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幻影的多模态3D打印模拟生物组织

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Summary

旋转涂层、多喷流打印和熔融沉积建模集成在一起,可生成多层异构幻象,模拟生物组织的结构和功能特性。

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Ma, C., Shen, S., Liu, G., Guo, S., Guo, B., Li, J., Huang, K., Zheng, Y., Shao, P., Dong, E., Chu, J., Xu, R. X. Multimodal 3D Printing of Phantoms to Simulate Biological Tissue. J. Vis. Exp. (155), e60563, doi:10.3791/60563 (2020).

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Abstract

生物医学光学成像在诊断和治疗各种疾病中起着重要的作用。然而,光学成像器件的精度和可重复性受其元件性能特性、测试环境和操作的影响很大。因此,有必要通过可追溯的幻象标准校准这些设备。然而,目前可用的大多数幻象都是同质幻象,无法模拟生物组织的多模态和动态特性。在这里,我们展示了使用集成旋转涂层模块、多喷流模块、熔融沉积建模 (FDM) 模块和自动控制框架的生产线进行异构组织模拟幻象的制造。"数字光学幻象"的结构信息和光学参数在原型文件中定义,导入生产线,并逐层在不同打印方式之间进行顺序切换。这种生产线的技术能力体现在皮肤模拟幻象的自动打印,包括表皮、真皮、皮下组织和嵌入肿瘤。

Introduction

生物医学光学成像代表一系列医疗成像工具,根据光与生物组织相互作用检测疾病和组织异常。与其他成像模式(如磁共振成像 (MRI) 和计算机断层扫描 (CT) 相比,生物医学光学成像利用低成本和便携式设备1、2、3、4等非侵入性测量组织结构、功能和分子特性。然而,尽管光学成像在成本和便携性方面具有优势,但临床诊断和治疗指导并未被广泛接受,部分原因在于其可重复性差,光学和生物参数之间缺乏定量映射。造成这种限制的主要原因是生物医学光学成像设备缺乏可追溯的定量校准和验证标准。

过去,各种组织模拟幻象被开发用于各种组织类型的生物医学光学成像研究,如脑5、6、7、皮肤8、9、10、11、12、膀胱13和乳房组织14、15、16、17。这些幻象主要由以下制造工艺之一生产:1) 旋转涂层10,18 (用于模拟均质和薄层组织);2)成型19(用于模拟具有几何特征的笨重组织);和3)三维(3D)打印20,21,22(用于模拟多层异构组织)。成型产生的皮肤幻象能够模拟皮肤组织的体积光学特性,但不能模拟横向光学异质性19。本茨等人采用双通道FDM3D打印方法模拟生物组织的不同光学特性23。然而,使用两种材料不能充分模拟组织光学异质性和各向异性。Lurie等人通过结合3D打印和旋转涂层13,为光学相干断层扫描(OCT)和膀胱镜片创建了一个膀胱幻象。然而,幻象的异构特征,如血管,必须手工绘制。

在上述幻象制造工艺中,3D 打印为模拟生物组织的结构和功能异质性提供了最大的灵活性。然而,许多生物组织类型(如皮肤组织)由多层和多尺度的成分组成,无法通过单个 3D 打印过程进行有效复制。因此,必须集成多个制造工艺。我们推荐一条3D打印生产线,集成了多种制造工艺,用于自动生产多层和多尺度组织模拟幻像,作为生物医学光学成像的可追溯标准(图1)。尽管旋转涂层、多喷头打印和 FDM 在我们的 3D 打印生产线中是自动化的,但每种模式都保留了与既定工艺相同的功能特性。因此,本文为生产多尺度、多层、异构组织模拟幻象提供了一般指南,无需在单个仪器中物理集成多个过程。

Figure 1
图1:3D打印生产线的CAD图。A) 3D 打印生产线,并拆下顶部外壳。(B) 旋转涂层模块和机械手模块的示意图。(C) 多喷打印模块的示意图。(D) FDM 打印模块的示意图(UV 灯属于多喷头打印模块)。请点击此处查看此图的较大版本。

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Protocol

1. 准备 3D 打印材料

注:我们的光学幻象生产线使用各种印刷材料来模拟生物组织的结构和功能异质性。打印材料的选择也取决于制造工艺。

  1. 用于旋转涂层印刷的材料准备
    1. 将100毫克二氧化钛(TiO2)粉末加入含有100mL立体光刻(SLA)光聚合物树脂的烧杯中。
    2. 在磁性搅拌器上搅拌烧杯中的混合物 30 分钟。
    3. 用锡箔密封烧杯,并在超声波机中声波15分钟。
    4. 对材料进行 10 分钟的真空处理,并将其加载到设备的存储注射器中。
  2. 多喷头打印的材料准备
    1. 在含有80克三乙二醇二聚氰胺的烧杯中加入17.56克2-羟基-2-甲基丙酮(1-羟基羟基苯基酮),以获得18%(w/w)材料。
    2. 用锡箔密封烧杯,并在超声波机中声波15分钟。
    3. 拿出20mL的混合物,加入5毫克的油溶性中国红染料。重复步骤 1.2.2。
    4. 对所有材料进行真空处理,将带有染料的溶液装入 Y(黄色)通道的盒中,并将纯溶液加载到 K(黑色)通道的盒中。
  3. FDM 打印的材料准备
    1. 将 200 克凝胶蜡装入三个烧杯中的每一个,然后用磁性搅拌器加热到 60°C。
    2. 将 600 毫克 TiO2粉末添加到第一个烧杯中。将80毫克石墨粉加入第二个。
    3. 将凝胶蜡与 TiO2混合,将凝胶蜡与不同烧杯中的石墨粉混合 30 分钟,在磁搅拌器上搅拌 30 分钟。
    4. 对三种不同材料进行 2 分钟的真空处理,并在凝固前将其装载到混合三喷嘴模块的挤出机中。

2. 为多式联运 3D 打印准备计算机模型

注:异构皮肤组织被简化为三层:表皮、真皮和皮下组织。表皮层由旋转涂层使用步骤 1.1 中引入的材料生成。真皮层由多喷流打印使用步骤 1.2 中引入的感光聚合物生成。皮下组织层由 FDM 使用步骤 1.3 中引入的材料生成。生成具有不同打印参数的计算机辅助设计 (CAD) 文件,以指导上述制造过程。

  1. 皮肤数字光学幻象的设计
    1. 设计以下三层皮肤幻象:100 μm厚的表皮层、400 μm厚的真皮层和1厘米厚的皮下组织。
    2. 使用 3D 建模软件包(例如,Solidworks)绘制肿瘤模型(图 5A)。
  2. 旋转涂层的参数设置
    1. 在打印装置的控制软件中设置旋转速度和持续时间的参数。本演示中使用的第一级旋转涂层速度为 200 转/分钟 (rpm),自旋涂层时间为 20 秒,第二阶段旋转涂层的速度为 1,000 rpm,自旋涂层为 40 s。
    2. 在控制软件中,将旋转涂层材料的量设置为 3 mL,将光固化时间设置为 180 s。
  3. 为多喷头打印准备源文件
    1. 将要打印的血管图像导入 AcroRIP Color 软件包,并根据打印幻像的光学参数与图像属性之间的关系设置参数(打印位置和喷墨量)。在这张打印的血管图片中,K通道装有透明光固化材料,Y通道装载了与中国红染料混合的光固化材料。
    2. 生成具有为 3D 打印定义的参数的".prn"文件。
  4. 为 FDM 打印准备 G 代码
    1. 使用 3D 映射软件包(例如 Solidworks)绘制 frustum 模型以模拟肿瘤。
    2. 将肿瘤模型的".stl"文件导入装有一体式喷嘴切片脚本的 Cura 软件包中。
    3. 切片模型以生成打印所需的 G 代码。
  5. 将文档加载到打印控制软件
    1. 单击菜单栏中的"文件"菜单项,选择"导入 UV 打印文件"子菜单项,并加载步骤 2.3 中引入的 UV 打印".prn"文件。
    2. 如步骤 2.5.1 中的步骤 2.5.1 中那样,将步骤 2.4 中生成的 G 代码加载到打印控制软件中。
    3. 单击"开始打印"按钮以启动自动 3D 打印过程。

3. 通过旋转涂层打印皮肤表皮层幻象组件

注:自旋涂层模块主要由三部分组成:1)自旋涂布机;2)胶水分配器;和3)紫外线灯。

  1. 用机械手将装载站上的基板移到旋转涂层的样品阶段。启动真空泵,通过吸附固定基板。
  2. 配胶器控制注射器将步骤 2.2.2 中引入的材料滴到基板的中心。
  3. 旋转涂布机开始按照设定的速度和时间参数工作。
  4. 放下紫外线灯(波长:395 nm),将其打开 180 s。
  5. 提起紫外线灯,关闭旋转涂层,然后打印皮肤表皮层。

4. 通过多冲喷射打印皮肤真皮层幻像组件

注:多喷墨打印模块由压电喷墨喷嘴、三维移动平台、控制面板和紫外线灯(汞灯)组成。溶剂型光固化材料、吸收材料和散射材料用作基质。不同区域不同比例的喷涂材料可以得到不同的光学参数。最后,逐层打印和固化真皮层幻像。

  1. 将基板移到 3D 移动平台,打开吸气阀以吸附平台上的基板。
  2. 3D 移动平台将基板固定在 UV 打印机的初始位置。
  3. 将喷墨打印机按圆柱体推到工作位置,喷墨打印机按主机发送的".prn"文件中指定的时间工作。此处,喷墨打印机的进纸信号用于驱动 Y 轴移动平台的移动。
  4. 喷墨打印机打印步骤 2.5.1 中设计的图层,气缸将喷墨打印机推回原始位置。与基板一起放置的 3D 移动平台的 Y 轴通过移动到初始位置进行初始化。
  5. 基板在 Y 轴的正方向移动 50 mm。紫外线灯由气缸向下推(基板上方 10 mm)。
  6. 根据固化时间设置打开 UV 灯 180 s。
  7. 将 UV 灯与气缸一起推到初始位置。与基板一起放置的 3D 移动平台的 Y 轴被初始化并返回到其初始位置。
  8. 沿 Z 轴将带有基板放置的 3D 移动平台向下移动 0.1 mm。
  9. 重复步骤 4.1_4.8 打印下一层,直到完成多层打印。

5. 通过 FDM 打印皮下组织幻象组件

注:FDM 模块由混合三头模块、单头模块和 3D 移动平台组成。凝胶蜡、吸收材料和散射材料用作制备皮下组织/肿瘤的幻象的原料。凝胶蜡在进料器中加热和熔化。由挤出头均匀搅拌,它被挤出以打印最终幻像与所需的光学参数。

  1. 打开喷嘴模块的加热功率,将温度设置为 60°C。
  2. 通过推动油缸将混合喷嘴移到工作位置。
  3. FDM 模块接收主机发送的 G 代码命令,混合喷嘴加热至 68°C。
  4. 打开搅拌马达,将材料混合均匀。
  5. 初始化 3D 移动平台,XYZ 轴移动到初始位置。
  6. 打印过程按照 G 代码命令执行。在逐层打印过程中,材料与确定每层幻像光学参数的混合比成比例拉伸。打印继续,直到皮下组织部分或肿瘤部分完全打印。
  7. 通过推动油缸将混合喷嘴模块移到初始位置。
    注意:由于石墨粉具有很强的光吸收性,因此需要尽可能均匀地混合,以避免聚合引起的光学参数发生变化。大颗粒尺寸的TiO2粉末容易沉淀,影响材料放置精度,因此必须将其完全混合。如果存放时间过长,则应更换 TiO2。

6. 将基板移回装载站

  1. 初始化 3D 移动平台并将 XYZ 轴移动到初始位置。将 3D 移动平台移动到切换位置。
  2. 通过推动气缸将机械手移到基板上方的位置。
  3. 拿起基板,用机械手将其移到装载站上。将基板放在装载站上并完成自动打印。

7. 通过成型铸造皮下组织层幻象组分

注:如果设计了幻象的肿瘤模型,则需要将聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 浇注到肿瘤外,从而铸造整个幻象。FDM 模块无需步骤 7.1_7.3 即可打印无肿瘤的皮下组织层。

  1. 用 3D 打印的矩形模具按压基板上。
  2. 将液体 PDMS 倒入模具中。
  3. 将基板放入培养箱中,在 60°C 下储存 2 小时。
  4. 从基板上取下幻像。

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Representative Results

旋转涂层制造的幻影
旋转涂层通过旋转转盘均匀地将液滴均匀地分布在基材上,固化后将制造原始主体的单层。基板的旋转速度和旋转时间不仅影响幻象的表面质量,而且决定幻像每一层的厚度。不同厚度的幻影可以通过逐层重复的旋转涂层制造。幻象的光学参数可以通过改变散射和吸收材料的比例来确定,如我们上一份出版物24所述。增加光固化树脂中的TiO2浓度将增加幻像的散射系数。考虑到自旋涂层的精度为0.01 mm,皮肤表皮厚度在0.04~1.6毫米之间,该工艺满足模拟皮肤表皮的要求(图2)。

Figure 2
图2:由旋转涂层制造的单层幻像。A) PDMS 材料被添加到 50% 比例的三丁基醇中,并在 3,000 rpm 下以旋转涂层 40 s 形成单层幻象。根据OCT.(B)测量,幻像的厚度为10±1 μm,PDMS薄膜的可实现厚度与不同旋转时旋转速度的相关性。请点击此处查看此图的较大版本。

由多喷头打印制造的幻影12
不同通道的可光固化材料与不同的光学颗粒混合,并根据".prn"文件在基板上由压电喷墨打印。固化后获得幻像的单层。多喷头打印机的分辨率为 18 μm x 18 μm x 10 μm(长度 x 宽度 x 高度),移动平台的位置分辨率为 1 μm,喷嘴支持四种不同类型的打印材料。打印平面的精度为 50 μm,每层的厚度由喷射材料的数量决定。由于单个通道的喷射量设置为 60%,因此每层的平均厚度为 100 ± 10 μm。皮肤组织真皮层厚度一般在0.4~2.4毫米之间,喷墨打印模块的厚度分辨率可达100μm。通过将印刷材料与中国红染料混合来模拟表皮血管(图3)。

Figure 3
图3:多喷墨打印的血管模拟。A) 印刷线模仿血管的血管图片.(B) 在打印过程中,打印在白纸上的血管的线条,纸张固定在3D移动平台的基板上。请点击此处查看此图的较大版本。

由 FDM 打印制作的幻影
凝胶蜡与石墨粉和 TiO2粉末混合,并通过 FDM 打印以所需形状打印。幻像水平方向的尺寸误差小于 1%。幻像的横向长度超过 20 mm,最小可打印功能为 1 mm,可打印范围为 100 mm x 100 mm x 20 mm。幻像的吸收和散射参数取决于内部TiO2和石墨粉末的比例。图 4显示了 FDM 打印时使用不含 TiO2和石墨粉末的凝胶蜡打印的不同特征尺寸的幻象。我们可以在印刷过程中改变TiO2与石墨粉末的比例,从而制造不同吸收和散射参数的幻象,包括梯度(4B)。吸收和散射参数与TiO2与石墨粉末比的相关性见于参考文献24。

Figure 4
图 4:FDM 打印结果。A) 具有渐变颜色的八层 40 mm x 40 mm x 0.4 mm 立方体模型。(B) 通过将凝胶蜡与 TiO2和石墨粉末混合在一起逐渐缩放而获得的梯度幻象。(C) 多角形状的 CAD 模型.(D) 多角模型打印。图片的右下角是在前视显微镜下测量的结果。FDM 的最小打印功能为 1 毫米 (E) 在 FDM 模块中打印的立体幻象.(F) 测量结果表明,当横向尺寸大于20毫米时,尺寸变化小于1%。请点击此处查看该图的较大版本。

由自动印刷生产线制造的幻影
通过集成上述三种打印方法并遵循上述协议,生产线系统能够产生肿瘤模拟幻象。以简化的皮肤模型为例,分别采用旋转涂层、多喷墨印刷和FDM打印,分别制成不同厚度和光学特性的表皮层、真皮层和皮下组织层。因此,验证了将旋转涂层、多喷墨打印和FDM打印相结合产生光学幻象的可能性,并产生了具有模拟光学和结构特性的组织光学幻象(图5,图6)。

Figure 5
图5:用嵌入的肿瘤制造多层皮肤幻象。A) 肿瘤幻象多层结构的示意图,包括一个旋转涂层层、七个多晶波打印层(包括三个透明层和三层血管层,以及一个公共层和一个 FDM 打印肿瘤)。图片的右下角是幻像的示意图。(B) 左边的幻象有两个嵌入肿瘤,右边有一个嵌入肿瘤。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:制作多层皮肤模拟幻象。A) 在硅晶片上打印的多层皮肤幻象由旋转涂层、多喷头打印层和从上到下的 FDM 打印层组成。(B) 幻影的正面视图,其表面嵌入了血管状的凹槽。(C) 幻象横截面的微观图像,显示不同的层。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

在多层幻象的制造中,用于旋转涂层的材料是一种轻固化材料,而不是PDMS。中间层采用多喷喷印刷方法印刷,采用光固化树脂为原料。虽然在添加三丁基醇后,可通过旋转涂层进行薄 PDMS 幻像,但在多喷流打印过程中,PDMS 层无法有效地与光固化材料结合。因此,我们选择了轻固化树脂作为旋转涂层。

目前,只有两种材料可用于多喷头打印。在光固化材料中加入TiO2粉末和印度油墨模拟真皮层的光学特性,这些特性可以在未来的工作中添加到系统中。

对于 FDM 打印,在挤出前应彻底混合材料。因此,由于混合而导致的过程延迟可能比传统的 FDM 打印工艺长。在打印过程中,3D 移动平台上的基板移动也会在相应时间内延迟。要打印具有复杂形状的幻像,需要改进对延迟的控制。

肿瘤模拟幻象制造的最后一步是铸造。事实上,在喷嘴组件的设计中,使用添加的喷嘴来注入第四种材料。然而,3D移动平台的运动过程控制复杂,喷嘴可能破坏原有的肿瘤模型。这可以通过重新设计运动控制程序来改进。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了国家自然科学基金(第11002139号)和中央大学基础研究基金的支持。我们感谢科技大学的Zachary J. Smith提供音频画外音。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone aladdin H110280-500g Light initiator
http://www.aladdin-e.com/
3D printing control system USTC USTC-3DPrinter_control1.0 custom-made
github:
https://github.com/macanzhen/
3D printing system USTC USTC-3DPrinter1.0 custom-made
AcroRip color Human Plus AcroRip v8.2.6
All-in-one nozzle slicing script Shenzhen CBD Technology Co.,Ltd. github:
https://github.com/macanzhen/
Chinese Red Dye Juents Oil-soluble
Cura Ultimaker Cura_15.04.6
Gel Wax Shanghai Lida Industry Co.,ltd. LP melting point: 56 °C
Graphite aladdin G103922-100g Change object optical absorption parameters
http://www.aladdin-e.com/
PDMS Dow Corning 184
Titanium dioxide ALDRICH 24858-100G 347 nm
Triethylene glycol dimethacrylate aladdin T101642-250ml Photocured monomer
http://www.aladdin-e.com/
UV ink SLA Photopolymer Resin time80s RESIN-A http://www.time80s.com/zlxz

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References

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