Activation et quantification de l'expression génique dans les cellules de culture tissulaire infectées par Salmonella

Immunology and Infection

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Summary

Ici, nous présentons un protocole pour mesurer rapidement et facilement le facteur nucléaire kappa-light-chain-enhancer des cellules B activées (NF-B) activation dans les lignées cellulaires exprimant NF-B::luciferase reporter construit, via des mesures de la luminescence dans le lysate cellulaire. En outre, l'expression génique est déterminée par RT-qPCR isolé à partir de cellules infectées par Salmonella Typhimurium.

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Mendez, J. M., Keestra-Gounder, A. M. NF-κB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells. J. Vis. Exp. (155), e60567, doi:10.3791/60567 (2020).

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Abstract

Le facteur de transcription dimérique NF-B régule beaucoup de voies de réponse cellulaire, y compris des voies inflammatoires en induisant l'expression de diverses cytokines et chemokines. Le NF-B est exprimé de façon constitutive et est séquestré dans le cytosol par le facteur nucléaire de protéine inhibitrice de l'améliorateur de gène polypeptide léger de kappa dans l'inhibiteur de cellules B, alpha (IBMD). L'activation de la NF-B nécessite la dégradation de l'I-B, qui expose ensuite un signal de localisation nucléaire sur NF-B et favorise son trafic vers le noyau. Une fois dans le noyau, nf-B se lie à la région promotrice des gènes cibles NF-B tels que l'interleukine 6 (IL-6) et l'IL-23, pour promouvoir leur expression.

L'activation de NF-B se fait indépendamment de la transcription ou de la traduction. Par conséquent, l'état d'activation de NF-B doit être mesuré soit en quantifiant le NF-B spécifiquement dans le noyau, soit en quantifiant l'expression des gènes cibles NF-B. Dans ce protocole, les cellules poignardées transfectées avec un NF-B::luciferase reporter construction sont astomisés pour l'activation NF-B en utilisant des techniques de culture tissulaire in vitro. Ces cellules sont infectées par Salmonella Typhimurium pour activer le NF-B, qui se connecte au noyau et se lie aux sites De B dans la région de promoteur de la luciferase, induisant son expression. Les cellules sont lysées et analysées avec le système d'analyse de la luciferase. La quantité de luciferase produite par les cellules est en corrélation avec l'intensité du signal de luminescence, qui est détecté par un lecteur de plaque. Le signal de luminescence généré par cette procédure fournit une méthode rapide et très sensible pour évaluer l'activation nf-B dans une gamme de conditions. Ce protocole utilise également la transcription inverse quantitative PCR (RT-qPCR) pour détecter les niveaux relatifs d'ARNm qui sont indicatifs de l'expression de gène.

Introduction

La famille de protéines de facteur nucléaire (NF-B) est d'importants activateurs de transcription qui régulent l'expression des gènes dans diverses voies biologiques. L'activation de NF-B induit la transcription des gènes cibles, dont beaucoup sont importants pour les réponses immunitaires et inflammatoires, la prolifération cellulaire, les réponses au stress et la progression du cancer1,2. Le NF-B joue un rôle intégral dans la médiation des résultats inflammatoires précoces pour le dégagement d'agent pathogène. Étant donné les nombreux processus biologiques médiés par l'activation de la NF-B, les perturbations de sa signalisation peuvent avoir de graves conséquences sur la santé et la maladie. La perte des mutations de fonction dans la signalisation de NF-B sont associées dans plusieurs phénotypes d'insuffisance immunitaire, alors que le gain des mutations de fonction sont associés à plusieurs types de cancers, y compris les lymphomes de B-cellule et les cancers du sein3. En outre, de nombreux agents pathogènes ont été montrés pour moduler directement l'état d'activation de NF-B par l'expression des facteurs de virulence4,5,6,7.

L'activation de NF-B est connue pour être une conséquence de beaucoup de stimulus variables comprenant des produits bactériens tels que des lipopolysaccharides (LPS), de flagellin et de peptidoglycans connus sous le nom de modèles moléculaires pathogène-associés (PAMPs). Ces PAMP sont détectés par des récepteurs de reconnaissance de modèles (PRR) tels que les récepteurs de type Toll (TLR) et les récepteurs de type Nod (NLR) conduisant à l'activation de NF-B et à l'expression subséquente d'un éventail de gènes inflammatoires NF-B-dépendants8. En plus de l'activation prR par les PPM, d'autres produits bactériens, tels que les protéines effecteurs bactériens, peuvent induire l'activation de NF-B. Il est intéressant de noter que les bactéries expriment également des protéines effectrices qui atténuent activement la voie NF-B et améliorent leur pathogénicité, soulignant l'importance de NF-B en tant que médiateur essentiel de l'immunité9.

Il y a cinq sous-unités différentes qui forment les dimers NF-B ; p50, p52, RelA (p65), RelB et cRel. Les deux principaux hétérodistes NF-B sont les p50:RelA et les dimères p52:RelB. Les dimères NF-B activés se lient aux sites d'ADN, connus sous le nom de sites B, dans les régions de promoteur et d'amélioration de divers gènes cibles. Dans des conditions homéostatiques normales, nf-B interagit avec une famille de protéines inhibiteurs connues sous le nom de protéines I-B pour rester inactives. Lors de la stimulation, l'I-B est phosphorylé par I-B Kinase (IKK), ce qui lui permet d'être ciblé pour l'ubiquitination, puis la dégradation. La dégradation de l'I-B active le NF-B en révélant un signal de localisation nucléaire. NF-B se transsitue ensuite au noyau, où il lie les sites B dans la région promoteur des gènes cibles et favorise la transcription10. Ainsi, l'activation de NF-B upregulates rna expression of NF-B target genes, and this change can be measured through RNA quantification assays such as RT-qPCR11.

Plusieurs méthodes existent et sont couramment utilisées pour la mesure de l'activation NF-B, y compris les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA), la translocation nucléaire, et les essais de journaliste de gène. EMSA est utilisé pour détecter les complexes protéiques avec des acides nucléiques. Les cellules stimulées sont fractionnées pour isoler les protéines nucléaires, y compris le NF-B translocalisé, qui est ensuite incubé avec des nucléotides radio-étiquetés contenant le domaine de liaison NF-B. Les échantillons sont exécutés sur un gel et représentés par autoradiographie de 32acide nucléique étiqueté P. Si nf-B est présent dans la fraction de protéine, il liera les nucléotides, qui migreront plus lentement à travers le gel et présenteront comme bandes discrètes. Les fractions nucléaires des cellules dépourvues de NF-B activé (p. ex., les cellules témoins non stimulées) ne produiront aucune bande car les nucléotides migrent plus rapidement vers l'extrémité du gel. Un inconvénient majeur de cette méthode est qu'elle est largement quantitative au sens binaire (c.-à-d., sur ou hors) et ne capture pas adéquatement les différences significatives dans la capacité de liaison NF-B. En outre, cette méthode ne tient pas compte des structures de chromatine qui sont fonctionnellement importantes pour les gènes cibles NF-B12,13.

Semblable à la méthode précédente, il y a un «non-shift» d'assay dans lequel les plaques multi-puits sont recouvertes de nucléotides contenant la séquence de liaison NF-B. Après le traitement des cellules avec des fractions nucléaires de protéine, NF-B se liera aux nucléotides liés au puits. Des anticorps anti-NF-B sont ensuite ajoutés, qui interagiront avec le NF-B lié et produiront un signal colorimétrique proportionnel à la quantité de NF-B, indiquant le degré d'activation NF-B. Cette méthode est avantageuse par rapport à l'EMSA en ce qu'elle ne nécessite pas d'acides nucléiques radio-étiquetés et est quantitative, en comparaison. Cependant, une mise en garde de cette méthode est qu'elle ne fait pas de différence encore entre les états de chromatine des gènes cibles NF-B14.

Une autre méthode par laquelle l'activation de NF-B peut être détectée est par l'immunoprécipitation de chromatine (ChIP), par laquelle l'ADN et les protéines interagissant sont croisés avec le formaldéhyde et immunoprécipités avec des anticorps spécifiques d'anti-NF-B. Les fragments spécifiques de nucléotide sont ensuite purifiés et identifiés par amplification de PCR ou séquençage direct de haut débit. Les résultats générés par cette méthode fournissent des résultats semi-quantitatifs de l'activité de liaison NF-B avec les gènes cibles. Cependant, les résultats dépendent fortement des conditions de fixation et des processus de purification à chaque étape15.

Dans les essais de translocation nucléaire, les cellules sont stimulées pour induire l'activation de NF-B et puis fixées. Des anticorps anti-p65 sont ajoutés aux cellules fixes. Alternativement, la sous-unité p65 elle-même peut être étiquetée avec un peptide fluorescent tel que vert fluorescent vert vert vert (GFP). Dans les deux cas, l'immunofluorescence permettra l'imagerie de la localisation de p65 pour déterminer la distribution cellulaire. En mesurant la proportion de protéines localisées cytosoliques et nucléaires, les chercheurs peuvent déterminer l'état relatif d'activation de nf-B. Un inconvénient de cette méthode est que l'immunofluorescence est comparativement longue, nécessite des anticorps coûteux, et a besoin d'une expertise technique relativement plus grande16.

Les gènes Reporter sont des outils couramment utilisés pour étudier les modèles de régulation et d'expression d'un gène d'intérêt. Typiquement, les gènes de reporter sont construits à partir de la séquence de promoteur d'un gène d'intérêt fusionné à un code génétique pour une protéine facilement détectable. Les protéines ayant des activités enzymatiques, la fluorescence ou les propriétés de luminescence sont généralement choisies pour leur capacité à être astoyées et quantifiées. Ainsi, la lecture (p. ex. luminescence, fluorescence) sert de signal pour la détection de l'expression du gène. Ces constructions de reporter peuvent alors être introduites dans différents types de cellules, telles que les cellules épithéliales ou les macrophages.

Décrit dans le protocole est l'utilisation d'une lignée cellulaire clonée HeLa (HeLa 57A) qui est poignardée transfectée avec un journaliste de luciferase contenant trois copies du consensus de l'immunoglobuline-chaîne promoteur région17. L'expression de la luciferase dépend de l'activation de nf-B, qui se produit après stimulation cellulaire. Les cellules stimulées sont facilement lysées à l'aide d'un tampon de lyse cellulaire fourni dans le kit d'assay de la luciferase. Une partie du lysate cellulaire est ensuite mélangée avec un tampon d'épreuve d'assay de luciferase qui contient de la luciférine. Luciferin est le substrat de la luciférase et est nécessaire pour la génération de lumière en présence de la luciférase. Après avoir combiné le tampon d'analyse avec le lysate, la solution émettra de la lumière dans un processus connu sous le nom de luminescence. La quantité de lumière produite, donnée en lumens, est proportionnelle à la quantité de luciferase présente dans le lysate et sert de mesure de l'activation nf-B. Les lectures lumen sont interprétées par rapport à une norme non stimulée pour tenir compte de l'activité de base nf-B et le signal lui-même est stable pendant plusieurs minutes pour permettre une mesure fiable. En outre, la ligne cellulaire HeLa 57A est poignardée transfectée avec un journaliste NF---B-indépendant de galactosidase. Le journaliste de l'a-galactosidase est exprimé de façon constitutive, et l'activité de la galactosidase peut être mesurée pour contrôler la viabilité cellulaire ou la variation des nombres cellulaires17. Les valeurs de luciférase peuvent alors être ajustées aux valeurs de la galactosidase et signalées à mesure que le pli augmente sur les cellules témoins non stimulées.

Étant donné que nf-B est un facteur de transcription responsable de l'expression accrue des gènes cibles dépendants de NF-B, une expérience de suivi pour contrôler l'expression accrue de nf-B-dépend est la réaction quantitative de chaîne de polymériase de transcription inverse ( RT-qPCR). RT-qPCR est une méthode très sensible par laquelle les changements dans l'expression du gène peuvent être quantifiés sur plusieurs ordres de grandeur. Les cellules stimulées et témoins sont récoltées pour l'ARN par extraction de phénol-chloroforme. Après la séparation de phase, l'ARN est extrait comme composant principal de la couche aqueuse. L'ARN est ensuite précipité et lavé pour produire une boulette pure. Cette pastille est ensuite reconstituée et nettoyée de l'ADN contaminant par le traitement DNase. L'ARN pur est ensuite transcrit à l'envers pour créer de l'ADN complémentaire (ADNc). Cet ADNc peut ensuite être analysé par des techniques quantitatives de PCR, où l'abondance d'une séquence spécifique d'ARNm est quantifiée pour déterminer l'expression de gène. Cette technique n'élucide pas le contrôle translationnel, la modification post-traductionnelle, l'abondance des protéines ou l'activité protéique. Cependant, beaucoup de gènes, particulièrement ceux impliqués dans des processus pro-inflammatoires, sont réglés par l'intermédiaire de NF-B et leur abondance d'ARNm est indicative de leur expression.

La méthode proposée ici utilise une façon rapide et simple par laquelle l'activation NF-B peut être détectée par des essais de luminescence du lysate cellulaire. Rt-qPCR de l'expression du gène cible NF-B peut être utilisé pour quantifier l'expression de gènes particuliers, ainsi que pour valider l'activité fonctionnelle de l'activation NF-B. Les principaux avantages d'un tel système sont sa simplicité et sa vitesse, ce qui permet un contrôle à haut débit d'une gamme de conditions qui modulent l'activation NF-B. Ce protocole convient à d'autres lignées cellulaires exprimant un NF-B::luciferase journaliste, et a été démontré dans les cellules RAW264.7 transfectés poignardant18. Le temps nécessaire pour traiter les échantillons, à partir de la lyse cellulaire à la génération d'un signal de luminescence, est minime et prend la durée d'environ une heure. La mesure de NF-B ne nécessite que des équipements de laboratoire de base tels que des plaques opaques, un lecteur de plaques capable de mesurer la luminescence, et un logiciel simple d'analyse de données comme un programme de feuilles de calcul.

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Protocol

1. Passaging et ensemencement de cellules

  1. Maintenir les cellules HeLa 57A dans un flacon de 75 cm2 contenant 10 ml de la médie d'Aigle modifiée de Dulbecco (DMEM) complétée par un sérum bovin fœtal inactivé à 5 % (SGF) à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 %.
  2. Aspiratez les médias de culture cellulaire et lavez-vous avec 1 ml de la solution trypsin-EDTA de 0,05 %. Aspirez la trypsine et remplacez-la par 1 ml supplémentaire. Placer le flacon dans un incubateur de 37 oC pendant 4 à 5 min pour permettre aux cellules de se détacher du flacon.
  3. Ajouter 9 ml de support de culture cellulaire et laver doucement le fond du flacon à quelques reprises pour déloger les cellules et former une suspension homogène.
  4. Diluer les cellules HeLa 57A 1:6 ou 1:8 dans les médias frais et les graines dans de nouveaux flacons. Les cellules de passage quand elles sont confluentes à 90% ou tous les trois jours et maintiennent des cellules à un minimum de 25% de confluence.
  5. Un jour avant la stimulation cellulaire, trypsiniser les cellules HeLa 57A et suspendre dans 10 ml de support de croissance. Compter les cellules en suspension à l'aide d'un hémocytomètre et utiliser des supports de croissance pour diluer les cellules jusqu'à une concentration finale de 2,5 x 105 cellules/mL dans un tube conique de 50 ml.
  6. Transférer 250 l de suspension cellulaire (6,25 x 10cellules) sur chaque puits d'une plaque de 48 puits. Plafonner périodiquement et retourner le tube conique pour assurer une suspension cellulaire homogène. Appuyez doucement sur la plaque sur le côté pour s'assurer que les cellules se répartissent uniformément dans les puits.
  7. Transférer la plaque à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 % et permettre aux cellules de se fixer et de croître pendant la nuit.

2. Préparation des bactéries

  1. Deux jours avant l'infection, les stocks congelés de Salmonella sur des plaques d'agar LB pour produire des colonies simples. Transférer les plaques dans un incubateur réglé à 37 oC et permettre la croissance du jour au lendemain.
  2. Un jour avant l'infection, ajouter 3 mL de bouillon de lysogénie (LB) aux tubes de culture bactérienne stériles, en ajoutant les antibiotiques appropriés aux médias.
  3. À l'aide d'une boucle d'inoculation stérile, choisissez une seule colonie à partir de cultures bactériennes stries et touchez la boucle au support LB. Ponctuez les tubes après avoir inoculé et jetez la boucle.
  4. Placer les tubes dans un incubateur secouant réglé à 37 oC, 180 tr/min, et laisser pousser toute la nuit.
  5. Le jour de l'infection, récupérez les cultures bactériennes de nuit de l'incubateur.
  6. Préparer les tubes pour la sous-culture en ajoutant 3 ml de LB frais, contenant des antibiotiques le cas échéant.
  7. Transférer 30 l de la culture bactérienne de nuit (1 dilution sur 100) aux médias fraîchement préparés. Placer les tubes dans un incubateur secouant réglé à 37 oC pendant 3 h.
  8. Après l'incubation de 3 h, transférer 1 ml de bouillon de LB stérile dans une cuvette en plastique pour servir de blanc. Transférer 900 l de LB dans les autres cuvettes à utiliser pour l'analyse de l'échantillon.
  9. Transférer 100 l de sous-culture bactérienne dans une cuvette contenant 900 l de LB et de pipette plusieurs fois pour mélanger. Répétez cette opération pour chaque suspension bactérienne.
  10. Allumez le spectrophotomètre pour mesurer la densité optique (OD) des cultures bactériennes à une longueur d'onde de 600 nm (OD600).
  11. Placez le blanc dans le spectrophotomètre. Prenez note de l'orientation, car il devrait y avoir une marque vers le haut indiquant une telle.
  12. Fermez le couvercle et appuyez sur le bouton Blank sur le spectrophotomètre pour obtenir l'absorption de fond.
  13. Remplacer la cuvette vierge avec un échantillon cuvette dans la même orientation et appuyez sur Lire.
  14. Enregistrez les valeurs OD600 de ces échantillons. Multipliez la valeur par 10 pour tenir compte du facteur de dilution.
  15. Diluer la sous-culture bactérienne avec lb frais pour obtenir une valeur d'absorption d'environ 1,0, ce qui correspond à peu près à 1 x 109 cfu/mL. Diluer cette suspension 1:10 dans une cuvette et mesurer l'absorption — ce qui devrait donner une valeur de 0,1.
  16. Dans un nouveau tube, ajouter un volume approprié de la sous-culture diluée à la LB fraîche pour obtenir une suspension de 1 x 108 cfu/mL à utiliser comme inoculum.
  17. Préparer les dilutions en série de l'inoculum en transférant 50 l de suspension bactérienne à un tube contenant 450 l de PBS stérile (dilution 10 fois) jusqu'à ce qu'une dilution finale d'environ 102 cfu/mL soit faite.
  18. Transférer 100 l des deux dilutions les plus basses (102 et 103 correspondant à 10 et 100 unités de formation de colonies, respectivement) sur une plaque d'agar LB et étendre la suspension avec un épandeur cellulaire pour obtenir des colonies uniques. Transférer ces plaques dans un incubateur de 37 oC et couver toute la nuit.
  19. Le jour suivant, compter les colonies et calculer la concentration bactérienne de l'inoculum initial pour déterminer la concentration réelle d'inoculum.

3. Infection des cellules

REMARQUE: À ce stade, les cellules devraient être à environ 90% de confluence. Pour les cellules HeLa 57A dans une plaque de 48 puits, c'est environ 1 x 105 cellules par puits. Les cellules seront infectées par la multiplicité de l'infection (MOI) de 10, ou 106 cfu/well.

  1. Étiqueter le couvercle de la plaque en fonction des conditions d'infection qui seront utilisées pour chaque puits, chaque condition étant effectuée en triple.
  2. Ajouter 10 l'inoculum pour les puits appropriés. Ajouter 10 L de LB stérile aux puits témoins non infectés.
  3. Pour synchroniser le moment de l'infection, placez la plaque dans une centrifugeuse de table et faites tourner à 500 x g pendant 5 min, en veillant à ce que la plaque soit contrebalancée.
  4. Transférer les cellules infectées dans un incubateur de CO2 de 5 % à 37 oC pendant 1 h.
  5. Placez un aliquot de culture cellulaire dans un bain d'eau de 37 oC pour une utilisation à l'étape suivante.
  6. Une heure après l'infection, retirez les supports de culture cellulaire du bain d'eau et essuyez l'extérieur avec 70 % d'éthanol. Transférer la plaque de culture tissulaire à l'armoire de biosécurité.
  7. En utilisant une technique stérile, aspirez les médias des puits et remplacez-les par 250 l de supports de culture cellulaire frais et chauds.
  8. Retourner les plaques à l'incubateur de CO2 de 5 % à 37 oC pour 4 h supplémentaires.
  9. Retirer les plaques de l'incubateur CO2 et aspirer les supports des puits. Pour l'analyse de la luciférase continuer à l'étape 4.1. Pour l'isolement de l'ARN procéder à l'étape 5.1.

4. Analyse Luciferase

  1. Ajouter 100 l de tampon de lyse cellulaire 1x dans les puits. Le tampon peut d'abord être dilué à une concentration de travail, selon le réactif.
  2. Transférer la plaque dans un congélateur de -80 oC et couver pendant au moins 30 min pour assurer une lyse cellulaire efficace.
  3. Placez la plaque contenant du lysate de cellules congelés sur un banc pour décongeler et préparer les réactifs de substrat de luciferase selon les recommandations du fabricant.
  4. Laisser les réactifs de substrat de luciferase pour l'équilibre à la température ambiante.
  5. Allumez le lecteur de plaque et ouvrez le programme de lecteur correspondant. Définir la machine pour mesurer la luminescence.
  6. Transférer 10 lde de chaque échantillon dans un puits d'une plaque opaque de 96 puits.
  7. Ajouter 50 l de réagent d'assay Luciferase à l'aide d'une pipette multicanal à chaque puits de la plaque opaque.
  8. Appuyez doucement sur la plaque sur le côté pour mélanger les puits et assurez-vous que la surface inférieure est recouverte de liquide. Placez la plaque dans un lecteur de plaque et amorcez la lecture.
  9. Copiez les valeurs de luminescence dans un programme de feuilles de calcul et tracez les résultats.

5. Isolation de l'ARN

  1. Ajouter 500 l de thiocyanate de guanidium à chaque puits et pipette de haut en bas plusieurs fois pour assurer une lyse complète.
  2. Transférer le contenu dans un tube de microcentrifuge étiqueté. Maintenir les échantillons sur la glace autant que possible pour maintenir la qualité de l'ARN.
  3. Fixer une centrifugeuse de table à 4 oC et maintenir la centrifugeuse à cette température pour le reste du protocole.
  4. À chaque tube d'échantillon, ajouter 100 l de chloroforme, bien fassez et secouez pendant 15 s. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
  5. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC. Pendant ce temps, préparez-vous à la prochaine étape de la purification de l'ARN en étiquetant de nouveaux tubes.
  6. Transférer la phase aqueuse supérieure vers le nouveau tube contenant 250 l d'isopropanol, en prenant soin de ne pas déranger les couches moyennes ou inférieures.
  7. Conservez les produits inutilisés dans un congélateur de -80 oC, qui peut également être utilisé pour l'analyse des protéines. La couche aqueuse résiduelle peut également servir de sauvegarde si l'ARN est nécessaire plus tard.
  8. Vortex le mélange de couche aqueuse et d'isopropanol et permettre aux échantillons de s'asseoir à température ambiante pendant 10 min.
  9. Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 10 min à 4 oC.
  10. Retirer les tubes de la centrifugeuse. Le précipitate de l'ARN forme une boulette blanche sur le côté et le bas du tube. Ouvrez les tubes et retirez soigneusement le supernatant en versant dans un récipient à déchets.
  11. Laver le granule d'ARN en ajoutant 500 l de 75 % d'éthanol et de vortex.
  12. Centrifugeuse à 8 000 x g pendant 5 min à 4 oC.
  13. Retirer le supernatant en versant et laver à nouveau le granule avec 75% d'éthanol.
  14. Centrifugeuse à 8 000 x g pendant 5 min à 4 oC.
  15. À l'aide d'une pipette à petit volume (p. ex., 10-200 'L volume), aspirer autant que possible du supernatant, en prenant soin de ne pas pousser de liquide dans le tube ou de déloger la pastille avec la pointe de la pipette. Si le granule est délogé, centrifugeuse brièvement et à nouveau essayer d'enlever supernatant.
    1. Séchez à l'air les granulés d'ARN. Si les granulés sont visibles pour n'importe quel échantillon, vérifiez périodiquement (toutes les 5 minutes) s'ils passent du blanc au clair, ce qui indique qu'ils sont secs. Une fois que les granulés commencent à se dégager, ajouter 20 l d'eau libre ultrapure et RNase pour dissoudre l'ARN.
    2. Si les granulés n'étaient pas initialement visibles pour les échantillons, il suffit d'ajouter de l'eau ultrapure 5 min après avoir enlevé le supernatant.
  16. Pour augmenter la solubilité, passer la solution à quelques reprises à travers une pointe de pipette et incuber pendant 10 min à 55-60 oC.

6. DNase Traitement de l'ARN

  1. Pour maintenir l'intégrité de l'ARN, entreposez les échantillons d'ARN sur la glace, sauf indication contraire. À ce moment-là, le tampon 10x DNase peut être retiré du congélateur et laissé décongeler sur la glace.
  2. Préparer le spectrophotomètre pour l'analyse de l'échantillon en nettoyant toutes les surfaces d'analyse de l'échantillon avec un chiffon sans matière de résine.
  3. Prenez une mesure de fond avant l'analyse. Pour ce faire, chargez le capteur avec 1,5 l de la même eau ultrapure utilisée pour dissoudre les granulés d'ARN. Appuyez sur le bouton Lire blanc pour générer une lecture de fond.
  4. Utilisez le chiffon sans matière de lait pour essuyer la surface de chargement de l'échantillon de l'instrument. Répétez cette étape après chaque lecture d'échantillon.
  5. Chargez 1,5 L d'ARN rechargé au titulaire de l'échantillon et sélectionnez L'échantillon. Répétez l'opération jusqu'à ce que tous les échantillons aient été lus.
  6. Préparer le mix maître DNase en combinant 2,4 L de tampon DNase 10x et 1 L de DNase, par échantillon, dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Préparer le mix maître pour deux volumes supplémentaires.
  7. Mélanger le mélange maître en faisant glisser le tube plusieurs fois. Brièvement centrifuger le tube pour recueillir le contenu au fond du tube. Ajouter 3,4 l de mastermix à 20 l d'échantillon d'ARN. Mélanger le contenu en clignotant et la centrifugeuse brièvement, comme avant.
  8. Transférer les échantillons dans un bloc de chaleur réglé à 37 oC pendant 20 min. Retirer le réactif d'inactivation de DNase du congélateur et décongeler à température ambiante.
  9. 20 min après avoir placé des échantillons sur le bloc chauffant, transférer les échantillons sur un support à tube placé sur le banc de travail.
  10. Vortex doucement le contenu du réactif d'inactivation DNase. Transférer 2,6 L de réactif d'inactivation DNase dans les tubes contenant de l'ARN, puis faire glisser les tubes pour créer un mélange homogène.
  11. Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 1 min.
  12. Soigneusement pipette le supernatant à un nouveau tube étiqueté.

7. Transcription inversée de l'ARNm à l'ADNc

  1. Préparer un mélange maître en fonction de la quantité d'échantillons plus deux supplémentaires pour tenir compte de la perte par pipetting (tableau 1). Utilisez 1 g d'ARN et ajoutez H2O à un volume de 50 OL au total.
Réactif Volume (L) Concentration finale
MgCl2 (25mM) 3.5 1,75 mM
Tampon de transcription inversée (10x) 5 1x 1x
mix dNTP (10 M, chacun) 2.5 500 nm
hexamer aléatoire (100 M) 1.25 2,5 M
Transcriptase inverse multiscribe (50 U/L) 1 1 U/L
Inhibiteur de la NAse (20 U/L) 1.25 1.25 U/L
ARN (1 g) 20 ng/uL
H2O recharger jusqu'à 50

Tableau 1 : Composants et recette pour le mélange maître de transcription inversée.

  1. Cassez les échantillons hermétiquement et étiquetez les tubes PCR sur le côté car les étiquettes sur le couvercle peuvent être retirées du couvercle chauffé du thermocycleur plus tard. Mélanger par un vortex.
  2. Centrifuger brièvement les tubes PCR pour recueillir des échantillons au fond du tube.
  3. Placez les tubes PCR dans un thermocycler et exécutez les échantillons dans les paramètres suivants :
    25 oC pendant 10 min, 48 oC pour 30 min, 95 oC pendant 5 min, puis tenir à 10 oC.
  4. Transférer les tubes contenant de l'ADNc nouvellement synthétisé dans un congélateur de -20 oC ou l'utiliser immédiatement dans l'analyse qPCR.

8. Préparation et chargement de la plaque pour l'analyse RT-qPCR

  1. Avant de commencer, planifiez la configuration de la plaque qPCR de 384 puits pour l'analyse de l'échantillon.
  2. Décongeler les amorces et l'ADNc sur la glace.
  3. Préparer un mix maître (voir tableau 2), plus environ 10 % de plus pour tenir compte de la perte par pipetting.
Réactif Volume (L)
10 M F apprêt 1
10 M R apprêt 1
Ultrapure H2O 4
2x SYBR vert 10

Tableau 2 : Composants et recette pour le mélange maître qPCR.

  1. Vortex le mélange maître et distribuer 8 L dans les puits de la plaque de 384 puits à l'aide d'une pipette répétiteur. Les échantillons seront analysés en double pour chaque combinaison d'échantillons d'amorce et d'ADNc.
  2. À l'aide d'une pipette P10 (ou plus petite), transférer 2 ll d'ADNc pour dupliquer les puits pour chaque ensemble d'amorce à analyser. Remplacer les pointes après chaque puits pour éviter la contamination croisée.
  3. Scellez la plaque en appliquant soigneusement le film adhésif à la surface, en veillant à ce que tous les puits soient couverts. Appuyez sur le film à l'aide d'une pagaie ou d'un rouleau d'étanchéité pour sceller fermement.
  4. Placer la plaque dans une centrifugeuse, avec une assiette vide comme contrepoids. Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 5 min.

9. Exécution du Thermocycler pour l'analyse qPCR

  1. Puissance sur l'ordinateur et l'instrument PCR en temps réel.
  2. Ouvrez le logiciel RT-qPCR et sélectionnez nouvelle expérience.
  3. Sous l'onglet Configuration, sélectionnez Propriétésd'expérience , où les paramètres de l'exécution peuvent être défini.
  4. Définissez le nom de l'expérience, qui définira le nom du fichier et les paramètres utilisés pour stocker les résultats.
  5. Pour la sélectiond'instruments , sélectionnez l'instrument actuellement connecté qui exécutera l'analyse. Sélectionnez la méthode d'exécution comparative de CT (Ct).
  6. Sélectionnez SYBR Green Reagents comme colorant d'ADN fluorescent à utiliser et Standard comme vitesse de rampe.
  7. Assurez-vous que la case à côté de la courbe de fusion inclut est cochée.
  8. Sous l'onglet Définir, attribuer des cibles (c.-à-d. des gènes à amplifier) et des échantillons (c.-à-d. des conditions expérimentales).
  9. Sélectionnez l'onglet Assign. Étiquetez les puits avec les cibles et les échantillons appropriés, car ils correspondent au schéma de chargement de la plaque de 384 puits.
  10. Sélectionnez La méthode d'exécution. Utiliser les paramètres pour l'analyse énumérés dans (tableau 3).
Tenir l'étape Scène PCR Étape de courbe de fonte
Étape 1 Étape 2 Étape 1 Étape 2 Étape 1 Étape 2 Étape 3
Temp 50 oC 95 oC 95 oC 60 oC 95 oC 60 oC 95 oC
Temps 2:00 10:00 0:15 1:00 0:15 1:00 0:15
Collecte de données Oui Oui
Nombre de cycles 1x 1x 40x 40x 1x 1x

Tableau 3 : Paramètres de cycle pour thermocycler.

  1. Placez la plaque de 384 puits dans le thermocycleur et commencez l'analyse.

10. Analyse des résultats qPCR avec la méthode Delta-delta Ct (2- Ct)

  1. Analyser les résultats générés par la réaction qPCR pour les erreurs qui peuvent interférer avec l'analyse en aval. De nombreuses erreurs seront signalées automatiquement par le système.
  2. Pour les amorces bien construites, les courbes de fonte ne devraient avoir qu'un seul pic. Exclure les puits contenant une courbe de fonte avec plus d'un pic d'une analyse plus approfondie.
  3. Exportez les valeurs Ct vers un programme de feuilles de calcul pour analyser les données à l'aide de la méthode de la CT. Un format suggéré est fourni (tableau 4). La dernière colonne est le changement d'expression de pli de l'échantillon, par rapport aux échantillons témoins.
Gène d'entretien ménager (GAPDH) Gène d'intérêt (IL6)
Ct1 (en) Ct2 Ave Ct Ct1 (en) Ct2 Ave Ct Ct Ave Ct ctrls Ct 2 ans et plus (Ct) Géomoyenne
Contrôle 1 15.33 15.37 15.35 26.81 26.91 26.86 11.51 10.51 1.00 0.50 1.00
Contrôle 2 16.83 16.77 16.80 26.89 26.92 26.91 10.11 10.51 -0.41 1.33
Contrôle 3 17.56 17.53 17.54 27.38 27.56 27.47 9.93 10.51 -0.59 1.50
Sl1344 1 Annonces 15.50 15.41 15.45 22.15 22.13 22.14 6.69 10.51 -3.83 14.21 13.23
SL1344 2 Annonces 16.02 15.98 16.00 23.01 22.96 22.98 6.98 10.51 -3.53 11.57
SL1344 3 Annonces 17.27 17.30 17.28 23.99 23.98 23.98 6.70 10.51 -3.82 14.09
sipA sopB sopE2 1 Annonces 15.38 15.41 15.39 23.31 23.09 23.20 7.80 10.51 -2.71 6.56 7.29
sipA sopB sopE2 2 16.01 16.05 16.03 23.89 23.92 23.91 7.88 10.51 -2.64 6.23
sipA sopB sopE2 3 16.78 16.78 16.78 24.02 24.06 24.04 7.27 10.51 -3.25 9.49
sipA sopB sopE2 sopE 1 15.52 15.60 15.56 27.04 27.03 27.03 11.47 10.51 0.96 0.51 0.79
sipA sopB sopE2 sopE 2 15.56 15.59 15.57 26.37 26.42 26.39 10.82 10.51 0.31 0.81
sipA sopB sopE2 sopE 3 15.91 15.92 15.91 26.24 26.12 26.18 10.27 10.51 -0.25 1.19

Tableau 4 : Format d'analyse des données qPCR.

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Representative Results

Le soute décrit ici se concentre sur l'activation du facteur de transcription NF-B à l'aide d'un journaliste de luciferase NF-B-dépendant qui est poignardétranscé dans une ligne de cellules HeLa. Le NF-B activé se transloque au noyau où il lie les sites de liaison de B des gènes cibles, y compris les cytokines pro-inflammatoires IL6 et IL23. Un aperçu général de l'activation NF-B est représenté à la figure 1. La bactérie gram-négative Salmonella enterica serovar Typhimurium a été utilisée dans cette étude comme activateur de NF-B et expression ultérieure de l'IL6 (figure 2). L'un des principaux facteurs de virulence requis pour la pathogénie est le système de sécrétion de type III-1 (T3SS-1) qui permet S. Typhimurium pour infecter les cellules et induire l'activation de NF-B. La fonction du T3SS-1 est de fournir des protéines bactériennes, appelées effecteurs, dans les cellules hôtes. Ici, les protéines effectrices ciblent de nombreuses voies de signalisation cellulaire pour assurer l'invasion des cellules épithéliales de l'hôte. L'activation NF-B induite par S. Typhimurium est principalement dépendant des protéines effectrices T3SS-1 SopE, SipA, SopB et SopE218. Ici, les cellules HeLa 57A ont été infectées par le type sauvage S. La souche de typhimurium SL1344 et deux souches mutantes dépourvues de trois (SipA, SopB, SopE2) ou quatre (SipA, SopB, SopE2, SopE) protéines effectrices. La figure 2 est une expérience représentative de l'activation de la luciferase dépendante du FN(figure 2A) et de l'expression du gène IL6 (Figure 2B) dans les cellules HeLa 57A infectées par le S. Typhimurium souches. L'infection par la souche sauvage SL1344 induit un signal de luciferase fort qui est diminué dans les cellules infectées par le triple mutant SipA, SopB, SopE2 triple (réponse dépendante de SopE), et réduite à des niveaux de contrôle avec le SipA, SopB, SopE2, SopE quadruple mutant. Les unités de luminescence relative (RLU) sont en corrélation avec les niveaux d'expression IL6 (figure 2). La figure 3 représente les résultats générés par l'analyse RT-qPCR.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de l'activation NF-B et des lectures en aval. Décrit ci-dessus, le NF-B est conservé dans le cytosol dans un état inactif par la protéine inhibitrice IB. Les stimuli internes et externes peuvent contribuer à l'activation de l'IKK, qui phosphorylère l'I-Bet et provoque sa dégradation protéosomal ultérieure. La dégradation de l'I-B md révèle le signal de localisation nucléaire de NF-B, qui favorise la translocation. Dans le noyau, le NF-B activé se lie aux sites de liaison B des gènes cibles, favorisant leur transcription et leur expression. Les gènes cibles, tels que les cytokines IL6 et IL23, sont exprimés et quantifiés via RT-qPCR. Dans HeLa 57A cellules luciferase est exprimée après l'activation nf-B, qui peut être quantifiée par des essais de luminescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Données représentatives de l'analyse de la luminescence et de l'analyse RT-qPCR après S. Infection au typhimurium des cellules HeLa 57A. 1 x 105 cellules HeLa 57A ont été infectées par 106 cfu (MOI 10) de la phase S du journal. Typhimurium sauvage type SL1344, ou les souches mutantes dépourvues de SipA, SopB et SopE2, et SipA, SopB, SopE2 et SopE. Après 1 h, les médias ont été remplacés et l'incubation s'est poursuivie pendant quatre heures supplémentaires. (A) Les cellules ont été traitées pour l'expression de la luciferase par des essais de luminescence. (B) Des cellules ont été extraites de l'ARN, qui a été employé pour l'analyse de RT-qPCR. L'expression relative des gènes cibles à l'aide de la méthode Delta-delta Ct (2-Ct)est montrée. L'écart moyen et standard des puits triplelicate s'affiche. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Résultats sommaires générés par l'analyse RT-qPCR. (A) Une parcelle d'amplification est montrée pour les puits amplifiant GAPDH des cellules de HeLa 57A infectées par S. Typhimurium. (B) La parcelle de courbe de fonte des puits contenant des amorces GAPDH montre un pic de fonte unique correspondant à environ 84 oC. (C) Des puits en double contenant des amorces pour IL-6. L'un des puits affiche un deuxième pic de fonte, tel que indiqué par une flèche noire, et devrait être exclu de l'analyse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La principale contribution du protocole décrit est qu'il fournit une méthode rapide et facile pour détecter l'activation NF-B dans les cellules, ce qui permet une analyse à haut débit de multiples conditions de stimulation ou de médicaments affectant l'activation NF-B. Ici, nous décrivons un protocole pour l'activation de NF-B dansles cellules De Lal Salmonella-infectées. Ces cellules peuvent être utilisées pour l'infection par d'autres agents pathogènes ainsi pour étudier l'impact de l'infection bactérienne sur l'activation NF-B. En outre, l'activation de la luciférase NF-B-dépendante dans les cellules HeLa 57A peut être utilisée pour dépister les activateurs ou les inhibiteurs des voies de signalisation menant à l'activation NF-B. Ici, nous entérons des cellules HeLa 57A dans des plaques de 48 puits, mais ces expériences peuvent être agrandis jusqu'à 96 et même 384 puits pour permettre plus d'échantillons par expérience. Les cellules HeLa 57A expriment constitutivement LacZ, qui peut être mesurée comme un contrôle interne pour le nombre de cellules et la viabilité à l'aide d'analyses de la gal. Le protocole décrit ici est applicable pour une utilisation dans les lignées cellulaires, soit de façon stable ou transitoirement transfectée avec un NF-B::luciferase reporter construire. La lignée de cellules macrophages RAW264.7 a déjà été utilisée à cette fin18. Fait important, cette méthode ne fait pas de distinction entre l'activation des différents homo/hétérodimères des cinq sous-unités distinctes de NF-B. Les différents complexes d'homo-hétérophonie NF-B ont des affinités différentes pour les séquences de promoteurs, ainsi que des conséquences transcriptionnelles différentes21. Il est possible que l'activation d'un dimère NF-B spécifique soit manquée en utilisant le journaliste décrit ici en raison de la faible affinité de liaison aux sites de liaison de l'immunoglobuline de la chaîne d'immunoglobuline.

Il est important de noter que les conditions propices à la stimulation d'une lignée cellulaire peuvent ne pas s'appliquer directement à une autre. Par conséquent, il est fortement recommandé que les conditions d'assay soient optimisées dans chaque système d'assay. Le temps de l'infection, le MOI, la durée du traitement médicamenteux, la dose de drogue et les conditions d'ensemencement sont tous des considérations importantes à prendre en compte lors de l'évaluation de l'activation de la NF-B. Par exemple, les macrophages RAW264.7 sont plus sensibles à l'infection à Salmonella nécessitant différentes conditions pour produire un signal de luminescence similaire comme on le voit avec les cellules HeLa 57A18.

Pendant les mesures de luminescence, il n'est pas rare que les puits de bord aient des valeurs considérablement différentes de celle des autres puits qui ont été stimulés de la même façon. Cela est généralement dû à des taux d'évaporation plus élevés des puits de bord sur la plaque conduisant à une concentration accrue de drogues. Ceci peut être résolu en ajoutant des milieux sans sérum à l'espace entre les puits, pour les plaques qui le permettent, en modifiant les combinaisons couvercle/plaque pour réduire l'évaporation, ou en omettant complètement les puits de bord si des problèmes persistent.

Exprimée dans les cellules des mammifères, luciferase luciferase luciferase luciferase a une demi-vie de plusieurs heures et est généralement considéré comme stable aux fins de la plupart des essais journaliste22. Des durées de traitement plus longues que celles décrites ici peuvent être effectuées de manière fiable. Cependant, le système d'analyse de luciferase utilisé ici produit un signal stable seulement pour la première minute et se détériore rapidement après cela. Par conséquent, il est très important que la mesure de luminescence soit faite rapidement après mélange de lysate cellulaire et de substrat.

Nf-B est un facteur de transcription pour un large éventail de gènes, y compris les cytokines et les chimiokines (c.-à-d., Il6 et Il23). La mesure de l'activité de luciférase dépendante du FN ne signifie pas nécessairement que ces cytokines et chemokines sont exprimées. Cette méthode peut compléter les techniques de quantification moléculaire existantes en servant de premier écran potentiel pour la caractérisation des conditions affectant l'activité NF-B, qui peuvent ensuite être validées fonctionnellement par RT-qPCR. La validation fonctionnelle de l'activation de NF-B peut également être effectuée par l'analyse occidentale de tache ou des essais fonctionnels spécifiques à une protéine d'intérêt dans les cas où la quantification d'ARNm peut ne pas être appropriée. C'est le cas de l'interleukine-bêta (Il1b), un gène dont la transcription est induite par la liaison NF-B, mais le produit protéique nécessite une modification post-traductionnelle pour former le produit mature23,24.

Le protocole d'isolement spécifique de l'ARN décrit ici n'est pas le seul qui peut être utilisé pour une utilisation dans l'analyse RT-qPCR, et d'autres méthodes préférées, telles que les kits disponibles dans le commerce, peuvent plutôt être utilisées. Il est important de noter que la qualité de l'ARN est très importante pour le processus et donc l'ARN doit être maintenu sur la glace autant que possible pour prévenir la dégradation. Il est important d'exécuter des réactions en double dans les réactions RT-qPCR pour s'assurer que les réactions PCR sont cohérentes, car la pipetting de ces petits volumes lors du chargement de la plaque de 384 puits peut souvent être une cause d'erreur. Les valeurs de Ct du gène d'entretien ménager devraient être cohérentes entre les échantillons, et les déviations de ceci peuvent être indicatives des étapes de nettoyage inefficaces ou des écarts dans des concentrations d'ARN pendant la transcription inverse qui peuvent affecter les résultats finaux. Il est également important de vérifier la courbe de fonte après chaque expérience qPCR. La présence d'un pic suggère que les amorces qPCR amplifient un seul gène. Les courbes multiples suggèrent qu'il y a une amplification de gène hors cible ou la présence des diététistes d'apprêt. Dans les deux cas, plusieurs pics présents dans la courbe de fonte suggèrent que les amorces devraient être redessinées pour assurer la spécificité. Avec tant de place pour la variabilité, l'exercice et le raffinement d'une bonne technique à chaque étape sont essentiels pour générer des résultats précis et reproductibles.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

La recherche dans le laboratoire Keestra-Gounder est soutenue par des subventions du NIAID des NIH sous le numéro de récompense R21AI122092 et de l'American Diabetes Association sous le numéro de prix 1-18-JDF-035.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive film VWR International 60941-070
Chloroform Fisher Bioreagents C298-500
DMEM Thermo Fisher 11665092
DNAse treatment kit Qiagen 79254
dNTPs Promega U1511
Ethanol Fisher Bioreagents BP2818100 molecular grade
FBS Sigma-Aldrich F0926
HeLa 57A cells Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Isopropanol Fisher Bioreagents BP26181
Kanamycin Fisher Bioreagents BP906-5
LB agar Fisher Bioreagents BP1425-500
Lysogeny broth Fisher Bioreagents BP1426-500
MgCl2 Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000 Thermo Scientific spectrophotometer
Promega luciferase assay system Promega E1501 Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers Thermo Scientific SO142
Real-time GAPDH forward primer 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC
AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer 5-'CCCACTCCTCCACCT
TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC
TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG
GCTG-3'
Reverse Transcriptase Applied Biosystems 4308228
RNAse inhibitor Thermo Scientific EO0381
RT buffer Promega A3561
SL1344 Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 Ref # 18
SYBR green Applied Biosystems 4309155 2x mastermix
Tri-reagent Molecular Research Center TR 118 guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA Thermo Fisher 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Ultrapure water Fisher Bioreagents BP248450
Well plate for PCR VWR International 89218-294 384-well plate

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References

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