En høy output metode for å isolere cerebral Pericytes fra Mouse

Biology
 

Summary

Vi presenterer en protokoll for ekstraksjon av murine cerebral pericytes. Basert på en antibiotika-fri berikelse orientert pericyte utvinning, er denne protokollen et verdifullt verktøy for in vitro studier som gir høy renhet og høy avkastning, og dermed redusere antall eksperimentelle dyr som brukes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mehra, A., Dehouck, L., Vandenhaute, E., Fatar, M., Fenart, L., Gosselet, F. A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse. J. Vis. Exp. (155), e60588, doi:10.3791/60588 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I de senere årene har cerebral pericytes blitt fokus for omfattende forskning på vaskulær biologi og patologi. Betydningen av pericytes i blod hjerne barriere formasjon og fysiologi er nå demonstrert, men molekyl grunnlaget er fortsatt i stor grad ukjent. Som patofysiologiske rolle cerebral pericytes i nevrologiske lidelser er spennende og av stor betydning, in vitro-modeller er ikke bare tilstrekkelig hensiktsmessig, men også i stand til å innlemme ulike teknikker for disse studiene. Flere metoder har blitt foreslått som in vitro modeller for utvinning av cerebral pericytes, selv om en antibiotika-fri protokoll med høy produksjon er ønskelig. Viktigst, en metode som har økt produksjon per ekstraksjon reduserer bruken av flere dyr.

Her foreslår vi en enkel og effektiv metode for å utvinne cerebral pericytes med tilstrekkelig høy effekt. Musen hjernevev homogenate er blandet med en BSA-dextran løsning for separasjon av vevet rusk og mikrovaskulær pellet. Vi foreslår en tre-trinns separasjon etterfulgt av filtrering for å få en microvessel rik Filtrer. Med denne metoden er mengden av mikrovaskulær fragmenter innhentet fra 10 mus tilstrekkelig til å frø 9 brønner (9,6 cm2 hver) av en 6-brønn plate. Mest interessant med denne protokollen, kan brukeren få 27 pericyte rike brønner (9,6 cm2 hver) i passasje 2. Renheten av pericyte kulturer er bekreftet med uttrykk for klassisk pericyte markører: NG2, PDGFR-β og CD146. Denne metoden demonstrerer en effektiv og gjennomførbar in vitro-verktøy for fysiologiske og patofysiologiske studier på pericytes.

Introduction

Cerebral pericytes er en viktig del av nevrovaskulære enheten (NVU), som består av en funksjonell enhet med cerebral endothelial celler av blod hjerne barrieren (BBB), gliacellene celler, ekstracellulære matrise og neurons. Pericytes er en viktig del i regulert funksjon av sentralnervesystemet (CNS) som de tjener som en av grensesnittene for utveksling av molekylær og mobilinformasjon.

Cerebral pericytes er innebygd i abluminal siden av hjernen microårene, og er avgjørende for å etablere1 og OPPRETTHOLDE2 BBB fysiologi. Flere nyere verker har også fremhevet rollen som cerebral pericytes i angiogenese3 og fartøy modning4, endothelial morphogenesis5 og overlevelse6, og i kontrollerende hjernen kolesterol metabolisme7. Viktigere er feilregulering i noen av disse prosessene paranoid kjennetegn ved nevrodegenerative sykdommer.

Faktisk, pericytes er en funksjonell nødvendighet for normal BBB funksjon og dens beskyttelse mot progresjon av flere nevrologiske sykdommer. Degenereres fysiologi og tap av pericytes er vanlig fellesnevnere i progresjon av Alzheimers sykdom8, neuronal tap under hvit materie dysfunksjon9, multippel sklerose10, i en periode på 12, akuttfase iskemiske hjerneslagtolv og i andre nevrologiske lidelser. Pericytes er også instrumental i tumor metastasering13. Interessant, pericytes har også vist å vise en redning rolle etter nevrologiske traumer og lidelser: i remyelination i hjernen1, iskemiske hjerneslag, ryggmargsskade14 og fremme angiogenese15. Mottakelighet for pericytes å forsterke den patofysiologiske manifestasjon av nevrologiske traumer og lidelser gjør dem til en potensiell terapeutisk mål16.

In vitro forskning modeller av pericytes i BBB er viktige verktøy for å gjennomføre omfattende studier. Disse modellene gir en plattform for mer forseggjort studier ved å representere arbeider modeller av BBB og mer. For eksempel kan disse modellene brukes til å forstå cellulære fysiologi innen pericytes og blant andre celletyper av NVU. Også, in vitro-modeller er førstehånds etterforskning verktøy for å teste farmakologisk påvirkning av nye stoffer og molekyler på pericytes. Disse modellene kan også brukes til å forstå patofysiologiske rolle pericytes i forhold til nevrologiske lidelser. Utviklingen av in vitro-modeller krever likevel økt effekt for å muliggjøre eksperimentell frihet. Disse modellene skal være enkelt og raskt, og redusere antall eksperimentelle dyr som brukes. I tillegg er evnen til å utvikle slike modeller til en dobbel og trippel cellekultur modeller ønskelig.

Det er mange protokoller som er utviklet. Protokollene foreslått av Tigges et al.17, Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20, og Crouch og Doetsch21 er prisverdig tilnærminger som tilfredsstiller de fleste nødvendigheter. Alle disse metodene gir effektive resultater, men avhengigheten av et stort antall forsøksdyr er fortsatt et felles for disse protokollene. Derfor blir det obligatorisk å utvikle en høy produksjon metode som kan isolere og rense pericytes med størst mulig effektivitet. I denne protokollen, renheten av cellene oppnådd etter en andre passasje er verifisert med flere pericytes markører. Vi sjekket for blodplate-avledet Vekstfaktorreseptor-β (PDGFR-β), som brukes som en klassisk markør av pericytes17, og for NG2 (Nevron-gliacellene antigen 2), som er en markør for pericyte mediert vaskulær morphogenesis22 og endometrial blodkar23. Vi har også sjekket for klynge av differensiering 146 (CD 146), som har blitt rapportert som en av molekylene uttrykt i pericytes17,18.

Her presenterer vi en protokoll for utvinning av primær pericytes fra mus (Wild type eller transgenics) som vil tilfredsstille alle de nevnte kravene med høy produksjon. Vi ansetter en antibiotika og immunopanning fritt valg-basert metode for spredning for den primære cerebral pericytes, som vil vise seg en effektiv modell for å gjennomføre in vitro studier.

Protocol

Alle eksperimenter ble utført etter instituttets retningslinjer for bruk og håndtering av dyr. I samsvar med den franske lovgivningen har dyre anlegget ved Universitetet i Artois blitt godkjent av lokale myndigheter (referanse: B62-498-5). I samsvar med EUs lovgivning (direktiv 2010/63/EU) ble alle prosedyrene godkjent av den lokale dyre omsorgen og bruks komitéen (Comité d'Ethique en Expérimentation animale du Nord-Pas-de-Calais, referanse: C2EA 75) og det franske forskningsdepartementet (referanse: 2015090115412152).

1. utarbeidelse av løsninger

  1. Klargjør 500 mL vaske buffer A (WBA): 10 mM HEPES løsning i Hank ' s balansert salt løsning (HBSS). Oppbevares ved 4 ° c.
  2. Klargjør 500 mL vaske buffer B (WBB): 0,1% storfe serum albumin (BSA) med 10 mM HEPES-oppløsning i HBSS. Oppbevares ved 4 ° c.
  3. Klargjør 300 mL 30% dextran oppløsning i WBA ved å blande løsningen over natten ved romtemperatur. Autoklav oppløsningen ved 110 ° c i 30 min før bruk. Etter autoklavering, la løsningen hvile ved romtemperatur for 2-3 h. Oppbevar oppløsningen ved 4 ° c.
  4. Klargjør 100 mL 0,1% BSA-oppløsning i kald dextran løsning. Rist kraftig for 3-4 min og oppbevar ved 4 ° c.
  5. Forbered komplett Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) kultur Media ved oppløsning 20% kalv serum, 2 mM glutamin, 50 μg/mL Gentamycin, 1% vitaminer, 2% aminosyrer basal medium Eagle (BME) i basal DMEM Media og lagre ved 4 ° c. Tilsett 1 ng/mL grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF) før bruk.
  6. Forbered komplett pericyte Media ved å legge pericyte vekst kosttilskudd (følger med pericyte Media) og 20% fosterets kalv serum (FCS) i pericyte kultur basal Media og lagre ved 4 ° c.

2. Brain vev utvinning og fjerning av hjernehinnene

  1. For konsistens, bruk mus av samme alder og samme kjønn i hver batch av utvinning. Bruk en patogen-fri dyr ly og gi annonsen lib tilgang til vann. For å sikre effektivitet og minimal bruk av dyr, unngå tap av vev materiale.
  2. Euthanize C57BL/6J, 4-6 uker gammel, mannlige mus (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Frankrike).
  3. Raskt avgiftsdirektoratet hjernevevet i sterile forhold, unngå skade på vevet. Plasser vevet forsiktig inn i 40 mL kaldt fosfat bufret saltvann (PBS).
  4. Overfør hjernevevet i kald PBS til en Petri parabol (100 mm x 15 mm).
  5. Plasser hjernevevet på en steril tørr, lofri klut og med buet tupp tang, Fjern lillehjernen, striatum og occipital nerver.
    1. Fjern alle de synlige hjernehinnene med en bomullspinne. Plasser hjernevevet opp ned og åpne fliker med en bomullsdott med utvendige lys strøk. Fjern alle synlige blodårer.
    2. Plasser hjernehinnene fritt hjernevev i en Petri parabol (100 mm x 15 mm) med 15 mL kaldt WBB.

3. homogenisering

  1. Overfør vevet til en Dounce vev kvern mørtel rør og tilsett 3-4 mL WBB med tang.
  2. Hakke vevet med en "løs" morter 55 ganger. Skyll den "løse" morter med WBB. Nå hakke på slurry med en "tight" morter 25 ganger.
  3. Del slurry likt i 2 50 mL rør og tilsett 1,5 x volum av kaldt 30% BSA-dextran, kraftig risting rørene å blande slurry.

4. isolering av den vaskulære fraksjonen

  1. Etter kraftig risting av rørene, sentrifuger rørene i 25 min ved 3 000 x g og 4 ° c.
  2. Overfør supernatanten (sammen med det øverste myelin laget) til 2 nye rør, og sentrifuger rørene i 25 min ved 3 000 x g og 4 ° c. Bevar pellets fra den første sentrifugering ved å tilsette 3 mL kaldt WBB (hold pellet ved 4 ° c).
  3. Gjentagelse steg 4,2 og forsiktig gjemme det pellets fra 2nd sentrifugering.
  4. Kast dextran og myelin med vevs rester fra rørene fra trinn 4,3. Bevar pellets i kalde WBB.
  5. Pool innholdet av rør 1 og rør 2 fra trinn 4,1 og utgjør opp til endelig volum på 10 mL med kaldt WBB.
  6. Gjenta dette trinnet for rør fra trinn 4,2 og trinn 4,3.
    Merk: til slutt er det 3 rør fra 3 centrifugations.
  7. Distansere pellet med 6 opp og ned slag med en 10 mL pipette, til ingen synlige klumper av pellets er igjen.
  8. Med hjelp av et vakuum filter montering og nylon mesh filter, filtrere cellen suspensjoner av hvert rør.
    Merk: Dette Filtreringstrinnet er viktig for å fjerne lengre/større fartøy via maske filteret.
  9. Utvinne og resuspend av blodpropp ved skraping filteret ved hjelp av en flat tupp tang eller en skrape i WBB ved romtemperatur. Filtrer suspensjonen med et friskt filter for å gjenopprette flere blodkar
  10. Del Filtrer likt i to rør og sentrifuger i 7 min ved 1 000 x g og RT.
    Merk: under dette sentrifugering trinnet klargjør du enzymatisk løsning. Bestem volumet av WBB som kreves i samsvar med antall dyr som brukes (se tabell av materialer). Legg 1x av DNase 1 og 1x av Tosyl-L-lysyl-chloromethane hydroklorid (TLCK) (se tabell over materialer) i wbb og pre-varm til 37 ° c.
  11. Samle pellets fra trinn 4,10 i ett rør med pre-varmet WBB med enzymer. Legg til forvarmet 1x kollagenase/dispase. Plasser røret i vannbadet ved risting ved 37 ° c i nøyaktig 33 min.
  12. Stopp enzym reaksjonen ved å tilsette 30 mL kald WBB. Sentrifuger suspensjonen i 7 min ved 1 000 x g og RT.
  13. Kast supernatanten forsiktig og distansere pellet i WBB med 6 opp og ned slag med en 10 mL pipette. Dette trinnet bør være mindre strenge og relativt raskere.
  14. Sentrifuger suspensjonen i 7 min ved 1 000 x g og RT.
    Merk: i løpet av dette trinnet, kast belegget fra kultur rettene og skyll dem en gang med DMEM ved romtemperatur. Coat cellekultur retter i minst 1 time ved RT.
  15. Kast supernatanten fra slangen innhentet på trinn 4,14, og distansere pellet i nye komplette DMEM medier, plate cellene (dag 0, p0) i 9 brønner av 6-brønn plater (1 brønn av 9,6 cm2 hver).

5. spredning av cerebral pericytes

  1. Oppretthold celle kulturene ved 37 ° c og 5% CO2 i en steril inkubator. Erstatt kultur Media etter 24 timer (dag 1) av plating cellene ved forsiktig fjerne rusk. Etter dag 1, endre kulturen Media i hver 48 h.
  2. Observer celle kulturen i minst 7-8 dager. På denne tiden, cellulære vekster på toppen av endothelial unilayer bør Observer.
  3. Passage cellene på dag 8-10 (avhengig av confluency) i pericyte kultur medium til passasje 1 (P1) på gelatin belagt kultur plater. Endre kultur Media i hver 2 dager. Observer cellene i 6-7 dager. Cellene blir fortløpende delt igjen til passering 2 (P2) på dag 17 [og passasje 3 (P3) på dag 24 bare hvis nødvendig], dyrket i pericyte medium i gelatin belagt plater.
    Merk: cellene skal være klare for eksperimenter/observasjon på nesten 80-90% confluency.

Representative Results

Denne protokollen (figur 1) effektivt gir 9 brønner (av 6-brønn plater) på tidspunktet for seeding på p0 (figur 2A (p0: dag 1)).

Fra p0 til P2 er det spesifikke morfologiske egenskaper som endothelial celler (indikert med hvite piler) og s gradvis økning i pericytes (indikert med svarte piler) kan observeres. I p0, den langstrakte endothelial celler utvikle fra microårene er i overflod (figur 2A, p0: dag 3), mens overflod av slike langstrakte celler er redusert i P1 og fraværende i P2. Tvert imot, pericytes vises som firkant celler som er rikelig i P2 (figur 2A, P2: dag 18).

For å bekrefte renheten til pericyte kulturen i P2, sjekket vi uttrykket NG2, CD146 og PDGFR-beta som pericyte markører ved hjelp av kvantitativ PCR (figur 2B), immuncytokjemi (figur 2C) og Western Blot (Figur 3). Pericytes i P2 uttrykke høyere nivåer av CD146, NG2 og PDGFR-β i forhold til uttrykket i total mus hjernen (MS br) ekstrakt. Som en kontroll, uttrykk for endothelial markører Occludin og CD31, astrocytter markør gliacellene Fibrillary surt protein (GFAP) og mikroglia markør CD11b ble også observert fraværende i P2.

Figure 1
Figur 1: oppsummering av protokollen. Denne oversikten representerer kritiske trinn for pericyte ekstraksjon som begynner med vevs oppløsning med glass morter jeksel etterfulgt av 3-trinns separasjon i dextran og filtrering. Denne protokollen sysselsetter en 33 min enzym fordøyelsen trinn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: celler morfologi og markører uttrykk. (A) fase kontrast bilder av Pericytes i p0, P1 og P2 stadier av spredning. Rikelig endothelial celler i p0 er indikert med hvite piler. Deres antall ble redusert i P1 og de har forsvunnet i P2. Pericytes indikeres av svarte piler. (B) analyse av CD146, NG2 og PDGFR-β-uttrykk ved PCR i Pericytes i P2 med Pericytes i P1 og mus hjernen (MS br) prøver. (C) representative bilder av Pericytes i P2 stiller positive IMMUNOSTAINING av CD146, PDGFR-β og, NG2. Scale bar: 50 μm (20x forstørrelse) og 20 μm (40x forstørrelse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representative renhet av cellekulturer. Analyse av CD146, PDGFR-β, NG2, Occludin, GFAP, CD31, CD11b og Tubulin uttrykk ved vestlige blotting i pericytes i P2 og mus hjernen (MS br) prøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representative sammenligning av ulike metoder for vev oppløsning, rensing, berikelse og enzymatisk fordøyelse. Hver publisert protokoll oppsummeres med indikasjoner på antall dyr som brukes for hver protokoll. Utganger er også indikert med hensyn til antall brønner innhentet ved såing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Cerebral pericytes er en integrert del av NVU og spille en aktiv rolle i induksjon og vedlikehold av BBB24. På samme måte er rollen til disse cellene i de ulike nevrodegenerative lidelser og vaskulær patologi interessant. Derfor vil en effektiv høy produksjon primær pericyte celle modell gir en effektiv plattform for in vitro studier.

Det finnes ulike protokoller som er foreslått for isolering av primær pericytes (Figur 4). Tigges et al.17 foreslo en metode inkludert kortikale vev med hjernehinnene. Denne tilnærmingen er tenderering av vev fra 6 mus (en 37 ° c, 70 min fordøyelse med Papain/DNase enzymer) etterfulgt av en oppløsning trinn via 21 G og 18 G nåler. Denne protokollen antyder en ett-trinns separasjon (sentrifugering i 22% BSA/PBS-løsning) som gir minst 2 kollagen I belagt brønner av en 6-brønn plate. Cellene opprettholdes i endothelial cellevekst medium (ECGM) til passasje 3 og senere i pericyte vekstmedium (PGM) for passaging celler for å fremme pericyte spredning. I en annen lignende tilnærming, Chen et al.18 foreslått vev dissosiasjon ved dicing vevet med en sterilisert barberhøvel blad og vev fordøyelse med Kollagenase/DNase for 90 min ved 37 ° c. Etter ett-trinns separasjon (sentrifugering i 22% BSA) av cellene, blir det myelin laget fjernet og pellet er vasket to ganger i ECGM. Microårene er belagt i 3 brønner av et kollagen jeg belagt 6-brønn plater. Etter å ha nådd samløpet, er cellene passert to ganger og senere opprettholdt i PGM. Til slutt, hvis cellene er vedtatt i forhold til 3, kan vi få 27 brønner av 6-brønn plater bare ved bruk av 10 mus i begynnelsen av protokollen.

I Thomsen et al., forfatterne antyder isolering av cerebral pericytes via en to-trinns enzym fordøyelsen19. Hjernehinnene og hvit materie er fjernet, og hjerne prøver er skåret i små biter. Vevs bitene gjennomgår den første enzym reaksjonen i kollagenase/DNase i for 75 min ved 37 ° c, etter ett trinn i separasjon i 20% BSA. Pellet er samlet og videre fordøyd i kollagenase/dispase/DNase I for 50 min ved 37 ° c. Dette trinnet etterfølges av microvessel separasjon i en 33% Percoll gradient og videre vasket en gang. Microårene er sådd på kollagen IV/fibronektin belagt 35 mm retter. Spredningen av pericytes er foretrukket av 10% FCS og Gentamicin sulfat i DMEM i 10 dager. I en annen to-trinns enzym fordøyelsen tilnærming, Yamazaki et al. foreslå hakking av excised vev i kaldt DMEM20. I den første enzym reaksjonen behandles prøvene med kollagenase/DNase I for 75 min ved 37 ° c. Etter ett trinn sentrifugering, blir pellet igjen vasket en gang og en andre enzym reaksjon er igangsatt i kollagenase/dispase for 60 min ved 37 ° c. Etter en ett-trinns separasjon, er pellet resuspendert og sentrifugert i 22% BSA løsning. Endelig er mikrovaskulær pellet resuspendert og belagt i en 6-brønn plate. For 5 mus hjerner, 1 brønn av en 6-brønn plate kan være belagt. For å få pericytes, endothelial kulturer er passert tre ganger mens opprettholdt i mus hjernen endothelial celle (mBEC) medium II. Crouch og Doetsch20 foreslår pericyte rensing metoden ved FACS. Vevsprøver fra cortex og ventrikkel – subventricular sone av mus hjernen er dissekert og hakket grundig med en skalpell. Etter kollagenase/dispase enzym inkubasjons i 30 min ved 37 ° c, er fordøyd vevet adskilt fra myelin og rusk sentrifugert i en 22% v/v Percoll løsning. Celle fjæringen blir deretter inkubert i fluorescensmerkete bøyd antistoffer for FACS analyse og sortering. De sorterte cellene er belagt i kollagen belagte brønner av 24 brønn plate. Det er antydet at en cortex gir nok celler for en plating i 1 brønn av 24-brønn plate.

Selv om produktiv, disse metoder komme med adskillige begrensninger, fra bruken av høy antallet av dyrene for enkelt bakst isolasjon å en meget begrenset beløpet av produksjon.

Under utviklingen av denne foreslåtte protokollen, var vi lykkes i å oppnå høy produksjon: 9 brønner av en 6-brønn plate fra så få som 10 mus. For dette formål, fjerning av hjernehinnene sikrer ett trinn fjerning av store fartøy fra vevet. Den Dounce vev jeksel er mer hensiktsmessig for bløtvev som hjernen. Det sikrer også prøve reduksjon med den løse morter, homogenisering med den stramme morter, og forebygger unødvendig cellulær skade. En av de viktigste målene i primær cellekultur protokoller er minimalt avfall av vev og utvidet gjenfinning av cerebral blodkar. I den presenterte protokollen oppnås dette ved repeterende sentrifugering av dextran-BSA tilført vev homogenate. En tre-trinns sentrifugering tilnærming bidrar til å gjenopprette store mengder blodkar fra vevet homogenate. Dette gir en 3x forbedret gjenoppretting av microårene. Etter separasjon, filtrering er det neste viktige skritt, som favoriserer utelukkelse av glatt muskel celle forbundet store fartøy. Som nevnt før en kombinasjon av ulike enzymer har blitt foreslått for enzymatisk fordøyelse. Mens DNase og kollagenase/dispase brukes til å redusere klumper av celler og isolere enkeltceller henholdsvis, er det svært viktig å hindre celle død i et slikt invasiv miljø, og dette er forhindret av TLCK, som derved øker den endelige avkastningen. I utgangspunktet er den første passasjen lov til å vokse en endothelial monolag, som senere støtter veksten av vedlagte pericytes på unilayer. Siden overlevelsen av primær endothelial celler reduseres ved passaging, øker det sannsynligheten for pericyte gjenfinning. Videre bruker denne protokollen en annen passaging som sikrer unngåelse av endothelial celle forurensning. Det bør bemerkes at med et høyere antall celler fra P2, er avhengigheten av ytterligere passaging av cellene redusert. I tillegg reduserer det muligheten for pericyte vekst blir overkjørt av glatte muskelceller, som sprer på mye høyere rente.

For å oppnå en høyere produksjon, er det flere trinn som er kritiske og bør utføres nøyaktig med hensyn til temperatur og tid. Blandingen av vev som homogenate inn i BSA-dextran bør være rask. Pellet dissosiasjon etter sentrifugering trinnene bør være rask for å hindre celle død. Videre 33 min av enzymatisk fordøyelse bør gjøres med presisjon og omsorg. En av begrensningene for denne protokollen er den 7-8 dagen varighet som endothelial unilayer er lov til å vokse og ytterligere rette for vekst av pericytes. Tydeligvis er isolering av microårene btter, veksten av unilayer er raskere, og dermed er det et økende antall pericytes. Det anbefales ikke å bruke mindre enn 10 mus i hver ekstraksjon for å sikre et tilstrekkelig antall mikrovaskulær fraksjoner å støtte pericyte vekst ytterligere. Hvis de nevnte punktene følges nøye, ønsket celle tetthet for cerebral pericyte kultur kan enkelt oppnås.

In vitro-modeller gir en mulig plattform for utvikling av avledede modeller for å få mer informasjon om patofysiologiske relevans og kommunikasjon mellom de andre cellene i NVU under nevrologiske lidelser. Isolerte pericytes kan innlemmes i en bi-cellulær kultur (med endothelial eller gliacellene celler) og Tri-Cellular kultur (endothelial og gliacellene celler) modeller. Utviklingen av disse modellene har ikke vært diskutert her. For å konkludere, gir denne protokollen en tilnærming for isolering av primær celler med høyere produksjon og en bedre plattform for in vitro forskning knyttet til cerebral pericyte biologi.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

LT og FG ble innvilget av Agence Nationale de la Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) innenfor rammen av EUs felles program – nevrodegenerative Disease Research (JPND) for prosjekt SNØBALL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amino acids BME Sigma B-6766 Store at 4 °C.
Basal DMEM media Invitrogen 316000083 Store at 4 °C.
Basic fibroblast growth factor Sigma F-0291 Store at -20 °C.
BSA Sigma A-8412 Store at 4 °C.
Collagenase dispase Sigma 10269638001 Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required.
Dextran Sigma 31398
DNase I Sigma 11284932001 Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C.
Gelatin Sigma G-2500 Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C.
Gentamycin Biochrom AG A-2712 Store at 4 °C.
Glutamine Merck I.00289 Store at -20 °C.
HBSS Sigma H-8264 Store at 4 °C.
HEPES Sigma H-0887 Store at 4 °C.
Matrigel BD Biocoat 354230 Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature.
Pericyte Medium-mouse Sciencell research laboratories 1231 Store at 4 °C.
Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone Sigma T-7254 Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C.
Vitamins Sigma B-6891 Store at -20 °C.
Equipment Requirements
Filtration tools Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity
Laboratory equipment Swing bucket rotor centrifuge
Water bath with agitator
Laminar Flow Hood : BSL2
Glassware (all components to be heat sterilized) Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle
Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches
Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches
Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base
Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azevedo, P. O., et al. Pericytes modulate myelination in the central nervous system. Journal of Cellular Physiology. 233, (8), 5523-5529 (2018).
  2. Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508, (7494), 55-60 (2014).
  3. Gianni-Barrera, R., et al. PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation. Angiogenesis. 21, (4), 883-900 (2018).
  4. Teichert, M., et al. Pericyte-expressed Tie2 controls angiogenesis and vessel maturation. Nature Communications. 8, 16106 (2017).
  5. Dave, J. M., Mirabella, T., Weatherbee, S. D., Greif, D. M. Pericyte ALK5/TIMP3 Axis Contributes to Endothelial Morphogenesis in the Developing Brain. Developmental Cell. 44, (6), 665-678 (2018).
  6. Franco, M., Roswall, P., Cortez, E., Hanahan, D., Pietras, K. Pericytes promote endothelial cell survival through induction of autocrine VEGF-A signaling and Bcl-w expression. Blood. 118, (10), 2906-2917 (2011).
  7. Saint-Pol, J., et al. Brain Pericytes ABCA1 Expression Mediates Cholesterol Efflux but not Cellular Amyloid-beta Peptide Accumulation. Journal of Alzheimer's Disease. 30, (3), 489-503 (2012).
  8. Sagare, A. P., et al. Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice. Nature Communications. 4, 2932 (2013).
  9. Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24, (3), 326-337 (2018).
  10. Claudio, L., Raine, C. S., Brosnan, C. F. Evidence of persistent blood-brain barrier abnormalities in chronic-progressive multiple sclerosis. Acta Neuropathologica. 90, (3), 228-238 (1995).
  11. Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Cellular and Molecular Neurobiology. 29, (3), 309-316 (2009).
  12. Yang, S., et al. Diverse Functions and Mechanisms of Pericytes in Ischemic Stroke. Current Neuropharmacology. 15, (6), 892-905 (2017).
  13. Yang, Y., et al. The PDGF-BB-SOX7 axis-modulated IL-33 in pericytes and stromal cells promotes metastasis through tumour-associated macrophages. Nature Communications. 7, 11385 (2016).
  14. Hesp, Z. C., et al. Proliferating NG2-Cell-Dependent Angiogenesis and Scar Formation Alter Axon Growth and Functional Recovery After Spinal Cord Injury in Mice. Journal of Neuroscience. 38, (6), 1366-1382 (2018).
  15. Guo, P., et al. Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment. American Journal of Pathology. 162, (4), 1083-1093 (2003).
  16. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136, (4), 507-523 (2018).
  17. Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84, (1), 74-80 (2012).
  18. Chen, J., et al. CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, (36), 7622-7631 (2017).
  19. Thomsen, M. S., Birkelund, S., Burkhart, A., Stensballe, A., Moos, T. Synthesis and deposition of basement membrane proteins by primary brain capillary endothelial cells in a murine model of the blood-brain barrier. Journal of Neurochemistry. 140, (5), 741-754 (2017).
  20. Yamazaki, Y., et al. Vascular Cell Senescence Contributes to Blood-Brain Barrier Breakdown. Stroke. 47, (4), 1068-1077 (2016).
  21. Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13, (4), 738-751 (2018).
  22. Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis. Developmental Dynamics. 222, (2), 218-227 (2001).
  23. Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression. Microcirculation. 23, (2), 122-133 (2016).
  24. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468, (7323), 557-561 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics