आंत-होमिंग नियामक टी सेल इंडक्शन के वीवो आवर्धन में

Immunology and Infection

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Summary

यहां हम आंत-होमिंग नियामक टी सेल इंडक्शन के वीवो वृद्धि में एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, डेंग्ड्रिटिक कोशिकाओं को स्थानीय रूप से सक्रिय विटामिन डी (1,25-डाइहाइड्रोक्सिविटामिन डी या 1,25 [ओह]2डी) और सक्रिय विटामिन ए (रेटिनोइक एसिड या आरए) डी नोवो की उच्च सांद्रता का उत्पादन करने के लिए इंजीनियर किया जाता है।

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Bi, H., Wasnik, S., Baylink, D. J., Liu, C., Tang, X. In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction. J. Vis. Exp. (155), e60585, doi:10.3791/60585 (2020).

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Abstract

भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट (आंत) में एक भड़काऊ पुरानी बीमारी है। संयुक्त राज्य अमेरिका में, लगभग 1.4 मिलियन आईबीडी रोगी हैं। आम तौर पर यह स्वीकार किया जाता है कि आंत बैक्टीरिया के लिए एक डिसविनियमित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रोग शुरू करती है और म्यूकोसल एपिथेलियल बाधा को बाधित करती है। हम हाल ही में बताते है कि आंत-homing नियामक टी (Treg) कोशिकाओं IBD के लिए एक आशाजनक चिकित्सा कर रहे हैं । तदनुसार, यह लेख आंत-होमिंग ट्रेग सेल इंडक्शन के वीवो वृद्धि में एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल में, डेंड्रिटिक कोशिकाओं को दो अणुओं डी नोवो, सक्रिय विटामिन डी (1,25-डाइहाइड्रोक्सीविटामिन डी या 1,25 [ओह]2डी) और सक्रिय विटामिन ए (रेटिनोइक एसिड या आरए) की स्थानीय रूप से उच्च सांद्रता का उत्पादन करने के लिए इंजीनियर किया जाता है। हमने पिछले निष्कर्षों के आधार पर 1,25 (ओह)2डी और आरए को चुना जो दिखारहा है कि 1,25 (ओह)2डी नियामक अणुओं (जैसे, फोर्हेड बॉक्स पी 3 और इंटरल्यूकिन-10) की अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है और आरए टी कोशिकाओं में आंत-होमिंग रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति को उत्तेजित कर सकता है। इस तरह के इंजीनियर डेंड्रिटिक कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए, हम दो जीन को ओवर्ड्यू करने के लिए डेंग्ड्रिटिक कोशिकाओं को पार करने के लिए एक लेंटिवायरल वेक्टर का उपयोग करते हैं। एक जीन साइटोक्रोम P450 परिवार 27 उपपरिवार बी सदस्य 1 है कि 25 हाइड्रोक्सीविटामिन डी 1α-हाइड्रोक्सीलेस, जो शारीरिक रूप से 1,25 (ओह)2डी के संश्लेषण उत्प्रेरक एनकोड है । दूसरा जीन एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 1 परिवार के सदस्य ए 2 है जो रेटिनाल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 2 को एन्कोड करता है, जो शारीरिक रूप से आरए के संश्लेषण को उत्प्रेरक करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग वीवो में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं की भविष्य की जांच के लिए किया जा सकता है।

Introduction

भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट (आंत) में एक भड़काऊ पुरानी बीमारी है। संयुक्त राज्य अमेरिका में, लगभग 1.4 मिलियन आईबीडी रोगी हैं। आम तौर पर यह स्वीकार किया जाता है कि आंत के बैक्टीरिया के प्रति एक डिसरेक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रोग शुरू करती है और म्यूकोसल एपिथेलियल बैरियर1,2को बाधित करती है । इस कारण से, वर्तमान में उपलब्ध अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) - अनुमोदित दवाएं भड़काऊ मध्यस्थों के कार्यों को रोकती हैं या प्रतिरक्षा कोशिकाओं की होमिंग को आंत में अवरुद्ध करती हैं। हालांकि, लक्षित किए गए भड़काऊ मध्यस्थ और प्रतिरक्षा कोशिकाएं प्रतिरक्षा सुरक्षा के लिए भी आवश्यक हैं। नतीजतन, भड़काऊ मध्यस्थ अवरोधक प्रणालीगत प्रतिरक्षा रक्षा से समझौता करते हैं और प्रतिरक्षा सेल होमिंग ब्लॉकर्स आंत प्रतिरक्षा रक्षा को कमजोर करते हैं, जिनमें से दोनों गंभीर परिणाम3,4का कारण बन सकते हैं। इसके अलावा, प्रतिरक्षा सेल होमिंग ब्लॉकर्स भी नियामक टी (Treg) कोशिकाओं के पेट में होमिंग ब्लॉक कर सकते है और इसलिए IBD रोगियों में पहले से ही समझौता आंत प्रतिरक्षा सहिष्णुता खराब कर सकते हैं । इसके अलावा, पेट में ट्रेग सेल होमिंग को अवरुद्ध करने से रक्त5में ट्रेग कोशिकाओं के संचय के कारण प्रणालीगत प्रतिरक्षा दमन भी हो सकता है। अंत में, अवरोधक और ब्लॉकर्स क्षणिक रूप से कार्य करते हैं और इस तरह, लगातार प्रशासन की आवश्यकता होती है। इन अवरोधकों और ब्लॉकर्स का लगातार प्रशासन अप्रिय दुष्प्रभावों को और बढ़ा सकता है।

हाल ही में, हमने एक उपन्यास रणनीति का प्रस्ताव किया जो आईबीडी उपचार6के लिए वर्तमान दवाओं से जुड़े दुष्प्रभावों को संभावित रूप से कम या खत्म कर सकती है। यह रणनीति पेरिफेरल लिम्फोइड ऊतकों6में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं को शामिल करने को बढ़ाती है। इस रणनीति का तर्क यह है कि आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाएं विशेष रूप से आंत के घर हैं और इसलिए प्रणालीगत प्रतिरक्षा सुरक्षा से समझौता नहीं करेंगे। इसके अलावा, चूंकि रेग कोशिकाएं संभावित रूप से स्मृति7,8,आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाएं संभावित रूप से आईबीडी रोगियों में पुरानी आंत सूजन का स्थिर नियंत्रण प्रदान कर सकती हैं और इस प्रकार, उपचार को अक्सर प्रशासित करने की आवश्यकता नहीं होनी चाहिए। इसके अलावा, चूंकि यह रणनीति वीवो में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं को शामिल करने में वृद्धि करती है, इसलिए इसमें एक अत्यधिक भड़काऊ वातावरण में वीवो अस्थिरता की चिंता नहीं है जो इन विट्रो जनित ट्रेग कोशिकाओं9,10के दत्तक हस्तांतरण से जुड़ा हुआ है। इस संबंध में, इन विट्रो जनित ट्रेग कोशिकाएं ऑटोइम्यून रोगों11,12,13 और प्रत्यारोपण अस्वीकृति 14,15के उपचार के लिए प्रस्तावित रणनीतियों में से एक हैं। अंत में, इस रणनीति में, डेंड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी) को दो अणुओं डी नोवो की स्थानीय रूप से उच्च सांद्रता का उत्पादन करने के लिए इंजीनियर किया जाता है: सक्रिय विटामिन डी (1,25-डाइहाइड्रोक्सीविटामिन डी या 1,25 [ओह]2डी) और सक्रिय विटामिन ए (रेटिनोइक एसिड या आरए)। हमने 1,25 (ओह)2डी और आरए को चुना क्योंकि 1,25 (ओह)2डी नियामक अणुओं की अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है (उदाहरण के लिए, फोर्कहेड बॉक्स पी 3 [foxp3] और interleukin-10 [आईएल-10])16,17 और आरए टी सेल18में आंत-होमिंग रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति को उत्तेजित कर सकता है । क्योंकि 1,25 (OH)2डी और आरए दोनों ही डीसी28, 29को भी टॉलराइज कर सकते हैं, हमारा कारण है कि इंजीनियर डीसी को वीवो में एक सहरोगी स्थिति में बनाए रखा जाएगा और इसलिए वीवो अस्थिरता चिंताओं को दरकिनार कर दिया जाएगा जो इन विट्रो जनित टॉरोजेनिक डीसी (टॉलडीसी)19,20,21से जुड़े हुए हैं । इस संबंध में, टोलडीसी भी ट्रेग सेलकार्यों 19,20,21के वीवो संवर्धन में प्रस्तावित रणनीतियों में से एक हैं। हमारे तर्कों का समर्थन करने के लिए, हमने दिखाया है कि वीवो डिलीवरी में इंजीनियर डीसी, पेरिफेरल लिम्फोइड ऊतकों6में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं के शामिल होने को बढ़ा सकते हैं।

हमारी प्रस्तावित रणनीति का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि 1,25 (ओह)2डी में अन्य कार्य भी हैं जो आईबीडी रोगियों को संभावित रूप से लाभान्वित कर सकते हैं। इन अन्य कार्यों में एंटीमाइक्रोबियल्स22 के स्राव को प्रोत्साहित करने और कार्सिनोजेनेसिस23को दबाने के लिए 1,25 (ओह)2डी की क्षमता शामिल है। संक्रमण और कैंसर अक्सर आईबीडी24,25से जुड़े होते हैं .

डीसी है कि दोनों 1,25 (OH)2डी और RA de novo के स्थानीय रूप से उच्च सांद्रता का उत्पादन कर सकते है उत्पंन करने के लिए, हम दो जीन को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए डीसी इंजीनियर करने के लिए एक लेंटिवायरल वेक्टर का उपयोग करें । एक जीन साइटोक्रोम P450 परिवार 27 उपपरिवार बी सदस्य 1 (CYP27B1) है जो 25-हाइड्रोक्सीविटामिन डी 1α-हाइड्रोक्सीलेस (1α-हाइड्रोक्सीलास) को एन्कोड करता है, जो शारीरिक रूप से 1,25 (ओह)2डी के संश्लेषण को उत्प्रेरक करता है। दूसरा जीन एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 1 परिवार के सदस्य A2 (ALDH1a2) है जो रेटिनाल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 2 (RALDH2) को एन्कोड करता है, जो शारीरिक रूप से आरए6के संश्लेषण को उत्प्रेरक करता है।

क्योंकि आंत के वीवो वृद्धि में-homing Treg सेल प्रेरण आईबीडी के उपचार में संभावित रूप से महत्वपूर्ण है, निम्नलिखित प्रोटोकॉल में हम 1α-hydroxylase-RALDH2-overexpressing डीसी (डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं) की पीढ़ी के लिए प्रक्रियाओं का विस्तार करेंगे कि वीवो में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं की भविष्य की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

वीवो एनिमल स्टडी प्रोटोकॉल में सभी की समीक्षा की गई और लोमा लिंडा विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) के साथ-साथ अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और मटेरियल कमांड (USAMRMC) के पशु देखभाल और उपयोग समीक्षा कार्यालय (ACURO) द्वारा अनुमोदित किया गया रक्षा विभाग।

1. लेंटिवायरस की तैयारी जो 1α-हाइड्रोक्सीलास और RALDH2 (लेंटी-CYP-ALDH वायरस) दोनों को व्यक्त करती है

  1. दिन 0: सुबह में, सीएम-10-डी सेल संस्कृति माध्यम में 293T कोशिकाओं की 5 x 105 कोशिकाओं/mL तैयार करें ।
  2. बीज 20 मिली0/थाली में 150 मिमी x 25 मिमी संस्कृति व्यंजन। संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर कोशिकाओं को 24 घंटे के बाद ~ 80-90% तक पहुंच जाएगा।
  3. पहला दिन: 2x एचबीएस (50 एमएम हेप्स, 280 एमएम एनएसीएल, और 1.5 एमएम एनए2एचपीओ4,पीएच 7.1) बनाएं। अलीकोट और स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. 2 एम CaCl2 बनाओ और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  5. प्रत्येक 150 मिमी x 25 मिमी संस्कृति पकवान के लिए, एक बाँझ 50 मीटर संस्कृति ट्यूब में एक डीएनए वर्षा मिश्रण तैयार करते हैं। सबसे पहले, 2x एचबीएस के 1,620 माइक्रोन, पीएमडी2जी (वीएसवीजी) के 9.5 माइक्रोन, पीसीएमवीआर8.74 (कैप्सिड) के 17.5 माइक्रोन, लेंटी-सीवाईपी-एएलडीएच प्लाज्मिड (एक लेंटिवायरल वेक्टर का 27 μg जो CYP27B1 और ALDH1a2 दोनों को वहन करता है)। दूसरा, एच2ओ को 3,037.5 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में जोड़ें।
  6. पिछले में, 1x एचबीएस और 125 एम सीएसीएल2की अंतिम सांद्रता के समाधान को मिलाते हुए 2 एम सीएसीएल2 ड्रॉपवाइज के 202.5 माइक्रोन जोड़ें। CaCl2 पिछले जोड़ा जाना चाहिए । कभी-कभी मिश्रण के साथ 20 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर ट्रांसफेक्शन मिश्रण छोड़ दें। कई 150 मिमी x 25 मिमी संस्कृति व्यंजनके लिए, तदनुसार स्केल करें।
  7. 293T कोशिकाओं वाले 150 मिमी x 25 मिमी संस्कृति पकवान में डीएनए वर्षा मिश्रण ड्रॉपवाइज के 3,240 माइक्रोन जोड़ें। धीरे से संस्कृति पकवान पक्ष पक्ष को भंवर जबकि डीएनए वर्षा मिश्रण जोड़ने । डिश को 37 डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करते हैं।
  8. दूसरा दिन: कैल्शियम फॉस्फेट ट्रांसफेक्शन समाधान को हटा दें, 1x पीबीएस के साथ धीरे-धीरे धोएं, और सीएम-4-डी सेल कल्चर मीडियम के साथ सेल कल्चर को रीफीड करें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
  9. तीसरा दिन: बाँझ भंडारण बोतलों में अधिस्थान ों को काटें और 4-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सेल कल्चर को फ्रेश सीएम-4-डी सेल कल्चर मीडियम से भरें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक और 24 घंटे के लिए कोशिकाओं संस्कृति।
  10. 4 दिन: बाँझ भंडारण की बोतलों में supernatants फसल । 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से दिन 3 और 4 दिन से सुपरनेटेंट फ़िल्टर करें। वीएसवीजी छद्म प्रकार के वायरस को केंद्रित करने के लिए, सुपरनेटेंट को अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 4,780 x ग्राम पर स्पिन करें।
  11. 5 दिन: छर्रों से supernatants डालो (गोली अक्सर दिखाई देता है) और ट्यूबों के लिए कई मिनट के लिए एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक कागज तौलिया पर नाली की अनुमति देते हैं ।
  12. 5% ग्लाइसेरोल वाले बाँझ पीबीएस के साथ पाइपिंग करके छर्रों को फिर से निलंबित करें। रिस्पेंशन के लिए वॉल्यूम 33.3 माइक्रोन प्रति 150 एमएम x 25 एमएम कल्चर डिश होगा।
  13. अलीकोट 200 माइक्रोन/ट्यूब और स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस पर। टिट्रेशन उद्देश्यों के लिए 50 माइक्रोन/शीशी का एक अलग आलीकोट बनाएं। टीटर 10 8-109 ट्रांसड्यूसिंग यूनिट्स (टीयू) /एमएल की सीमा के भीतर होना चाहिए।
  14. संस्कृति व्यंजनों में ब्लीच डालकर उन्हें त्याग दें।
    नोट: ये ट्रांससंक्रमित कोशिकाएं प्रोटोकॉल में सबसे बड़ी सुरक्षा चिंता हैं क्योंकि कोशिकाओं में सभी लेंटिवायरल तत्व व्यक्त किए जाते हैं।

2. बोन मैरो व्युत्पन्न डीसी (बीएमडीसी) की पीढ़ी

  1. 4-5 बाल्ब/सी चूहों से 50 मिलीआर बाँझ पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में फसल टिबियस और फीमर संस्कृति माध्यम6युक्त।
  2. टिबियस और फीमर को 100 मिमी x 20 मिमी संस्कृति डिश में स्थानांतरित करें जिसमें संस्कृति माध्यम होता है। कैंची और संदंश का उपयोग करके टिबियस और फीमर से मांसपेशियों जैसे ऊतकों को हटा दें।
  3. बोन मैरो गुहा का पर्दाफाश करने के लिए टिबियस और फीमर के दोनों सिरों को काट लें।
  4. 30 जी सुई से जुड़ी 10 मिलीएल सिरिंज में 10 मीटर कल्चर मीडियम ड्रा करें।
  5. ध्यान से बोन मैरो गुहा में सुई डालें और बोन मैरो को एक साफ 50 मीटर बाँझ पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में फ्लश करें। यदि आवश्यक हो तो इस प्रक्रिया को दोहराएं, यह सुनिश्चित करने के लिए कि अस्थि मज्जा को पूरी तरह से बाहर निकाल दिया गया है।
  6. 5 मिन के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज्ड (400 x ग्राम)द्वारा बोन मैरो कोशिकाओं को गोली मारें।
  7. 1x लाल रक्त कोशिका लिसिस बफर के 5 mL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।
  8. कभी-कभी मिलाते हुए 4-5 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  9. संस्कृति माध्यम के 30 मिलीग्राम जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
  10. 5 मिन के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज्ड (400 एक्स जी)द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें। CM-10-R सेल कल्चर मीडियम के 10 मिलील में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें। जरूरत पड़ने पर कोशिकाओं को मलबे को हटाने के लिए 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से पास किया जा सकता है।
  11. एक सेल गिनती करें और सीएम-10-आर सेल संस्कृति माध्यम का उपयोग कर 1 x 106 कोशिकाओं/mL करने के लिए कोशिकाओं को समायोजित करें ।
  12. पुनः संयोजन murine ग्रेनुलोसाइट/मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ, अंतिम एकाग्रता = १०० U/mL) और murine interleukin-4 (आईएल-4, अंतिम एकाग्रता = 10 U/mL) जोड़ें ।
    नोट: जीएम-सीएसएफ और आईएल-4 के स्टॉक समाधान क्रमशः 100,000 यू/एमएल (1,000x) और 10,000 यू/एमएल (1,000x) पर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं।
  13. कोशिकाओं को 4 मीटर/वेल पर 6 अच्छी संस्कृति प्लेटों में वितरित करें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 की संस्कृति करें।
  14. कोमल पाइपिंग के साथ अअनुयायी कोशिकाओं को हटा दें।
  15. जीएम-सीएसएफ (100 यू/एमएल) और आईएल-4 (10 यू/एमएल) युक्त नए सिरे से सीएम-10-आर सेल कल्चर मीडियम जोड़ें। संस्कृति एक और ४८ घंटे के लिए कोशिकाओं ।
  16. लेंटी-सीवाईपी-एएलडीएच वायरस द्वारा ट्रांसड्यूक्शन के लिए हार्वेस्ट नॉनडिएंडेंट कोशिकाएं (बीएमडीसी) ।

3. डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए लेंटी-सीवाईपी-एएलडीएच वायरस के साथ डीसी का ट्रांसड्यूक्शन

  1. सीएम-10-आर सेल कल्चर मीडियम के 05 मिलील की कुल मात्रा में 1 x 106 डीसी/वेल तैयार करें जिसमें 50 माइक्रोन वायरस और 6 वेल कल्चर प्लेट में 8 माइक्रोन/एमएल प्रोटामाइन हो।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर कोशिकाओं को संस्कृति।
  3. मीडियम को नए सीएम-10-आर सेल कल्चर मीडियम और कल्चर से बदलें कोशिकाएं 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को एक और 24 घंटे के लिए। इस समय बिंदु पर, 1α-हाइड्रोक्सीलेस और RALDH2 की एंजाइमैटिक गतिविधियों का मूल्यांकन किया जा सकता है (चरण 4 देखें)। यदि आवश्यक हो, तो दूसरे ट्रांसड्यूक्शन के लिए चरण 3.1-3.3 दोहराएं।
  4. लिपोपोलिसाक्राइड (100 एनजी/एमएल) जोड़ें और 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को संस्कृति।
  5. प्रयोगों के लिए कोशिकाओं (डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं) फसल।

4. डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं में अतिव्यक्त 1α-हाइड्रोक्सीलेस और RALDH2 का मूल्यांकन

  1. डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं में अतिव्यक्त 1α-हाइड्रोक्सीलेस का मूल्यांकन
    1. बीज 1.0 x 106 डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं/अच्छी तरह से 12 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में सीएम के 2 मिलीएल में-10-आर सेल संस्कृति मध्यम ।
    2. 2.5 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए 25 (ओह) डी जोड़ें। 24 घंटे के लिए डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें ।
    3. सुपरनेटेंट को काटकर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रेडियोइम्यूनोसे (आरआईए) (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके सुपरनेटेंट में 1,25 (ओह)2डी सांद्रता के लिए परख।
    5. एक एंटी-CYP27B1 एंटीबॉडी का उपयोग करके फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) द्वारा डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं में 1α-hydroxylase की अभिव्यक्ति निर्धारित करें।
  2. डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं में अतिव्यक्त रालेढा 2 का मूल्यांकन
    नोट: अतिव्यक्त RALDH2 की अभिव्यक्ति और गतिविधि एक वाणिज्यिक एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज (ALDH) डिटेक्शन किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके निर्धारित की जाती है।
    1. बीज 1 एल डीसी-CYP-ALDH या नियंत्रण कोशिकाओं (परख बफर में 1 x 105 कोशिकाओं/mL) में से प्रत्येक में दो 5 मिलीएल ट्यूबों में से प्रत्येक में (एक "नियंत्रण" के रूप में लेबल और अंय "परीक्षण" के रूप में लेबल) ।
    2. प्रत्येक नियंत्रण ट्यूब में आहारडाइलामाइनोबेंजाल्डिहाइड (डीईएबी) समाधान (95% इथेनॉल में 1.5 mM) के 10 माइक्रोन जोड़ें और तुरंत मिलाएं। डीईएबी एक RALDH2 अवरोधक है।
    3. नियंत्रण और परीक्षण ट्यूबों के लिए सक्रिय RALDH फ्लोरेसेंस सब्सट्रेट (300 माइक्रोन) के 5 μL जोड़ें और तुरंत मिलाएं।
    4. ट्यूबों को 45 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. 5 मिन के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 400 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें।
    6. परख बफर के 200 μL में कोशिकाओं का पुनर्गठन।
    7. कोशिकाओं को बर्फ पर रखें और FACS द्वारा विश्लेषण के लिए आगे बढ़ें।

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Representative Results

डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं ने 1α-हाइड्रोक्सीलेस की काफी बढ़ी हुई मात्रा व्यक्त की। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या बीएमडीसी से उत्पन्न डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं ने 1α-हाइड्रोक्सीलेस की काफी बढ़ी हुई मात्रा व्यक्त की, बीएमडीसी को बोन-मैरो-व्युत्पन्न डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं (बीएमडीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं) का उत्पादन करने के लिए लेंटी-सीवाईपी-एएलडीएच वायरस के साथ स्थानांतरित किया गया था। बाद में, बीएमएससी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं की जांच एफएसीएस द्वारा 1α-हाइड्रोक्सीलास की अभिव्यक्ति के लिए की गई थी। हमारे आंकड़ों से पता चला है कि बीएमडीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं, जब माता पिता के BMDCs की तुलना में, 1α-हाइड्रोक्सीलेस(चित्रा 1ए)की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति प्रदर्शित की । हमने बीएमडीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं में 1α-हाइड्रोक्सीलेस की एंजाइमैटिक गतिविधि भी निर्धारित की। ऐसा करने के लिए सीएम-10-आर सेल कल्चर मीडियम के 2 मिलील में 1.0 x 106 बीएमडीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं को 12 अच्छी संस्कृति प्लेटों में जोड़ा गया। 25 (ओह) डी तो २.५ μM की अंतिम एकाग्रता पर सेल संस्कृति में जोड़ा गया था । कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर सुसंस्कृत किया गया था और सुपरनेटेंट को रेडियोइम्यूनोसे (रिया) का उपयोग करके 1,25 (ओह)2डी के माप के लिए काटा गया था। हमारे आंकड़ों से पता चला है कि 1,25 (OH)2डी सांद्रता बीएमडीसी-CYP कोशिकाओं की संस्कृति supernatants में (बीएमडीसी लेंटी-CYP-GFP वायरस के साथ transduced) और बीएमडीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं प्रत्येक लगभग 20x माता पिता की बीएमसी और बीएमडीसी-ALDH कोशिकाओं (BMDC-ALDH कोशिकाओं (BMDCs) के साथ transduced(1

डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं ने रालेढा 2 की मात्रा में काफी वृद्धि व्यक्त की। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या बीएमडीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं ने RALDH2 की काफी बढ़ी हुई मात्रा व्यक्त की, रालेढा2 अवरोधक आहारडाइलामानोबेंजाल्डिहाइड (डीईएबी) (डीईएबी) (15 माइक्रोन) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में सेल संस्कृतियों में एक RALDH2 सब्सट्रेट जोड़ा गया था। कोशिकाओं के अंदर बनाए गए फ्लोरोसेंट उत्पाद का विश्लेषण FACS द्वारा किया गया था। हमारे आंकड़ों से पता चला है कि बीएमडीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं के फ्लोयोरसेंस तीव्रता (MFIs) का मतलब है लगभग 6x माता पिता के BMDCs की तुलना में अधिक थे, सुझाव है कि BMDC-CYP-ALDH कोशिकाओं, जब माता पिता के BMDCs की तुलना में, काफी बढ़ाया RALDH2 enzymatic गतिविधि व्यक्त(चित्रा 2ए,बी)

डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं ने विट्रो में foxp3+CCR9+ आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं को शामिल करने में वृद्धि की। यह जांच करने के लिए कि डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाएं विट्रो में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं के शामिल होने को बढ़ाने में सक्षम थीं, हमने डीसी 2.4 कोशिकाओं (एक अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न डीसी लाइन26,27,28,29),लेंटी-सीवाईपी-एएलडीएच वायरस के साथ और DC2.4-CYP-ALDH कोशिकाओं को उत्पन्न किया। बाद में, हमने यह निर्धारित किया कि क्या DC2.4-CYP-ALDH कोशिकाएं विट्रो में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं के शामिल होने को बढ़ाने में सक्षम थीं। तदनुसार, भोली CD4+ टी कोशिकाओं C57BL/6 चूहों से शुद्ध किया गया । शुद्ध भोली CD4+ 5 x 105 कोशिकाओं पर टी कोशिकाओं/अच्छी तरह से तो माता पिता DC2.4 कोशिकाओं (1 x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से) या DC2.4-CYP-ALDH कोशिकाओं (1) के साथ cocultured थे x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से) 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में एक सीरम मुक्त माध्यम में एक विरोधी सीडी 3 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (5 μg/mL) और recombinant मानव आईएल-2 (५० U/mL) की उपस्थिति में । इसके अलावा, संस्कृतियों में विभिन्न सांद्रता में 25 (ओह) डी और रेटिनोल को भी जोड़ा गया था। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेटेड किया गया था । पांच दिन बाद, कोशिकाओं को फॉक्स3 और सी-सी केमोकिन रिसेप्टर टाइप 9 (सीसीआर9) की अभिव्यक्ति के लिए FACS द्वारा विश्लेषण किया गया । हमारे डेटा से पता चला है कि सब्सट्रेट्स की उपस्थिति में, DC2.4 कोशिकाओं ने सीडी 4+ टी सेल आबादी(चित्रा 3ए, बी)में foxp3+CCR9+ कोशिकाओं की बहुतायत को काफी नहीं बदला। इसके विपरीत, DC2.4-CYP-ALDH कोशिकाओं ने सीडी4 + टी कोशिकाओं के बीच foxp3+CCR9+ कोशिकाओं की बहुतायत को काफी बढ़ाया। इसके अलावा, अधिक 25 (OH) डी जोड़ा, DC2.4-CYP-ALDH कोशिकाओं की क्षमता अधिक से अधिक CDp3+CCR9+ सीडी 4+ टी कोशिकाओं के बीच कोशिकाओं की बहुतायत में वृद्धि करने के लिए । इसलिए, हमारे डेटा समर्थन है कि डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं को विट्रो में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं के शामिल करने में वृद्धि कर सकते हैं ।

डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं ने वीवो में फॉक्सपी 3+सीसीआर9+ आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं को शामिल करने में वृद्धि की। यह निर्धारित करने के लिए कि डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं को वीवो में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं के शामिल होने में वृद्धि हो सकती है, हमने इंट्रापेरिटोनी रूप से बाल्ब/सी चूहों में निम्नलिखित कोशिकाओं में से एक को प्रशासित किया: माता-पिता DC2.4 कोशिकाओं, DC2.4-CYP कोशिकाओं (DC2.4 कोशिकाओं lenti-CYP-GFP वायरस के साथ transduced), और डीसी-2.4-CYP-ALDH सेल प्रशासन के चार दिन बाद, मेसेंडेरिक लिम्फ नोड्स की जांच FACS(चित्रा 4ए)द्वारा की गई थी । हमारे डेटा से पता चला है कि DC2.4-CYP-ALDH कोशिकाओं, जब नियंत्रण की तुलना में, काफीCD3 + टी कोशिकाओं के बीच foxp3+CCR9+ कोशिकाओं की बहुतायत में वृद्धि हुई(चित्रा 4बी, सी)। इन परिणामों के आधार पर, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच सेल प्रशासन परिधीय लिम्फोइड ऊतकों में फॉक्सपी 3+सीसीआर9+ टी कोशिकाओं को शामिल करने में काफी वृद्धि करता है।

Figure 1
चित्रा 1: डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं को काफी 1α-हाइड्रोक्सीलेस की मात्रा में वृद्धि व्यक्त की । (A)बीएमडीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं को एफएसीएस द्वारा उत्पन्न और विश्लेषण किया गया था। एक प्रतिनिधि FACS साजिश माता पिता के BMDCs और बीएमडीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं (लाइव कोशिकाओं पर gated) में 1α-हाइड्रोक्सीलेस की अभिव्यक्ति से पता चलता है । (ख)डीसी संस्कृतियों में 1α-हाइड्रोक्सीलेस सब्सट्रेट (यानी, 25 (OH) D) जोड़ा गया था । 24 घंटे बाद, सुपरनेटेंट एकत्र किए गए और 1,25 (ओह)2डी सांद्रता को मापा गया। डेटा माता-पिता बीएमडीसी, बीएमडीसी-सीवाईपी कोशिकाओं, बीएमडीसी-एएलडीएच कोशिकाओं और बीएमडीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं की संस्कृतियों में 1,25 (ओह)2डी की सांद्रता दिखाता है। **पी एंड एलटी; 0.01। ANOVA परीक्षण। n = 4. यह आंकड़ा Xu एट अल6से अनुकूलित है । कॉपीराइट 2019। अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ इम्यूनोलॉजिस्ट, इंक कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं RALDH2 की काफी वृद्धि की राशि व्यक्त की । (A)बीएमडीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं को प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में उत्पन्न और विश्लेषण किया गया था। प्रतिनिधि मढ़ा FACS भूखंडों BMDCs में BODIPY अमीनोसेटेट फ्लोरेसेंस और बीएमडीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं की उपस्थिति में (+ DEAB) या अनुपस्थिति (-DEAB) RALHD2 अवरोधक diethylaminobenzaldehyde (DEAB) दिखा । (ख)बीएमडीसी में बॉडीपी अमीनोसेटेट की मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) और डीईएबी की अनुपस्थिति में बीएमडीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाएं । * पी एंड एलटी; 0.05; टी-टेस्ट; n = 4. यह आंकड़ा Xu एट अल6से अनुकूलित है । कॉपीराइट 2019। अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ इम्यूनोलॉजिस्ट, इंक कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं ने विट्रो में foxp3+CCR9+ आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं को शामिल करने में वृद्धि की। (A)CD4+ भोली टी कोशिकाओं C57BL/6 माउस तिल्ली से अलग थे । सीडी 4+ टी कोशिकाओं को तब माता-पिता डीसी 2.4 कोशिकाओं या DC2.4-CYP-ALDH कोशिकाओं की उपस्थिति में एक विरोधी सीडी 3 mAb (5 μg/mL) द्वारा संस्कृतियों में सक्रिय किया गया था । इसके अतिरिक्त, संस्कृतियों को 25 (ओह) डी और रेटिनोल की इंगित सांद्रता के साथ जोड़ा गया था। पांच दिन बाद, कोशिकाओं को सीडी 3 + सीडी4 +टी सेल आबादी में foxp3 और CCR9 की अभिव्यक्ति के लिए FACS द्वारा एकत्र और विश्लेषण किया गया । प्रतिनिधि FACS भूखंडों CD3+CD4+ टी सेल आबादी में foxp3 और CCR9 की अभिव्यक्ति दिखाते हैं । (ख)से संचयी आंकड़े(ए)। * पी एंड एलटी; 0.05; एनोवा परीक्षण; n = 4. यह आंकड़ा Xu एट अल6से अनुकूलित है । कॉपीराइट 2019। अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ इम्यूनोलॉजिस्ट, इंक कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं ने वीवो में foxp3+CCR9+ आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं को शामिल करने में वृद्धि की। (A)Balb/c चूहों इंट्रापेरिटोनी (i.p.) निम्नलिखित डीसी स्थानान्तरण (हस्तांतरण): कोई डीसी हस्तांतरण (कोई हस्तांतरण), माता पिता DC2.4 कोशिकाओं, DC2.4-CYP कोशिकाओं, और DC2.4-CYP-ALDH कोशिकाओं में से एक प्राप्त किया । चार दिन बाद, मेसेंडेरिक लिम्फ नोड्स (एमएलएनएस) का विश्लेषण FACS द्वारा किया गया । (ख)प्रतिनिधि एफएसीएस भूखंड सीडी 3+ टी सेल आबादी में foxp3 और CCR9 के भाव दिखाते हैं । (C)से संचयीडेटाCD3 + टी सेल आबादी में foxp3+CCR9+ कोशिकाओं का प्रतिशत दिखा । सभी विश्लेषणों के लिए CD3+ टी कोशिकाओं पर कोशिकाओं को गेट किया गया था। जहां लागू हो, प्रस्तुत किए गए डेटा का अर्थ है ± एसईएम। * पी एंड एलटी; 0.05; एनोवा परीक्षण; n = 4-6। यह आंकड़ा Xu एट अल6से अनुकूलित है । कॉपीराइट 2019। अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ इम्यूनोलॉजिस्ट, इंक कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस लेख में हम परिधीय लिम्फोड ऊतकों में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं को शामिल करने में वृद्धि करने के लिए डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं के उपयोग का वर्णन करते हैं। हमारे डेटा से पता चला है कि डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं को दोनों 1,25 (OH)2डी और आरए इन विट्रो के स्थानीय रूप से उच्च सांद्रता de novo क्रमशः इसी सब्सट्रेट्स (यानी, 25 [OH] डी और रेटिनोल, की उपस्थिति में संश्लेषित कर सकते हैं) । क्योंकि 25 (OH) D और रेटिनोल की पर्याप्त रक्त सांद्रता आसानी से विटामिन डी और एक पूरक ता्मक के माध्यम से रोगियों में क्रमशः प्राप्त किया जा सकता है, जिनके पास30,31की कमी है, हम कारण हैं कि डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाएं परिधीय लिम्फोइड ऊतकों में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं के प्रेरण को बढ़ा सकती हैं जब 25 (OH) डी और रेटिनोल की सामान्य रक्त सांद्रता मौजूद होती है। इस तर्क का समर्थन करने के लिए, हमारा डेटा दर्शाता है कि सामान्य स्वस्थ जानवरों में जिनमें विटामिन डी और विटामिन ए की कमी नहीं है, डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाएं रेग कोशिकाओं के प्रेरण को बढ़ाती हैं जो नियामक अणुओं (यानी, फॉक्सपी 3 और आईएल-10) और एक आंत-होमिंग रिसेप्टर (यानी, सीसीआर9) को व्यक्त करती हैं। इसलिए आईबीडी के इलाज के लिए आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं की आगे की जांच के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम उच्च टिटर के साथ लेंटी-सीवाईपी-एएलडीएच वायरस का उत्पादन है। पसंदीदा वायरस टि्वटर 108-109 TUs/mL होना चाहिए। डीसी में उच्च ट्रांसड्यूक्शन दक्षता के लिए लेंटी-सीवाईपी-एएलडीएच वायरस का एक उच्च टिटर आवश्यक है।

इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम डीसी में ट्रांसड्यूक्शन दक्षता है। क्योंकि डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं को इस तकनीक में विट्रो में टॉरलेइज्ड नहीं किया जाता है, इसलिए यह आवश्यक है कि ट्रांसड्यूक्शन दर 90% से अधिक हो ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाएं वीवो में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं के शामिल होने को कुशलतापूर्वक बढ़ा सकती हैं। इसके अलावा, डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं को आगे FACS द्वारा पहले वीवो प्रशासन३२में शुद्ध किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल का एक अनूठा लाभ यह है कि डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं को वीवो प्रशासन में पहले विट्रो में टॉरमेंइज्ड करने की जरूरत नहीं है । यह उम्मीद की जाती है कि डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं को 1,25 (ओह)2डी और आरए के संयुक्त कार्यों के परिणामस्वरूप, वीवो में एक सहरोग्य स्थिति में बनाए रखा जाएगा क्योंकि 1,25 (OH)2डी और आरए दोनों को डीसी33,34को बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, हम आशा करते हैं कि डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं को वीवो भड़काऊ वातावरण में अस्थिरता की चिंता नहीं होगी ।

वर्तमान में, हमने केवल यह दर्शाया है कि डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाएं परिधीय लिम्फोइड ऊतकों और आंतों6में आंत-होमिंग ट्रेग कोशिकाओं की आवृत्ति (संख्या) बढ़ा सकती हैं। नतीजतन, एक पूरे के रूप में आंतों में नियामक समारोह बढ़ाया जाता है क्योंकि आंतों में ट्रेग कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ जाता है। चित्रा 4 से पता चलता है कि जब नियंत्रण उपचार के साथ उन लोगों की तुलना में, डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं के साथ इंट्रापेरिटोनियल उपचार काफी mesenteric लिम्फ नोड्स में CCR9+foxp3+ Treg कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि हुई है, जिसका अर्थ है कि मेसेन्ट्रिक लिम्फ नोड्स में अधिक ट्रेग कोशिकाओं को आंतों के ऊतकों में विशेष रूप से घर में सक्षम हैं । चित्रा 4 आगे से पता चलता है कि मेसेंट्रिक लिम्फ नोड्स में अधिकांश foxp3+ टी कोशिकाएं सीसीआर 9 के लिए नकारात्मक हैं और इसलिए आंत-होमिंग क्षमता नहीं है। हालांकि, क्या डीसी-CYP-ALDH कोशिकाओं को भी प्रति से प्रत्येक Treg सेल के नियामक समारोह में वृद्धि कर सकते है (जैसे foxp3 और/या आईएल-10 के बढ़ाया अभिव्यक्ति के स्तर के रूप में) आगे की जांच की आवश्यकता है ।

यहां वर्णित अभिकर्मक और सामग्री केवल पशु अध्ययन के लिए हैं। हालांकि, प्रोटोकॉल इसी मानव अभिकर्मकों और सामग्रियों का उपयोग करके मानव अध्ययन के लिए लागू होता है, सिवाय इसके कि डीसी मनुष्यों में परिधीय रक्त मोनोसाइट्स से उत्पन्न होंगे। इस प्रोटोकॉल का अंतिम लक्ष्य आईबीडी के उपचार के लिए नैदानिक ग्रेड डीसी-सीवाईपी-एएलडीएच कोशिकाओं की पीढ़ी है।

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Disclosures

डीआरएस जियाओलेई तांग और डेविड जे बायलिंक इस अध्ययन से संबंधित एक लंबित पेटेंट के आविष्कारक हैं ।

Acknowledgments

इस काम को पुरस्कार संख्या के तहत सहकर्मी समीक्षा चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम के माध्यम से स्वास्थ्य मामलों के लिए रक्षा के सहायक सचिव के कार्यालय द्वारा समर्थित किया गया था । W81XWH-15-1-0240 (XT) । राय, व्याख्याओं, निष्कर्ष, और सिफारिशों लेखक के उन रहे है और जरूरी रक्षा विभाग द्वारा समर्थन नहीं कर रहे हैं । इस काम को लोमा लिंडा विश्वविद्यालय में चिकित्सा विभाग (681207-2967 [XT और GG], 681205-2967 [XT], और ३२५४९१ [डीजेबी]) से अनुसंधान नवाचार अनुदान द्वारा भी आंशिक रूप से समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringes ThermoFisher Scientific Cat# 03-377-23
100 mm x 20 mm culture dishes Sigma-Aldrich Cat# CLS430167
12-well culture plates ThermoFisher Scientific Cat# 07-200-82
150 mm x 25 mm culture dishes Sigma-Aldrich Cat# CLS430559
25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) Sigma-Aldrich Cat# H4014
293T cells ATCC CRL-3216
2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
6-well culture plates ThermoFisher Scientific Cat# 07-200-83
ALDEFLUOR kit Stemcell Technologies Cat# 01700
Anti-CYP27B1 Abcam Cat# ab95047
BD FACSAria II BD Biosciences N/A
CaCl2 Sigma-Aldrich Cat# C1016
CM-10-D cell culture medium DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-10-R cell culture medium RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-4-D cell culture medium DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL Sigma-Aldrich Cat# CLS430513
Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL Sigma-Aldrich Cat# CLS430514
Dissecting scissor ThermoFisher Scientific Cat# 08-940
DMEM medium ThermoFisher Scientific Cat# 11960044
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific Cat# 16000044
Forceps ThermoFisher Scientific Cat# 22-327379
Gibco ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific Cat# A1049201
Glycerol Sigma-Aldrich Cat# G5516
Goat anti-rabbit IgG Abcam Cat# ab205718
HEPES Millipore Cat# 391340
Lenti-CYP-ALDH Custom-made 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter.
L-glutamine ThermoFisher Scientific Cat#25030081
Lipopolysaccharide Sigma-Aldrich Cat# L3755
Murine GM-CSF Peprotech Cat# 315-03
Murine IL-4 Peprotech Cat# 214-14
Na2HPO4 Sigma-Aldrich Cat# NIST2186II
NaCl Sigma-Aldrich Cat# S9888
Needles ThermoFisher Scientific Cat# 14-841-02
Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
pCMVR8.74 Addgene Plasmid# 22036
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific Cat#15140148
Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
PMD2G Addgene Plasmid# 12259
Polypropylene tube, 15 mL ThermoFisher Scientific Cat# AM12500
Polypropylene tube, 50 mL ThermoFisher Scientific Cat# AM12502
Protamine sulfate Sigma-Aldrich Cat# P3369
Rabbit polycloncal IgG isotype control Abcam Cat# ab171870
Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement Heartland Assays
RPMI 1640 medium, no glutamine ThermoFisher Scientific Cat# 21870076
Sodium pyruvat ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
Sorvall Legend XTR Centrifuge ThermoFisher Scientific Cat# 75004521
Sterile Cell strainers, 40 mm ThermoFisher Scientific Cat# 07-201-430
Sterile storage bottles, 500 mL ThermoFisher Scientific Cat# CLS431432

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References

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