu bağlamda, bu hücreler in vitro moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir, pluripotency ile ilgili transkripsiyon faktörlerinin dinamik lokalizasyonu veya kanserle ilişkili genleri ifade rağmen quiescent kalmak için yeteneği gibi, ne olursa olsun kökeni anatomik bölge. Ancak, gelecekteki araştırmalar her bölge arasında rapor edilen moleküler farklılıkları (küresel ekspresyon genleri, metabolik aktivite, sinyal yolları) göz önünde bulundurmalıdır ve bu da rejeneratif tıpta uygulamaları nın yankıları olacaktır. Daha önce Pi3K/AKT ve fokal adezyon sinyal yollarının farklı amniyotik bölgeler arasında RNA-seq6ile yer alan genlerin farklı bir ekspresyonu rapor ettik. PI3K/AKT kendi kendini yenilemeyi düzenler ve HPSC'de pluripotency korur, odak yapışma kizaz aktivasyonu ise onların farklılaşma teşvik21,22. Bu nedenle, hatlara özgü diferansiyasyon protokolleri sırasında farklı anatomik bölgelerden izole edilen HAEC'de her iki yolun rolünü karakterize etmeyi öneriyoruz. Buna ek olarak, çeşitli çalışmalar hücresel bileşenler, moleküler fonksiyon ve biyolojik süreçler ile ilgili her iki bölge arasındaki farkları göstermektedir. Örneğin, intramembranöz emilimin taşıma sürecinde yer alan aquaporinlerin bölgeye özgü gen ekspresyonu ve protein dağılımıbildirilmiştir 23. Başka bir çalışmada mikrodiziler tarafından miRNome karşılaştırıldı, miR-145 ve miR-143 bölgeye özgü ifade gösteren, ikinci posttranskripsiyonel prostaglandin-endoperoxidase düzenlemek mümkün olan 2 dönem emek gibi belirli koşullar altında2 16. Ayrıca, plasental bölge yansıyan doku15ile karşılaştırıldığında daha yüksek mitokondriyal solunum ancak daha düşük reaktif oksijen türlerinin tespiti sunar. Yansıyan ve plasental bölgelerde amnion diseksiyon HAEC izole etmek ve ayrı ayrı kendi özgü özelliklerini analiz etmek için teşvik edilir, büyüme faktörleri ve sitokinlerin serbest bırakılması gibi, düşük immünojenite, ekstrasellüler matriks üretimi, diğer hücre tipleri ile coculture onların koşullu ortamın etkisi, ve yeni işlevler gibi bir besleyici katman olarak HPSC hatları korumak için kapasiteleri24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Araştırmamız Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 ve 21081) ve CONACYT (A1-S-8450 ve 252756) tarafından desteklenmiştir. Teknik destek için Jessica González Norris ve Lidia Yuriria Paredes Vivas'a teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture reagents
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific/Gibco 21985023 55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific/Gibco 12430054 Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA Thermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G 0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified Thermo Fisher Scientific/Gibco 10439024
Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher Scientific/Gibco 11140050 100X
Paraformaldehyde any brand
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%) any brand
Sodium Pyruvate Thermo Fisher Scientific/Gibco 11360070 100 mM
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific/Gibco 25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352360
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator MaCSmix
Antibodies and Kits Antibody ID
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 RRID:AB_3975
Anti-KI67 Santa Cruz 23900 RRID:AB_627859)
Anti-NANOG Peprotech 500-P236 RRID:AB_1268274
Anti-OCT4 Abcam ab19857 RRID:AB_44517
Anti-SOX2 Millipore AB5603 RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4 Cell Signaling 4755 RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60 Cell Signaling 4746 RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit Abcam 66110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, (6), 700-708 (2016).
  2. Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151, (1), 66-74 (2015).
  3. Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
  4. Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).
  5. Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10, (12), 0146082 (2015).
  6. Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375, (1), 31-41 (2019).
  7. Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39, (8), 1305-1316 (2018).
  8. Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41, (4), 1983-1991 (2018).
  9. Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245, (7), 762-773 (2016).
  10. Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
  11. Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80, (4), 13003 (2018).
  12. Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39, (4), 918-926 (2017).
  13. Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37, (2), 161-171 (1997).
  14. Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. Springer. 268-318 (1995).
  15. Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36, (11), 1329-1332 (2015).
  16. Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6, (9), 24131 (2011).
  17. Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79, (5), 954-961 (2008).
  18. Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22, (8), 1351-1367 (2013).
  19. Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7, (1), 3761 (2017).
  20. Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
  21. Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10, (3), 312-326 (2012).
  22. Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34, (7), 1753-1764 (2016).
  23. Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3, (3), 12320 (2015).
  24. Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15, (2), 322-324 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics